Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Los exosomas son vesículas extracelulares de tamaño nanométrico involucradas en la comunicación celular. El desarrollo de “nanovehículos”, como los exosomas, es una innovadora estrategia para optimizar la entrega de fármacos a un determinado sitio de acción. Por otro lado, las nanopartículas de oro (AuNPs) son candidatos interesantes para su aplicación en biomedicina debido a sus múltiples propiedades fisicoquímicas que le permiten ser empleadas para terapia y diagnóstico. En estudios anteriores se ha observado que los exosomas provenientes de las células B16F10 presentan una acumulación preferente a nivel pulmonar. A partir de esto, estas nanovesículas podrían utilizarse para direccionar de manera selectiva compuestos bioactivos tales como las nanopartículas de oro (AuNPs). Por lo tanto, la hipótesis de este trabajo plantea que es posible aislar exosomas que contienen nanopartículas de oro funcionalizadas a partir del sobrenadante de la línea celular B16F10. Para llevar a cabo lo anterior, el objetivo de este trabajo fue desarrollar una estrategia para incorporar las AuNPs al interior de los exosomas, y con esto mejorar la entrega terapéutica de éstas. Para esto, se desarrollaron AuNPs conjugadas con ácido fólico o el péptido R7CLPFFD y luego éstas se incubaron con el cultivo celular de B16F10. Posteriormente, se aislaron las nanovesículas por dos métodos: ultracentrifugación y utilizando el kit comercial Exospin®. Ambas muestras obtenidas se caracterizaron por dynamic light scattering, potencial zeta, microscopía electrónica de transmisión y western blotting. Posteriormente, se evaluó la presencia de oro en las muestras de exosomas aislados a través de espectrofotometría UV-visible y activación neutrónica. Como resultado de la estrategia propuesta se obtuvieron exosomas que contienen nanopartículas de oro desde el sobrenadante de la línea celular B16F10. Finalmente, se espera que este nanosistema pueda ser utilizado para la entrega selectiva de principios activos hacia el pulmón / Exosomes are nanometric extracellular vesicles involved in cell communication. The development of “nanovehicles”, such as the exosomes, is an innovative strategy to optimize the drug delivery to specific action sites. On another hand, gold nanoparticles (AuNPs) are interesting candidate for biomedical applications due to its physicochemical properties that allow them to be used for therapy and diagnosis. Previous studies have shown that isolated exosomes from B16F10 cells are accumulated preferentially in the lungs. Consequently, this nanovesicles could be used for the selective delivery of bioactive compounds such as the gold nanoparticles (AuNPs). Therefore, the hypothesis of this work suggests that it is possible to isolate exosomes containing functionalized gold nanoparticles from the supernatant of the B16F10 cell line. From the above, the goal of this project was developed a strategy for the incorporation of gold nanoparticles (AuNPs) into exosomes that permitting improve the drug delivery of them. For this, we developed functionalized AuNPs with folic acid or R7CLPFFD peptide and later those AuNPs were incubated with B16F10 cell culture. Then, we isolated the nanovesicles by two methods: ultracentrifugation and using the Exospin® kit. Both samples were characterized by dynamic light scattering, zeta potential, transmission electronic microscopy and western blotting. Later, we evaluated the presence of gold in the isolated exosomes samples by UV-visible spectrophotometry and neutronic activation. As result of the proposed strategy, we isolated exosomes containing gold nanoparticles from the B16F10 culture supernatants. Finally, we expect that this nanosystem could be used for the selective delivery of active compounds to the lungs

Las células de un organismo multicelular se comunican a través una amplia variedad de mecanismos que incluyen no sólo la transferencia directa por contacto célula-célula, sino también la secreción de las moléculas y vesículas que viajan a otras células. Las células de mamíferos segregan una gran variedad de vesículas extracelulares (EV). Los exosomas son vesículas extracelulares con un tamaño de entre 20-100 nanometros que pueden transferir información en forma ácidos nucleicos o proteínas entre diferentes células por lo que son reconocidos como un potente mecanismo de comunicación intercelular. Este tipo de vesículas está siendo objeto de intensa investigación no solo en el proceso de metástasis tumoral, ya que se cree que los exosomas están relacionados con la extensión del tumor a órganos no relacionados, sino en el ámbito de la medicina regenerativa, puesto que se consideran potenciales candidatos implicados en los mecanismos paracrinos inducidos por las células madre. Por este motivo, en este trabajo se analizó el potencial terapéutico de los exosomas derivados de células madre mesenquimales (MSC). Así, nos planteamos la hipótesis de que las MSC fueran capaces de transferir exosomas hacia las células de los tejidos que reparan. Un trabajo reciente de nuestro grupo de investigación demostró que la sobreexpresión del factor inducible por hipoxia 1α (HIF-1α) en MSC (MSC-HIF) potenciaba la capacidad terapéutica de las MSC para mejorar la función cardiaca tras un infarto agudo de miocardio (IAM). En consecuencia, estudiamos el contenido de microRNAs en los exosomas derivados de las MSC y las MSC-HIF. Se observó que las poblaciones de microRNAs presentes exosomas derivados de MSC y MSC-HIF cambiaron de manera reproducible en función de la disponibilidad de oxígeno que poseían las células, lo que interpretamos como un mecanismo respuesta celular mediada por exosomas. Así también, observamos que en las MSC-HIF la combinación de la sobreexpresión de HIF-1α con las bajas tenciones de oxigeno generaban exosomas cargados con microRNAs con potencial terapéutico para el tratamiento del IAM. Sin embargo, no fuimos capaces de demostrar el potencial terapéutico de los exosomas aislados de dichas poblaciones celulares en un modelo de infarto experimental en rata, lo que pudo ser ocasionado por un diseño incorrecto del procedimiento experimental. Esto provocó un giro en la orientación de la tesis y decidimos centrarnos en los mecanismos celulares inducidos por los exosomas en el entorno cardiaco. En este contexto, recientemente se ha descrito la presencia de exosomas en cardiomiocitos (CM) humanos. A nivel de ultraestructura, la anatomía del tejido cardiaco revela una intrínseca relación entre los CM y las células endoteliales (ECs) que componen el endotelio microvascular coronario, el cual se encarga de nutrir a los CM realizando el transporte de combustibles metabólicos desde la sangre hacia los CM. El espacio perivascular que separa a los CM de las ECs es de tan solo 1µm, permitiendo el flujo de información a corta distancia entre los CM y las ECs. Mantener esta disposición es fundamental para lograr un acople metabólico entre ambos tipos celulares. El corazón no posee reservas apreciables de combustibles metabólicos por lo el aporte de nutrientes y oxigeno debe ser continuo y regulado. Por esto pensamos que el aporte energético del endotelio hacia el corazón debería estar finamente coordinado, no solo por el control exógeno del metabolismo en todo el organismo sino también por algún mecanismo en el que el propio cardiomiocito regule el trasporte de su célula endotelial asociada. Además se sabe que las ECs liberan factores que alteran la actividad de los CM, y de la misma manera que los CM liberan factores que alteran las ECs. Sin embargo, se conoce poco a cerca de los mecanismos que regulan el flujo de nutrientes desde las ECs hacia los CM, especialmente es situaciones de estrés agudo en donde se requiere un mecanismo activo a nivel local que regule el trasporte endotelial. En este trabajo se estudió cómo los exosomas derivados de los CM alteraban el transporte de glucosa en ECs. En primer lugar mostramos datos que indican que el ayuno de glucosa incrementa la síntesis y secreción de exosomas en cultivos de CM neonatales de rata. En segundo lugar demostramos que estos exosomas derivados de CM son internalizados por las ECs en una manera dependiente de la disponibilidad de glucosa del medio. Por último aportamos evidencias de que los exosomas derivados de los CM que fueron cultivados en condiciones de ayuno de glucosa fueron capaces de trasferir trasportadores de glucosa (GLUTs) hacia las ECs, en donde estos GLUTs trasferidos mediante exosomas incrementaron la captación de glucosa y la actividad glicolítica de las ECs. Tomando en conjunto los resultados, en la presente tesis se propone un modelo de comunicación entre los CM y las ECs, en el cual el tráfico de proteínas mediado por exosomas desde los CM hacía las ECs trasladaría las necesidades metabólicas de los CM a las ECs las cuales están en contacto directo con los nutrientes presentes en el flujo coronario. Este novedoso mecanismo de acción a corta distancia revela una relación intrínseca entre la demanda de glucosa de los CM y el transporte de glucosa de las ECs permitiendo una rápida respuesta desde las ECs al incrementar la cantidad de transportadores de glucosa sin necesidad de síntesis de novo ni de la modificación de los perfiles de transcripción génica, lo que sin duda aumenta la eficiencia del proceso de comunicación celular. / García, NA. (2014). Estudio de la comunicación intercelular mediada por exosomas y sus implicaciones terapéuticas [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/48165 / TESIS

[ES] Las células de los mamíferos secretan una gran variedad de vesículas extracelulares (EV) que participan activamente en la comunicación celular. Entre ellas, los exosomas son un tipo de EV cuyo tamaño está comprendido entre los 20 y 150 nanómetros que juegan un papel importante en la comunicación celular. De este modo, se ha descrito el papel de los exosomas en distintos procesos como la regeneración de tejidos, la respuesta inmunitaria o en la progresión de diferentes tipos de cánceres. Por otro lado, se ha observado que la actividad de la vía de señalización de Notch juega un papel importante en procesos de diferenciación celular, la angiogénesis o la proliferación, entre otros. Además, se ha relacionado con la aparición y progresión de un gran número de patologías, como el cáncer. Trabajos recientes han advertido que la actividad de la vía de Notch puede regularse mediante un nuevo mecanismo de señalización mediado por exosomas. En este trabajo se profundizó en este nuevo mecanismo de señalización de la vía de Notch en dos contextos diferentes como son las terapias regenerativas y el cáncer. Un trabajo previo de nuestro laboratorio demostró que las células madre mesenquimales (MSC) que mantenían una expresión aumentada del factor inducible por hipoxia 1α (HIF-1α; HIF-MSC) aumentaban el potencial terapéutico de las MSC nativas en un modelo de infarto agudo de miocardio (IAM) en rata a través de un aumento de la angiogénesis y una reducción de la fibrosis. Varios trabajos han estudiado la relación entre la vía de señalización de Notch y HIF-1α; así como la influencia de ambos en el proceso angiogénico. Por estos motivos, en este trabajo nos interesamos por evaluar la relación de ambas vías y su efecto sobre la angiogénesis a través de los exosomas liberados por las HIF-MSC y las MSC. Los resultados permitieron observar que la expresión de HIF-1α indujo un aumento en la secreción y la transferencia de exosomas de MSC a cultivos primarios de células endoteliales. Además, se observó que los exosomas derivados de HIF-MSC tenían un mayor potencial angiogénico tanto in vitro como in vivo en parte debido a una mayor incorporación del ligando de la vía de Notch Jagged1. Se ha observado que los exosomas derivados de células tumorales contribuyen a la progresión tumoral a través de mecanismos como la activación de la transición epitelio mesénquima (EMT), el establecimiento de nichos pre-metastáticos o la inmunomodulación. Así, se sabe que la vía de señalización de Notch es capaz de activar la EMT durante la progresión de distintos tipos de cánceres. Así mismo, los cánceres de mama de peor prognosis han sido relacionados con una desregulación de la vía de señalización de Notch. Por estas razones, nos inquietó la posibilidad de que la señalización de la vía de Notch a través de exosomas estuviera influyendo en la progresión del cáncer de mama. De este modo, estudiamos la presencia de componentes de la vía de señalización de Notch en los exosomas procedentes de dos líneas tumorales de cáncer de mama, una más agresiva (MDA-MB-231) y otra menos agresiva (MCF-7). Así, se observó que varios componentes de Notch se sobreexpresaron en los exosomas procedentes de MDA-MB-231 en comparación con los procedentes de MCF-7. Fue de particular interés la detección del dominio intracelular con actividad transcripcional de Notch1 (N1ICD) sobreexpresado en los exosomas procedentes de MDA-MB-231. Debido a que previamente había sido demostrado que una sobreexpresión de N1ICD en MCF-7 aumentaba su tumorigenicidad a través de una inducción de la EMT, se evaluó el efecto de los componentes de Notch incorporados en los exosomas procedentes de ambas líneas tumorales sobre cultivos de MCF-7. Nuestros resultados sugieren que los componentes de Notch incorporados en los exosomas procedentes de MDA-MB-231 son funcionales y contribuyen a la induc / [CAT] Les cèl·lules dels mamífers secreten una gran varietat de vesícules extracel·lulars (EV) que participen activament en la comunicació celular. Entre elles, els exosomes són un tipus de EV amb una grandària compresa entre els 20 i 150 nanòmetres que juguen un paper important en la comunicació celular. D'aquesta manera, s'ha descrit el paper dels exosomes en diferents processos com la regeneració de teixits, la resposta immunitària o en la progressió de diferents tipus de càncers. D'altra banda, s'ha observat que l'activitat de la via de senyalització de Notch juga un paper molt important en processos de diferenciació cel·lular, la angiogénesis o la proliferació, entre altres. A més, s'ha relacionat amb l'aparició i progressió d'un gran nombre de patologies, com el càncer. Treballs recents han advertit que l'activitat de la via de Notch pot regular-se mitjançant un nou mecanisme de senyalització mediat per exosomes. En aquest treball es va aprofundir en aquest nou de mecanisme de senyalització de la via de Notch en dos contextos diferents com són les teràpies regeneratives i el càncer. Un treball publicat pel nostre equip de treball va demostrar que les cèl·lules mare mesenquimals (MSC) que mantenien una expressió augmentada del factor inducible per hipòxia 1α (HIF-1α; HIF-MSC) augmentaven el potencial terapèutic de les MSC natives en un model d'infart agut de miocardi (IAM) en rata a través d'un augment de la angiogénesis i una reducció de la fibrosi. Diversos treballs han estudiat la relació entre la via de senyalització de Notch i HIF-1α; així com la influència de tots dos en el procés angiogénic. Per aquests motius, en aquest treball ens vam interessar en estudiar la relació de totes dues vies i el seu efecte sobre la angiogénesis a través dels exosomes alliberats per les HIF-MSC i les MSC. Els resultats van permetre observar que l'expressió de HIF-1α va induir un augment en la secreció i la transferència d'exosomes de MSC a cultius primaris de cèl·lules endotelials. A més, es va observar que els exosomes derivats de HIF-MSC tenien un major potencial angiogénic tant in vitro com in vivo en part a causa d'una major incorporació del lligant de la via de Notch Jagged1. S'ha observat que els exosomes procedents de cèl·lules tumorals contribueixen a la progressió tumoral a través de mecanismes com l'activació de la transició epiteli mesènquima (EMT), l'establiment de nínxols pre-metastàtics o la inmunomodulació. En aquest sentit, se sap que la via de senyalització de Notch és capaç d'activar l'EMT durant la progressió de diferents tipus de càncers. Així mateix, els càncers de mama de pitjor prognosi han sigut reiteradament relacionats amb una desregulació de la via de senyalització de Notch. Per açò, ens va inquietar la possibilitat que la senyalització de la via de Notch a través d'exosomes estiguera influint en la progressió del càncer de mama. D'aquesta manera, estudiem la presència de components de la via de senyalització de Notch en els exosomes procedents de dues línies tumorals de càncer de mama, una més agressiva (MDA-MB-231) i una altra menys agressiva (MCF-7). Així, es va observar que diversos components de Notch es sobreexpresaben en els exosomes procedents de MDA-MB-231 en comparació amb els procedents de MCF-7. Va ser de particular interés la detecció del domini intracel·lular amb activitat transcripcional de Notch1 (N1ICD) sobreexpresat en els exosomes procedents de MDA-MB-231. Debut a que havia sigut demostrat que una sobreexpressió de N1ICD en MCF-7 augmentava la seua tumorigenicidad a través d'una inducció de l'EMT, es va evaluar l'efecte dels components de Notch incorporats en els exosomes procedents de les dues línies tumorals sobre cultius de MCF-7. Els nostres resultats suggereixen que els components de Notch incorporats en els exosomes procedents de MDA-MB-231 eren funcionals i contribuïen a la / [EN] Mammal cells secrete a great variety of extracellular vesicles (EV) that actively participate in intercellular communication. Among them, exosomes are a type of EV whose size is between 20 and 150 nanometers and play an important role in intercellular communication. In this way, the role of exosomes in different processes such as tissue regeneration, the immune response or in the progression of different types of cancers has been described. On the other hand, it has been observed that the Notch signaling pathway plays a very important role in processes such as cell differentiation, angiogenesis or proliferation, among others. In addition, it has been related to the appearance and progression of a large number of pathologies, such as cancer. Recent works have shown that the activity of the Notch pathway can be regulated by a new signaling mechanism mediated by exosomes. In this work, we deepened this new signaling mechanism of the Notch signaling pathway in two different contexts: the regenerative therapies and cancer. A work previously published by our laboratory showed that mesenchymal stem cells (MSC) that maintained an increased expression of hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α; HIF-MSC) increased the therapeutic potential of native MSC in a model of acute myocardial infarction (AMI) in rats through an increase in angiogenesis and a reduction in fibrosis. Several studies have studied the relationship between the Notch signaling pathway and HIF-1α as well as the influence of both in the angiogenic process. For these reasons, in this work we were interested in evaluating the relationship of both pathways and their effect on angiogenesis through exosomes released by HIF-MSCs and MSCs. The results showed that the expression of HIF-1α induced an increase in the secretion and the transfer of exosomes of MSC to primary cultures of endothelial cells. In addition, it was observed that exosomes derived from HIF-MSC had a greater angiogenic potential both in vitro and in vivo in part due to a greater incorporation of the Notch ligand Jagged1. In the last decade, it has been observed that exosomes from tumor cells contribute to tumor progression through mechanisms such as the activation of epithelial to mesenchymal transition (EMT), the establishment of pre-metastatic niches orimmunomodulation. In this sense, it is known that the Notch signaling pathway is capable of activating EMT during the progression of different types of cancers. Likewise, breast cancers of bad prognosis have been repeatedly related to a deregulation of the Notch signaling pathway. For these reasons, we were concerned about the possibility that the signaling of the Notch pathway through exosomes was influencing the progression of breast cancers. In this way, we studied the presence of Notch signaling pathway components in exosomes from the metastatic and more aggressive MDA-MB-231 and the non-metastatic and less aggressive MCF-7 cell lines. It was observed that several Notch components were overexpressed in exosomes from MDA-MB-231 compared to those from MCF-7. Of particular interest was the detection of the intracellular domain with transcriptional activity of Notch1 (N1ICD) overexpressed in MDA-MB-231 exosomes. It has been previously demonstrated that an overexpression of N1ICD in MCF-7 increases its tumorigenicity through an induction of EMT. Because of this, we evaluated the effect of Notch components incorporated in exosomes from both tumoral cell lines on MCF-7 cultures. Our results suggested that Notch components incorporated into MDA-MB-231 exosomes were functional and contributed to the induction of EMT when added to MCF-7 cultures in part due to N1ICD activity. / González-King Garibotti, H. (2019). Estudio de las Implicaciones de la Via de Señalización de Notch en Cardioregeneración y Cáncer [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/124343 / TESIS