Berlin, Techn. Univ., Diss., 2004. / Computerdatei im Fernzugriff.

Thesis (Ph.D.)--University of Nebraska-Lincoln, 2007. / Title from title screen (site viewed Mar. 27, 2008). PDF text: xxiii, 235 p. : ill. (some col.) ; 3 Mb. UMI publication number: AAT 3284719. Includes bibliographical references. Also available in microfilm and microfiche formats.

Frankfurt (Main), Universiẗat, Diss., 2008. / Erscheinungsjahr an der Haupttitelstelle: 2007.

Stuttgart, Univ., Diss., 2002.

Konstanz, Univ., Diss., 2006.

Orientador: Luciana Gonzaga de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-22T05:28:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rampasio_RaquelRodrigues_M.pdf: 2052024 bytes, checksum: 07f4cd2fcba87af264e6efceab06d527 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Epóxidos enantiopuros e dióis vicinais têm sido utilizados na síntese de inúeras moléculas bioativas. Dessa forma, as epóxido-hidrolases microbianas capazes de hidrolisar enantioseletivamente epóxidos racêmicos emergiram como uma alternativa promissora na obtenção destes compostos. Recentemente, a linhagem P. stipitis CCT 2617 foi selecionada por apresentar atividade hidrolítica frente a epóxidos terminais e teve seu genoma completo publicado. Assim, esta levedura foi selecionada para o trabalho de clonagem e expressão de sua epóxido hidrolase. Neste trabalho, a clonagem do gene SEH1, que codifica para a epóxido hidrolase de P. stipitis, foi efetuada com sucesso em P. pastoris, tanto no vetor pPICZa A, quanto no vetor pPICZ B. A clonagem da proteína com a cauda de histidina deve auxiliar na detecção da expressão. A detecção de uma banda, referente a uma proteína de 46 kDa, no gel de eletroforese foi um indício de que a expressão da enzima SEH (contendo o fator a) ocorreu, porém, não conseguimos reproduzir este resultado posteriormente. Além disso, buscamos melhores alternativas para a detecção da atividade enzimática, como o teste de adrenalina e o ensaio baseado em substrato fluorogênico, que devem ser aperfeiçoados para a utilização com células íntegras. A modelagem computacional da estrutura tridimensional da PSEH resultou em um modelo contendo 40% de hélices a e 12% de folhas b. Determinamos que os resíduos que devem fazer parte do sítio ativo são Tyr319, Asp209, Asp352 e His383 e, tendo em vista que a PSEH deve se apresentar na forma de um homodímero com sítio ativo similar ao das EHs de P. aeruginosa, A. radiobacter e A. niger, nossa hipótese é que esta enzima deve hidrolisar epóxidos pouco volumosos e aromáticos com algum nível de enantiosseletividade / Abstract: Enantiopure epoxides and vicinal diols have been used to prepare a number of bioactive molecules. Thus, the microbial epoxide hydrolases able to enantioselectivity hydrolyze racemic epoxides emerged as a promising alternative in the synthesis of these compounds. Recently, the P. stipitis CCT2617 strain was selected due to the presence of hydrolytic activity against terminal epoxides and had its genome completely described. Therefore, this yeast was selected for cloning and expression of the gene SEH1, which was annoted as epoxide hydrolase. In this work, the cloning of SEH1 gene, codifying for the epoxide hydrolase of P. stipitis, was done with success in P. pastoris, both in pPICZa A and pPICZ B vectors. The cloning of the protein with a histidine tag should help in the detection of expression. The detection of a protein with 46 kDa evidenced that the expression of SEH enzyme (containing the a factor) is occurring, however, this result was not reproducible due to the sample degradation. Furthermore, better alternatives for the detection of enzyme activity were performed, as adrenaline test and fluorogenic assay, which must be optimized for application with whole cells. The 3D structure computational modeling of PSEH resulted in a model that contains 40% of a helices and 12% of b sheets. Our hypothesis is that the residues that make part of the active site are Tyr319, Asp209, Asp352 and His 383. And, considering that the PSEH should be in the homodimeric form with an active site similar to that of the EHs of P. aeruginosa, A. radiobacter and A. niger, this enzyme should hydrolyze small and aromatic epoxides probably with some enantioselectivity / Mestrado / Quimica Organica / Mestre em Química

Orientador: Márcia Justino Rossini Mutton / Resumo: A utilização de biomassa lignocelulósica para produzir biocombustíveis, como o etanol, pode fornecer uma alternativa sustentável aos combustíveis fósseis. Os bagaços de sorgo sacarino e sorgo biomassa são considerados matérias-primas lignocelulósicas potenciais para a produção de etanol por meio de pré-tratamento, hidrólise enzimática e fermentação. Um dos entraves do processo é a utilização de microrganismos capazes de metabolizar pentoses e fermentarem em altas temperaturas. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo avaliar as condições de adaptação e o desempenho fermentativo das estirpes de leveduras (LJ04 e Pichia kudriavzevii LJ03), em temperaturas de 37Cº e 40ºC, para produção de etanol de segunda geração, a partir de hidrolisados de bagaço de sorgo sacarino (Malibu J53 e Malibu A1001) e sorgo biomassa (Palo Alto) pré-tratados com explosão à vapor catalisada com ácido. Os bagaços dos genótipos foram avaliados quanto a composição química e rendimentos dos açúcares recuperáveis. Testes fermentativos foram realizadas com as leveduras Pichia kudriavzevii LJ03 e LJ04, nas temperaturas de 37ºC e 40ºC para avaliar três meios de cultivo com diferentes teores de hidrolisado (Meio 1 – 0%; Meio 2 – 33%; Meio 3 - 50%) durante 120 horas de fermentação. A partir do melhor meio de cultivo, fermentações em bioerreatores foram realizadas com as condições estabelecidas, em 96 horas de fermentação. Os resultados evidenciaram a eficiência do pré-tratamento e da hidrólise enzimática... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Lignocellulosic biomass to produce biofuels such as ethanol may provide a sustainable alternative to fossil fuels. Sweet sorghum bagasse is considered a potential lignocellulosic raw material for the production of fuel ethanol by means of pretreatment, enzymatic hydrolysis and fermentation. One of the difficult to the process is the use of microrganisms capable of metabolizing pentoses and fermenting at high temperatures. In this context, this work aimed to evaluate the adaptation conditions and fermentative performance of two yeast strains (LJ04 and Pichia kudriavzevii LJ03), at temperatures of 37º and 40ºC, for production of second generation ethanol from hydrolysates of Sweet sorghum bagasse (Malibu J53 and Malibu A1001) and Sorghum biomass (Palo Alto) pretreated with acid catalyzed steam explosion. Bagasse from those genotypes was evaluated for chemical composition and recoverable sugar yields. Fermentation tests were performed with Pichia kudriavzevii LJ03 and LJ04 yeast strain at 37ºC and 40ºC to evaluate three culture media with different hydrolyzed liquor contents (Medium 1 - 0%; Medium 2 - 33%; Medium 3 - 50%) during 120 hours of fermentation. After that, the best culture medium was chosen, fermentation in bioreactors were performed under the established conditions, in 96 hours of fermentation. The results showed the efficiency of pretreatment and enzymatic hydrolysis and the recovery of sugars without the formation of inhibitors. Strain LJ04 was classified as Pichia... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Pichia pastoris is a methylotrophic yeast gaining acclamation for its capabili ties in heterologous protein expression. In contrast to other host organisms such as bacteria or mammalian cells, P. pastoris offers many advantages over its counterparts. For example, P. pastoris is cost-effective in that it can grow to high cell densities on simple media. The optional use of a constitutive (GAP) or inducible (A OXI) promoter and the ab ility to perfo1m post-translational protein modifications are additional qualities that make for a powerful heterologous expression system. This study focuses on harnessing the benefits described to develop a high-throughput reporter system for the screening of potential super-secreting mutant strains of P. pastoris. Plasmid constructs were engineered with the lacZ reporter gene, which encodes for the β-galactosidase protein, and fused to the S. cerevisiae MATa signal sequence. Expression plasmids were successfully transformed in P. pastoris strain yGS 115 followed by induction. Western blot analyses confirm the expression of β-galactosidase and colorimetric activity assays further validate enzymatic function. A mutant library containing cis- and/or trans-acting mutations was created by treating P. pas loris clones harboring the β-galactosidase expression plasmid with ultraviolet (UV) radiation. A colorimetric plate assay was combined with a replica-plating system that enabled the screening of thousands of potential super-secreting mutant colonies in a high-throughput format. This study sheds light onto our current understanding of secretion in yeast and further contributes to developing P. pastoris into a valuable heterologous protein expression system.

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Würzburg, Univ., Diss., 2008. / Zsfassung in engl. Sprache.