This PhD thesis is the result of the combination of experimental and computational techniques with the aim of understanding the mechanism of action of de novo cyclic decapeptides with high antimicrobial activity. By experimental techniques the influence of the replacement of the phenylalanine for tryptophan residue in their antimicrobial activity was tested and the stability in human serum was also analyzed, in order to evaluate their potential therapeutic application as antitumor agents. On the other hand, the interaction amongst the peptide BPC194 c(KKLKKFKKLQ), the best candidate from the whole library of cyclic peptides, and a model anionic membrane was simulated. The results showed a structure-function relationship derived from the stable conformation of the peptides involved in the membrane permeabilization. As a result, a rational design was performed being BPC490 the peptide with best antimicrobial activity compared with the best active peptide from the original library. / Aquesta tesi doctoral resulta de la combinació d’estudis mitjançant tècniques experimentals i computacionals amb l’objectiu d’entendre el mecanisme d’acció de "de novo" decapèptids cíclics amb elevada activitat antimicrobiana. Experimentalment, es va avaluar la influència de la substitució dels residus de fenilalanina per triptòfan en la seva activitat antimicrobiana i també la seva estabilitat sèrum humà, per tal de valorar la seva possible aplicació terapèutica envers el càncer. Per altra banda, es va simular la interacció del pèptid BPC194 c(KKLKKFKKLQ), millor candidat de la biblioteca de pèptids cíclics, amb models aniònics de bicapa lipídica. Els resultats van posar en manifest una relació estructura-funció derivada de la conformació estable dels pèptids que participen directament en la permeabilització de la membrana. Es va procedir doncs al disseny racional de nous pèptids cíclics sent el pèptid BPC490 el que va presentar una millor activitat bacteriana en comparació amb el pèptid més actiu de la llibreria original.

En aquesta tesi doctoral es va estudiar la preparació de pèptids biarílics en fase sòlida. En primer lloc, es varen borilar residus de fenilalanina o tirosina presents a la seqüència peptídica a través d’una reacció de Miyaura. A continuació, es varen arilar els boronats resultants a través d’una reacció de Suzuki-Miyaura sota irradiació de microones, utilitzant diversos halurs d’aril i haloaminoàcids. La metodologia trobada es va estendre a la preparació de pèptids biarílics cíclics. Aquesta aproximació presenta l’avantatge d’evitar la síntesi en dissolució i la purificació del boronoaminoàcid. A més, permet la preparació d’una àmplia diversitat de pèptids biarílics a partir d’un únic boronopèptid. L’avaluació de l’activitat biològica dels pèptids sintetitzats va permetre idenficar seqüències actives enfront dels bacteris Erwinia amylovora, Xanthomonas vesicatoria, i Pseudomonas syringae, que són responsables de malalties greus en plantes d’interès econòmic com pereres i pomeres, i que varen resultar ser molt poc tòxics enfront cèl•lules eucariotes. / The present PhD study was focused on the preparation of biaryl peptides on solid-phase. First, phenylalanine or tyrosine residues were borylated through a Miyaura reaction. Then, the resulting boronates were arylated via a Suzuki-Miyaura reaction under microwave irradiation, using a range of aryl halides and haloamino acids. This methodology was extended to the solid-phase synthesis of biaryl cyclic peptides. This strategy is advantageous because it avoids the synthesis and purification of amino acid boronates in solution. Moreover, it allows the preparation of a large diversity of biaryl peptides from a single boronopeptide intermediate. The evaluation of the biological activity allowed the identification of active sequences against the economically important plant pathogenic bacteria Erwinia amylovora, Xanthomonas vesicatoria, and Pseudomonas syringae, and moreover they were not toxic against eukaryotic cells.

In the present PhD thesis we studied the solid-phase peptide synthesis of antimicrobial peptides derived from the lead peptides BP100 and BPC194. First, peptides derived from BP100 containing D-amino acids at different positions of the sequences were prepared. Moreover, peptidotriazoles derived from BP100 were also synthesized containing the triazole ring at the side-chain of different amino acids. Then, we proceeded to perform studies for the synthesis of multivalent peptides derived from BPC194. To achieve this objective, the synthesis of cyclic peptides containig a triazole ring at amino acids side-chain with different elongations was carried out. Finally, we prepared various carbopeptides containing 2 and 4 units of BP100 and/or its derivatives. The evaluation of the biological activity allowed the identification of active sequences against the economically important phytopathogenic bacteria and fungi and not toxic against eukaryotic cells. / En aquesta tesi doctoral es va estudiar la preparació en fase sòlida de pèptids antimicrobians derivats dels pèptids lead BP100 i BPC194. En primer lloc, es varen preparar derivats del pèptid lineal BP100 incorporant D aminoàcids en diferents posicions de la seqüència. A més, també es varen sintetitzar derivats d'aquest pèptid lead incorporant un anell de triazole a la cadena lateral de diferents aminoàcids. Posteriorment, es va procedir a l'estudi de la síntesi dd pèptids multivalents derivats de BPC194. Per aconseguir aquest objectiu es va portar a terme la síntesi de pèptids cíclics incorporant un anell de triazole a la cadena lateral d’aminoàcids amb diferents allargades de cadena. Finalment, va procedir a la preparació de carbopèptids contenint 2 i 4 unitats de BP100 i/o derivats. L’avaluació de l’activitat biològica dels pèptids sintetitzats va permetre idenficar seqüències actives enfront de bacteris fitopatògens i fongs i poc tòxiques enfront cèl•lules eucariotes.

Evalúa la protección en cerdos mediante el uso de dos vacunas recombinantes desarrolladas con el péptido TSOL18 de Taenia solium, con dos tipos de adyuvantes y dos esquemas de vacunación controlados en un ensayo de infección experimental. Cuarenta y nueve cerdos de dos meses de edad fueron distribuidos en los siguientes tratamientos: T1Vacuna IILTSOL18+ISA206V; T2Vacuna UMTSOL18+QuilA; T3Vacuna IILTSOL18+QuilA; T4Vacuna IILTSOL18+ISA206V; T5Control. La vacunación se realizó al día 0 y al día 23 de estudio para los cerdos de T2, T3 y T4, mientras que los cerdos de T1 fueron únicamente vacunados al día 23. Se realizó el desafío oral con proglótidos de Taenia solium al día 37 de estudio y los cerdos fueron mantenidos 12 semanas adicionales bajo condiciones controladas. Se realizaron pruebas de ELISA indirecto en suero sanguíneo para la detección de anticuerpos anti-TSOL18, los cuales fueron interpretados mediante el porcentaje de positividad (PP+). Posteriormente, los cerdos fueron eutanasiados para la evaluación y conteo de cisticercos en la canal, los cuales se clasificaron como viables o degenerados. No se observaron cisticercos sanos en cerdos que recibieron dos dosis de vacuna; además se observaron mejores resultados mediante el uso de la vacuna IILTSOL18+Adyuvante QuilA (ausencia tanto de quistes sanos como degenerados). Los cerdos de T3 presentaron valores más altos de PP+, con una mediana de 67.3. Se concluye que la vacuna IILTSOL18+Adyuvante QuilA aplicada al día 0 y 23 del estudio presenta un mejor nivel de protección en comparación a los otros protocolos de vacunación, al no observarse quistes sanos ni degenerados en las canales de los cerdos y presentar valores más altos de PP+ mediante la prueba de ELISA. / Tesis

Algunos aminoácidos ciclobutánicos de origen natural han presentado actividad biológica como antivíricos, analgésicos, antimicrobianos, antidepresivos y neurotróficos. Es por este motivo que en esta Tesis se prepararon diferentes a,b-deshidro-a-aminoácidos ciclobutílicos (DHAAs) ópticamente activos a partir de los precursores quirales a-pineno y (-)-verbenona. Dentro de estos DHAAs se sintetizaron pares de enantiómeros, DHAAs con la misma o inversa quiralidad, y con el doble enlace unido directamente al anillo de ciclobutano o a un metileno de distancia. La hidrogenación de estos compuestos, usando catalizadores aquirales (Pd/C y Wilkinson) y quirales ((S,S)-Chiraphos y Duphos), condujo a la síntesis de a-aminoácidos ciclobutílicos saturados, con elevadas estereoselectividades en algunos casos. Los APNs son pseudopéptidos capaces de transportar la información genética, vía las bases nucleicas, de igual manera que el ADN o el ARN. Ésta y otras propiedades, como por ejemplo la capacidad de actuar como agente antisense con elevada eficiencia, hacen posible que el oligómero de APN sea muy interesante en diferentes disciplinas: química, biología molecular y por supuesto en medicina. Así pues, en esta Tesis a partir de un a-aminoácido ciclobutílico saturado, se sintetizó el primer ácido péptidonucleico (APN) con un anillo de ciclobutano en su estructura. Se incorporó el monómero sintetizado en un decámero y se realizó un estudio de la estabilidad térmica en la hibridación del decámero con cadenas complementarias de ADN, ARN y APN. Los resultados de este estudio confirmaron que la incorporación del monómero en un oligómero no mejora ni empeora la afinidad por una cadena complementaria, en comparación con la afinidad que presenta un oligómero estándar de APN.Por otra parte, a partir de un a,b-deshidro-a-aminoácido ciclobutílico se prepararon dos a,b-deshidro-a-péptidos ciclobutílicos ópticamente activos (dipéptidos) con buenos rendimientos. Uno de ellos contiene una unidad de glicina en su estructura, mientras que el otro contiene el aminoácido (S)-fenilalanina. Se realizó un estudio posterior de hidrogenación de estos compuestos, obteniéndose a-péptidos ciclobutílicos saturados con muy buenos excesos diastereoisoméricos, próximos al 100% en algunos casos. Se realizaron espectros de dicroismo circular de los a-péptidos, tanto insaturados como saturados, obteniéndose curvas con la misma tendencia que la de otros péptidos descritos en la bibliografía, los cuales se ha demostrado que poseen capacidad de ser inductores de giros b, debido a una conformación determinada, muy congelada, para estás moléculas. / Some natural cyclobutane amino acids have displayed activities as antiviral or antimicrobial agents, neurotropics and analgesics. Therefore, in this Thesis were prepared different chiral a,b-dehydro-a-cyclobutyl amino acids (DHAAs) from quiral precursors: a-pinene and (-)-verbenone. These DHAAs were synthesized in enantiomeric form, with the same and reverse chirality, and with the double bond directly attached to the cyclobutane ring or separated from the carbocycle by a methylene group. Some cyclobutyl saturated a-amino acids were produced with high stereoselectivity in some cases, in the hydrogenation of the DHAAs employing different achiral catalysts (Pd/C and Wilkinson) and chiral catalysts ((S,S)-Chiraphos and Duphos).PNA is a pseudopeptide with the potential of carrying genetic information (via the nucleobase) code in a manner identical to DNA or RNA. This property and other, as for instance the ability of working like an antisense agent with high efficiency, make the molecule of PNA of significant interest in many disciplines of chemistry, molecular biology and of course in medicine. Therefore, in this Thesis, from a saturated cyclobutyl amino acid, we synthesized the first peptide nucleic acid (PNA) with a cyclobutane ring. The monomer was incorporated in a decamer and it was hybridized to complementary DNA, RNA and PNA. We studied the thermal stability (Tm) of the hybrids. The results of this researches confirmed that the incorporation of the cyclobutanyl PNA monomer in an oligomer doesn't change the affinity to a complementary oligonucleotide, if we compare it with the affinity that displays a standard PNA oligomer.On the other hand, some chiral a,b-dehydro-a-cyclobutyl peptides (dipeptides) were synthesized, in high yields, from one DHAA. One with the amino acid glycine, and the other one with a (S)-phenylalanine. The hydrogenation of these compounds afforded cyclobutyl saturated a-peptides with high de (~100% in some cases). The CD spectra of the a-peptides, unsaturated and saturated, showed the same tendency as other peptides with the capacity of being b-turn inducers, due to a fixed conformation for these.

La miocardiopatía hipertrófica (MCH) es una enfermedad primaria del miocardio causada por cambios genéticos. La MCH presenta hipertrofia cardíaca, desorganización de los miocitos e incremento de la matriz colágena intersticial que contribuyen al desarrollo de un amplio espectro de anomalías funcionales, incluyendo isquemia miocárdica, disfunción sistólica, insuficiencia cardíaca congestiva, arritmias y muerte súbita (MS).Los objetivos de este trabajo fueron:- Comparar los valores de los diferentes biomarcadores (estrés parietal, inflamación, daño endotelial, necrosis, fibrosis y remodelado tisular) entre pacientes con MCH y un grupo control de similares características. - Examinar el comportamiento de las concentraciones de los diferentes biomarcadores clasificando el grupo de pacientes según su capacidad funcional, atendiendo a los grupos de la escala NYHA.- Estudiar la asociación de cada biomarcador a las diferentes variables clínicas, asociación con las características demográficas y con las diferentes pruebas complementarias que estiman la severidad de la enfermedad.El aumento de las concentraciones de NT-proBNP en pacientes con MCH, sugiere la existencia de un aumento en la tensión de la pared del ventrículo y una mayor rigidez de la misma debido al depósito de tejido fibrótico. Se ha observado un marcado daño endotelial, como demuestra una media elevada del FvW en el grupo de pacientes. La presencia de necrosis de cardiomiocitos se corrobora, al resultar significativo un discreto aumento de concentraciones de TnThs en los sujetos con MCH. Entre los péptidos del colágeno estudiados, sólo el ICTP está aumentado en pacientes, sugiriendo que la degradación del colágeno tipo I jugaría un papel importante en el remodelado tisular extracelular que tiene lugar en la MCH. - Se observa una asociación entre los valores séricos de NT-proBNP, FvW, TnThs y GDF-15 con una peor capacidad funcional. Los valores de PCRhs obtenidos, aun encontrando asociación a peor capacidad funcional, sugieren que en la MCH no hay presencia de afección de carácter inflamatorio en su fisiopatología. Como conclusiones destacamos que: NT-proBNP se ha asociado al grado de fibrosis estimado mediante RTG. La concentración de FvW se ha relacionado con obstrucción y taquicardia ventricular no sostenida, no en cambio con el RTG. Sí se asocia el aumento de TnThs a más fibrosis, además de con disfunción sistólica, por lo que dicho incremento podría reflejar una pérdida continua de miocitos debido a un moderado rango de necrosis. Del grupo de péptidos estudiados del metabolismo del colágeno tipo I y III, no se han observado resultados concluyentes que expliquen un desequilibrio entre el remodelado tisular, destrucción y formación de tejido fibrótico miocárdico. / Hypertrophic cardiomyopathy (HCM) is a myocardial disease caused by genetic changes in genes encoding proteins of the sarcomere. HCM provides cardiac hypertrophy, myocyte disarray and increased interstitial collagen matrix, which contribute to the development of a broad spectrum of functional abnormalities, including myocardial ischemia, systolic dysfunction, congestive heart failure, arrhythmias and sudden cardiac death (SCD). Our aims were:- Compare the values of the different biomarkers (wall stress, inflammation, endothelial damage, necrosis, fibrosis and tissue remodeling) between HCM patients and a control group with similar characteristics.- Examine the behavior of the different biomarkers concentrations, classifying patients according to their functional capacity, attending to the NYHA scale groups. - To study the association of each biomarker to different clinical variables related with demographics and various complementary tests to estimate the severity ofthe disease.Results and conclusions: - Increased concentrations of NT-proBNP, suggest the existence of an increased wall tension and increased ventricular stiffness due to deposition of fibrotic tissue, in HCM patients. A marked endothelial damage has been observed, as evidenced elevated vWF levels in patients. The presence of a cardiomyocyte necrosis is confirmed in the slight but significant increase of hsTnT levels in HCM subjects. Among the studied collagen peptides, only the ICTP was increased in patients, suggesting that type I collagen degradation may play a role in extracellular tissue remodeling that takes place in the HCM. - There is an association between serum levels of NT-proBNP, vWF, hsTnT and GDF-15, with worse functional class. The hsCRP values obtained even were associated with worse functional capacity, not suggested the presence of an inflammatory condition in the HCM pathophysiology. - NT-proBNP was associated with the fibrosis degree estimated by LGE. vWF levels has been linked to obstruction and non-sustained ventricular tachycardia, whereas not with the LGE. Higher values of hsTnT was clearly related to an increased fibrosis in addition to systolic dysfunction, therefore this increase may reflect a continuous myocyte loss due to a moderate range of necrosis. In the group of collagen peptides studied of collagen type I and III metabolism, have been inconclusive results that could explain an imbalance between tissue remodeling, destruction and formation of myocardial fibrotic tissue.

L’estudi d’espècies marines (micro- i macroorganismes) és interessant perquè ha conduit a l’aïllament de substàncies amb una estructura química totalment diferent de les trobades en productes naturals aïllats d’organismes terrestres i a més amb una amplia gama de activitat biològica força interessant. La mayotlida és un producte natural d’origen marí aïllat per la empresa Pharmamar d’una mostra de Spongia sp. La mayotlida presenta activitat inhibidora del creixement (GI50) del ordre nanomolar. Des del punt de vista estructural, la mayotlida és un sistema octapeptídic i té la peculiaritat de la unió entre dos triptòfans (Trps), mitjançant l’enllaç entre el N indòlic d’un i el C3a de l’altre, que es troba ciclat constituint una unitat hexahidropirroloindole (HPI). Aquesta estructura triptòfan-pirroloindole ha sigut detectada, fins el moment en pocs productes naturals, i la mayotlida és el primer exemple d’un compost bis-macrocíclic amb aquest enllaç. En el capítol 1 de la memòria s’estudia la formació del sistema triptòfan-pirroloindole, per a lo qual s’ha assajat la reacció entre un Trp i un anàleg halogenat de l’HPI en diferents condicions experimentals a fi de trobar les més adients. Estàn descrites dues rutes sintètiques que condueixen a la formació de l’HPI halogenat en la posicióo 3a, conduint cadascuna a un diastereòmer distint. A més, en la formació de l’enllaç entre el C3a de l’HPI i el N indòlic del Trp, s’han escollit els grups protectors més adients i amb ortogonalitat entre ells per al creixement ordenat i selectiu del sistema Trp-HPI. En el capítol 2 s’inicia la síntesis de la mayotlida. En primer lloc, s’ha estudiat la formació de l’anell A, que és l’anell petit de la mayotlida. L’anell A és un macrocicle de tretze puntes format per tres aminoàcids: un Trp, l’HPI i l’Ile. S’han assajat tres posicions de macrociclació per a comprovar el punt idoni per tancar l’anell. S’ha determinat l’estereoquímica relativa dels estereocentres d’aquest anell mitjançant experiments de RMN mono i bidimensionals. La segona part d’aquest capítol es dedica a la formació del segon macrocicle, que anomenem anell B. S’ha sintetitzat, en fase sòlida, la cadena lineal pentapeptídica que unida als grups àcid i amina de l’anell A conduirà a l’anell B de la mayotlida. S’ha acoblat aquesta cadena amb l’anell A i s’ha realitzat la macrociclació de l’anell B per fornir la mayotlida. S’ha comparat la mayotlida sintètica amb la natural, coeluint ambdues al mateix temps. En el capítol 3 s’ha plantejat la síntesi de dos anàlegs de la mayotlida, els quals tenen la mateixa seqüència peptídica que l’anell B de la mayotlida i es diferèncien en que no tenen l’enllaç Trp-HPI, és a dir, no contenen l’anell A en la seva estructura; a més, un d’ells té un Trp enlloc de l’HPI. Endemés, s’ha assajat l’activitat de l’anell A de la mayotlida i d’un dels anàlegs sintetitzats. / Marine natural products research is interesting because marine species (micro- and macroorganisms) biosynthesize compounds with different chemical structures and bioactivities from terrestrial natural products. Mayotlide is a marine natural product; it was isolated by Pharmarmar from a sample of Spongia sp. Mayotlide shows a nanomolar GI50 activity. Structurally, mayotlide is an octapeptidic system and it has the characteristic trait: the bond between Trp’s – the N-indole of a Trp and the C3a of a cycled Trp: a hexahydropyrroloindole unit (HPI). Few natural products contain this Trp-HPI system in their structures until the moment, and mayotlide is the first example of a bis-macrocyclic compound with this bond. The chapter 1 of the manuscript studies the synthesis of tryptophan-pyrroloindole system, which requires the reaction between a Trp and a halogenated HPI. Two synthetic routes have been reported to afford the halogenated HPI at C3a, each of which afford one mainly different diastereomer. In addition, the most suitable orthogonal protecting groups have been selected to allow the selective growing from the Trp-HPI system. The chapter 2 is about the beginning of the synthesis of mayotlide. First, the synthesis of the A ring has been studied, which is the small ring of mayotlide. The A ring is composed of three amino acids: Trp, Ile, and HPI. Three closing points of macrocycle have been tested. Several mono and bidimensional NMR experiments have made relative stereochemistry of stereocenters possible. The second half of this chapter is about the second macrocycle formation. The elongation of peptide chain of mayotlide has been synthesized on solid phase. Then, the couplings between the peptide chain and the A ring have been performed, affording the synthetic mayotlide. The natural and synthetic mayotlide have coeluted at the same time in a HPLC. The syntheses of two analogues of mayotlide have been studied in chapter 3. The structures of these analogues are one cycle which contain the same peptide sequence of the B ring of mayotlide; one of them has change the HPI for a Trp. In addition, the activities of the A ring and one analogue have been tested.

El virus C (GBV-C) o virus de la hepatitis G (HGV) está relacionado con el virus de la hepatitis C (HCV) ya que tiene una organización genómica y una homología en la secuencia muy próxima pero, sin embargo, no parece causar hepatitis ni ningún otro tipo de patología. En los últimos años, se han publicado numerosos trabajos en los que se asocia la co-infección del GBV-C/HGV y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) con una menor progresión de la enfermedad causada por el virus VIH así como con una mayor supervivencia de los pacientes una vez que el SIDA se ha desarrollado. Basándonos en un modelo de co-infección, existen diversas teorías de cómo el virus de la hepatitis G puede influir en la enfermedad del VIH, se cree que puede inducir las quemoquinas, regular negativamente los co-receptores del VIH, así como provocar otros efectos indefinidos en los linfocitos huésped. Pero el mecanismo responsable del efecto beneficioso que el GBV-C/HGV tiene sobre el curso de la infección causada por VIH no está todavía definido. Teniendo en cuenta el posible uso de los péptidos sintéticos, el objetivo de la actual tesis doctoral es llevar a cabo la selección de péptidos de la proteína de envoltura E1 del GBV-C/HGV con potencial capacidad de inhibición del péptido de fusión del VIH-1, mediante la síntesis múltiple en paralelo de secuencias peptídicas lineales que cubren la totalidad de la estructura primaria de esta proteína y su posterior evaluación mediante ensayos biofísicos. Con ello se pretende plantear la utilización de péptidos sintéticos del GBV-C/HGV en el diseño de inhibidores de la entrada del VIH en la célula huésped. Se pretende así tratar de comprender mejor el efecto de la presencia de anticuerpos anti-GBV-C/HGV en la progresión de la enfermedad causada por la infección del VIH y de profundizar en el conocimiento actual acerca de la interacción entre estos dos virus. Se realiza la síntesis en fase sólida de 58 péptidos correspondientes a la proteína de envoltura E1 del GBV-C/HGV y mediante el ensayo de liberación de contenidos vesiculares se seleccionan 5 péptidos capaces de inhibir la capacidad del péptido de fusión (PF) del VIH-1 de formar poros en las membranas. Se realizan estudios detallados de los péptidos y de la inhibición del proceso de fusión, inducido por el péptido de fusión del VIH-1, por parte de secuencias del GBV-C/HGV. Para ello se realizan estudios de citotoxicidad, ensayos de hemólisis, estudio de la estructura mediante dicroísmo circular, ensayos de agregación de liposomas inducida por los péptidos y ensayos de transferencia de energía por resonancia. Por otra parte se realizan ensayos utilizando monocapas de extensión como modelos de membrana mediante la técnica de Langmuir-Blodgett, y se calculan las concentraciones superficial de exceso y las de saturación, información que servirá para conocer la capacidad de los péptidos para formar monocapas estables en la interfase aire/agua. Los diferentes ensayos muestran una interacción de los péptidos de la proteína E1 con el péptido de fusión del VIH-1, dando lugar a una inhibición de la actividad que el péptido de fusión del VIH-1 tiene sobre las membranas lipídicas. Esto sugiere que estos péptidos pueden ser candidatos para ser utilizados en futuras terapias antivirales. / "BIOPHYSICAL STUDIES OF SYNTHETIC PEPTIDES OF THE ENVELOPE PROTEIN E1 OF GBV-C/HGV AND ITS RELATIONSHIP WITH HIV" The virus C (GBV-C) or hepatitis G virus (HGV) is related to hepatitis C virus (HCV) because it has similar genome organization and sequence homology; however, it does not seem to cause hepatitis or any other pathology. In recent years, there have been several studies in which the GBV-C/HGV and human immunodeficiency virus (HIV) co-infection is associated with less progression of the disease caused by HIV as well as improved survival of patients after AIDS has developed. Based on a model of co-infection, there are several theories of how the hepatitis G virus can affect HIV disease: it could induce chemokines, negatively regulate the HIV co-receptors and cause other undefined effects in the host cell. But the mechanism responsible for the beneficial effect that GBV-C/HGV has over the course of infection by HIV is not yet defined. Taking into account the possible use of synthetic peptides, the aim of the present thesis is to carry out the selection of peptides from the envelope protein E1 of GBV-C/HGV with potential ability to inhibit the HIV-1fusion peptide. The aim is to better understand the effect of the presence of antibodies anti-GBV-C/HGV in the progression of AIDS and to study the interaction between these two viruses. The solid phase synthesis of 58 peptides corresponding to the envelope protein E1 of GBV-C/HGV was made and 5 peptides capable of inhibiting the ability of the fusion peptide (FP) of HIV-1 to form pores in membranes were selected by means of the leakage of vesicular contents assay. Detailed studies of the E1 peptides and their ability to inhibit the fusion process induced by the fusion peptide of HIV-1 were done. Monolayers and liposomes were used as model membranes. The different tests show an interaction of the E1 peptides with the HIV-1fusion peptide, resulting in an inhibition of the activity that the fusion peptide has on lipid membranes. This suggests that these peptides could be good candidates for future antiviral therapies.

Els pèptids són biopolímers naturals amb una importància cabdal en el cos humà, actuant com a neurotransmissors, endorfines o hormones. Recentment, s’han descobert propietats molt interessants de pèptids amb aplicacions científiques en camps tan diversos, com ara cosmètica, biotecnologia o química terapéutica. En el darrer cas, destaquen especialment certs pèptids d’origen marí amb una considerable activitat antitumoral, alguns dels qual es troben actualmente en avançades fases clíniques. Amb la intenció de millorar les propietats farmacològiques i farmacocinètiques dels pèptids bioactius, es dissenyen anàlegs que sovint impliquen una dificultat sintètica afegida. En aquest escenari, resulta bàsic comptar amb eines químiques adequades i potents. La present tesi doctoral s’enmarca en el desenvolupament de nous reactius d’aplicació en metodologia de síntesi peptídica. Les mol•lècules que presenten grups N-hidroxilamina àcids tenen un gran rellevància en metodologia de síntesi de pèptids, degut al seu excel•lent caràcter com a grup de sortida en substitucions nucleofíliques. D’entre les diverses famílies que formen aquest grup cal esmentar els benzotriazols, tals com HOBt i HOAt, i les sals d’oni derivades. No obstant, en els darrers anys s’ha conegut la seva tendència a descomposar de manera explosiva en escalfar o sota impacte mecànic, raó per la qual el transport d’aquests reactius per aire s’ha vist restringit o prohibit. Amb la necessitat de disposar d’una nova família de N-hidroxilamines eficient i segura, s’ha posat l’atenció en una classe d’oximes amb substituents electroatraients, que mostren una acidesa en el rang necessari per ser aplicades en la formació de l’enllaç peptídic. Particularment interessant resulta el 2-ciano-2-hidroxiiminoacetat d’etil, reanomenat en aquesta tesi com a Oxyma, que combina de forma òptima estabilitat, reactivitat i disponibilitat comercial. En la present tesi doctoral s’ha estudiat el comportament d’Oxyma i les sals d’uroni (COMU) i fosfoni (PyOxim) derivades, en comparació amb HOBt, HOAt i els corresponents reactius d’acoblament. Els resultats obtinguts mostren un notable increment de la solubilitat, disminució de l’epimerització i augment de l’eficiència d’acoblament quan s’usen reactius basats en Oxyma, sent en models impedits estèricament fins i tot més eficaços que els anàlegs de HOAt. A més, s’ha investigat el perfil de descomposició de Oxyma i COMU, en comparació amb els dels benzotriazols, mitjançant els assajos calorimètrics DSC i ARC. Els resultats permeten concloure que els reactius d’acoblament basats en Oxyma mostren una cinètica de descomposició radicalment oposada a la dels benzotriazols, tot alliberant menys pressió i per tant, el risc tèrmic és també molt menor. Per últim, s’ha comprovat la compatibilitat dels reactius basats en Oxyma amb irradiació per microones. El caràcter de bon grup sortint de les oximes àcides s’ha reafirmat en la síntesi i evaluació de carbonats actius per a la introducció dels grups protectors Fmoc i Alloc. De manera especial, els derivats de ciano-2-piridino oxima van mostrar un alt rendiment amb una formació pràcticament nul•la de dipèptids. Així mateix, l’elevada acidesa d’Oxyma es pot aplicar també en la prevenció de reaccions secundàries catalitzdes per base, com ara aspartimides i piperidides. En aquest sentit, Oxyma indueix una minimització d’aquesta ciclació intramol•lecular i altres reaccions indesitjades causades per la presència de base en una extensió major que HOBt i HOAt. D’altra banda, la reïna 2-clorotritil, utilitzada en la obtenció de pèptids àcid C-terminal protegits, s’ha mostrat estable a tractament d’Oxyma sempre i quan aquests no superin les 24 hores, moment en el que el percentatge de pèptid escindit del suport polimèric pot pujar fins 5%, similar o inferior a l’efecte originat amb tractament de HOBt i HOAt. / Peptides are naturally-ocurring biopolymers that exert essential functions in the human body. Moreover, many applications of peptides have been found recently in cosmetics, biotechnology, drug delivery or medicinal chemistry. Some marine peptidic natural products, in example, show remarkable antitumoral activity and are currently on Phase II clinical trials. Reinforcing available methodological tools in peptide synthesis is basic to overcome the synthetic challenges that pose sophisticated, drug-like peptides. Nowadays, this feature is more relevant since peptide science is facing the fall of N-hydroxybenzotriazoles, such as HOBt and HOAt, as carbodiimide additives due to their explosive potential. The present doctoral manuscript aims at developing novel efficient and safe coupling reagents with application in methodology of peptide synthesis. Organic compounds containing acidic N-hydroxylamine moieties are of great utility in peptide synthesis. Our attention was drawn to a series of stable, highly acidic oximes bearing electron-withdrawing substituents. Among these, ethyl 2-cyano-2-hydroxyiminoacetate (renamed as Oxyma) displays an appropriate balance of stability, reactivity, racemization suppression and comercial availability. Based on promising preliminary reports, an exhaustive study on Oxyma and novel derived onium salts, such as COMU or PyOxim, was undertaken. Results showed a remarkable increase on solubility, epimerization reduction and coupling efficiency when Oxyma and the derived reagents were employed. Moreover, DSC and ARC calorimetric assays, proved that Oxyma-based reagents present slower decomposition kinetics combined with lower termal risk than benzotriazoles. Finally, Oxyma-containing reagents proved to be compatible with microwave. The extraordinary leaving group ability of such acidic oximes was confirmed in the synthesis and evaluation of active carbonates for the introduction of Fmoc and Alloc. Use of Cyano-2-pyridine oxime analogues resulted in high yield of Fmoc-amino acid with minimal dipeptide formation. In addition, the high acidity of Oxyma can be also applied to prevention of base-driven side reactions, like aspartimides or Pro-based overcoupling, in which Oxyma induced a stronger minimization than HOBt and HOAt. Moreover, extremely acid-labile 2-chlorotrityl resin proved to be stable to Oxyma treatments shorther than 24 hours, when the percentage of released peptide rises to 5%, a similar or lower effect to that originated by HOBt and HOAt treatments.

La capacidad de Mycobacterium tuberculosis para sobrevivir dentro del macrófago contribuye grandemente a su patogenicidad, latencia y persistencia durante la infección. Este bacilo induce alteraciones en el ambiente intrafagosomal e inhibe la maduración del fagosoma, favoreciendo su supervivencia intracelular. M. tuberculosis PknG secuestra al macrófago precisamente al evitar la fusión fagosoma-lisosoma. En este sentido, PknG representa una familia de dianas novedosas para enfrentar la necesidad de nuevos antimicrobianos para la tuberculosis latente. Aquí, apuntamos a: (i) elucidar la base estructural-molecular del ATP y Mg2+ como cofactores de PknG; (ii) caracterizar los parámetros cinéticos que gobiernan la formación del complejo PknG:ATP; e, (iii) identificar péptidos capaces de unirse a PknG para investigar experimentalmente su interactoma usando enfoques combinatorios como “Phage Display”. Nuestros resultados confirman que PknG se une exclusivamente al ATP con una constante de disociación (KD) de 108.8  22.9 µM. El Mg2+ estabiliza térmicamente a PknG de forma ATP-dependiente. Análisis de estado pre-estacionario muestran que la unión y disociación del ATP es rápida en el complejo PknG:ATP. Usando PknGN-Ext, TPR resolvimos la estructura cristalina en el estado unido al ADP mientras que demostramos que el ATP imposibilita la cristalización. Los análisis bioinformáticos de las librerías enriquecidas por Phage Display identificaron 57 potenciales peptidos que interactuarían con PknG. Una comparación cercana con el proteoma de M. tuberculosis proporcionó un subconjunto de 20 proteínas que podrían interactuar con PknG. Nuestros resultados confirmaron cinco proteínas asociadas a PknG previamente reportadas: PknG, DnaK chaperona, transportador ABC Rv1747, Proteína Ribosomal L23 y Factor de Elongación Tu, resaltando la validez de nuestra plataforma para descubrir el interactoma de PknG. Así, nuestros resultados revelan interacciones proteína-proteína putativas que podrían participar en la supervivencia micobacteriana, mientras que también proporcionan bases sólidas para desarrollar drogas antituberculosas al interrumpir estas interacciones o explotar estos peptidos tipo compuesto líder. / The ability of Mycobacterium tuberculosis to survive inside the macrophage greatly contributes to its pathogenicity, latency and persistence during infection. This bacillus induces alterations in the intraphagosomal environment and inhibits phagosome maturation, thus promoting mycobacterial survival. M. tuberculosis PknG hijacks the macrophage precisely by avoiding phagosome-lysosome fusion. In this sense, PknG represents a family of novel targets to cope with the need for new antimicrobials for latent tuberculosis. Here, we aimed to: (i) elucidate the structural-molecular basis of ATP and Mg2+ as PknG cofactors; (ii) characterize the kinetic parameters governing PknG:ATP complex formation; and, (iii) identify PknG-binding peptides to experimentally query PknG’s interactome using combinatorial approach such as Phage Display. Our results confirm that PknG exclusively binds to ATP with a dissociation constant (KD) of 108.8  22.9 µM. Mg2+ thermally stabilizes PknG in an ATP-dependent manner. Pre-steady-state analyses show that ATP binding and dissociation are rapid in the PknG:ATP complex. Using PknGN-Ext, TPR we solved the ADP-state crystal structure while showing that ATP precludes crystallization. Phage Display and bioinformatic analyses identified 57 potential PknG binders. A close comparison to the M. tuberculosis proteome provided a subset of 20 proteins that may interact with PknG. Our results confirmed five previously reported PknG-associated proteins: PknG, DnaK chaperone, ABC transporter Rv1747, Ribosomal Protein L23 and Elongation Factor Tu, highlighting our platform’s validity to uncover the PknG interactome. Altogether, our results reveal putative protein-protein interactions that may play a role in mycobacterial survival, while also providing solid bases for the development of anti-tuberculosis drugs by disrupting these interactions or exploiting these lead-like peptide molecules. / Tesis