Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / La migración de los linfocitos a los órganos linfoides secundarios es un paso crucial en la iniciación de la respuesta inmune adquirida. Este fenómeno es caracterizado por múltiples eventos que requieren de interacciones entre el endotelio y el linfocito, e involucra la participación de diversas moléculas que favorecen la migración de los linfocitos a través de las células endoteliales columnares (HEC). La transmigración es un proceso activo que depende del estado de activación y diferenciación de los linfocitos y de señales específicas de las células endoteliales. Diversos estudios han demostrado que los linfocitos T de memoria migran selectivamente a través de células endoteliales a sitios de inflamación y/o infección. Además, ciertas evidencias sugieren que la expresión de moléculas MHC-II por células endoteliales facilitan el reclutamiento de linfocitos T antígeno específicos, hacia un tejido. Por otra parte, en nuestro laboratorio hemos demostrado que la adhesión de linfocitos B a células endoteliales columnares derivadas de amígdalas humanas (HUTEC) induce la activación endotelial, conduciendo a la producción de diversas citoquinas y quimioquinas. En esta tesis determinamos que la adhesión de linfocitos B a HUTEC permite la presencia de moléculas MHC-II en la superficie endotelial, además de la producción de un patrón de expresión diferencial de quimioquinas, las cuales podrían estar involucradas en la transmigración de los linfocitos. Los resultados muestran que la presencia de moléculas MHC-II en la superficie de las células endoteliales depende de la adhesión de los linfocitos B, pero no de linfocitos T. Sin embargo, MHC-II no se induce a nivel transcripcional, sugiriendo que las HUTEC adquieren moléculas MHC-II de los linfocitos B humanos durante el proceso de adhesión celular. Además, el contacto de los linfocitos B a HUTEC induce la expresión del mRNA de las quimioquinas CCL2, CCL3, CCL5, CCL7, CXCL8, entre otras. Demostramos que el efecto de la adhesión de linfocitos B a HUTEC induce la transmigración de linfocitos T de memoria central. Por otra parte, investigamos el efecto de factores soluble secretados por HUTEC y/o linfocitos B, después del contacto, en la migración transendotelial. Nuestros resultados muestran que no son necesarios los factores solubles para un incremento en la transmigración, aunque estos factores permiten una migración más eficiente de los linfocitos T. En conclusión, estos resultados sugieren que la interacción de linfocitos B con células endoteliales modula la respuesta inmune, favoreciendo la transmigración preferencial de linfocitos T CD4+ de memoria central / Lymphocytes migration to secondary lymphoid organs is a crucial step in the initiation of the acquired immune response. This phenomenon is characterized by multiple events that require interactions between the endothelium and lymphocytes, and involves diverse molecules that favor the migration of T lymphocytes across the high endothelial cells (HEC). Transmigration is an active process that depends on the state of activation and differentiation of T lymphocytes and specific signals of endothelial cells. Diverse studies have demonstrated that memory T lymphocytes selectively migrate across endothelial cells to sites of inflammation and/or infection. In addition, certain evidences suggest that expression of MHC-II molecules by endothelial cells facilitate the recruitment of antigen specific T lymphocytes towards a tissue. On the other hand, in our laboratory we have demonstrated that the adhesion of B lymphocytes to high endothelial cells derived from human tonsils (HUTEC) induces endothelial activation, leading to the production of several cytokines and chemokines. In this thesis we determined that the adhesion of B lymphocytes to HUTEC cells allows the presence of MHC-II molecules on the endothelial surface, in addition to the production of a differential expression pattern of chemokines, which could be involved in the lymphocytes’ transmigration. These results show that the presence of MHC-II molecules on the surface of endothelial cells depends on the adhesion of B lymphocytes, but not T lymphocytes. However, MHC-II is not induced at transcriptional level, suggesting that HUTEC cells acquire MHC-II molecules from human B lymphocytes during the process of cellular adhesion. In addition, the contact of B lymphocytes to HUTEC cells induces the mRNA expression of chemokines such as CCL2, CCL3, CCL5, CCL7, CXCL8, among others. We demonstrated that the effect of the adhesion of B lymphocytes to HUTEC cells induces the memory central T lymphocytes transmigration. In the other hand, we investigated the effect of soluble factors secreted by HUTEC cells and/or B lymphocytes, after the contact between them, in the transendotelial migration. Our results show that although soluble factors are not necessary to increase the transmigration, these factors allow a more efficient migration of T lymphocytes. In conclusion, these results suggest that the interaction of B lymphocytes with endothelial cells modulates the immune response, favoring the preferential transmigration of central memory CD4+ T lymphocytes

El síndrome antifosfolípido (SAF) es una enfermedad autoinmune sistémica, que se caracteriza por la presencia conjunta de trombosis vascular o complicaciones obstétricas (pérdida fetal o abortos espontáneos a repetición) y la presencia de anticuerpos antifosfolípidos (aFLs) en el plasma de los pacientes. El mecanismo por el cual esos anticuerpos producen la enfermedad no se comprende totalmente, y esto se debe a la poli especificidad de estos anticuerpos, la multiplicidad de los sitios de acción y por la variabilidad del contexto clínico en donde se presenta la enfermedad. Mediante estudios in vitro e in vivo se demostró que la actividad trombogénica de los aFLs esta determinada entre otras por la interferencia que producen estos anticuerpos con el sistema hemostático: inhiben el camino de la proteína C activada, impiden la normal fibrinolisis y producen la activación celular, principalmente células endoteliales, monocitos y plaquetas. En las células endoteliales (CE) y en los monocitos, los aFLs incrementan la expresión de FT y moléculas de adhesión, mientras que en las plaquetas se observó un aumento en la producción plaquetaria de TXA2, agregación y liberación de los gránulos plaquetarios en presencia de dosis subagregantes de diferentes agonistas. Con el fin de dilucidar los mecanismos intracelulares involucrados en la activación celular mediada por los aFLs, se estudió el rol de la p38 MAPK, una proteína serina/treonina quinasa, que constituye la mayor cascada de transducción de señales inflamatorias desde la superficie celular hacia el núcleo. En este trabajo de tesis se comprobó que los aFLs producen la activación de la p38 MAPk en las plaquetas y en las CE, y que esta vía de activación intracelular es en gran parte responsable del incremento de la activación plaquetaria y de las CE, debido a que los efectos protrombóticos y proinflamatorios de los aFLs son disminuyen significativamente cuando se inhibe la p38MAPk con el inhibidor especifico SB20380. / Antiphospholipid Syndrome (APS) is a systemic autoimmune disease, characterized by the joint presence of vascular thrombosis or obstetric complications (fetal loss or recurrent spontaneous abortions) and the presence of antiphospholipid antibodies (aPL) in the plasma of patient. The mechanism by which these antibodies cause disease is not fully understood, and this is due to the poly specificity of these antibodies, multiple sites of action and variability of clinical context where the disease occurs. Using in vitro and in vivo showed that the thrombogenic activity of aPL is determined among others by the interference caused by these antibodies with the hemostatic system: the way to inhibit activated protein C, prevent normal fibrinolysis and cell activation occur mainly endothelial cells, monocytes and platelets. In endothelial cells (EC) and monocytes, AFLS increase TF expression and adhesion molecules, whereas in platelets was observed an increase in platelet production of TXA2, platelet aggregation and release in the presence of doses of subagregantes different agonists. In order to elucidate the intracellular mechanisms involved in mediated cell activation by the aPL, we studied the rol of p38 MAPK, a protein serine / threonine kinase, which constitutes the major transduction cascade of inflammatory signals from the cell surface to the nucleus. In this thesis aPLs were found to produce the activation of p38 MAPK in platelets and EC, and that the intracellular activation pathway is largely responsible for the increased platelet activation and EC, because that prothrombotic and proinflammatory effects of aPLs are significantly diminished when p38MAPK was inhibited with specific inhibitor SB20380.

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Las células de un organismo multicelular se comunican a través una amplia variedad de mecanismos que incluyen no sólo la transferencia directa por contacto célula-célula, sino también la secreción de las moléculas y vesículas que viajan a otras células. Las células de mamíferos segregan una gran variedad de vesículas extracelulares (EV). Los exosomas son vesículas extracelulares con un tamaño de entre 20-100 nanometros que pueden transferir información en forma ácidos nucleicos o proteínas entre diferentes células por lo que son reconocidos como un potente mecanismo de comunicación intercelular. Este tipo de vesículas está siendo objeto de intensa investigación no solo en el proceso de metástasis tumoral, ya que se cree que los exosomas están relacionados con la extensión del tumor a órganos no relacionados, sino en el ámbito de la medicina regenerativa, puesto que se consideran potenciales candidatos implicados en los mecanismos paracrinos inducidos por las células madre. Por este motivo, en este trabajo se analizó el potencial terapéutico de los exosomas derivados de células madre mesenquimales (MSC). Así, nos planteamos la hipótesis de que las MSC fueran capaces de transferir exosomas hacia las células de los tejidos que reparan. Un trabajo reciente de nuestro grupo de investigación demostró que la sobreexpresión del factor inducible por hipoxia 1α (HIF-1α) en MSC (MSC-HIF) potenciaba la capacidad terapéutica de las MSC para mejorar la función cardiaca tras un infarto agudo de miocardio (IAM). En consecuencia, estudiamos el contenido de microRNAs en los exosomas derivados de las MSC y las MSC-HIF. Se observó que las poblaciones de microRNAs presentes exosomas derivados de MSC y MSC-HIF cambiaron de manera reproducible en función de la disponibilidad de oxígeno que poseían las células, lo que interpretamos como un mecanismo respuesta celular mediada por exosomas. Así también, observamos que en las MSC-HIF la combinación de la sobreexpresión de HIF-1α con las bajas tenciones de oxigeno generaban exosomas cargados con microRNAs con potencial terapéutico para el tratamiento del IAM. Sin embargo, no fuimos capaces de demostrar el potencial terapéutico de los exosomas aislados de dichas poblaciones celulares en un modelo de infarto experimental en rata, lo que pudo ser ocasionado por un diseño incorrecto del procedimiento experimental. Esto provocó un giro en la orientación de la tesis y decidimos centrarnos en los mecanismos celulares inducidos por los exosomas en el entorno cardiaco. En este contexto, recientemente se ha descrito la presencia de exosomas en cardiomiocitos (CM) humanos. A nivel de ultraestructura, la anatomía del tejido cardiaco revela una intrínseca relación entre los CM y las células endoteliales (ECs) que componen el endotelio microvascular coronario, el cual se encarga de nutrir a los CM realizando el transporte de combustibles metabólicos desde la sangre hacia los CM. El espacio perivascular que separa a los CM de las ECs es de tan solo 1µm, permitiendo el flujo de información a corta distancia entre los CM y las ECs. Mantener esta disposición es fundamental para lograr un acople metabólico entre ambos tipos celulares. El corazón no posee reservas apreciables de combustibles metabólicos por lo el aporte de nutrientes y oxigeno debe ser continuo y regulado. Por esto pensamos que el aporte energético del endotelio hacia el corazón debería estar finamente coordinado, no solo por el control exógeno del metabolismo en todo el organismo sino también por algún mecanismo en el que el propio cardiomiocito regule el trasporte de su célula endotelial asociada. Además se sabe que las ECs liberan factores que alteran la actividad de los CM, y de la misma manera que los CM liberan factores que alteran las ECs. Sin embargo, se conoce poco a cerca de los mecanismos que regulan el flujo de nutrientes desde las ECs hacia los CM, especialmente es situaciones de estrés agudo en donde se requiere un mecanismo activo a nivel local que regule el trasporte endotelial. En este trabajo se estudió cómo los exosomas derivados de los CM alteraban el transporte de glucosa en ECs. En primer lugar mostramos datos que indican que el ayuno de glucosa incrementa la síntesis y secreción de exosomas en cultivos de CM neonatales de rata. En segundo lugar demostramos que estos exosomas derivados de CM son internalizados por las ECs en una manera dependiente de la disponibilidad de glucosa del medio. Por último aportamos evidencias de que los exosomas derivados de los CM que fueron cultivados en condiciones de ayuno de glucosa fueron capaces de trasferir trasportadores de glucosa (GLUTs) hacia las ECs, en donde estos GLUTs trasferidos mediante exosomas incrementaron la captación de glucosa y la actividad glicolítica de las ECs. Tomando en conjunto los resultados, en la presente tesis se propone un modelo de comunicación entre los CM y las ECs, en el cual el tráfico de proteínas mediado por exosomas desde los CM hacía las ECs trasladaría las necesidades metabólicas de los CM a las ECs las cuales están en contacto directo con los nutrientes presentes en el flujo coronario. Este novedoso mecanismo de acción a corta distancia revela una relación intrínseca entre la demanda de glucosa de los CM y el transporte de glucosa de las ECs permitiendo una rápida respuesta desde las ECs al incrementar la cantidad de transportadores de glucosa sin necesidad de síntesis de novo ni de la modificación de los perfiles de transcripción génica, lo que sin duda aumenta la eficiencia del proceso de comunicación celular. / García, NA. (2014). Estudio de la comunicación intercelular mediada por exosomas y sus implicaciones terapéuticas [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/48165

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La búsqueda de tratamientos alternativos para el cáncer es un gran desafío para la comunidad científica moderna, ya que la aparición de resistencia a los tratamientos utilizados, por parte de los diversos tipos de tumor, es un problema aún sin resolver. Se ha visto y comprobado que la angiogénesis (desarrollo de nuevos vasos a partir de vasos preexistentes) es un fenómeno estrechamente ligado al crecimiento tumoral y la capacidad metastásica del cáncer, por lo que su limitación es un nuevo camino de investigación en búsqueda de un tratamiento definitivo. Con el objetivo de estudiar el efecto angiogénico tumoral analizamos el efecto del implante intramuscular profundo de tumor TA3-MTX-R. en el modelo de ratón (Mus musculus) AJ hembras, clínicamente sanas. Para ello, se utilizaron 2 grupos de 8 ratones cada uno. Un grupo control (A) al cual se le aplicó suero fisiológico y un grupo experimental (B), al cual se le inoculó por vía intramuscular tumor el mismo día. A los ratones se les realizó mediciones del crecimiento tumoral y se esperó hasta la muerte natural de estos, debido al tumor primario y sus metástasis. Se realizó estudio histológico e inmunohistoquímico con conteo de los capilares en un área de estudio estándar, para evaluar angiogénesis, tanto en tumor como en tejidos blanco de metástasis. Los resultados se analizaron estadísticamente, mostrando un importante aumento en la angiogénesis de los ratones con tumor versus los controles. Se constató también que el tumor tiene la capacidad de sacar a las células endoteliales de su estado de reposo del ciclo celular (G0), para hacerlas entrar en una proliferación acelerada

Las calcificaciones vasculares y la osteoporosis son patologías prevalentes en mujeres postmenopáusicas. Ambos trastornos se caracterizan por una distorsión de la arquitectura natural del tejido, donde la inflamación y el estrés oxidativo son condiciones que subyacen. La existencia de posibles mecanismos fisiopatológicos compartidos presupone la posibilidad de nuevas estrategias terapéuticas comunes. Los resultados controvertidos sobre el riesgo/beneficio de la terapia de sustitución hormonal para prevenir patologías asociadas a la menopausia, ha incentivado la búsqueda de nuevas opciones de tratamiento. Los fitoestrógenos se posicionaron como una opción. En este trabajo de tesis se investigó el rol del fitoestrógeno Genisteína en los procesos celulares involucrados en la transformación ósea del lecho vascular, en la remodelación ósea y en la interacción óseo-vascular. A nivel vascular demostramos que la Genisteína regula los procesos celulares involucrados en la calcificación vascular. Empleando cultivos primarios determinamos que, en células endoteliales Genisteína estimula la síntesis de óxido nítrico, ejerce un balance positivo sobre el crecimiento celular favoreciendo su supervivencia frente al estrés oxidativo. Así mismo, en condiciones de inflamación, la Genisteína previene la expresión de moléculas de adhesión celular endoteliales y de integrinas monocíticas involucradas en la adhesión de los mononucleares al endotelio vascular. En células musculares lisas vasculares (CMLV) el tratamiento con el fitoestrógeno previene la transformación celular a linaje símil osteoblástico. En un modelo experimental de transdiferenciación ósea de CMLV, demostramos que la isoflavona reduce la actividad fosfatasa alcalina y la formación de nódulos de calcio en la matriz extracelular de CMLV. Los resultados se corroboraron por ensayos ex vivo, demostrando una marcada disminución en la formación de áreas de calcificación en el tejido aórtico intacto. A diferencia de la acción anti-ósea evidenciada en el sistema vascular, a nivel óseo la Genisteína estimula la osteoblastogénesis y la osteoclastogénesis. La diferenciación de preosteoblastos a osteoblastos maduros se demostró por la estimulación de marcadores tempranos de diferenciación (Runx-2 y REα), por el aumento de la actividad fosfatasa alcalina y del depósito de colágeno y, por la estimulación de la mineralización de la matriz extracelular. En cocultivos de osteoblastos-monocitos, y a través de análisis de cambios morfológicos y expresión de la enzima fosfatasa ácida tartrato resistente, se demostró que Genisteína favorece la maduración monocítica a osteoclastos diferenciados. Desde un punto de vista molecular, el mecanismo de acción del fitoestrógeno incluye la participación del receptor de estrógenos y la vía óxido nítrico sintasa. En su conjunto, los resultados de este trabajo de tesis evidencian una acción selectiva y diferencial de la Genisteína según el tipo celular sobre el cual actúa. Adicionalmente se demostró la existencia de una interacción bidireccional ósea-vascular favoreciendo el crecimiento celular y la angiogénesis. Si bien los datos aportados corresponden a ensayos in vitro en sistemas aislados, sugieren una potencial acción dual de la Genisteína a favor del mantenimiento de la arquitectura natural de ambos tejidos. De confirmarse estas acciones en modelos in vivo se aportaría fundamento para fomentar el consumo de fitoestrógenos como alternativa para promover la salud ósea y cardiovascular. / Although soy phytoestrogen are proposed to prevent or improve postmenopausal vascular and bone diseases, the currently available data are controversial and unclear. In this thesis we investigated the molecular and biochemical action of the isoflavone Genistein on the cellular events involved in vascular calcification and in bone remodeling. We also focused our attention on the interactions between bone and vascular cells. At vascular level, the data obtained supported the hypothesis that Genistein prevents in vitro vascular calcification. To that end, rat aortic vascular cell cultures and murine monocytes in vitro, exposed to Genistein were employed. Genistein down-regulated the expression of endothelial cell adhesion molecules and monocytes integrins, involved in stable leukocyte attachment induced by a pro-inflammatory environment. In endothelial cells, promotes nitric oxide synthesis and under oxidative stress favors cell growth and survival. On vascular muscle cells, the isoflavone markedly reduced cell proliferation and migration. In order to study vascular calcification, muscle cells transdifferentiation into osteoblasts like cells was evaluated. The expression of alkaline phosphatase and the presence of calcified nodules in the extracellular matrix were selected as features of vascular muscle cells transdifferentiation. Both osteoblastic markers were significantly reduced after Genistein treatment. These data were corroborated in ex vivo assays using aortic tissue, where the presence of calcified areas was significantly reduced by Genistein treatment. In contrast to this anti-osteogenic action, on bone cells Genistein promoted osteoblastogenesis and osteoclastogenesis. The isoflavone promoted calvaria preosteoblast differentiation with an earlier up-regulation of the estrogen receptor alpha gene expression and the enhancement of mRNA levels of the Runt-related transcription factor 1 mRNA expression. The differentiative effect was accompanied through, an increase of alkaline phosphatase activity, extracellular collagen deposition and increased matrix mineralization. Using co-cultures of osteoblasts and monocytes, and tartrate resistant acid phosphatase staining, we found that Genistein induced osteoclast differentiation from mononuclear blood cells. The mechanisms displayed by Genistein involved the participation of estrogen receptor and nitric oxide pathway. We also obtained evidence that Genistein acted through a bidirectional cross link between bone and vascular cells, that modulates cells growth and enhanced angiogenesis. Although our data arise from in vitro assays employing isolated cells and required confirmation using in vivo animal models, provide knowledge that support the hypothesis that phytoestrogens could be useful for cardiovascular and bone health.

L’alteració anòmala de la resposta inflamatòria és la causa de moltes patologies com l’aterosclerosi, les malalties autoimmunes, la fibrosi pulmonar, l’asma o el rebuig en el trasplantament d’òrgans. Les cèl•lules endotelials i les cèl•lules dendrítiques (CDs) són són cèl•lules presentadores d’antigen (CPAs) claus en aquest procés. Les cèl•lules endotelials estan en contacte directe amb el sistema immune i són un component essencial de la vasculatura. Les CDs juguen un paper crític en la regulació de la resposta inmunitària adaptativa. Els principals objectius d'aquesta tesi han estat: 1) Realitzar una anàlisi comparativa dels perfils globals resultants de la interacció d’ambdues isoformes de CD40L (sCD40L i mCD40L) amb el receptor CD40 en cèl•lules endotelials. CD40 (TNFRSF5) és una proteïna de membrana que s’expressa en totes les CPAs. El seu lligand fisiològic, el CD40L s’expressa en limfòcits T activats. Existeixen dues isoformes, una forma transmembrana (mCD40L) i una forma soluble (sCD40L) provinent de la divisió proteolítica de la proteïna de membrana. Mitjançant un siRNA dirigit contra el receptor CD40 humà i la informativitat dels microarrays s’ha pogut confirmar que: -sCD40L produeix una activació endotelial anàloga a l’obtinguda amb mCD40L, encara que la magnitud d’activació de sCD40L és significativament menor, confirmant el seu paper com “activador” cel•lular regulant gens involucrats en la resposta immune i processos inflamatoris. -S’indueixen dos importants processos biològics preferentment via mCD40L: 1) Quimiotaxi (CXCL10, PLAU, CCL5, CXCL5, CX3CL1, CCL20 i CXCL11); i 2) catabolisme del triptòfan (IDO i KYNU). La regulació diferencial d’aquesta via metabòlica és molt interessant, ja que les cèl•lules que sobreexpressen l’enzim IDO indueixen una potent activitat immunosupressora a les cèl•lules T. 2) Analitzar la capacitat de C4BP i del factor H d’influir en el procés de diferenciació i/o maduració de les CDs induïdes in vitro a partir de monòcits de sang perifèrica. La cadena alfa de C4BP i el factor H semblen induir un estat semimadur en aquestes cèl•lules caracteritzades per una baixa expressió del marcador de maduració CD83 i de les molècules coestimuladores CD86, CD80 i CD1a, una reduïda internalització i processament d’antígens i un augment de la secreció de la citoquina inflamatòria IL-10 i reducció de la secreció de TNF-α, IFN-γ i IL-12, una disminució de la quimiotaxi i de l’expressió del receptor CCR7, implicat en la migració de les CDs cap als nòduls limfàtics i una disminució de la resposta al•logènica. Aquestes CDs semimadures podrien ser considerades CDs reguladores de la resposta immunitària. / Abnormal alteration of the inflammatory response is the cause of many diseases such as atherosclerosis, autoimmune diseases, pulmonary fibrosis, asthma or rejection in organ transplantation. Endothelial and dendritic cells are antigen-presenting cells (APCs) key in this process. Endothelial cells are in touch with the immune system and are an essential component of the vasculature. Dendritic cells play a critical role in the regulation of the adaptive immune response. The main goals of this work have been: 1) Comparative analysis of global profiles resulting from the interaction of two isoforms of CD40L (sCD40L and mCD40L) with CD40 receptor on endothelial cells. CD40 (TNFRSF5) is a membrane protein expressed in all APCs. Its physiological ligand, CD40L expressed on activated T lymphocytes, has two isoforms, a transmembrane form (mCD40L) and a soluble form (sCD40L) from the proteolytic division of the membrane protein. Using a siRNA directed against human CD40 receptor and the informativeness of the Microarray Technology it has been confirmed that: -sCD40L produces similar endothelial activation to obtained with mCD40L, although the magnitude of this activation is significantly lower, confirming its role as a "trigger" cellular genes involved in regulating the immune response and inflammation. -Two important biological processes are induced preferably via mCD40L: 1) chemotaxis (CXCL10, PLEASE, CCL5, CXCL5, CX3CL1, CCL20 and CXCL11), and 2) catabolism of tryptophan (IDO and KYNU). The differential regulation of this metabolic pathway is very interesting, because cells that overexpress IDO induce a potent immunosuppressive activity in T cells. 2) Analyze the ability of C4BP and factor H to influence the process of differentiation and/or maturation of DCs induced in vitro from peripheral blood monocytes. The alpha chain of C4BP and factor H induce a semimature state in these cells characterized by low expression of maturation marker CD83 and co-estimulative molecules CD86, CD80 and CD1a, increased secretion of inflammatory cytokine IL-10 and reduced secretion of TNF-α, IFN-γ and IL-12, a decrease in chemotaxis and the expression of CCR7 receptor, involved in the migration of CDs to the lymph nodes and a decrease in the allogeneic response. These semimature CDs could regulate the immune

El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) es la quinta causa de muerte por cáncer en los países desarrollados y uno de los tumores humanos más agresivos. A pesar del papel clave de la angiogénesis -la formación de nuevos vasos a partir de otros preexistentes- en la progresión y metástasis de muchos tumores, su papel en PDAC ha sido poco caracterizado. El activador tisular del plasminógeno (tPA), una proteína multifuncional que regula numerosas funciones celulares, ejerce efectos proangiogénicos en modelos in vivo de PDAC, aunque no se han analizado los mecanismos moleculares responsables de estos efectos. Esta tesis trata de identificar el papel de tPA en la angiogénesis del PDAC, así como de descubrir los factores responsables de la sobreexpresión de tPA en cáncer de páncreas. En primer lugar, hemos demostrado que los efectos pro-angiogénicos de tPA pueden ser tanto directos como indirectos. Por un lado, aunque tPA no cambia los niveles de moléculas pro-angiogénicas como VEGF, TGF-b, IL-1 o IL-8 producidas por las células tumorales o endoteliales, sí que induce la sobreexpresión y activación de MMP-9, una metaloproteasa implicada en promover angiogénesis, sugiriendo por tanto que esta proteína puede mediar de forma indirecta los efectos proangiogénicos de tPA. Por otro lado, hemos encontrado que tPA, de forma independiente de su actividad catalítica, promueve directamente la proliferación, migración y tubulogénesis de las células endoteliales. Estos efectos son mediados por la activación en estas células de las rutas de señalización ERK1/2, AKT y JNK. Además, mediante siRNA o inhibidores químicos, hemos encontrado que Annexina A2, Galectina-1 y EGFR son necesarios para la activación de la señalización inducida por tPA en células endoteliales. Finalmente, hemos visto que citoquinas inflamatorias e hipoxia, dos eventos asociados a PDAC y además inductores de angiogénesis, dan lugar a un fuerte incremento de los niveles de tPA en células tumorales pancreáticos. Todos estos datos apoyan un mecanismo de retroalimentación positiva entre estímulos proangiogénicos presentes en las células tumorales y el estroma, y el incremento de la molécula proangiogénica tPA. / Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is the fifth leading cause of cancer death in the developed countries and one of the most aggressive human tumors. Despite the key contribution of angiogenesis – the growth of new vessels from pre-existing ones- to the progression and spread of many cancers, its role in PDAC has been poorly characterized. Tissue plasminogen activator (tPA), a multifunctional protein regulating a broad range of cellular functions, has been reported to exert pro-angiogenic effects in in vivo models of PDAC, although the underlying molecular mechanism has not been analyzed. This work aims to elucidate the role of tPA in the angiogenesis of PDAC as well as to identify the factors responsible for tPA increase in pancreatic cancer. First, we demonstrated that tPA pro-angiogenic effects are both indirect and direct. On the one hand, tPA does not change the levels of the pro-angiogenic molecules VEGF, TGF-b, IL-1 or IL-8 produced by pancreatic tumoral cells or endothelial cells, but it is involved in MMP-9 –a potent stimulator of angiogenesis- upregulation and activation in pancreatic and endothelial cells, suggesting that this matrix metalloproteinase can indirectly mediate tPA angiogenic effects. On the other hand, we found that tPA, in a catalytic-independent way, directly promotes endothelial cell proliferation, migration and tubulogenesis. These direct effects of tPA are mediated by activation of ERK1/2, AKT and JNK signaling pathways in endothelial cells. In addition, using siRNA technology or chemical inhibitors, we found that AnnexinA2, Galectin-1 and EGFR are required for tPA-mediated signaling activation in endothelium. Finally, we found that inflammatory cytokines and hypoxia, two hallmarks of PDAC and also angiogenic stimuli, lead to a sharp increase in tPA levels in pancreatic tumoral cells. These data support a feed-back loop between proangiogenic stimuli present in both tumoral and stromal cells and the increase of the proangiogenic molecule tPA.

En aquesta Tesi, un nou biomaterial de disseny composat per seqüències peptídiques repetitives i amfifíliques, que per autoensamblatge forma xarxes de nanofibres (i hidrogels), AcN-RADARADARADARADA-CONH2, s´ha utilitzat com a anàleg de la matriu extracel·lular per al manteniment, proliferació i diferenciació cel·lular. Aquest pèptid s'ha funcionalititzat amb motius biològicament actius procedents de proteïnes de la matriu extracel·lular incloent laminina-1 i colàgen IV. El scaffold peptídic autoensamblant RAD16-I i els seus derivats biològicament actius s´han caracteritzat i provat utilitzant diferents sistemes cel·lulars com pot ser les cèl·lules d'aorta humanes (HAEC), hepatocits madurs i la línea progenitora de fetge (Lig-8). La proteòlisi d'aquest pèptid s'ha avaluat utilitzant tripsina com a enzim proteolític, i els fragments resultants s'han analitzat per MALDI-TOF i AFM. Així mateix, la segona generació de biomaterials basats en el RAD16-I s'ha provat tant amb HAEC com amb hepatocits madurs. Amb aquests sistemes hem demostrat que el desenvolupament d'una matriu biomiètica reforça, a la vegada que manté, les funcions específiques de cada teixit. En particular, els resultats obtinguts en diferenciació, proliferació i manteniment de la funció cel·lular utilitzant pèptids sintètics autoensamblants són comparables amb els resultats que s'obtenen utilitzant matrius biològiques (Colàgen I i Matrigel). Això indica que els nostres anàlegs de la matriu extracel·lular poden substituir als materials naturals, i suggereix l'ús d'aquests materials intel·ligents amb capacitat instructiva en aplicacions terapèutiques. Així mateix s'ha provat que l'ús d'aquests pèptids auto-ensamblants és eficient en la construcció d'un nínxol de cèl·lules mare. Hem sigut capaços de controlar la cinètica cel·lular (de simètrica a assimètrica) induint diferenciació funcional, a la vegada que es mantenia una petita proporció de cèl·lules no diferenciades. Aquests resultats indiquen clarament que hem sigue capaços d'obtenir un nínxol on cèl·lules primitives (Lig-8) es diferencien adquirint funcions d'hepatocits madurs. Hem desenvolupat una plataforma de biomaterials que es podrien utilitzar per la funcionalització amb innumerables biomolècules amb capacitat d'induir processos biològics com la diferenciació, proliferació i funció metabòlica. Aquests biomaterials, preveiem que tindran un gran impacte a l'àrea terapèutica i biología regenerativa. / En esta Tesis, un nuevo biomaterial de diseño compuesto por secuencias peptídicas repetitivas y amfifílicas que por autoensamblaje forma redes de nanofibras (e hidrogeles), AcN-RADARADARADARADA-CONH2 (RAD16-I), se ha utilizado como análogo de la matriz extracelular para el mantenimiento, proliferación y diferenciación celular. Este péptido se ha funcionalizado con motivos biológicamente activos procedentes de proteínas de la matriz extracelular incluyendo laminina-1 y colágeno IV. El scaffold peptídico autoensamblante RAD16-I y sus derivados biológicamente activos se han caracterizado y probado utilizando diferentes sistemas celulares como puede ser células endoteliales de aorta humanas (HAEC), hepatocitos maduros y la línea progenitora de hígado Lig-8. La proteólisis de este péptido se ha evaluado utilizando tripsina como enzima proteolítico, y los fragmentos resultantes se han analizado por MALDI-TOF y AFM. Asimismo, la segunda generación de biomateriales basados en el RAD16-I se ha probado tanto con HAEC como hepatocitos maduros. Con estos sistemas hemos demostrado que el desarrollo de una matriz biomimética refuerza a la vez que mantiene las funciones específicas de cada tejido. En particular, los resultados obtenidos en diferenciación, proliferación y mantenimiento de la función celular utilizando los péptidos sintéticos auto-ensamblantes son comparables con los resultados que se obtienen usando matrices biológicas (Colágeno I y Matrigel). Esto indica que nuestros análogos de la matriz extracelular pueden reemplazar a los materiales naturales, y sugiere el uso de estos materiales inteligentes con capacidad instructiva en aplicaciones terapéuticas. Asimismo, se ha probado que el uso de estos péptidos auto-ensamblantes es eficiente en la construcción de un nicho de células madre. Hemos sido capaces de controlar la cinética celular (de simétrica a asimétrica) induciendo diferenciación funcional, a la vez que se mantenía una pequeña proporción de células no diferenciadas. Estos resultados indican claramente que hemos sido capaces de obtener un nicho donde células primitivas (Lig-8) se diferencian adquiriendo funciones de hepatocitos maduros. Hemos desarrollado una plataforma de biomateriales que se podrían utilizar para la funcionalización con innumerables biomoléculas con capacidad de inducir procesos biológicos como la diferenciación, proliferación y función metabólica. Estos biomateriales preveemos que tendrán un gran impacto en el área terapéutica y biología regenerativa. / In this Thesis, a new designed biomaterial made out of short repetitive amphiphilic peptide sequence AcN-RADARADARADARADA-CONH2 (RAD16-I) that self-assembles forming nanofiber networks (hydrogel scaffold) has been used as synthetic extracellular matrix analog for cell maintenance, proliferation and differentiation. This peptide has been functionalized with biological active motifs from extracellular matrix proteins including laminin-1 and collagen IV. The prototypic self-assembling peptide scaffold RAD16-I and its biologically active derivatives have been characterized and tested using several cellular systems such as human aortic endothelial cells (HAEC), mature hepatocytes and a putative liver progenitor cell line, Lig-8. The proteolysis of the peptide RAD16-I has been evaluated using trypsin as a proteolytic enzyme and the resulting fragments have been analyzed by MALDI-TOF and AFM. Moreover the second generation of RAD16-I-based biomaterials have been tested using HAEC and mature hepatocytes. With these systems we have shown that the development of a biomimetic matrix enhances as well as maintain tissue-specific functions. In particular, the results obtained in cell differentiation, proliferation and maintenance of cell function using the synthetic self-assembling peptide matrices, are comparable with the results obtained using natural biological matrices counterparts (Collagen-I and Matrigel). This indicates that our extracellular matrix analogs can replace the use of naturally-derived materials and suggests the use of these smart biomaterials with instructive capacity for cells in therapeutics. Moreover, the use of the self-assembling peptide RAD16-I in the recreation of a stem-cell niche proved to be highly efficient. We were able to control stem-cell kinetics (from symmetric to assymetric) inducing functional differentiation while maintaining a small proportion of undifferentiated cells. This striking results clearly indicate that we were able to obtain a stem-cell niche where primitive cells (Lig-8) undergo differentiation acquiring mature hepatic functions. We have developed a biomaterial platform that can be used for functionalization with innumerable biomolecules, with capacity to induce biological processes like differentiation, control of proliferation, metabolic function, etc. These biomaterials will have a strong impact in therapeutics and regenerative biology.

L'adenocarcinoma pancreàtic és una neoplàsia amb mal pronòstic per la que no existeixen marcadors específics. En aquesta tesi s'han estudiat possibles alteracions de les estructures glucídiques de la ribonucleasa pancreàtica humana (RNasa 1) de sèrum amb l'objectiu de determinar el seu ús diagnòstic. S'han descrit les estructures glucídiques de la RNasa 1 sèrica i de línies cel·lulars endotelials, i s'ha observat un increment en la proporció d'estructures biantenàries amb Fc en la RNasa 1 sèrica de pacients amb càncer de pàncreas, fet que podria ser d'utilitat diagnòstica. També, donada la gran similitud entre les estructures glucídiques descrites per la RNasa 1 sèrica i per l'endotelial, l'origen de la RNasa 1 sèrica sembla ser principalment endotelial. La RNasa 1 també s'ha avaluat per electroforesi bidimensional i s'ha establert una correlació entre el contingut d'àcid siàlic i el seu pI, fet que pot ajudar a la interpretació dels mapes bidimensionals d'altres glicoproteïnes. / Pancreatic adenocarcinoma has one of the highest mortality rates of all neoplasias and it has no specific markers. In this work, possible alterations in the glycan structures of human pancreatic ribonuclease (RNase 1) present in serum are investigated with the aim of determining its diagnostic utility. Serum and endothelial RNase 1 glycan structures have been described and an increase of biantennary structures with Fc in serum RNasen 1 from pancreatic cancer patients could be observed, what can be of diagnosis utility. Also, due to the high similarity between serum RNase 1 and endothelial RNase 1 glycan structures, it was concluded that endothelium can be the main producer of serum RNase 1. RNase 1 was also evaluated by two-dimensional electrophoresis and a correlation between the sialic acid content and the observed pI decrease could be establish, what may be very significant for understanding and interpreting two-dimensional maps from other glycoproteins.