Les molècules MHC de classe II uneixen pèptids generats en l'interior de la cèl.lula i els presenten a les cèl.lules T CD4+, que inicien i regulen la resposta immunitària. Les cadenes a i b que formen les MHC de classe II de nova síntesi, interaccionen amb una chaperona, la cadena invariant (Ii), que estabilitza el plegament dels dímers ab i impedeix la seva unió als pèptids presents en el reticle endoplasmàtic (RE). La interacció amb Ii també permet l'arribada dels complexes MHC II-Ii a la via endocítica on la chaperona es degrada fins que només el segment anomenat CLIP roman unit al solc d'unió a antigen dels dímers ab. L'alliberació del CLIP i la unió amb pèptids antigènics s' afavoreix pel baix pH dels endosomes i és catalitzada per HLA-DM, que estabilitza les MHC II i selecciona els pèptids units més estables. Quan s'ha format el complex MHC II-pèptid, aquest és conduït cap a la superfície cel.lular. En les cèl.lules B s'ha descrit l'expressió de la co-chaperona HLA-DO que interacciona amb el complex MHC II/DM i modula l'acció d'HLA-DM. En les malalties autoimmunitàries específiques d'òrgan, com la diabetis de tipus 1, la resposta autorreactiva destrueix selectivament les cèl.lules epitelials endocrines. En aquestes situacions s'ha descrit l'expressió de MHC II així com l'expressió variable de la cadena invariant (Ii) i HLA-DM, suggerint que la presentació d'epítops críptics per les cèl.lules endocrines podria permetre el manteniment de la resposta autorreactiva. En aquest treball s'ha estudiat aquesta hipòtesi des de dos aproximacions: (i) l'anàlisi del repertori peptídic associat a les MHC II en cèl.lules endocrines mitjançant tècniques d'espectrometria de masses i (ii) la caracterització de la via endocítica on s'associen els lligands a MHC II, per tècniques de microscopia electrònica de transmissió. L'estudi s'ha realitzat sobre el model experimental aconseguit per transfecció estable de la línia cel.lular derivada d'un insulinoma de rata RINm5F, amb els gens de les molècules humanes: HLA-DRB1*0401, Ii i HLA-DM. La transfecció seqüencial dels diferents gens permeté obtenir les cèl.lules endocrines (i) RIN-DR4, (ii) RIN-DR4Ii, (iii) RIN-DR4DM, i (iv) RIN-DR4IiDM. Els resultats mostren que les cèl.lules endocrines reorganitzen la via endocítica amb l'expressió de DR4, Ii i DM, afavorint-se la formació d'endosomes tardans multivesiculars i multilaminars, on es concentren les tres molècules implicades en la presentació d'antigen. En absència de chaperones, els complexes DR4-pèptid de la superfície cel.lular es troben associats a un repertori peptídic inestable i molt heterogeni, on s'identifiquen lligands derivats majoritàriament d' extrems N- i C-terminals de proteïnes citosòliques i que en molts casos no respecten el motiu d'anclatge a DR4. La coexpressió d'Ii permet la detecció d'un major nombre de dímers DR4 fora del RE que es localitzen preferentment a la superfície cel.lular. En absència d'HLA-DM, aquests complexes són inestables i es troben associats a CLIP, tot i que també s'han identificat lligands derivats de proteïnes exògenes i autòlogues. L'expressió d' HLA-DM en absència d'Ii permet la detecció de complexes DR4-pèptid estables amb lligands que respecten el motiu d'anclatge i deriven de proteïnes de membrana i citoplasmàtiques. La màxima eficiència s'aconsegueix amb la coexpressió d'ambdues chaperones. En les cèl.lules DR4IiDM, els dímers DR4 expressats a la superfície són estables i s'associen a un repertori peptídic homogeni en seqüència, longitud i origen, format per lligands autòlegs derivats de proteïnes de la superfície, de la vía secretora i del citoplasma, en algunes ocasions específiques de llinatge. Aquests lligands sempre respecten el motiu d'anclatge a DR4 i difereixen dels identificats en una línia B limfoblastoid homozigota per DR4. Per tant, l'expressió de DR4, Ii i DM en cèl.lules endocrines permet la presentació de pèptids autòlegs, específics de teixit i amb característiques diferents als presentats per cèl.lules amb l'expressió de MHC II constitutiva. Aquests epítops a més de ser condicionats pel llinatge cel.lular, estan influenciats per l'expressió de chaperones i podrien variar durant la resposta autoimmune en l'òrgan diana, condicionant el seu desenvolupament. / MHC class II molecules present peptides to CD4+T cells to iniciate and regulate the immune response. Newly synthetized MHC class II a and b chains interact with a chaperone named invariant chain (Ii) that stabilizes their folding preventing the binding of peptide ligands in the endoplasmic reticulum (ER). The invariant chain targets MHC II-Ii complexes to the endocytic pathway where it is proteolitically degraded leaving a portion of its sequence named CLIP bound to the ab dimers. The exchange of CLIP for stably bound peptides is favoured by the endosomal acidic pH and catalized by another specific chaperone, HLA-DM. Stable MHC II-peptide complexes reach the plasma membrane by vesicular transport. HLA-DO is a third class II chaperone expressed by some antigen presenting cells, like B cells, that modulate HLA-DM function. In organ-specific autoimmune diseases such as type 1 diabetes, epithelial endocrine cells are the specific targets of the autoreactive response. In these situations endocrine cells express MHC II molecules and both chaperones Ii and DM with heterogeneous expression levels that leads to the suggestion that criptic epitopes may be presented by endocrine epithelial cells, thus maintaining the autoreactive response. This hypotesis has ben approached in this work from two different points: (i) analysis of the peptide repertoire associated to MHC II by mass spectrometry techniques and (ii) characterization of the endocytic pathway, where ligands associate to class II molecules, by cryoelectron microscopy. The study has been performed using an experimental model based on the stable transfection of the rat insulinoma cell line RINm5F with human class II genes HLA-DRB1*0401, Invariant chain and HLA-DM. Sequential transfection allowed the generation of four endocrine cell lines expressing (i) RIN-DR4, (ii) RIN-DR4Ii, (iii) RIN-DR4DM, (iv) RIN-DR4IiDM. The data show that class II expression in endocrine cells induce a reorganization of the endocytic pathway, favouring the formation of multivesicular and multilaminar late endosomes where molecules involved in class II antigen presentation are accumulated. In the absence of chaperones, DR4-peptide complexes contain a highly heterogeneous unstable peptide pool, with ligands mostly derived from the N- and C-termini of cytosolic proteins, that in many cases did not respect the DR4-peptide binding motif. Ii expression increase the presence of DR4 dimers outside the ER, mostly accumulated at the cell surface. In the absence of DM, these complexes are unstable and most of them associate to CLIP, although minor ligands from exogenous and autologous proteins are also identified. DM expresion in the absence of Ii allow the detection of stably bound DR4-peptide complexes at the cell surface, containing sequences derived from either cell surface or cytoplasmic proteins. In DR4IiDM cells, DR4 complexes at the cell surafce are stable and are associated to a peptide repertoire highly homogeneous in sequence, length and origin, formed by ligands derived from surface, secreted and cytoplasmic proteins, some of them tissue-specific. All the identified ligands respect the DR4-peptide binding motif and are different from the repertoire identified in a DR4-homozygous B-lymphoblastoid cell line. Thus, DR4, Ii and DM expression in endocrine epithelial cells allow the presentation of a panel of peptides, different from the ones presented by cells with constitutive class II expression, some of which are tissue specific. This repertoire is cell type dependent and influenced by the expression of both chaperones, suggesting the possibility of variations in the target organs during the autoimmune process that may condition its development.

No description available.

No description available.

A la bibliografía es poden trobar múltiples exemples que mostren com els β-aminoàcids són capaços d'adoptar estructures secundàries en forma de hèlix, girs o làmina. Per aquest motiu, en el nostre grup de recerca hem sintetitzat β¬pèptids constituïts per residus ciclobutànics amb el propòsit d'estudiar si aquest anell carbocíclic pot constituir una restricció conformacional que origini la formació d'estructures secundàries o terciàries. En la present Tesi Doctoral, s'han sintetitzat dos tipus de pèptids ciclobutànics, un on l'anell ciclobutànic forma part de l'esquelet peptídic i un altre on l'anell es troba com a substituent. També s'han sintetitzat diferents urees ciclobutàniques i materials mixtes constituïts per TTF-β-dipèptid ciclobutànic. Aquest treball s'ha organitzat en diferents apartats. Es pot trobar una Introducció General on s'explica el nostre interès per aquest tipus de compostos, seguida de diferents capítols on es tracten diversos temes. En cada capítol es descriu el procediment sintètic realitzat, així com l'estudi estructural dels compostos sintetitzats. Aquest estudi s'ha dut a terme en solució, per analitzar així les estructures secundàries generades utilitzant técniques de RMN, DC i càlculs teòrics. També s'ha realitzat un estudi supramolecular mitjançant tècniques microscòpiques (TEM, AFM, SEM) amb l'objectiu d'analitzar les possibles estructures terciàries originades pels diferents compostos. En el capítol dedicat a les urees, es descriuen aquests compostos obtinguts com a productes no desitjats a la síntesis dels derivats β-cis¬ciclobutànics. Donat que s'han obtingut difraccions de raigs X d'aquests compostos, s'ha realitzat un estudi d'aquests en estat sòlid. A més a més, hem dut a terme un estudi preliminar sobre possibles aplicacions que aquests derivats ciclobutànics puguin presentar. Per aquesta raó, per una banda s'ha avaluat l'activitat de diferents β-pèptids ciclobutànics com a inhibidors enzimàtics de la CPA i la CPB. D'altra banda, també es mostra com s'ha sintetitzat i estudiat un conductor orgànic quiral mitjançant un acoblament entre un dels nostres β-dipèptids ciclobutànics amb un derivat TTF. / It is well documented that peptides built in β-amino acids could be able to adopt secondary structures like helices, turns or sheets. Therefore, in our research group, we have synthesized β-peptides made of cyclobutane containing residues with the purpose to study if this carbocyclic ring could provide conformational constraint to prompt the formation of secondary or even tertiary structures. In the present work, we have synthesized two different kinds of cyclobutane containing peptides, one where the cyclobutane ring is a part of the main carbon chain and another class where this ring is taken in as a substituent. We have also synthesized different cyclobutane ureas and mixed materials composed of TTF-cyclobutane β-dipeptide. This Doctoral Thesis has been organized in different parts. There is a General Introduction where we explain our interest in this sort of compounds, followed by different chapters for every subject. In each chapter we describe the synthetic procedure(s) for the target cyclobutane containing compounds as well as their structural study. This has been carried out in solution, to analyse the generated secondary structures, using NMR techniques, CD and theoretical calculations. We have also performed a supramolecular study by microscopic approaches (TEM, AFM, SEM) to explore the possible tertiary structures these compounds could develop. In the chapter devoted to ureas, we describe these compounds as secondary products obtained from the synthesis of β-cis-cyclobutane derivatives. In this case, we have been able to obtain X-ray diffraction pattern and, consequently, we have studied these compounds in the solid state too. In addition, we have carried out a preliminary study about the applications these cyclobutane derivatives could present. For that reason, on one hand, we have explored the activity of some cyclobutane β-peptides as CPA and CPB enzyme inhibitors. On the other hand, we also show how we have synthesized and studied a chiral organic conductor by coupling one of our cyclobutane β-dipeptide with a TTF derivative.

El Virus de la Immunodeficiència Humana, VIH, és un virus amb envolta de la família Retroviridae. El primer pas en el procés d'infecció del virus és la seva entrada dins de la cèl·lula hoste. En el cas d'infecció de limfòcits T, primer es produeix el reconeixement del receptor CD4 del limfòcit per part de la proteïna gp120 del virus. Aquest proteïna està unida mitjançant interaccions de tipus febles a una altra proteïna de l'envolta lipídica del virus, la proteïna gp41. Aquesta proteïna és la responsable final de la fusió entre la membrana plasmàtica de la cèl·lula hoste i l'envolta lipídica del virus, permetent l'entrada d'aquest últim al citosol de la cèl·lula i iniciant el procés d'infecció.La proteïna gp41 presenta en el seu extrem amino terminal una seqüència molt hidrofòbica i rica en residus de glicina i alanina, la qual cosa fa que sigui conformacionalment polimòrfca, i que es coneix com pèptid de fusió. Un cop produït el reconeixement, la gp120 sofreix un canvi conformacional que es transmet a la gp41, de manera que el pèptid de fusió interacciona amb la membrana del limfòcit, desencadenant el procés de fusió.En el present treball s'ha estudiat la interacció de pèptids de fusió de la proteïna gp41 del VIH amb membranes model. Els resultats obtinguts han permès proposar un model cinètic dels diferents processos que tenen lloc durant la interacció d'aquests pèptids amb membranes model, contribuint de manera remarcable a resoldre una qüestió fins ara controvertida, referent al tipus d'estructura que adopta el pèptid de fusió quan interacciona amb les membranes i que desencadena la fusió. El treball també ha permès determinar la importància del potencial dipolar de membrana, un paràmetre físico-químic de les membranes, en aquests processos així com la importància de la presència de colesterol en les membranes model. Segons els resultats obtinguts, el pèptid de fusió primerament interaccionaria amb la membrana. Un cop unit a aquesta, el pèptid de fusió experimentaria un canvi conformacional, passant d'una barreja d'estructura helicoïdal, desordenada i de fulla ?, a més estrcutura ?, la qual finalment seria l'estructura responsable de la fusió. A més, el pèptid durant la interacció provocaria una desestabilització de la membrana, una agregació de membranes model i una deshidratació de la seva interfície aigua-lípid. El potencial dipolar de membrana, afectaria tan sols al procés d'unió del pèptid de fusió a les membranes, mentre que no afectaria al canvi conformacional ni a la fusió. Aquests últims estarien afectats per la hidratació de les membranes i/o per la seva fluïdesa, tal i com mostren els resultats obtinguts amb el colesterol. Finalment el treball ens ha permès formular la qüestió de si els agregats peptídics amorfs detectats en el cas dels pèptids de fusió del VIH podrien correspondre a un tipus conformacional més general, implicat en d'altres processos amb rellevància biològica, com l'efecte citotòxic dels pèptids amiloïdes relacionat amb certes malalties neurodegeneratives.El conexeixement dels processos moleculars de la infecció vírica podria permetre el disseny de noves estratègies farmacològiques que podrien inhibir la entrada del virus a la cèl·lula. / The Human Immunodeficiency Virus, HIV, is an enveloped virus of the Retroviridae family. The first step in the sequence of events leading to the virus entry into the target cell is the binding of gp120 to the CD4 receptor on T-lymphocytes membranes. The gp120 protein is noncovalently associated to gp41 protein, which is the protein responsible of fusion between cellular and viral membranes, allowing virus entry in the target cell.The gp41 contains in its amino terminus a sequence rich in glycine and alanine residues, the so-called fusion peptide. Following the interaction of gp120 with the CD4 receptor, a series of conformational rearrangements takes place, which result in the interaction of the N-terminal part of gp41 with the cell membrane. This process has been described to trigger the fusion of the viral and the cellular membranes.In the present work we have studied the interaction of HIV gp41 fusion peptide with model membranes. The results obtained allow us to propose a kinetic model for the different steps that take place during interaction of fusion peptide with model membranes, contributing to resolve a controversial question about the secondary structure that adopts the fusion peptide upon interaction with membranes and that trigger membrane fusion. Results also allowed us to determine the significance of membrane dipole potential on the interaction of fusion peptides with the membranes, an effect which is due to the presence of cholesterol in the model membranes. The results showed that membrane fusion depends on the transformation of unordered and probably helical structures into ? aggregates structures and that such a conformational change occurs upon binding to the membrane. Moreover, this interaction would induce membrane destabilization, vesicle aggregation and the dehydration of the membrane surface. The membrane dipole potential would only affect the binding process but would not affect either the conformational change or the fusion. These two processes would be affected by surface membrane hydration and/or membrane fluidity. Finally this work allowed us hypothesize whether amorphous peptidic aggregates detected in the case of HIV fusion peptides would correspond to a more general structure, that could be involved in others relevant biological processes, such as the cytotoxic effect of amyloid peptides which is related with certain neurodegenerative diseases.The knowledge of molecular mechanisms underlying viral infection could facilitate the design of novel pharmacological strategies against the viral entry into the target cell.

1) "Diseño, síntesis y caracterización de inhibidores de la fusión de VIH-1 análogos del péptido C34 de gp41 con D aminoácido"En el proceso de fusión del virus del VIH-1 a la célula diana intervienen las proteínas de la cubierta viral gp120 y gp41. La gp120 al interaccionar con el receptor CD4 y co-receptores sufre un cambio conformacional que enseguida causa cambios en la estructura de gp41. Esta proteína sufre una reorganización que conduce al acercamiento entre la región N-terminal y la región C-terminal de gp41 aproximando las membranas celular y viral entre si. El péptido C34 tiene buenas propiedades como inhibidor de la fusión viral y forma complejos estables con el péptido N36 derivado de la región N-terminal de gp41. En este capítulo se discute el efecto de cambiar la quiralidad del péptido C34 total o parcialmente, para aumentar la estabilidad de este péptido frente a proteasas. Mientras los péptidos derivados de C34 con todo-D aminoácidos fueron incapaces de inhibir la fusión del VIH-1. Los péptidos heteroquirales, especialmente el péptido M3C34, son capaces de formar complejos estables con N36 e inhibir la fusión.2) "Identificación de complejos heteroquirales entre péptidos todo-D y el fragmento N-terminal del dominio de B de la proteína A de Staphyloccus aureus"La proteína A es un factor patogénico encontrado en la superficie del Staphylococcus aureus. Esta proteína es capaz de unirse al fragmento cristalizable de las inmunoglobulinas G. El dominio B, un trímero de hélices antiparalelas, es uno de los cinco dominios responsables de este reconocimiento. Péptidos derivados de la región N-terminal de este dominio no tienen una estructura estable en disolución. Sin embargo, la presencia de la de péptidos correspondientes a la región C-terminal del dominio forman complejos que aumentan el contenido helicoidal del sistema. En este capitulo se diseñó una quimioteca OBOC (del ingles "one bead one compound") de 4096 péptidos con aminoácidos D derivados de la secuencia de la hélice C-terminal el domino B, con el objetivo de identificar péptidos todo-D capaces de interactuar con el fragmento N-terminal del domino B y de formar complejos no covalentes heteroquirales. 3) "Síntesis, caracterización estructural y evaluación de la interacción con inmunoglobulina G de nuevos análogos del dominio B de la proteína A de Staphylococcus aureus"Los fragmentos correspondientes a la hélice C-terminal y región N-terminal del domino B de la proteína A de Staphylococcus. aureus forman complejos que aumentan la helicidad del sistema. En nuestro grupo se identificaron dos péptidos derivados de la hélice C-terminal del dominio B que forman complejos con el fragmento N-terminal con mutaciones en los residuos Ser 44 y Leu 47. En esta parte se describe la caracterización estructural y evaluación de la actividad de los complejos no covalentes formados entre estos péptidos y el fragmento N-terminal del dominio B y los dominios enteros. Después de comprobar que el fragmento N-terminal interaccionaba con los análogos no naturales de la hélice C-terminal se sintetizaron los dos dominios análogos con las modificaciones encontradas en la región C-terminal (Ser44Phe Leu47Lys y Ser44Phe Leu47Val). El análisis de estructura por dicroísmo circular reveló que los análogos mostraban estructura helicoidal y eran térmicamente estables. Por resonancia de plasmon superficial se encontró que los análogos se unían a inmunoglobulina de conejo y al fragmento cristalizable de las inmunoglobulinas humano con una afinidad similar, aunque con cambios en las cinéticas de asociación y disociación. La información estructural de cada residuo se analizó por medio de resonancia magnética nuclear. Este estudio mostró que los dominios análogos conservan tres regiones helicoidales y de acuerdo a los experimentos de intercambio H/D se pliegan de forma similar al dominio natural. / This thesis is divided in three parts. The first part is about the design, synthesis and characterization of new peptide inhibitors of the HIV-1 fusion derived of the C-terminal region of gp41. In the second part was described the design and synthesis of a library of all-D peptide derived of the C-terminal region of B domain of protein A of Staphylococcus aureus to identify all-D peptides which could interact with the N-terminal fragment of B domain to get heteroquiral non covalent complexes. The third part is about the synthesis, structural characterization and activity evaluation of two new analogues en B domain of protein A of Staphylococcus aureus with mutations in Ser44 and Leu47.

El virus de la hepatitis G (GBV-C/HGV) es un virus ARN perteneciente a la familia Flaviviridae. Su prevalencia, basada en la positividad del ARN, oscila entre el 1 y el 4% en la población general. Sin embargo este porcentaje aumenta hasta el 20-30% en los individuos expuestos a sangre o sus derivados, en individuos infectados por el virus de la hepatitis C o por el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), hecho que indica que se transmite principalmente por vía parenteral. Aunque no está claro su potencial patogénico, los estudios más recientes sugieren que la infección por este virus reduce la mortalidad en los pacientes infectados por el HIV, de ahí el interés en disponer de una herramienta que permita el diagnóstico de la infección por GBV-C/HGV de un modo rápido y sencillo. Desde hace años, los péptidos sintéticos se vienen utilizando en sistemas de diagnóstico para muchas enfermedades, sin embargo, los péptidos lineales que mimetizan epítopos B son débilmente reconocidos por los anticuerpos, y por ello, existe la tendencia de utilizar combinaciones más complejas que permitan mejorar tanto la sensibilidad como la especificidad de los ensayos.En esta tesis se han diseñado y sintetizado, utilizando la metodología de síntesis en fase sólida, construcciones peptídicas en las que se combinan regiones de proteínas de envoltura y no estructurales. Se han sintetizado tanto péptidos quiméricos, que contienen más de un epítopo (lineales y ramificados), como péptidos cíclicos en los que los epítopos sufren restricción de movilidad. La capacidad antigénica de las construcciones sintéticas se ha evaluado utilizando principalmente la técnica del enzimoinmunoensayo (ELISA) aunque también se ha investigado la utilidad de la técnica de la resonancia del plasmón de superficie (SPR) para detectar la presencia de anticuerpos anti-GBV-C/HGV en muestras de suero de individuos pertenecientes tanto a los grupos de riesgo como en la población sana. Además, se ha realizado un estudio conformacional con la finalidad de establecer una correlación entre la estructura secundaria adoptada por los péptidos y su capacidad antigénica. Finalmente, se ha estudiado la capacidad inmunogénica de las construcciones peptídicas en animales de experimentación. Los resultados obtenidos muestran, por un lado, que las construcciones en las que se combinan varios epítopos son las que presentan una mejor precisión diagnóstica, y por otro lado, que la introducción de restricción de movilidad permite incrementar la sensibilidad mostrada por la molécula precursora lineal. / "Design and synthesis of peptides for serodiagnose of the hepatitis G virus (GBV-C/HGV) infection". The GB virus C, so called hepatitis G virus (GBV-C/HGV), is a single-strand RNA virus belonging to the Flaviviridae family. The prevalence rate of GBV-C/HGV in healthy blood donors is 1-4% in worldwide and about 20-35% in high risk populations, thus indicating that this virus is transmitted via the parenteral route. Although controversial data exit concerning the potential to cause hepatitis in humans recent studies suggest that coinfection with HIV is associated with prolonged survival. For this reason it would be interesting to find an easy tool to diagnose this apparently non-pathogenic virus. In recent years, synthetic peptides that mimic specific epitopes of infectious agents have been used in diagnostic systems for various diseases. The main drawback of this approach is that peptides representing topographic B-cell epitopes are poorly recognised by antibodies. There is a tendency toward using chimeric to avoid those problems and to improve the sensitivity and specificity of the assays.In this thesis, new putative epitopes located both in envelope and in nonstructural proteins of GBV-C/HGV were synthesized using solid-phase chemistry. The corresponding synthetic peptides, obtained in linear, multimeric and cyclic forms, were used as antigens in ELISA and in real-time bioespecific interaction measurements (SPR) to detect GBV-C/HGV-specific antibodies in different panels of human sera. Furthermore, CD and FT-IR have been used in conjunction to characterize the conformational changes therein with synthetic constructs that could explain their different antigenicity.The results obtained showed, on one hand, that the combination of different antigens seems to be necessary to ensure good sensitivity and more specificity and, on the other hand, that cyclic compounds show higher ability to recognize anti-GBV-C/HGV antibodies than its parent peptide. Our results offer a new approach to develop new diagnostic peptide based biosensors for serodiagnosis of GBV-C/HGV infection.

Les molècules ramificades poden jugar un paper clau en la síntesi en fase sòlida de compostos amb una elevada complexitat estructural. En aquest sentit i concretament en la síntesi de pèptids i peptidomimètics, els aminoàcids trifuncionals hi juguen un paper fonamental. En aquesta tesi s'han utilitzat aquest tipus de molècules per tal d'obtenir estructures complexes com són els pèptids cíclics, els foldàmers i noves quimioteques. Com a plataformes ramificadores s'han utilitzat derivats trifuncionals de prolina, com la cis-gamma-amino-L-prolina i la trans-4-hidroxi-L-prolina. Així, la present tesi doctoral descriu tres projectes diferents els quals comparteixen l'ús de la síntesi en fase sòlida com a metodologia sintètica, així com la utilització d'aminoàcids trifuncionals. Els diferents projectes es basen en: (i) estudi de grups protectors ortogonals en la síntesi de pèptids cíclics en fase sòlida; (ii) síntesi, estudis estructurals i aplicacions de fòldamers gamma-peptídics derivats de la gamma-amino-L-prolina; i (iii) síntesi en fase sòlida d'una llibreria d'inhibidors de la lisil-tRNA sintetasa (LysRS) de Plasmodium falciparum, paràsit causant de la malària. CAPÍTOL 1: En la síntesi en fase sòlida és del tot imprescindible disposar de grups protectors ortogonals per tal d'obtenir uns resultats satisfactoris al final d'una síntesi complexa. Tot i això, no sempre s'arriba als resultats esperats. El primer capítol d'aquesta tesi descriu els problemes derivats de treballar amb els grups protectors d'amines Fmoc i Alloc quan estan continguts en el mateix aminoàcid trifuncional. El problema que es descriu és l'eliminació prematura del grup Fmoc en les condicions d'eliminació dels grup Alloc. Així, s'estableix l'origen del problema i s'estableixen metodologies alternatives d'acoblament per tal d'evitar subproductes no desitjats. Aquest mateix capítol descriu la síntesi en fase sòlida de tetra-beta-pèptids cíclics utilitzant un sistema de protecció tetraortogonal. CAPÍTOL 2: Els gamma-pèptids són els foldàmers més estudiats fins al moment, ja que se n'ha descrit propietats força interessants com ara l'antimicrobiana o la seva capacitat per travessar la membrana de cèl·lules eucariotes, fet que els converteix en bons candidats a transportadors de fàrmacs. La rellevància que estan adoptant aquests peptidomimètics es deu bàsicament al fet que aquestes molècules no naturals poden millorar alguns inconvenients dels pèptids naturals, com pot ser la baixa estabilitat en front a proteasses. El segon capítol d'aquesta tesi doctoral descriu la síntesi en fase sòlida de gamma-pèptids derivats de la cis-gamma-amino-L-prolina. A més a més, estudis estructurals mitjançant l'ús de tècniques de dicroïsme circular i ressonància magnètica nuclear estableixen que aquest tipus de compostos formen llaços C9, donant com a resultat en una estructura regular una sèrie de girs concatenats d'aquest tipus, estructura que també es pot descriure com a hèlix 9. Aquest mateix capítol descriu algunes propietats d'aquest compostos, com ara la seva capacitat de travessar membranes cel·lulars, la baixa toxicitat, l'elevada estabilitat en front a proteasses o l'activitat antimicrobiana. L'entrada cel·lular de cada pèptid es quantifica mitjançant tècniques de fluorimetria de plaques i de citometria de flux i es visualitza al microscopi confocal. CAPÍTOL 3: El tercer capítol descriu la síntesi d'una llibreria de compostos potencials inhibidors de la lisil-tRNA sintetassa (LysRS) del Plasmodium falciparum, paràsit causant de la malària. S'ha vist que les aminoacil-tRNA sintetasses poden ser dianes terapèutiques força vàlides, ja que tot i ser enzims essencials en totes les espècies, aquestes es poden inhibir d'una forma espècie-específica. En la ruta biològica de la traducció en la que participen les tRNA sintetasses es forma un complex intermedi, l'aminoacil adenilat, en el qual es va basar el disseny dels inhibidors. Així, aquest capítol descriu la síntesi de sulfamats en fase sòlida i la seva posterior utilització en la síntesi d'una llibreria de 90 inhibidors. / Branched molecules, such as trifunctional amino acids, can play important roles in the creation of complex structures using solid-phase synthesis. This thesis describes the use of proline derived trifunctional amino acids such as cis-gamma-aminoproline and trans-4-hidroxyproline for the synthesis of cyclic peptides, foldamers and libraries. Thus, this thesis has been divided into three different chapters, which share both the use of these trifunctional molecules and the use of solid-phase peptide synthesis as a common methodology. The first chapter describes several problems derived from the use of orthogonal protecting groups in the same molecule. For instance, it describes that, in certain cases, the Fmoc protecting group can be removed when eliminating the Alloc one, not for its removing conditions but for the free amine that are kept free once the Alloc group has been removed. The use of several protecting groups at the same time was also tested in the synthesis of cyclic tetra-beta-peptides using a tetra-orthogonal protecting scheme. The second chapter describes the solid-phase synthesis of abiotic foldamers derived from proline derivatives. This chapter also describes that these compounds can fold forming a series of C9 turns, which, in an idealised structure, can form an helix 9. The labelling of these gamma-peptides with a fluorescent probe followed by their confocal microscopy study reveal that these gamma-peptides are able to cross the cell membrane of eukaryotic cells, a property that makes them good candidates as drug carriers for drug delivery. Actually, the conjugation of one of them with a PNA reveals that this gamma-peptide can transport this big non-membrane permeable molecule inside the cell, demonstrating its value for such application. In the third chapter, the solid phase synthesis of sulfamates is described, as well as their application in the synthesis of inhibitors of the lysil-tRNA synthetase (LysRS) of "Plasmodium falciparum"

The increasing importance of peptides as drugs creates the necessity of new methodologies for the synthesis of complex peptides. This PhD thesis has been focused on the development of new protecting groups (including new linkers) for peptide synthesis. The work done has solved several problems in peptide synthesis making it more versatile. These are some of the results obtained:- The removal conditions of the pNZ group as α-amino and Orn and Lys side chain protector have been optimized. These optimized conditions make pNZ orthogonal to the most used protecting groups in the Fmoc/tBu solid phase peptide synthesis strategy (Fmoc, Boc and Alloc) and minimize its most important side reactions such as formation of diketopiperazines, aspartimides and removal of the α-Fmoc group. The use of the pNZ group allows also the synthesis of complex and biologically interesting peptides such as the antitumoral peptide Kahalalide F.- A new protecting agent, the Fmoc-2-mercaptobenzothiazole (Fmoc-MBT), has been developed. It prevents side reactions in the synthesis of Fmoc-amino acids.New protecting groups developed:- p-Nitromandelic linker (pNM): it is useful for the synthesis of peptides and depsipeptides using the Boc/Bn strategy.- Backbone protectors (3,4-ethylenedioxythenyl (EDOTn) and 1-methyl-3-indolylmethyl (MIM)): they improve some of the poperties of the present backbone protectors such as their difficult elimination and steric hindrance.- Phenyl-EDOTn derivatives as super acid labile carboxylic acid protecting groups.- 1,2-dimethylindole-3-sulfonyl (MIS) as a protector of the side chain of arginine: it is much more acid labile than the present protecting groups and it is compatible with tryptophan containing peptides. / Els pèptids estan cobrant una importància creixent com a fàrmacs i això fa necessàries noves eines per a la seva síntesi. Aquesta Tesi Doctoral se centra en el desenvolupament de grups protectors per a la síntesi de pèptids complexos. Aquests protectors poden ser molècules petites lliures o unides a suports polimèrics. En el darrer cas s'anomenen espaïadors bifuncionals.L'impuls decisiu per a la química de pèptids va ser el desenvolupament de la metodologia de fase sòlida per part de Merrifield als anys 60. L'estratègia original de Merrifield es denomina Boc/Bn (tert-butiloxicarbonil/benzil). En ella el grup α-amino dels aminoàcids està protegit pel grup Boc, làbil a àcid trifluoroacètic (TFA), i les cadenes laterals dels aminoàicds estan protegides amb protectors de tipus benzílic, eliminats al escindir el pèptid de la resina amb àcids forts, en general HF. Actualment, però, l'estratègia més usada es la Fmoc/tBu (9- fluorenilmetoxicarbonil/tert-butil) ón el grup α-amino es protegeix amb el grup Fmoc, làbil a bases, i les cadenes laterals amb grups de tipus tert-butil, eliminats al escindir el pèptid de la resina amb TFA.El treball realitzat en aquesta Tesi ha permès resoldre alguns dels problemes actuals en síntesi de pèptids aconseguint fer-la més versàtil. En concret:- S'han millorat les condicions d'eliminació del grup pNZ com a protector d'α-amino i de les cadenes laterals d'Orn i Lys. Aquestes condicions el fan ortogonal als protectors més usats en síntesi de pèptids (Boc, Fmoc y Alloc) i minimitzen les reaccions secundàries associades a la síntesi de pèptids en fase sòlida mitjantçant l'estratègia Fmoc/tBu, com la formació de dicetopiperazines, aspartimides i l'eliminació del grup α-Fmoc. L´ús del prup pNZ permet a més l'accés a estructures peptídiques complexes així com el desenvolupament de noves estratègies de síntesi de pèptids d'elevat interès biològic com el pèptid antitumoral Kahalalide F.- S'ha desenvolupat un nou agent protector, el Fmoc-2-mercaptobenzotiazole (Fmoc-MBT), que permet la síntesi de Fmoc-aminoàcids evitant les reaccions secundàries associades als reactius actuals.Nous protectors desenvolupats:- Espaïador bifuncional p-nitromandèlic (pNM): és útil per a la síntesi de pèptids i depsipèptids mitjantçant química Boc/Bn.- Protectors d'amides de l'esquelet peptídic (3,4-etilendioxi-2-tenil (EDOTn) y 1-metil-3- indolilmetil (MIM)): milloren algunes de les propietats dels protectors actuals com la seva difícil eliminació i el seu impediment estèric.- Derivats del fenil-EDOTn com a grups protectors d'àcids carboxílics molt làbils a medi àcid (estàndar i espaïadors bifuncionals).- 1,2-dimetilindole-3-sulfonil (MIS) com a protector de la cadena lateral de l'arginina molt més làbil a medi àcid que els protectors actuals i compatible amb pèptids que contenen triptòfan. / RESUMEN EN CASTELLANOLos péptidos están cobrando cada vez más importancia como fármacos y esto hace necesarias nuevas herramientas para su síntesis. La presente Tesis Doctoral se centra en el desarrollo de grupos protectores para síntesis de péptidos complejos. Estos protectores pueden se moléculas pequeñas o unidas a soportes poliméricos. En este último caso se denominan espaciadores bifuncionales.El impulso decisivo para la química de péptidos fue el desarrollo de la metodología de fase sólida por parte de Merrifield en los años 60. La estrategia original de Merrifield, se denomina Boc/Bn (tert-butiloxicarbonilo/benzilo). En ella el grupo α-amino de los amino ácidos está protegido con el grupo Boc, lábil a ácido trifluoroacético (TFA), y las cadenas laterales de los amino ácidos están en general protegidas con protectores de tipo benzílico, eliminados al escindir el péptido de la resina con ácidos fuertes, generalmente HF. Sin embargo, en la actualidad, la estrategia más usada es la Fmoc/tBu (9-fluorenilmetoxicarbonilo/tert-butilo) , en la cual el grupo α-amino se protege con el grupo Fmoc, lábil a bases y las cadenas laterales con grupos de tipo tert-butilo, eliminados al escindir el péptido de la resina con TFA.El trabajo realizado en la presente Tesis ha permitido resolver algunos de los problemas actuales en síntesis de péptidos haciéndola mas versátil. Concretamente:- Se han mejorado las condiciones de eliminación del grupo pNZ como protector del α-amino y de las cadenas laterales de Orn y Lys. Estas condiciones lo hacen ortogonal a los protectores más usados en síntesis de péptidos (Boc, Fmoc y Alloc) y minimizan reacciones secundarias asociadas a la síntesis de péptidos en fase sólida mediante la estrategia Fmoc/tBu, como la formación de dicetopiperazinas, aspartimidas y la eliminación del grupo α-Fmoc. El uso del grupo pNZ permite además el acceso a estructuras peptídicas complejas así como el desarrollo de nuevas estrategias de síntesis de péptidos de elevado interés biológico como el péptido antitumoral Kahalalide F.- Se ha desarrollado un nuevo agente protector, el Fmoc-2-mercaptobenzotiazol (Fmoc-MBT), que permite la síntesis de Fmoc-amino ácidos evitando las reacciones secundarias asociadas a los reactivos actuales.Nuevos grupos protectores desarrollados:- Espaciador bifuncional p-nitromandélico (pNM): es útil para la síntesis de péptidos y depsipéptidos mediante química Boc/Bn. - Protectores de amidas del esqueleto peptídico (3,4-etilendioxi-2-tenil (EDOTn) y 1-metil-3- indolilmetil (MIM): mejoran algunas de las propiedades de los protectores actuales, com su difícil eliminación y su impedimento estérico.- Derivados del fenil-EDOTn como grupos protectores de ácidos carboxílicos muy lábiles a medio ácido (estándar y espaciadores bifuncionales).- 1,2-dimetilindole-3-sulfonil (MIS) como protecor de la cadena lateral de la arginina mucho más lábil a medio ácido que los protectores actuales y compatible con péptidos que contienen triptófano.

En situaciones patológicas, como en el caso de la autoinmunidad, las células epiteliales de tejidos expresan ectopicamente moléculas de MHC de clase II. El estudio de los mecanismos que dan lugar a la formación de los complejos MHC-péptido, su presentación en la superficie de la APC y el reconocimiento de los mismos por parte de las células T es fundamental para poder entender, no sólo la respuesta inmune a infecciones, sino también patologías tan relevantes como el cáncer, la autoinmunidad o el rechazo de y/o mantenimiento de la enfermedad. En esta tesis se ha abordado el estudio de la presentación de péptidos por moléculas de MHC de clase II utilizando diversas estrategias proteómicas. En primer lugar, el trabajo se centró en la caracterización de los repertorios peptídicos asociados a una APC y a células epiteliales que expresaban moléculas de MHC de clase II, secuenciándose más de 300 ligandos peptídicos, incluyendo diversos péptidos presentados ex vivo en tiroides afectados por una patología autoinmune. Mediente este estudio se mostró que existen diferencias en los repertorios asociados a las células epiteliales frente a los presentados por las APC, tanto en las características de los péptidos como en las de las proteínas de las cuales derivan. Asimismo, se muestra como la expresión de las chaperonas HLA-DM y Ii afecta a las características del repertorio. Finalmente, se identificaron péptidos de clase II presentados en tiroides humanos afectados por la enfermedad de Graves-Basedow, entrre ellos un péptido derivado de la tiroglobulina, una proteína descrita como autoantígeno de esta enfermedad. En una segunda parte del trabajo se ha estudiado el efecto de la transfección de las moléculas HLA-DR, HLA-DM y Ii sobre el proteoma de las células epiteliales y se han identificado diversas proteínas implicadas en este proceso, mostrando que a pesar de no existir cambios drásticos en el proteoma global, algunas proteínas implicadas en el metabolismo celular varían su expresión. Asimismo, se han identificado 30 proteínas que se encuentran asociadas directamente o a través de otras moléculas con las moléculas de HLA-DR4 en la célula , entre ellas diversas chaperonas y enzimas de oxidoreducción, y proteínas implicadas en el transporte asociado a membranas. La expresión de estas proteínas dependía además de la expresión de la chaperonas Ii y DM por lo que se sugiere que algunas podrían estar implicadas en la generación, procesamiento o presentación de péptidos por las moléculas de MHC de clase II.