Orientador: Anita Jocelyne Marsaioli / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-27T18:00:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_BrunaZucolotoda_D.pdf: 6212345 bytes, checksum: ec8b84a214cbc377e0f9f13d33ddc561 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Os processos biocatalíticos foram abordados nesta tese de doutorado deste a triagem de micro-organismos para a seleção de biocatalisadores adequados até o uso de enzimas isoladas em reações de interesse biotecnológico. O primeiro capítulo apresenta o isolamento, identificação e a triagem enzimática de bactérias heterotróficas isoladas de rejeitos de mineração de cobre. A partir destas amostras foi possível isolar 189 bactérias, as quais apresentaram uma diversificada atuação catalítica. As bactérias isoladas foram identificadas por MALDI-TOF e por sequenciamento do gene RNAr 16S sendo encontrados diversos gêneros como Bacillus, Acinetobacter, Pseudomonas, Delftia, Stenotrophomonas, Hydrogenophaga, Rhodococcus, entre outros. O segundo capítulo apresenta o estudo do potencial catalítico de uma nova epóxido hidrolase de Aspergillus brasiliensis CCT1435, recombinante e expressa em E. coli. Esta EH é ativa em uma ampla faixa de pH e temperatura, apresentando um desempenho ótimo em pH 6,0 e 30 °C. Este trabalho ainda permitiu uma avaliação detalhada da aplicação biocatalítica desta EH na hidrólise do óxido de estireno em meio aquoso e bifásico. Por fim, o terceiro capítulo apresenta resultados preliminares envolvendo um processo quimio-enzimático para a produção de alcalóides pirrolidínicos a partir das respectivas 1,4-dicetonas. Esta metodologia é promissora uma vez que diversas 1,4-dicetonas foram convertidas nas suas respectivas iminas cíclicas, sendo que a subsequente etapa de redução com NaBH3CN promoveu a formação das pirrolidinas de interesse. Portanto, esta tese de doutorado apresenta um estudo amplo e diversificado envolvendo processos biocatalíticos aplicados em uma série de reações de interesse biotecnológico / Abstract: Biocatalytic processes have been addressed in this thesis from the microorganism screening for the selection of suitable biocatalysts to the use of isolated enzymes in biotechnological reactions. The first chapter presents the isolation, identification and enzymatic screening of heterotrophic bacteria isolated from copper mine drainages. From these samples, 189 bacteria were isolated, which showed diverse catalytic activities. The isolated bacteria were identified by MALDI-TOF and 16S rRNA gene sequencing and several genera were found: Bacillus, Acinetobacter, Pseudomonas, Delftia, Stenotrophomonas, Hydrogenophaga, Rhodococcus, among others. The second chapter presents the catalytic potential of a new epoxide hydrolase from Aspergillus brasiliensis CCT1435 (AbEH), recombinant and expressed in E. coli. This EH is active in a wide pH and temperature range, with a great performance at pH 6.0 and 30 °C. This work also presents the AbEH biocatalytic application for the styrene oxide hydrolysis in aqueous and biphasic media. Finally, the third chapter presents preliminary results involving a chemo-enzymatic method for the production of pyrrolidine alkaloids from the corresponding 1,4-diketones. This approach is promising since several 1,4-diketones were converted to their respective cyclic imines, and the subsequent reduction with NaBH3CN promoted the pyrrolidines formation. Therefore, this thesis presents a broad and diverse study of biocatalytic processes applied in a number of interesting biotechnological reactions / Doutorado / Quimica Organica / Doutora em Ciências

Orientador: Andréa Balan Fernandes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T16:02:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pegos_VanessaRodrigues_M.pdf: 19133775 bytes, checksum: abcda42c9097c7e59ea61175934c2304 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A captação de sulfato em Escherichia coli é dependente do transportador do tipo ABC (do inglês, ATP Binding Cassete), SbpCysAWD, pertencente a um regulon que envolve 26 genes. Na ausência de sulfato, a bactéria induz a expressão de dois outros transportadores ABC, o de proteínas do sistema de transporte de alcanosulfonatos (SsuABCDE) e de sulfonatos alifáticos (TauABCDE), que são responsáveis pela captação, incorporação e oxidação destes compostos a sulfito e aldeído. Embora não comprovado funcionalmente, Xanthomonas axonopodis pv. citri apresenta todos os genes envolvidos neste regulon e, neste trabalho, dando continuidade à caracterização do transportador SsuABCDE, foi realizada pela primeira vez, a caracterização estrutural e funcional das enzimas SsuD e SsuE. Análises bioquímicas associadas às análises de bioinformática e modelagem molecular, revelaram que as enzimas SsuD e SsuE constituem um sistema de dois componentes, no qual a SsuD seria a óxido-redutase responsável pela oxidação do NAD(P)H, seguida da redução da FMN. A proteína foi expressa e purificada a partir de células de E. coli com massa molecular de 39 kDa, e se organiza na forma de um octâmero, conforme demonstrado por experimentos de espalhamento de raios X a baixo ângulo e ultra-centrifugação. O modelo da estrutura tridimensional da SsuD revela uma proteína com enovelamento barril-TIM, com conservação de resíduos que permitem a oligomerização e a interação com NAD(P)H, mas não com flavina. Ensaios enzimáticos mostraram que a SsuD liga NADP(Pbp) com alta afinidade (0,21 µM) e é capaz de oxidá-lo conforme os parâmetros cinéticos de Km: 0.1877 µM -1; Kcat: 7,192 s-1; Vmáx: 0.7911 µM/min; Kcat/Km: 3,8 x 107 m-1S-1. Ainda, foram obtidos cristais da SsuD em diferentes condições as quais estão em fase de refinamento. As análises de bioinformática da SsuE sugerem que ela seja a óxido-redutase do sistema. O trabalho ainda mostra a caracterização da proteína Pbp de X. axonopodis, do suposto sistema de transporte de fosfonatos. A Pbp foi expressa com massa molecular de 33 kDa, e as análises espectroscópicas revelaram alterações conformacionais na estrutura secundária na presença de fosfonatos e fosfato, bem como aumentada estabilidade térmica na presença de espermidina, usada nos ensaios de cristalização. Cristais foram obtidos em diferentes condições e devem ser usados para os testes de difração. Os resultados apresentados neste trabalho revelam dados de proteínas e sistemas de X. axonopodis ainda não estudados e serão importantes para direcionar futuros estudos sobre a função destas na bactéria, tanto em condições laboratoriais, como em testes in vivo, durante infecção na planta / Abstract: Sulfur uptake in Escherichia coli is dependent of the ABC transporter SbpCysAWD (ATP Binding Cassete), which belongs to a regulon with 26 genes. In the sulfate absence, the bacteria induces the expression of two other ABC transporters, for alkanesulfonates (SsuABCDE) and aliphatic sulfonates (TauABCDE), which are responsible for the uptake and oxidation of these compounds to sulfite and aldehyde. Although its functionality has been not showed, Xanthomonas axonopodis pv. citri has all the genes involved in this regulon, including the alkanesulfonate transporter and enzymes. In order to continue the characterization of this transport, this work shows for the first time, the structural and functional characterization of the proteins SsuD and SsuE. Biochemical analyses associated to the bioinformatics and molecular modeling tools revealed that the SsuD and SsuE form a two-components system, where SsuD is the oxidoreductase responsible for the NAD(P)H oxidation followed by the FMN reduction. The protein was expressed and purified from E. coli cells with a molecular mass of the 39 kDa and it is organized in a octamer, such was demonstrated by the small angle scattering X-ray and ultracentrifugation assays. The tri-dimensional model of SsuD reveals a TIM barrel folding and conservation of residues that allow the oligomerization and NADP interaction. Enzymatic assays showed a high affinity binding of SsuD and NADP (0,21 µM) and that the protein was able to obtain the cinetic parameters, such as Km: 0.1877µM -1; Kcat: 7,192 s-1; Vmáx: 0.7911 µM/min; Kcat/Km: 3,8x 10-7 m 1S-1. Indeed, SsuD crystals were obtained in different conditions. The work still shows the charactrization of the Pbp protein, from X. axonopodis, believed to be the fosfonate/fosfate binding protein. Pbp was expressed with a molecular mass of 33 kDa, and spectroscopic analyses revealed conformational changes at the secondary structure content in presence of fosfonates, as well as an increased thermal stability in presence of spermidine, which was used for the crystallization trials. Crystals were obtained but still not tested. All results presented in this work can bring some light to the strategies that X. axonopodis uses for growth and infection and they will direct our studies for laboratorial and in vivo analyses / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular