Orientador: Luciana Gonzaga de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-27T15:18:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gonzalez_GabrielaDesireeTormet_M.pdf: 4315214 bytes, checksum: c9035c7fc38805f3a9804bc69a845c1e (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Epóxido-hidrolases pertencem a um amplo grupo de enzimas hidrolíticas encontradas em todos os tipos de organismos vivos, incluindo insetos, plantas e micro-organismos. Agem sobre uma variedade de epóxidos convertendo-os aos respectivos dióis. As epóxido-hidrolases são de grande interesse para aplicação em biotecnologia uma vez que podem levar à obtenção de epóxidos e dióis enantiomericamente puros como uma alternativa à aplicação dos catalisadores químicos. Neste estudo foram produzidas e caracterizadas funcional e estruturalmente epóxido-hidrolases de dois tipos: uma ?,?-hidrolase (B1EPH2) anotada do genoma de Streptomyces sp B1 e várias hidrolases-ciclases análogas à limoneno epóxido hidrolase (LEH) denominadas enzimas B. As enzimas B são encontradas nos agrupamentos de genes que participam da biossíntese de poliéteres como lasalocida, nigericina, nanchangmicina, tetronasina, tetronomicina e salinomicina. As enzimas B atuam no mecanismo de ciclização oxidativa que origina os anéis do tipo pirano e furano presentes nesses compostos. Todos os genes foram clonados e expressos com sucesso em E. coli BL21(DE3). As enzimas foram purificadas via cromatografia por afinidade. A atividade das enzimas como epóxido-hidrolases foi avaliada utilizando-se o teste de adrenalina. Observou-se que todas as enzimas apresentaram ampla atividade catalítica na hidrólise de epóxidos com diferentes características estruturais; ao contrário da LEH, as enzimas B apresentaram alta capacidade de aceitação por substratos. As estruturas secundárias e terciárias destas enzimas foram previstas por análise in silico e por medições do espectro de dicroísmo circular. As estruturas tridimensionais de algumas enzimas B, assim como a previsão dos resíduos que compõem o sítio ativo, foram obtidas através de estudos de difração de raios-X, evidenciando a similaridade estrutural das enzimas B à LEH / Abstract: Epoxide hydrolases are hydrolytic enzymes found in all living organisms, including insects, plants and microorganisms. Such enzymes act promoting the conversion of a variety of epoxides to the corresponding diols. Epoxide hydrolases are of great interest in biotechnological applications as an alternative to chemical catalysts since it can lead to enantiomerically pure epoxides and diols. This study details the production and structural and functional characterization of one ?,?-hydrolase (B1EPH2) annotated from genome of Streptomyces sp B1 and several hydrolases-cyclases similar to limonene epoxide hydrolase (LEH) named B enzymes. B enzymes are found in biosynthetic gene clusters of polyether antibiotic as lasalocid, nigericin, nanchangmycin, tetronasin, tetronomycin and salinomycin. They are known to participate in the oxidative cyclization process leading to the formation of the pyran and furan rings present in these compounds. All genes were successfully cloned and expressed into E. coli BL21(DE3). The enzymes were purified by affinity chromatography and the activity as epoxide hydrolase was evaluated using the adrenaline fingerprint test. All enzymes showed wide catalytic activity towards the hydrolysis of epoxides with diverse structural features; unlike LEH, B enzymes have high range substrate acceptance. Secondary and tertiary structures of these enzymes were predicted by in silico analyses and circular dichroism spectrum measurements. Three-dimensional structures of some of the B enzymes as well as the prediction of the active site residues were obtained throughout X-ray diffractometry endorsing structural similarities of B enzymes and LEH / Mestrado / Quimica Organica / Mestra em Química

Orientadores: Anete Pereira de Souza, Valéria Maia Merzel / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T03:05:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Beloti_LilianLuzia_D.pdf: 11283696 bytes, checksum: dfedaea17b072c7d899caa1ccd4e9032 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The complete abstract is available with the full electronic document / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Luciana Gonzaga de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-22T05:28:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rampasio_RaquelRodrigues_M.pdf: 2052024 bytes, checksum: 07f4cd2fcba87af264e6efceab06d527 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Epóxidos enantiopuros e dióis vicinais têm sido utilizados na síntese de inúeras moléculas bioativas. Dessa forma, as epóxido-hidrolases microbianas capazes de hidrolisar enantioseletivamente epóxidos racêmicos emergiram como uma alternativa promissora na obtenção destes compostos. Recentemente, a linhagem P. stipitis CCT 2617 foi selecionada por apresentar atividade hidrolítica frente a epóxidos terminais e teve seu genoma completo publicado. Assim, esta levedura foi selecionada para o trabalho de clonagem e expressão de sua epóxido hidrolase. Neste trabalho, a clonagem do gene SEH1, que codifica para a epóxido hidrolase de P. stipitis, foi efetuada com sucesso em P. pastoris, tanto no vetor pPICZa A, quanto no vetor pPICZ B. A clonagem da proteína com a cauda de histidina deve auxiliar na detecção da expressão. A detecção de uma banda, referente a uma proteína de 46 kDa, no gel de eletroforese foi um indício de que a expressão da enzima SEH (contendo o fator a) ocorreu, porém, não conseguimos reproduzir este resultado posteriormente. Além disso, buscamos melhores alternativas para a detecção da atividade enzimática, como o teste de adrenalina e o ensaio baseado em substrato fluorogênico, que devem ser aperfeiçoados para a utilização com células íntegras. A modelagem computacional da estrutura tridimensional da PSEH resultou em um modelo contendo 40% de hélices a e 12% de folhas b. Determinamos que os resíduos que devem fazer parte do sítio ativo são Tyr319, Asp209, Asp352 e His383 e, tendo em vista que a PSEH deve se apresentar na forma de um homodímero com sítio ativo similar ao das EHs de P. aeruginosa, A. radiobacter e A. niger, nossa hipótese é que esta enzima deve hidrolisar epóxidos pouco volumosos e aromáticos com algum nível de enantiosseletividade / Abstract: Enantiopure epoxides and vicinal diols have been used to prepare a number of bioactive molecules. Thus, the microbial epoxide hydrolases able to enantioselectivity hydrolyze racemic epoxides emerged as a promising alternative in the synthesis of these compounds. Recently, the P. stipitis CCT2617 strain was selected due to the presence of hydrolytic activity against terminal epoxides and had its genome completely described. Therefore, this yeast was selected for cloning and expression of the gene SEH1, which was annoted as epoxide hydrolase. In this work, the cloning of SEH1 gene, codifying for the epoxide hydrolase of P. stipitis, was done with success in P. pastoris, both in pPICZa A and pPICZ B vectors. The cloning of the protein with a histidine tag should help in the detection of expression. The detection of a protein with 46 kDa evidenced that the expression of SEH enzyme (containing the a factor) is occurring, however, this result was not reproducible due to the sample degradation. Furthermore, better alternatives for the detection of enzyme activity were performed, as adrenaline test and fluorogenic assay, which must be optimized for application with whole cells. The 3D structure computational modeling of PSEH resulted in a model that contains 40% of a helices and 12% of b sheets. Our hypothesis is that the residues that make part of the active site are Tyr319, Asp209, Asp352 and His 383. And, considering that the PSEH should be in the homodimeric form with an active site similar to that of the EHs of P. aeruginosa, A. radiobacter and A. niger, this enzyme should hydrolyze small and aromatic epoxides probably with some enantioselectivity / Mestrado / Quimica Organica / Mestre em Química

Orientador: Anita Jocelyne Marsaioli / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-27T18:00:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_BrunaZucolotoda_D.pdf: 6212345 bytes, checksum: ec8b84a214cbc377e0f9f13d33ddc561 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Os processos biocatalíticos foram abordados nesta tese de doutorado deste a triagem de micro-organismos para a seleção de biocatalisadores adequados até o uso de enzimas isoladas em reações de interesse biotecnológico. O primeiro capítulo apresenta o isolamento, identificação e a triagem enzimática de bactérias heterotróficas isoladas de rejeitos de mineração de cobre. A partir destas amostras foi possível isolar 189 bactérias, as quais apresentaram uma diversificada atuação catalítica. As bactérias isoladas foram identificadas por MALDI-TOF e por sequenciamento do gene RNAr 16S sendo encontrados diversos gêneros como Bacillus, Acinetobacter, Pseudomonas, Delftia, Stenotrophomonas, Hydrogenophaga, Rhodococcus, entre outros. O segundo capítulo apresenta o estudo do potencial catalítico de uma nova epóxido hidrolase de Aspergillus brasiliensis CCT1435, recombinante e expressa em E. coli. Esta EH é ativa em uma ampla faixa de pH e temperatura, apresentando um desempenho ótimo em pH 6,0 e 30 °C. Este trabalho ainda permitiu uma avaliação detalhada da aplicação biocatalítica desta EH na hidrólise do óxido de estireno em meio aquoso e bifásico. Por fim, o terceiro capítulo apresenta resultados preliminares envolvendo um processo quimio-enzimático para a produção de alcalóides pirrolidínicos a partir das respectivas 1,4-dicetonas. Esta metodologia é promissora uma vez que diversas 1,4-dicetonas foram convertidas nas suas respectivas iminas cíclicas, sendo que a subsequente etapa de redução com NaBH3CN promoveu a formação das pirrolidinas de interesse. Portanto, esta tese de doutorado apresenta um estudo amplo e diversificado envolvendo processos biocatalíticos aplicados em uma série de reações de interesse biotecnológico / Abstract: Biocatalytic processes have been addressed in this thesis from the microorganism screening for the selection of suitable biocatalysts to the use of isolated enzymes in biotechnological reactions. The first chapter presents the isolation, identification and enzymatic screening of heterotrophic bacteria isolated from copper mine drainages. From these samples, 189 bacteria were isolated, which showed diverse catalytic activities. The isolated bacteria were identified by MALDI-TOF and 16S rRNA gene sequencing and several genera were found: Bacillus, Acinetobacter, Pseudomonas, Delftia, Stenotrophomonas, Hydrogenophaga, Rhodococcus, among others. The second chapter presents the catalytic potential of a new epoxide hydrolase from Aspergillus brasiliensis CCT1435 (AbEH), recombinant and expressed in E. coli. This EH is active in a wide pH and temperature range, with a great performance at pH 6.0 and 30 °C. This work also presents the AbEH biocatalytic application for the styrene oxide hydrolysis in aqueous and biphasic media. Finally, the third chapter presents preliminary results involving a chemo-enzymatic method for the production of pyrrolidine alkaloids from the corresponding 1,4-diketones. This approach is promising since several 1,4-diketones were converted to their respective cyclic imines, and the subsequent reduction with NaBH3CN promoted the pyrrolidines formation. Therefore, this thesis presents a broad and diverse study of biocatalytic processes applied in a number of interesting biotechnological reactions / Doutorado / Quimica Organica / Doutora em Ciências