This PhD thesis is the result of the combination of experimental and computational techniques with the aim of understanding the mechanism of action of de novo cyclic decapeptides with high antimicrobial activity. By experimental techniques the influence of the replacement of the phenylalanine for tryptophan residue in their antimicrobial activity was tested and the stability in human serum was also analyzed, in order to evaluate their potential therapeutic application as antitumor agents. On the other hand, the interaction amongst the peptide BPC194 c(KKLKKFKKLQ), the best candidate from the whole library of cyclic peptides, and a model anionic membrane was simulated. The results showed a structure-function relationship derived from the stable conformation of the peptides involved in the membrane permeabilization. As a result, a rational design was performed being BPC490 the peptide with best antimicrobial activity compared with the best active peptide from the original library. / Aquesta tesi doctoral resulta de la combinació d’estudis mitjançant tècniques experimentals i computacionals amb l’objectiu d’entendre el mecanisme d’acció de "de novo" decapèptids cíclics amb elevada activitat antimicrobiana. Experimentalment, es va avaluar la influència de la substitució dels residus de fenilalanina per triptòfan en la seva activitat antimicrobiana i també la seva estabilitat sèrum humà, per tal de valorar la seva possible aplicació terapèutica envers el càncer. Per altra banda, es va simular la interacció del pèptid BPC194 c(KKLKKFKKLQ), millor candidat de la biblioteca de pèptids cíclics, amb models aniònics de bicapa lipídica. Els resultats van posar en manifest una relació estructura-funció derivada de la conformació estable dels pèptids que participen directament en la permeabilització de la membrana. Es va procedir doncs al disseny racional de nous pèptids cíclics sent el pèptid BPC490 el que va presentar una millor activitat bacteriana en comparació amb el pèptid més actiu de la llibreria original.

En aquesta tesi doctoral es va estudiar la preparació de pèptids biarílics en fase sòlida. En primer lloc, es varen borilar residus de fenilalanina o tirosina presents a la seqüència peptídica a través d’una reacció de Miyaura. A continuació, es varen arilar els boronats resultants a través d’una reacció de Suzuki-Miyaura sota irradiació de microones, utilitzant diversos halurs d’aril i haloaminoàcids. La metodologia trobada es va estendre a la preparació de pèptids biarílics cíclics. Aquesta aproximació presenta l’avantatge d’evitar la síntesi en dissolució i la purificació del boronoaminoàcid. A més, permet la preparació d’una àmplia diversitat de pèptids biarílics a partir d’un únic boronopèptid. L’avaluació de l’activitat biològica dels pèptids sintetitzats va permetre idenficar seqüències actives enfront dels bacteris Erwinia amylovora, Xanthomonas vesicatoria, i Pseudomonas syringae, que són responsables de malalties greus en plantes d’interès econòmic com pereres i pomeres, i que varen resultar ser molt poc tòxics enfront cèl•lules eucariotes. / The present PhD study was focused on the preparation of biaryl peptides on solid-phase. First, phenylalanine or tyrosine residues were borylated through a Miyaura reaction. Then, the resulting boronates were arylated via a Suzuki-Miyaura reaction under microwave irradiation, using a range of aryl halides and haloamino acids. This methodology was extended to the solid-phase synthesis of biaryl cyclic peptides. This strategy is advantageous because it avoids the synthesis and purification of amino acid boronates in solution. Moreover, it allows the preparation of a large diversity of biaryl peptides from a single boronopeptide intermediate. The evaluation of the biological activity allowed the identification of active sequences against the economically important plant pathogenic bacteria Erwinia amylovora, Xanthomonas vesicatoria, and Pseudomonas syringae, and moreover they were not toxic against eukaryotic cells.

In the present PhD thesis we studied the solid-phase peptide synthesis of antimicrobial peptides derived from the lead peptides BP100 and BPC194. First, peptides derived from BP100 containing D-amino acids at different positions of the sequences were prepared. Moreover, peptidotriazoles derived from BP100 were also synthesized containing the triazole ring at the side-chain of different amino acids. Then, we proceeded to perform studies for the synthesis of multivalent peptides derived from BPC194. To achieve this objective, the synthesis of cyclic peptides containig a triazole ring at amino acids side-chain with different elongations was carried out. Finally, we prepared various carbopeptides containing 2 and 4 units of BP100 and/or its derivatives. The evaluation of the biological activity allowed the identification of active sequences against the economically important phytopathogenic bacteria and fungi and not toxic against eukaryotic cells. / En aquesta tesi doctoral es va estudiar la preparació en fase sòlida de pèptids antimicrobians derivats dels pèptids lead BP100 i BPC194. En primer lloc, es varen preparar derivats del pèptid lineal BP100 incorporant D aminoàcids en diferents posicions de la seqüència. A més, també es varen sintetitzar derivats d'aquest pèptid lead incorporant un anell de triazole a la cadena lateral de diferents aminoàcids. Posteriorment, es va procedir a l'estudi de la síntesi dd pèptids multivalents derivats de BPC194. Per aconseguir aquest objectiu es va portar a terme la síntesi de pèptids cíclics incorporant un anell de triazole a la cadena lateral d’aminoàcids amb diferents allargades de cadena. Finalment, va procedir a la preparació de carbopèptids contenint 2 i 4 unitats de BP100 i/o derivats. L’avaluació de l’activitat biològica dels pèptids sintetitzats va permetre idenficar seqüències actives enfront de bacteris fitopatògens i fongs i poc tòxiques enfront cèl•lules eucariotes.

L’estudi d’espècies marines (micro- i macroorganismes) és interessant perquè ha conduit a l’aïllament de substàncies amb una estructura química totalment diferent de les trobades en productes naturals aïllats d’organismes terrestres i a més amb una amplia gama de activitat biològica força interessant. La mayotlida és un producte natural d’origen marí aïllat per la empresa Pharmamar d’una mostra de Spongia sp. La mayotlida presenta activitat inhibidora del creixement (GI50) del ordre nanomolar. Des del punt de vista estructural, la mayotlida és un sistema octapeptídic i té la peculiaritat de la unió entre dos triptòfans (Trps), mitjançant l’enllaç entre el N indòlic d’un i el C3a de l’altre, que es troba ciclat constituint una unitat hexahidropirroloindole (HPI). Aquesta estructura triptòfan-pirroloindole ha sigut detectada, fins el moment en pocs productes naturals, i la mayotlida és el primer exemple d’un compost bis-macrocíclic amb aquest enllaç. En el capítol 1 de la memòria s’estudia la formació del sistema triptòfan-pirroloindole, per a lo qual s’ha assajat la reacció entre un Trp i un anàleg halogenat de l’HPI en diferents condicions experimentals a fi de trobar les més adients. Estàn descrites dues rutes sintètiques que condueixen a la formació de l’HPI halogenat en la posicióo 3a, conduint cadascuna a un diastereòmer distint. A més, en la formació de l’enllaç entre el C3a de l’HPI i el N indòlic del Trp, s’han escollit els grups protectors més adients i amb ortogonalitat entre ells per al creixement ordenat i selectiu del sistema Trp-HPI. En el capítol 2 s’inicia la síntesis de la mayotlida. En primer lloc, s’ha estudiat la formació de l’anell A, que és l’anell petit de la mayotlida. L’anell A és un macrocicle de tretze puntes format per tres aminoàcids: un Trp, l’HPI i l’Ile. S’han assajat tres posicions de macrociclació per a comprovar el punt idoni per tancar l’anell. S’ha determinat l’estereoquímica relativa dels estereocentres d’aquest anell mitjançant experiments de RMN mono i bidimensionals. La segona part d’aquest capítol es dedica a la formació del segon macrocicle, que anomenem anell B. S’ha sintetitzat, en fase sòlida, la cadena lineal pentapeptídica que unida als grups àcid i amina de l’anell A conduirà a l’anell B de la mayotlida. S’ha acoblat aquesta cadena amb l’anell A i s’ha realitzat la macrociclació de l’anell B per fornir la mayotlida. S’ha comparat la mayotlida sintètica amb la natural, coeluint ambdues al mateix temps. En el capítol 3 s’ha plantejat la síntesi de dos anàlegs de la mayotlida, els quals tenen la mateixa seqüència peptídica que l’anell B de la mayotlida i es diferèncien en que no tenen l’enllaç Trp-HPI, és a dir, no contenen l’anell A en la seva estructura; a més, un d’ells té un Trp enlloc de l’HPI. Endemés, s’ha assajat l’activitat de l’anell A de la mayotlida i d’un dels anàlegs sintetitzats. / Marine natural products research is interesting because marine species (micro- and macroorganisms) biosynthesize compounds with different chemical structures and bioactivities from terrestrial natural products. Mayotlide is a marine natural product; it was isolated by Pharmarmar from a sample of Spongia sp. Mayotlide shows a nanomolar GI50 activity. Structurally, mayotlide is an octapeptidic system and it has the characteristic trait: the bond between Trp’s – the N-indole of a Trp and the C3a of a cycled Trp: a hexahydropyrroloindole unit (HPI). Few natural products contain this Trp-HPI system in their structures until the moment, and mayotlide is the first example of a bis-macrocyclic compound with this bond. The chapter 1 of the manuscript studies the synthesis of tryptophan-pyrroloindole system, which requires the reaction between a Trp and a halogenated HPI. Two synthetic routes have been reported to afford the halogenated HPI at C3a, each of which afford one mainly different diastereomer. In addition, the most suitable orthogonal protecting groups have been selected to allow the selective growing from the Trp-HPI system. The chapter 2 is about the beginning of the synthesis of mayotlide. First, the synthesis of the A ring has been studied, which is the small ring of mayotlide. The A ring is composed of three amino acids: Trp, Ile, and HPI. Three closing points of macrocycle have been tested. Several mono and bidimensional NMR experiments have made relative stereochemistry of stereocenters possible. The second half of this chapter is about the second macrocycle formation. The elongation of peptide chain of mayotlide has been synthesized on solid phase. Then, the couplings between the peptide chain and the A ring have been performed, affording the synthetic mayotlide. The natural and synthetic mayotlide have coeluted at the same time in a HPLC. The syntheses of two analogues of mayotlide have been studied in chapter 3. The structures of these analogues are one cycle which contain the same peptide sequence of the B ring of mayotlide; one of them has change the HPI for a Trp. In addition, the activities of the A ring and one analogue have been tested.

INTRODUCCIÓN: El tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal se ha basado en el uso de aminosalicilatos corticoides e inmunosupresores, que ayudan a controlar los brotes de la enfermedad, aunque no consiguen su curación. El bloqueo de las moléculas de adhesión endotelial, que permiten el reclutamiento de leucocitos desde el lecho vascular hacia el área inflamada, podría ser una diana terapéutica útil en esta enfermedad.OBJETIVOS: 1. Determinar el valor de las moléculas de adhesión endotelial como nuevas dianas terapéuticas en la enfermedad inflamatoria del intestino. 2. Evaluar el posible valor terapéutico de su modulación con anticuerpos monoclonales bloqueantes de las moléculas de adhesión endotelial, péptidos trébol y ciclosporina A.MATERIAL Y MÉTODOS: El modelo experimental utilizado ha sido el de la colitis inducida por DSS en el ratón, que remeda la colitis ulcerosa en humanos. Para cuantificar la expresión in vivo de las moléculas de adhesión endotelial se ha recurrido a la técnica del doble anticuerpo marcado y para evaluar su expresión in vitro. a los cultivos primarios de células endoteliales de vena de cordón umbilical humano. Asimismo, para analizar las interacciones leucocito-endotelio en las vénulas del colon se ha utilizado la microscopía intravital de fluorescencia.RESULTADOS Y CONCLUSIONES: 1. En la colitis experimental inducida por DSS existe un aumento en la expresión de las moléculas de adhesión endotelial ICAM-1, VCAM-1 y MAdCAM-1 y de las interacciones leucocito-endotelio (roadamiento y adhesión) en las vénulas postcapilares del colon. 2. VCAM-1 es la principal molécula responsable del incremento de la adhesión leucocitaria al endotelio y juega un papel fundamental en la fisiopatología de la enfermedad inflamatoria intestinal experimental. 3. El inmunobloqueo sostenido de VCAM-1 tiene efecto terapéutico ya que mejora el curso de la colitis. En cambio, la inmunoneutralización de ICAM-1 o de MAdCAM-1 no altera el curso clínico en este modelo experimental. 4. El aumento de la expresión de las moléculas de adhesión endotelial VCAM 1 y MAdCAM-1 en el colon es proporcional a la gravedad de la colitis inducida. 5. El péptido trébol TFF2 es útil en el tratamiento de la colitis experimental, siendo su administración tópica superior a la sistémica 6 TFF2 produce de forma indirecta, una reducción en la expresión de las moléculas de adhesión endotelial y en el reclutamiento leucocitario que contribuye a su efecto beneficioso. 7. La ciclosporina A mejora la colitis experimental inducida por DSS en el ratón. 8. El efecto terapéutico de la ciclosporina A se debe, en parte, a que reduce la producción de citocinas proinflamatorias y la expresión de las moléculas de adhesión del endotelio, actuando directamente sobre la célula endotelial, lo que decrece el reclutamiento leucocitario hacia el intestino inflamado.SUMARIO: 1- VCAM-1 es la molécula de adhesión endotelial más importante en este modelo experimental de colitis que remeda la colitis ulcerosa en humanos- 2 El inmunobloqueo de VCAM-1, en contraste con el de ICAM-1 o MAdCAM-1, podría atenuar la respuesta inflamatoria sin alterar los mecanismos inmunes fisiológicos ya que esta molécula no está implicada en la recirculación fisiológica de los leucocitos. 3. Los trabajos que componen esta Tesis Doctoral constituyen la base racional para investigar el efecto de los anticuerpos anti-VCAM-1 en los pacientes con colitis ulcerosa. / INTRODUCTION: Treatment of inflammatory bowel disease is currently based on the use of aminosalicylates, corticosteroids and immunomodulators, which can control flares of disease but are not curative. Blockade of endothelial adhesion molecules involved in the recruitment of leukocytes from the vascular bed to the inflammatory site might be a useful therapeutic strategy in this disease.AIM: To assess the usefulness of modulation of endothelial adhesion molecules with monoclonal antibodies, trefoil peptides (TFF2), and cyclosporin A (CsA) as a therapeutic strategy for experimental colitis. MATERIAL AND METHODS: Dextran sulphate sodium (DSS)-induced colitis, a murine model that mimics human ulcerative colitis, was used. Cell adhesion molecule expression was measured by the dual radiolabeled antibody technique. Leukocyte-endothelial cell interactions were determined in colonic venules by fluorescence intravital microscopy.RESULTS AND CONCLUSIONS: 1. VCAM-1 plays a central role in leukocyte recruitment in colitis since blockade of this adhesion molecule has a higher therapeutic effect than immunoneutralization of ICAM-1 or MAdCAM-1 in this experimental model.2. TFF2 is useful in the treatment of colitis, and topical administration is superior to the systemic route. Indirect reduction in adhesion molecule expression and leukocyte recruitment into the inflamed intestine contributes to the beneficial effect of TFF2 treatment.3. CsA A ameliorates DSS-induced colitis in mice. Reduced adhesion molecule expression resulting from diminished pro-inflammatory cytokine production and from a direct effect of CsA in endothelial cells decreases leukocyte recruitment into the inflamed intestine, contributing to this protective effect. SUMMARY: 1. VCAM-1 is the most important endothelial adhesion molecule in an experimental model of colitis that mimics human ulcerative colitis. 2. VCAM-1 immunoblockade, in contrast to ICAM-1 or MAdCAM-1, can attenuate the inflammatory response without altering the physiological immune mechanisms since this molecule is not involved in the physiological recirculation of leukocytes. 3. The results of this Doctoral Thesis constitute the rationale to investigate the effects of anti-VCAM-1 antibodies in patients with ulcerative colitis.

El virus C (GBV-C) o virus de la hepatitis G (HGV) está relacionado con el virus de la hepatitis C (HCV) ya que tiene una organización genómica y una homología en la secuencia muy próxima pero, sin embargo, no parece causar hepatitis ni ningún otro tipo de patología. En los últimos años, se han publicado numerosos trabajos en los que se asocia la co-infección del GBV-C/HGV y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) con una menor progresión de la enfermedad causada por el virus VIH así como con una mayor supervivencia de los pacientes una vez que el SIDA se ha desarrollado. Basándonos en un modelo de co-infección, existen diversas teorías de cómo el virus de la hepatitis G puede influir en la enfermedad del VIH, se cree que puede inducir las quemoquinas, regular negativamente los co-receptores del VIH, así como provocar otros efectos indefinidos en los linfocitos huésped. Pero el mecanismo responsable del efecto beneficioso que el GBV-C/HGV tiene sobre el curso de la infección causada por VIH no está todavía definido. Teniendo en cuenta el posible uso de los péptidos sintéticos, el objetivo de la actual tesis doctoral es llevar a cabo la selección de péptidos de la proteína de envoltura E1 del GBV-C/HGV con potencial capacidad de inhibición del péptido de fusión del VIH-1, mediante la síntesis múltiple en paralelo de secuencias peptídicas lineales que cubren la totalidad de la estructura primaria de esta proteína y su posterior evaluación mediante ensayos biofísicos. Con ello se pretende plantear la utilización de péptidos sintéticos del GBV-C/HGV en el diseño de inhibidores de la entrada del VIH en la célula huésped. Se pretende así tratar de comprender mejor el efecto de la presencia de anticuerpos anti-GBV-C/HGV en la progresión de la enfermedad causada por la infección del VIH y de profundizar en el conocimiento actual acerca de la interacción entre estos dos virus. Se realiza la síntesis en fase sólida de 58 péptidos correspondientes a la proteína de envoltura E1 del GBV-C/HGV y mediante el ensayo de liberación de contenidos vesiculares se seleccionan 5 péptidos capaces de inhibir la capacidad del péptido de fusión (PF) del VIH-1 de formar poros en las membranas. Se realizan estudios detallados de los péptidos y de la inhibición del proceso de fusión, inducido por el péptido de fusión del VIH-1, por parte de secuencias del GBV-C/HGV. Para ello se realizan estudios de citotoxicidad, ensayos de hemólisis, estudio de la estructura mediante dicroísmo circular, ensayos de agregación de liposomas inducida por los péptidos y ensayos de transferencia de energía por resonancia. Por otra parte se realizan ensayos utilizando monocapas de extensión como modelos de membrana mediante la técnica de Langmuir-Blodgett, y se calculan las concentraciones superficial de exceso y las de saturación, información que servirá para conocer la capacidad de los péptidos para formar monocapas estables en la interfase aire/agua. Los diferentes ensayos muestran una interacción de los péptidos de la proteína E1 con el péptido de fusión del VIH-1, dando lugar a una inhibición de la actividad que el péptido de fusión del VIH-1 tiene sobre las membranas lipídicas. Esto sugiere que estos péptidos pueden ser candidatos para ser utilizados en futuras terapias antivirales. / "BIOPHYSICAL STUDIES OF SYNTHETIC PEPTIDES OF THE ENVELOPE PROTEIN E1 OF GBV-C/HGV AND ITS RELATIONSHIP WITH HIV" The virus C (GBV-C) or hepatitis G virus (HGV) is related to hepatitis C virus (HCV) because it has similar genome organization and sequence homology; however, it does not seem to cause hepatitis or any other pathology. In recent years, there have been several studies in which the GBV-C/HGV and human immunodeficiency virus (HIV) co-infection is associated with less progression of the disease caused by HIV as well as improved survival of patients after AIDS has developed. Based on a model of co-infection, there are several theories of how the hepatitis G virus can affect HIV disease: it could induce chemokines, negatively regulate the HIV co-receptors and cause other undefined effects in the host cell. But the mechanism responsible for the beneficial effect that GBV-C/HGV has over the course of infection by HIV is not yet defined. Taking into account the possible use of synthetic peptides, the aim of the present thesis is to carry out the selection of peptides from the envelope protein E1 of GBV-C/HGV with potential ability to inhibit the HIV-1fusion peptide. The aim is to better understand the effect of the presence of antibodies anti-GBV-C/HGV in the progression of AIDS and to study the interaction between these two viruses. The solid phase synthesis of 58 peptides corresponding to the envelope protein E1 of GBV-C/HGV was made and 5 peptides capable of inhibiting the ability of the fusion peptide (FP) of HIV-1 to form pores in membranes were selected by means of the leakage of vesicular contents assay. Detailed studies of the E1 peptides and their ability to inhibit the fusion process induced by the fusion peptide of HIV-1 were done. Monolayers and liposomes were used as model membranes. The different tests show an interaction of the E1 peptides with the HIV-1fusion peptide, resulting in an inhibition of the activity that the fusion peptide has on lipid membranes. This suggests that these peptides could be good candidates for future antiviral therapies.

Els pèptids són biopolímers naturals amb una importància cabdal en el cos humà, actuant com a neurotransmissors, endorfines o hormones. Recentment, s’han descobert propietats molt interessants de pèptids amb aplicacions científiques en camps tan diversos, com ara cosmètica, biotecnologia o química terapéutica. En el darrer cas, destaquen especialment certs pèptids d’origen marí amb una considerable activitat antitumoral, alguns dels qual es troben actualmente en avançades fases clíniques. Amb la intenció de millorar les propietats farmacològiques i farmacocinètiques dels pèptids bioactius, es dissenyen anàlegs que sovint impliquen una dificultat sintètica afegida. En aquest escenari, resulta bàsic comptar amb eines químiques adequades i potents. La present tesi doctoral s’enmarca en el desenvolupament de nous reactius d’aplicació en metodologia de síntesi peptídica. Les mol•lècules que presenten grups N-hidroxilamina àcids tenen un gran rellevància en metodologia de síntesi de pèptids, degut al seu excel•lent caràcter com a grup de sortida en substitucions nucleofíliques. D’entre les diverses famílies que formen aquest grup cal esmentar els benzotriazols, tals com HOBt i HOAt, i les sals d’oni derivades. No obstant, en els darrers anys s’ha conegut la seva tendència a descomposar de manera explosiva en escalfar o sota impacte mecànic, raó per la qual el transport d’aquests reactius per aire s’ha vist restringit o prohibit. Amb la necessitat de disposar d’una nova família de N-hidroxilamines eficient i segura, s’ha posat l’atenció en una classe d’oximes amb substituents electroatraients, que mostren una acidesa en el rang necessari per ser aplicades en la formació de l’enllaç peptídic. Particularment interessant resulta el 2-ciano-2-hidroxiiminoacetat d’etil, reanomenat en aquesta tesi com a Oxyma, que combina de forma òptima estabilitat, reactivitat i disponibilitat comercial. En la present tesi doctoral s’ha estudiat el comportament d’Oxyma i les sals d’uroni (COMU) i fosfoni (PyOxim) derivades, en comparació amb HOBt, HOAt i els corresponents reactius d’acoblament. Els resultats obtinguts mostren un notable increment de la solubilitat, disminució de l’epimerització i augment de l’eficiència d’acoblament quan s’usen reactius basats en Oxyma, sent en models impedits estèricament fins i tot més eficaços que els anàlegs de HOAt. A més, s’ha investigat el perfil de descomposició de Oxyma i COMU, en comparació amb els dels benzotriazols, mitjançant els assajos calorimètrics DSC i ARC. Els resultats permeten concloure que els reactius d’acoblament basats en Oxyma mostren una cinètica de descomposició radicalment oposada a la dels benzotriazols, tot alliberant menys pressió i per tant, el risc tèrmic és també molt menor. Per últim, s’ha comprovat la compatibilitat dels reactius basats en Oxyma amb irradiació per microones. El caràcter de bon grup sortint de les oximes àcides s’ha reafirmat en la síntesi i evaluació de carbonats actius per a la introducció dels grups protectors Fmoc i Alloc. De manera especial, els derivats de ciano-2-piridino oxima van mostrar un alt rendiment amb una formació pràcticament nul•la de dipèptids. Així mateix, l’elevada acidesa d’Oxyma es pot aplicar també en la prevenció de reaccions secundàries catalitzdes per base, com ara aspartimides i piperidides. En aquest sentit, Oxyma indueix una minimització d’aquesta ciclació intramol•lecular i altres reaccions indesitjades causades per la presència de base en una extensió major que HOBt i HOAt. D’altra banda, la reïna 2-clorotritil, utilitzada en la obtenció de pèptids àcid C-terminal protegits, s’ha mostrat estable a tractament d’Oxyma sempre i quan aquests no superin les 24 hores, moment en el que el percentatge de pèptid escindit del suport polimèric pot pujar fins 5%, similar o inferior a l’efecte originat amb tractament de HOBt i HOAt. / Peptides are naturally-ocurring biopolymers that exert essential functions in the human body. Moreover, many applications of peptides have been found recently in cosmetics, biotechnology, drug delivery or medicinal chemistry. Some marine peptidic natural products, in example, show remarkable antitumoral activity and are currently on Phase II clinical trials. Reinforcing available methodological tools in peptide synthesis is basic to overcome the synthetic challenges that pose sophisticated, drug-like peptides. Nowadays, this feature is more relevant since peptide science is facing the fall of N-hydroxybenzotriazoles, such as HOBt and HOAt, as carbodiimide additives due to their explosive potential. The present doctoral manuscript aims at developing novel efficient and safe coupling reagents with application in methodology of peptide synthesis. Organic compounds containing acidic N-hydroxylamine moieties are of great utility in peptide synthesis. Our attention was drawn to a series of stable, highly acidic oximes bearing electron-withdrawing substituents. Among these, ethyl 2-cyano-2-hydroxyiminoacetate (renamed as Oxyma) displays an appropriate balance of stability, reactivity, racemization suppression and comercial availability. Based on promising preliminary reports, an exhaustive study on Oxyma and novel derived onium salts, such as COMU or PyOxim, was undertaken. Results showed a remarkable increase on solubility, epimerization reduction and coupling efficiency when Oxyma and the derived reagents were employed. Moreover, DSC and ARC calorimetric assays, proved that Oxyma-based reagents present slower decomposition kinetics combined with lower termal risk than benzotriazoles. Finally, Oxyma-containing reagents proved to be compatible with microwave. The extraordinary leaving group ability of such acidic oximes was confirmed in the synthesis and evaluation of active carbonates for the introduction of Fmoc and Alloc. Use of Cyano-2-pyridine oxime analogues resulted in high yield of Fmoc-amino acid with minimal dipeptide formation. In addition, the high acidity of Oxyma can be also applied to prevention of base-driven side reactions, like aspartimides or Pro-based overcoupling, in which Oxyma induced a stronger minimization than HOBt and HOAt. Moreover, extremely acid-labile 2-chlorotrityl resin proved to be stable to Oxyma treatments shorther than 24 hours, when the percentage of released peptide rises to 5%, a similar or lower effect to that originated by HOBt and HOAt treatments.

En aquesta Tesi, un nou biomaterial de disseny composat per seqüències peptídiques repetitives i amfifíliques, que per autoensamblatge forma xarxes de nanofibres (i hidrogels), AcN-RADARADARADARADA-CONH2, s´ha utilitzat com a anàleg de la matriu extracel·lular per al manteniment, proliferació i diferenciació cel·lular. Aquest pèptid s'ha funcionalititzat amb motius biològicament actius procedents de proteïnes de la matriu extracel·lular incloent laminina-1 i colàgen IV. El scaffold peptídic autoensamblant RAD16-I i els seus derivats biològicament actius s´han caracteritzat i provat utilitzant diferents sistemes cel·lulars com pot ser les cèl·lules d'aorta humanes (HAEC), hepatocits madurs i la línea progenitora de fetge (Lig-8). La proteòlisi d'aquest pèptid s'ha avaluat utilitzant tripsina com a enzim proteolític, i els fragments resultants s'han analitzat per MALDI-TOF i AFM. Així mateix, la segona generació de biomaterials basats en el RAD16-I s'ha provat tant amb HAEC com amb hepatocits madurs. Amb aquests sistemes hem demostrat que el desenvolupament d'una matriu biomiètica reforça, a la vegada que manté, les funcions específiques de cada teixit. En particular, els resultats obtinguts en diferenciació, proliferació i manteniment de la funció cel·lular utilitzant pèptids sintètics autoensamblants són comparables amb els resultats que s'obtenen utilitzant matrius biològiques (Colàgen I i Matrigel). Això indica que els nostres anàlegs de la matriu extracel·lular poden substituir als materials naturals, i suggereix l'ús d'aquests materials intel·ligents amb capacitat instructiva en aplicacions terapèutiques. Així mateix s'ha provat que l'ús d'aquests pèptids auto-ensamblants és eficient en la construcció d'un nínxol de cèl·lules mare. Hem sigut capaços de controlar la cinètica cel·lular (de simètrica a assimètrica) induint diferenciació funcional, a la vegada que es mantenia una petita proporció de cèl·lules no diferenciades. Aquests resultats indiquen clarament que hem sigue capaços d'obtenir un nínxol on cèl·lules primitives (Lig-8) es diferencien adquirint funcions d'hepatocits madurs. Hem desenvolupat una plataforma de biomaterials que es podrien utilitzar per la funcionalització amb innumerables biomolècules amb capacitat d'induir processos biològics com la diferenciació, proliferació i funció metabòlica. Aquests biomaterials, preveiem que tindran un gran impacte a l'àrea terapèutica i biología regenerativa. / En esta Tesis, un nuevo biomaterial de diseño compuesto por secuencias peptídicas repetitivas y amfifílicas que por autoensamblaje forma redes de nanofibras (e hidrogeles), AcN-RADARADARADARADA-CONH2 (RAD16-I), se ha utilizado como análogo de la matriz extracelular para el mantenimiento, proliferación y diferenciación celular. Este péptido se ha funcionalizado con motivos biológicamente activos procedentes de proteínas de la matriz extracelular incluyendo laminina-1 y colágeno IV. El scaffold peptídico autoensamblante RAD16-I y sus derivados biológicamente activos se han caracterizado y probado utilizando diferentes sistemas celulares como puede ser células endoteliales de aorta humanas (HAEC), hepatocitos maduros y la línea progenitora de hígado Lig-8. La proteólisis de este péptido se ha evaluado utilizando tripsina como enzima proteolítico, y los fragmentos resultantes se han analizado por MALDI-TOF y AFM. Asimismo, la segunda generación de biomateriales basados en el RAD16-I se ha probado tanto con HAEC como hepatocitos maduros. Con estos sistemas hemos demostrado que el desarrollo de una matriz biomimética refuerza a la vez que mantiene las funciones específicas de cada tejido. En particular, los resultados obtenidos en diferenciación, proliferación y mantenimiento de la función celular utilizando los péptidos sintéticos auto-ensamblantes son comparables con los resultados que se obtienen usando matrices biológicas (Colágeno I y Matrigel). Esto indica que nuestros análogos de la matriz extracelular pueden reemplazar a los materiales naturales, y sugiere el uso de estos materiales inteligentes con capacidad instructiva en aplicaciones terapéuticas. Asimismo, se ha probado que el uso de estos péptidos auto-ensamblantes es eficiente en la construcción de un nicho de células madre. Hemos sido capaces de controlar la cinética celular (de simétrica a asimétrica) induciendo diferenciación funcional, a la vez que se mantenía una pequeña proporción de células no diferenciadas. Estos resultados indican claramente que hemos sido capaces de obtener un nicho donde células primitivas (Lig-8) se diferencian adquiriendo funciones de hepatocitos maduros. Hemos desarrollado una plataforma de biomateriales que se podrían utilizar para la funcionalización con innumerables biomoléculas con capacidad de inducir procesos biológicos como la diferenciación, proliferación y función metabólica. Estos biomateriales preveemos que tendrán un gran impacto en el área terapéutica y biología regenerativa. / In this Thesis, a new designed biomaterial made out of short repetitive amphiphilic peptide sequence AcN-RADARADARADARADA-CONH2 (RAD16-I) that self-assembles forming nanofiber networks (hydrogel scaffold) has been used as synthetic extracellular matrix analog for cell maintenance, proliferation and differentiation. This peptide has been functionalized with biological active motifs from extracellular matrix proteins including laminin-1 and collagen IV. The prototypic self-assembling peptide scaffold RAD16-I and its biologically active derivatives have been characterized and tested using several cellular systems such as human aortic endothelial cells (HAEC), mature hepatocytes and a putative liver progenitor cell line, Lig-8. The proteolysis of the peptide RAD16-I has been evaluated using trypsin as a proteolytic enzyme and the resulting fragments have been analyzed by MALDI-TOF and AFM. Moreover the second generation of RAD16-I-based biomaterials have been tested using HAEC and mature hepatocytes. With these systems we have shown that the development of a biomimetic matrix enhances as well as maintain tissue-specific functions. In particular, the results obtained in cell differentiation, proliferation and maintenance of cell function using the synthetic self-assembling peptide matrices, are comparable with the results obtained using natural biological matrices counterparts (Collagen-I and Matrigel). This indicates that our extracellular matrix analogs can replace the use of naturally-derived materials and suggests the use of these smart biomaterials with instructive capacity for cells in therapeutics. Moreover, the use of the self-assembling peptide RAD16-I in the recreation of a stem-cell niche proved to be highly efficient. We were able to control stem-cell kinetics (from symmetric to assymetric) inducing functional differentiation while maintaining a small proportion of undifferentiated cells. This striking results clearly indicate that we were able to obtain a stem-cell niche where primitive cells (Lig-8) undergo differentiation acquiring mature hepatic functions. We have developed a biomaterial platform that can be used for functionalization with innumerable biomolecules, with capacity to induce biological processes like differentiation, control of proliferation, metabolic function, etc. These biomaterials will have a strong impact in therapeutics and regenerative biology.

Aquesta tesi doctoral se centra en l'estudi de l'aplicació de pèptids antimicrobians en la lluita contra agents patògens de cultius de plantes d'interès econòmic.L'estratègia sintètica s'ha portat a terme utilitzant metodologies convencionals de síntesi de pèptids en fase sòlida com l'estratègia tridimensional ortogonal Fmoc/tBut/Allyl. Ha calgut fer la recerca de les condicions òptimes per a l'eliminació del grup Allyl i la ciclació. D'entre els pèptids cíclics de 4-10 aminoacids sintetitzats, el decapèptid c(Lys-Leu-Lys-Leu-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Gln) ha resultat ésser el més efectiu i s'ha pres com a base per al disseny d'una quimioteca de 56 pèptids. Dels resultats obtinguts s'ha sintetitzat una segona quimioteca basada en l'estructura general c(X1-X2-X3-X4-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Gln) determinada com la que posseix el millor perfil d'activitat. Els pèptids més efectius obtinguts constituixen els primers exemples de pèptids cíclics actius contra E. amylovora i poden ser considerats com a bons candidats pel desenvolupament d'agents antimicrobians efectius en protecció vegetal. / This PhD thesis was centred on the study of the application of de novo designed head-to-tail cationic cyclic peptides as inhibitors of the plant pathogenic microorganisms responsible for diseases in plants of great economic importance.The solid-phase synthesis of the cyclopeptides was carried out using a three-dimensional orthogonal Fmoc/tBut/Allyl strategy. The optimisation study of the allyl group removal and of the head-to-tail cyclization of linear peptides on SynPhase Lanterns was required for the syntheses. From the synthesized cyclic peptides of 4 to 10 residues, the cyclodecapeptide c(Lys-Leu-Lys-Leu-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Gln) was the most active and has been used as parent peptide in a using a combinatorial chemistry approach. From the results, a second library based on the structure c(X1-X2-X3-X4-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Gln) has been synthesized. The best cyclodecapeptides are the first examples of cyclic peptides effective against E. amylovora and make them potential candidates for the development of antimicrobial agents for use in plant protection.

Els aminoàcids biarílics es troben en una àmplia varietat de pèptids naturals amb important activitat biològica. Concretament, les arilhistidines formen part de les aciculitines, pèptids amb activitat citotòxica i antifúngica, La reacció de Suzuki-Miyaura és el mètode més versàtil per obtenir biarils assimètrics, encara que, fins el moment, no s'havia aplicat per a l'arilació de l'imidazole de la histidina. L'objectiu general d'aquesta tesi fou demostrar que es podia arilar l'imidazole de la histidina en fase sòlida mitjançant una reacció de Suzuki-Miyaura. En primer lloc, es sintetitzaren 4(5)-metil-5(4)-fenilimidazole i 4(5)-metil-5(4)-(2-metoxifenil)imidazole a través de l'acoblament creuat entre un N-benzilbromoimidazole i el corresponent àcid arilborònic. Posteriorment, s'arilaren 5-bromohistidines utilitzant diversos àcids arilborònics mitjançant una reacció de Suzuki-Miyaura assistida per irradiació micrones, tant en dissolució com en fase sòlida. I finalment, mitjançant aquesta metodología, es sintetitzaren pèptids antimicrobians contenint 5-arilhistidines actius contra bacteris gram-negatius responsables d'importants malalties en plantes com el foc bacterià. / Biaryl amino acids are present in a great variety of natural peptides which display important biological activities. In particular, arylhistidines naturally occur in cytotoxic and antifungal marine peptides, aciculitins. The Suzuki-Miyaura cross-coupling is the most versatile method to obtain unsymmetrical biaryls. Up to now, it had not been applied to the arylation of the histidine imidazole ring. The main objective of this thesis was to demonstrate that a Suzuki-Miyaura reaction was amenable to solid-phase arylation of the histidine imidazole ring. Firstly, it was synthesized 4(5)-methyl-5(4)-phenylimidazole and 4(5)-methyl-5(4)-(2-methoxyphenyl)imidazole by cross-coupling between N-benzylbromoimidazole and the corresponding arylboronic acid. Secondly, 5-bromohistidines were arylated with several arylboronic acids by a microwave-assisted Suzuki-Miyaura cross-coupling reaction in solution as well as solid-phase leading to the corresponding arylhistidines. Finally, antimicrobial peptides containing 5-arylhistidines were prepared using the previous methodology. They showed activity against gram-negative bacteria responsible of important plant diseases such as fire blight.