La búsqueda de nuevas enzimas capaces de ser empleadas en procesos industriales que puedan reemplazar a métodos químicos tradicionales es una actividad constante en la Biotecnología. Una vez detectado el biocatalizador con las propiedades buscadas, debe ser purificado para estudiar sus propiedades más relevantes y los factores que controlan su eficiencia en la aplicación deseada. Si bien la elección de la cepa microbiana adecuada es vital para la producción de dichas enzimas, el proceso de producción también resulta ser de gran importancia a la hora de escalar el proceso de producción. Las enzimas pécticas han sido utilizadas en diversas industrias desde hace más de medio siglo. La industria que más se ha beneficiado de ellas es la industria alimentaria. La mayor aplicación industrial de las pectinasas se encuentra en la industria procesadora de jugos de frutas, ayudando, junto con otro tipo de enzimas a optimizar los procesos de filtración y clarificación. Geotrichum klebahnii es un hongo levaduriforme que crece en medios sintéticos y produce una pectinasa capaz de solubilizar pectina a partir de residuos vegetales.

A pesar de que la fuente tradicional de enzimas coagulantes de la leche para la fabricación de quesos ha sido el estómago de mamíferos lactantes, motivos económicos, nutricionales, culturales, religiosos y/o de disponibilidad de estómagos han hecho necesaria la búsqueda de sustitutos de origen vegetal, fúngico y bacteriano para la elaboración de quesos. Respecto a las enzimas de origen vegetal, sólo un reducido número de peptidasas han sido aisladas, caracterizadas y purificadas a partir de las plantas superiores. En este sentido es necesario destacar que sólo el uno por mil de las especies conocidas se han analizado con respecto a su contenido y perfil de peptidasas. En plantas que crecen en nuestro país se han aislado y caracterizado peptidasas serínicas y cisteínicas en algunas especies de Asclepiadaceae, Bromeliaceae y Moraceae. En cuanto a las peptidasas aspárticas, sólo se ha estudiado una enzima producida por discos de papa sometidos a estrés abiótico, no existiendo otros antecedentes de estudios sobre fitoproteasas aspárticas y ninguno sobre enzimas de plantas que coagulen la leche. En este trabajo de tesis se propone estudiar las peptidasas que poseen acción coagulante de la leche y que se encuentran presentes en Cynara scolymus L. ( alcaucil , alcachofa ), tanto en la planta cultivada a campo como en cultivos in vitro. Para lograr este objetivo general se plantearon los siguientes objetivos parciales: Estudiar la actividad proteinolítica y coagulante de la leche de los extractos crudos de las diferentes partes del alcaucil. Caracterizar la preparación enzimática cruda que presente las mejores condiciones caseinolíticas, de acuerdo a los resultados del ítem anterior. Purificar dicho extracto crudo y caracterizar las fracciones purificadas. Inducir la expresión in vitro de peptidasas coagulantes de la leche de Cynara scolymus L. mediante el agregado de diferentes reguladores de crecimiento. Realizar estudios comparativos entre las peptidasas coagulantes de la leche obtenidas de las plantas crecidas a campo y de las provenientes de cultivos in vitro. Elaborar y evaluar quesos con las enzimas estudiadas.

Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento / La Parotiditis Crónica Recurrente Infantil (PCRI) es una inflamación recurrente y dolorosa, de etiología desconocida. Se inicia a los 2 años de edad y se mantiene hasta la adolescencia, comprometiendo la calidad de vida. Estudios recientes relacionan alteraciones de la composición molecular salival parotídea de pacientes con PCRI, con el grado de alteración sialográfico parotídeo. El propósito de este estudio fue realizar un seguimiento de la composición molecular de la saliva parotídea de pacientes con PCRI sometidos a mantención terapéutica. Se incluyeron 28 pacientes con PCRI tratados en el Servicio Máxilofacial Infantil del Hospital San Juan de Dios. Se tomó muestra de saliva parotídea bilateral para determinar: a) Concentración de proteínas, b) Perfiles electroforéticos unidimensionales y c) Frecuencia de actividad metaloproteinasa MMP9 y MMP2; antes y después de un periodo de mantención terapéutica. La saliva parotídea de los pacientes con PCRI luego de la mantención terapéutica no presenta variaciones en la concentración de proteínas y en la frecuencia de individuos que presentan actividad MMP-9 y MMP-2. Los perfiles electroforéticos se mantienen relativamente estables a excepción de dos bandas: la banda I que se presentó en una menor cantidad de pacientes que recibieron el tratamiento, y la banda J que se presenta en una mayor cantidad de pacientes luego de que estos recibieran tratamiento. El conjunto de observaciones realizadas, ha permitido determinar que después de un largo periodo de tiempo de mantención terapéutica, la saliva parotídea de pacientes con PCRI presenta una mantención de las alteraciones en la composición molecular. Se requiere de estudios adicionales que permitan identificar y caracterizar las proteínas que variaron después del tratamiento en la saliva de estos pacientes.

Ingeniera Civil en Biotecnología / El melanoma es un cáncer de alta incidencia y mortalidad, que posee una inmunogenicidad suprimida por mecanismos de evasión propios, como la expresión aberrante del gangliósido GD2 en la superficie de las células tumorales. Entre las terapias experimentales, la hemocianina de Megathura crenulata, conocida como KLH, generó una respuesta inmune protectiva contra el tumor de melanoma al estar acoplada a un péptido que mimetiza a GD2 (péptido P10), induciendo anticuerpos anti-GD2 que dirigen la respuesta hacia el tumor. Así, se propuso que las hemocianinas de los moluscos del litoral chileno, Concholepas concholepas (CCH) y Fissurella latimarginata (FLH), acopladas a P10 generarían una respuesta inmune protectiva frente al desafío de ratones C57BL/6, con melanoma murino de la línea B16F10. Primero, los péptidos P10 y control (S266) fueron acoplados a las tres hemocianinas mediante el entrecruzador sulfo-SMCC. Luego, utilizando el adyuvante AddaVax, como potenciador inmunológico de los conjugados hemocianina-péptido, se inmunizó a los ratones encontrándose un elevado y similar título de anticuerpos contra las hemocianinas (de 1:2.500), y un menor título de anticuerpos específicos y predominantemente de clase IgG contra cada péptido (de 1:300). Posteriormente, se evaluó la terapia anti-tumoral inducida por tres inmunizaciones con los conjugados y con hemocianinas no acopladas, en ratones desafiados con células B16F10 y previamente sensibilizados con cada antígeno. Se encontró que FLH indujo una mayor respuesta inmune protectiva contra el tumor que CCH, dado que inhibió la incidencia y la velocidad de crecimiento tumoral, similar al control positivo con KLH, estando o no conjugada, y sin efectos tóxicos colaterales. Con ello, y según se verificó por inmunofluorescencia y indirecta citometría de flujo, los anticuerpos anti-hemocianinas presentaron reacción cruzada con epítopos presentes en las células B16F10 y en líneas de melanoma humano. En conclusión, no se encontraron diferencias entre las hemocianinas al actuar como carrier de péptidos miméticos, pero sí hubo diferencias significativas en la respuesta inmune antitumoral inducida por FLH y KLH, respecto a los controles y a CCH, resultados que son promisorios para continuar los estudios preclínicos con FLH, que potencien su uso como adyuvante o inmunomodulador en la terapia del melanoma.

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / En la actualidad existe gran interés en el uso de nanopartículas esféricas de oro (NPAu) para aplicaciones biomédicas. Éstas presentan propiedades ópticas que permiten la absorción y disipación de energía de manera local en forma de calor luego de ser irradiadas, lo que puede ser utilizado para destruir células tumorales o disolver agregados tóxicos proteicos de β-amiloide (ATAβ) involucrados en la enfermedad de Alzheimer (EA). En nuestro laboratorio se conjugaron las NPAu con el péptido CLPFFD-NH2 el cual reconoce a estos ATAβ, formando el conjugado NPAu-CLPFFD. Estos agregados pueden ser disueltos en presencia de este conjugado mediante la aplicación de microondas de baja potencia, reduciéndose su toxicidad. No obstante, el conjugado NPAu-CLPFFD atraviesa la barrera hemato-encefálica (BHE) en baja proporción con respecto a la dosis administrada. El enfoque principal de este estudio fue recubrir el conjugado NPAu-CLPFFD con copolímeros de carácter anfifílico como los poloxámeros (Pluronic®) para facilitar el pasaje a través de la BHE. Estos copolímeros han demostrado tener la capacidad tanto de inhibir transportadores de eflujo expresados en distintos tipos de células como también de modificar la fluidez de modelos de membranas. En este estudio se emplearon tres copolímeros los cuales difieren en sus propiedades estructurales: Pluronic® P85, F127 y L121, siendo sus balances hidrofílico-lipofílico (sigla en inglés HLB): 16, 22 y 1, respectivamente. Los nanocompósitos se caracterizaron mediante espectrofotometría de absorción molecular, dispersión dinámica de la luz (sigla en inglés DLS), potencial zeta, microscopía electrónica de transmisión (sigla en inglés TEM) y termogravimetría. Se evaluó además in vitro las alteraciones en la estabilidad y permeabilidad de modelos de membranas debido a la interacción con los nanocompósitos, y la capacidad de estos de difundir pasivamente mediante el ensayo de permeabilidad de membrana artificial en paralelo (sigla en inglés PAMPA). Así, se logró determinar que estos nanocompósitos son capaces de modificar la estabilidad y permeabilidad de los modelos de membrana biológica, posiblemente debido a cambios en su organización. A pesar de esto, ninguno fue capaz de mejorar el traspaso mediante difusión pasiva de NPAu a través del modelo de membrana en el PAMPA / Nowadays, there exists a great interest in the use of spherical gold nanoparticles (NPAu) for biomedical applications. NPAu have optical properties that allow the absorption and local dissipation of energy in the form of heating after being irradiated, which can be used to destroy tumoral cells or dissolve ammiloid-β toxic protein aggregates (ATAβ) that are involved in the Alzheimer disease (EA). In our laboratory, NPAu were conjugated with the CLPFFD-NH2 peptide which recognizes ATAβ, forming the NPAu-CLPFFD conjugate. These aggregates can be dissolved in the presence of NPAu-CLPFFD through the application of weak microwaves fields, decreasing their toxicity. However, the NPAu-CLPFFD conjugate crosses the blood brain barrier (BHE) in very small proportion with respect to the dose injected. The main focus of this study was the coating of NPAu-CLPFFD by amphiphilic polymers such as poloxamers (Pluronics®) to facilitate the cross throughout the BHE. These copolymers have demonstrated the capacity to inhibit efflux transporter expressed in different types of cells and also modify the fluidity of model membranes. In this study, three copolymers were used which differ in their structural properties: Pluronic® P85, F127 y L121, where their hydrophilic lipophilic balances (HLB) are 16, 22 and 1, respectively. The nanocomposites were characterized through molecular absorption spectrophotometry, dynamic light scattering (DLS), zeta potential, transmission electronic microscopy (TEM) and thermogravimetry. Also, changes in the stability and permeability of membrane models due to the interaction with nanocomposites, and the capacity of these to cross passively through the parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), were evaluated in vitro. In this way, it was determined that these nanocomposites are capable of modify biological membrane model stability and permeability possibly due to changes in their organization. Despite this, these systems were not capable to improve the cross of NPAu through passive diffusion in the PAMPA / Fondecyt Fondap Mecesup UCH

Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento / Parotiditis crónica recurrente infantil (PCRI), inflamación recurrente de etiología desconocida se manifiesta alrededor de los 3 años y se mantiene hasta la adolescencia, comprometiendo la calidad de vida. Estudios recientes reportan un aumento en la frecuencia de algunos polipéptidos en la saliva parotídea proveniente de pacientes con PCRI al compararla con la de sujetos controles sanos. El propósito de este estudio fue identificar polipéptidos variantes asociados a la condición de PCRI. Se incluyeron 37 pacientes con PCRI que estaban siendo tratados en el Servicio Maxilofacial Infantil del Hospital San Juan de Dios y 8 individuos controles sanos. Se tomó muestra de saliva parotídea bilateral para determinar: concentración de proteínas, perfiles electroforéticos unidimensionales, frecuencias de polipéptidos variantes e identificación de ellos mediante espectrometría de masas MALDI TOF. La saliva parotídea de los pacientes con PCRI, en relación a los controles, presenta con mayor frecuencia los polipéptidos de 87, 43, 37, 33, 29 y 26 kDa. La banda de 26 kDa presente en el 100% de los pacientes con PCRI, corresponde a la región C de la cadena liviana kappa de inmunoglobulina. Un péptido de 144 kDa, exclusivo para los pacientes con PCRI se presentó en 6 muestras. Los pacientes con PCRI presentan en su saliva parotídea alteraciones en la frecuencia de varias proteínas en relación a los individuos controles sanos. El aumento de la frecuencia de la banda correspondiente a la región C de la cadena liviana kappa de la inmunoglobulina sugiere un mecanismo de respuesta glandular asociado a esta condición patológica.

Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / La Parotiditis Crónica Recurrente Infantil (PCRI) es una inflamación recurrente y dolorosa, de etiología aún no dilucidada de la glándula parótida asociada a sialectasia no obstructiva. Generalmente, se inicia alrededor de los 2 años de edad y se mantiene hasta la adolescencia. Estudios anteriores han demostrado la presencia de metaloproteinasas 2 y 9 en la saliva parotídea de pacientes con PCRI. En este estudio, trabajo se propuso analizar la frecuencia y actividad enzimática de las formas activas y latentes de dichas metaloproteinasas. En 32 pacientes con PCRI de 4 a 13 años, se recolectó saliva parotídea y se analizó mediante cuantificación de proteínas por el método de Bramhall para posteriormente determinar la actividad metaloproteinasa 2 y 9 mediante zimografía en presencia de gelatina. Se registró el compromiso clínico y sialográfico de ambas glándulas parótidas y se les correlacionó con la frecuencia y actividad nzimática de las formas activas y latentes de las metaloproteinasas en cuestión. La saliva parotídea de los pacientes con PCRI, presentó una tendencia a una mayor frecuencia y actividad enzimática de las metaloproteinasas 2 y 9 de la saliva proveniente de glándulas comprometidas clínica y sialográficamente respecto de la saliva proveniente de glándulas asintomáticas. Sin embargo, no hubo diferencia estadística entre estos dos tipos de saliva para ninguno de los parámetros medidos. La presencia de las formas activas y latentes de las metaloproteinasas 2 y 9 en saliva proveniente de glándulas asintomáticas de los pacientes PCRI unilateral, sugiere que existe una modalidad subclínica de esta patología afectando a dichas parótidas. Estudios osteriores con un número mayor de muestras, realizados en pacientes con distintos esquemas terapéuticos, al inicio y durante el tratamiento, serían interesantes para poder determinar de manera mas clara la diferencia entre la frecuencia y actividad enzimática metaloproteasa en la saliva proveniente de glándulas comprometidas versus glándulas clínicamente sanas.

Memoria para optar al Título de Bioquímico / La enfermedad de Alzheimer (EA) es una patología neurodegenerativa progresiva caracterizada principalmente por agregados proteicos intracelulares (ovillos neurofibrilares) y extracelulares (placas seniles o amiloides). Estos últimos están formados por un péptido de 39 a 43 aminoácidos, conocido como péptido ß amiloide (Aß), el que se genera por proteólisis de la Proteína Precursora del Amiloide (APP). Existen dos formas principales del péptido Aß, una de 40 aminoácidos presente en personas sanas, y otra de 42 aminoácidos, constituyente principal de las placas observadas en pacientes de EA. Estas placas se forman a partir de la agregación de monómeros (M) que forman oligómeros solubles (O), los que formarían posteriormente protofibrillas y finalmente las fibras insolubles. La falta de correlación entre el grado de demencia y la cantidad de placas ha sugerido que los oligómeros solubles podrían ser los responsables de los síntomas iniciales. Si bien no están claros los blancos específicos del péptido Aß, uno de los principales candidatos son las sinapsis excitatorias que responden a glutamato. Estas sinapsis poseen una especialización de membrana conocida como densidad postsináptica (DPS), estructura que contiene a los receptores para neurotransmisores y proteínas asociadas a la regulación de la función sináptica, agrupadas por proteínas de andamio. Dentro de los receptores para glutamato, el R-NMDA es de gran importancia en procesos de memoria y aprendizaje, y su actividad puede ser modulada por el receptor para neurotrofinas p75NTR. Este receptor también está contenido en la DPS, y participa tanto en sobrevida como en apoptosis neuronal. Además, posee la capacidad de unirse a ligandos estructuralmente no relacionados, entre los que se encuentra el péptido Aß, postulándose como potencial blanco molecular del péptido. Nuestra hipótesis es que El péptido Aß en concentraciones nanomolares es capaz de inhibir la actividad del R-NMDA en la DPS por interacción con el receptor p75NTR. Para este trabajo, se obtuvieron DPS de corteza de rata adulta, las cuales fueron microinyectadas en ovocitos de Xenopus laevis. Estos ovocitos son sometidos a estudios de fijación de potencial con 2 electrodos (voltage clamp), y se midieron las respuestas obtenidas con el agonista NMDA en presencia de distintas concentraciones del péptido Aß1-40(M) y Aß1-42(M) y (O). En el caso del péptido Aß1-42(M), se observa una inhibición a todas las concentraciones utilizadas, sin ser dependiente de la dosis. Por otro lado, los péptidos Aß1-40(M) y Aß1-42(O) poseen efectos duales sobre las corrientes de NMDA: a bajas concentraciones producen un efecto inhibitorio y a altas concentraciones un efecto potenciador. En el caso del péptido Aß1-40(M), la inhibición se logra usando una concentración de 50 nM, mientras que en el caso del Aß1-42(O) se logra con una concentración de 5 nM. En ambos casos la potenciación ocurre al usar una concentración de 1 uM. Adicionalmente, el efecto Aß1-42(O) está mediado por el receptor p75NTR, ya que el uso de un anticuerpo que produce pérdida de función del receptor es capaz de revertir tanto el efecto inhibidor como potenciador del péptido. Estos datos permiten confirmar que existe participación del receptor p75NTR en los efectos sinápticos causados por el péptido, especialmente sobre la actividad del RNMDA, apuntando al rol fisiológico del péptido y su relación con la patología de la EA. / Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative progressive pathology characterized mainly by protein intracellular (neurofibrillary tangles) and extracellular (Amyloid plaques) aggregates. The latter are formed by 39-43 aminoacids peptide, known as amyloid ß(Aß), generated by proteolysis of Amyloid Precursor Protein (APP). There are two principal forms, one of 40 aminoacids, present in healthy people, and other of 42 aminoacids, main constituent of plaques seen in AD patients. These plaques are formed by aggregation of monomers (M), which form oligomers (O), then protofibrils and finally insoluble fiber. The lack of correlation between grade of dementia and number of plaques has suggested that soluble oligomers could be the responsible of initial symptoms. Although there is no clarity about specific targets of Aß peptide, one of the most named are excitatory synapses activated by glutamate. These synapses have a membrane specialization known as postsynaptic density (PSD), structure that contains the neurotransmitter receptors and proteins associated with regulation of synaptic function, grouped by scaffolding proteins. Between glutamate receptors, NMDA-R has great importance in memory and learning process, and his activity can be modulated by the neurotrophin receptor p75NTR. This receptor is also present in PSD and participates in both survival and neuronal apoptosis. In addition, it has the ability to bind ligands structurally unrelated, including Aß peptide, postulating the p75NTR as a potential molecular target of the peptide. Our hypothesis is that Aß peptide in nanomolar concentration is able to inhibit R-NMDA activity in PSD by interacting with p75NTR. For this work, we obtained PSD from adult rat cortex, which were microinjected into Xenopus laevis oocytes. These oocytes were subjected to 2-electrodes voltage clamp, and responses to agonist NMDA were acquired in presence of different concentrations of Aß1-40(M) and Aß1-42(M) and (O). In the case of Aß1-42(M), inhibition was non dose-dependent. On the other hand, Aß1-40(M) and Aß1-42(O) have dual effect on NMDA-R currents: at low concentrations the peptides have an inhibitory effect and at high concentrations a potentiation effect. In the case of Aß1-40(M), inhibition is obtained using a concentration of 50 nM, whereas for the Aß1-42(O) is obtained with a concentration of 5 nM. In both cases, potentiation occurs when a concentration of 1 uM is used. Additionally, the effect of Aß1-42(O) is p75NTR-mediated, because the use of loss-of-function antibody reversed both inhibition and potentiation effect. These data allow us to confirm that there is participation of p75NTR in synaptic effects caused by Aß peptide, specially on NMDA-R activity, pointing to the physiological function of the peptide and its relationship with AD pathology.

Objetivo: Seleccionar e identificar aptámeros de ADN capaces de reconocer con alta afinidad y de forma específica péptidos de proteínas de membrana de Leishmania braziliensis. Diseño: El presente estudio es un estudio experimental in vitro que involucra las áreas de biomedicina y biotecnología debido a que se usará péptidos sintéticos para evaluar la afinidad de unión a los aptámeros seleccionados usando la plataforma ELONA.

Magíster en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / Ingeniero Civil en Biotecnología / Durante las últimas décadas, una rama de la investigación biotecnológica se ha enfocado en desarrollar y optimizar procesos de producción de proteínas recombinantes orientadas a aplicaciones terapéuticas. En particular, los péptidos terapéuticos ofrecen actualmente un nuevo potencial comercial para la industria farmacéutica y biotecnológica al generar estrategias efectivas en el tratamiento de diversas patologías como cáncer y alteraciones metabólicas entre otras. Estudios previos han demostrado la capacidad supresora de tumores de péptidos con blanco intracelular como p53p-Ant y PNC-27. Estos corresponden a regiones derivadas de la proteína p53, factor de regulación transcripcional que inhibe la progresión del ciclo celular e induce reparación celular o apoptosis, en caso de estrés genotóxico. Ambos péptidos contienen en su secuencia, un péptido de penetración celular, el cual les entrega la capacidad de atravesar la membrana plasmática. Así, bajo distintos mecanismos, con p53p-Ant y PNC-27 se ha reportado apoptosis o bien necrosis de manera selectiva en ciertos tipos de células tumorales. El presente trabajo tuvo por objetivo expresar en E. coli los péptidos p53p-Ant y PNC-27, y purificarlos mediante el sistema IMPACT. Éste es un mecanismo de expresión y purificación mediado por inteínas que permite purificar a través de una columna de afinidad, proteínas recombinantes con su secuencia nativa sin el uso de proteasas y minimizando pasos cromatográficos. Se logró producir ambos péptidos en forma soluble. La expresión soluble del péptido PNC-27 se consiguió a partir de los dos vectores de expresión proporcionados por el sistema IMPACT (pTXB1 y pTYB11), esta expresión resultó ser fuertemente dependiente de las condiciones de cultivo ya que se requiere de una inducción a baja temperatura (12 °C). Por su parte, la expresión soluble de p53p-Ant depende tanto del sistema de expresión como de las condiciones de cultivo. El diseño de las construcciones genéticas, en particular las que incluyen el vector de expresión pTYB11, permitió una efectiva purificación de los péptidos utilizando un único paso cromatográfico. Más aún, los niveles de rendimiento (0,4 1,2 mg L-1) superan los reportados para péptidos con el mismo sistema y los niveles de pureza obtenidos permitirían desarrollar investigación avanzada con ensayos biológicos in vivo o in vitro.