La teràpia gènica s’està convertit en una tècnica innovadora per tal de curar una malaltia mitjançant la inserció de gens dins les cèl•lules i òrgans d’un individu. El repte recau en l’alliberació eficient I segura de l’àcid nucleic terapèutic a les cèl•lules i òrgans objectiu. De tots els vectors sintètics desenvolupats recentment, els nanotubs de carboni són una elecció interessant que ja ha demostrat prometre considerablement com a sistema alliberació, gràcies a la seva proporció amplada-alçada i la seva capacitat de traspassar la membrana cel•lular. El problema que sorgeix és la seva limitada solubilització i l’agregació espontània in vivo. Amb l’objectiu de desenvolupar nous dissenys basats en nanotubs de carboni per a la formació de complexos capaços de transfectar ADN a les cèl•lules, amb un a bon registre de biocompatibilitat i viabilitat cel•lular, s’han desenvolupat diferents estratègies. En primer lloc, s’ha optimitzat la funcionalització covalent dels nanotubs per mitjà de tècniques de plasma. Aquest tipus de modificació permet aconseguir tan superfícies altament reactives capaces d’unir ADN a través d’una molècula enllaçant, com superfícies carregades positivament que permeten l’envolcall de l’àcid nucleic per interacció electrostàtica. En segon lloc, s’ha avaluat la dispersió de nanotubs de diferents mides per mitjà d’un agent estabilitzant incloent un surfactant, un polímer amfifílic i proteïnes. Aquesta naturalesa química de la superfície del nanotub, juntament amb altres propietats físiques com ara l’allargada o el diàmetre, té un efecte directe en la dispersibilitat, citotoxicitat i biodistribució d’aquest sistemes. L’ús de proteïnes per functionalitzar nanopartícules és encoratjador ja que forma la corona de proteïna a la seva superfície. Tals conjugats mostren una elevada capacitat de carregar ADN i permeten la regulació de la seva alliberació mitjançant la manipulació de la composició de la corona. / La terapia génica se está convirtiendo en una técnica innovadora para curar enfermedades mediante la inserción de genes dentro de las células y órganos de un individuo. El reto recae en la liberación eficiente y segura de un acido nucleico terapéutico a los órganos objectivo. De todos los vectores sintéticos desarrollados recientemente, los nanotubos de carbono son una elección interesante que ya ha demostrado prometer considerablemente como sistema de liberación gracias a su proporción anchura-altura y su capacidad de traspasar la membrana celular. El problema que surge es su limitada solubilización i la agregación espontanea in vivo. Con el objetivo de desarrollar nuevos diseños basados en nanotubos de carbono para la formación de complejos capaces te transfectar ADN a las células, con un buen registro de biocompatibilidad y viabilidad celular, se han desarrollado diferentes estrategias. En primer lugar, se ha optimizado la funcionalización covalente de los nanotubos por medio de técnicas de plasma. Este tipo de modificación permite conseguir tanto superficies altamente reactivas capaces de unir ADN a traves de una molécula enlazante, como cargadas positivamente que permiten el envoltorio del acido nucleico por interacción electrostática. En segundo lugar, se han evaluado la dispersión de nanotubos de medidas diferentes por mediado de un agente estabilizante que incluye un surfactante un polímero amfifílico y proteínas. Esta naturaleza química de la superficie del nanotubo, junto con otras propiedades físicas como su longitud o diámetro, tiene un efecto directo en la dispersibilidad, citotoxicidad y biodistribución de estos sitemas. El uso de proteínas para funcionalizar nanopartículas es alentador ya que forma la corona de proteínas en su superficie. Dichos compuestos muestran una elevada capacidad de cargar ADN y permiten la regulación de su liberación mediante la manipulación de la composición de la corona. / Gene therapy has become an increasing innovative technique to treat disease by the insertion of genes into individual’s cells and tissues. The challenge is to efficiently and safely deliver the therapeutic nucleic acid into the target cells and organs. Among the synthetic vectors recently developed, carbon nanotubes are an interesting choice as they have already demonstrated considerable promise as delivery systems due to their high aspect ratio and their capacity to translocate the cell membrane. The problem that arises is their limited solubilization and spontaneous aggregation in vivo. Aiming to engineer new carbon nanotube-based designs for the formation of complexes able to transfect DNA/RNA to cells with a good track of biocompatibility and cell viability, different strategies have been developed. Firstly, the covalent functionalization of carbon nanotubes by plasma techniques has been optimized. This type of modification allows to either achieving highly reactive surfaces able to covalently bind DNA towards a chemical linker or a positively charged nanotube surface enabling the wrapping of the nucleic acid by electrostatic interaction. Secondly, the dispersion of the differently-sized carbon nanotubes by means of a stabilizing agent including a surfactant, an amphiphilic polymer and proteins has been assessed. The chemical nature of the modifying moieties on the carbon nanotube, alongside to other physical properties such as length or diameter, has a direct effect on the dispersibility, cytotoxicity and biodistribution of these systems. The use of proteins in the nanoparticle functionalization is encouraging due to the formation of the protein corona on its surface. Such complex exhibits high DNA load capacities and allows a tunable payload release by manipulating the corona composition

Les malalties cardiovasculars són una de les majors causes de mortalitat a escala mundial. L’infart de miocardi és el principal responsable de les cardiopaties isquèmiques. La irrigació sanguínia al cor es veu bloquejada degut a una oclusió en un capil•lar sanguini provocant mort cel•lular massiva que genera una zona miocardíaca necròtica. En la última dècada, la medicina cardíaca regenerativa s’ha focalitzat en estratègies fonamentades en l’enginyeria de teixits i la teràpia cel•lular basada en cèl•lules mare. En aquest treball, hem caracteritzat el potencial cardíac de diferents tipus cel•lulars cultivats en bastides tri-dimensionals (3D) generades a partir de l’hidrogel peptídic RAD16-I. En primer lloc, hem estudiat l’adquisició de potencial mesenquimàtic de fibroblasts humans de dermis (hNDFs) en cultius 3D i la seva diferenciació subseqüent a llinatges adipogènic i cardiogènic. Únicament els hNDFs cultivats en hidrogels de RAD16-I adquireixen una potenciació mesenquimàtica. Les cèl•lules adopten espontàniament propietats semblants a les cèl•lules mare mesenquimàtiques mentre que la diferenciació a adipogènesis i cardiogènesis requereix medi d’inducció. En segon lloc, hem comparat el grau de diferenciació cardíaca de cèl•lules mare humanes pluripotents induïdes (hiPSCs) cultivades en ambients 2D versus 3D i hem avaluat l’efecte de l’àcid ascòrbic (AA) en el procés. En el nostre treball i com ja s’havia demostrat en publicacions prèvies, l’AA va resultar accelerar i millorar la diferenciació cardíaca de hiPSCs en cultius 2D. A més, els resultats presentats suggereixen que les hiPSCs cultivades en 3D augmenten el seu grau de diferenciació i adquireixen un potencial cardiogènic 105 vegades més elevat que en els cultius 2D. En tercer lloc, hem dissenyat un pegat cardíac basat en cultius 3D de cèl•lules adultes porcines progenitores del teixit adipós del mediastí (pMATPCs) injectats en matrius naturals (pericardi humà descel•lularitzat). Hem implantat la bio-pròtesis miocardíaca in vivo i hem determinat que la bio-bastida afavoreix la migració cel•lular i la regeneració de la zona infartada en el model porcí. En conclusió, hem analitzat el potencial cardiogènic de cèl•lules adultes somàtiques (hNDFs), cèl•lules mare adultes (pMATPCs) i cèl•lules mare pluripotents (hiPSCs) en cultius 3D basats en hidrogels de RAD16-I per a futures aplicacions en el tractament de malalties cardíaques. / Las enfermedades cardiovasculares son una de las mayores causas de mortalidad a escala mundial. El infarto de miocardio es el principal responsable de las cardiopatías isquémicas. La irrigación sanguínea al corazón se ve bloqueada debido a una oclusión en un capilar sanguíneo provocando muerte celular masiva que genera una zona miocárdica necrótica. En la última década, la medicina cardíaca regenerativa se ha focalizado en estrategias fundamentadas en la ingeniería de tejidos y la terapia celular basada en células madre. Es este trabajo, hemos caracterizado el potencial cardíaco de distintos tipos celulares cultivados en andamios tridimensionales (3D) generados a partir del hidrogel peptídico RAD16-I. En primer lugar, hemos estudiado la adquisición de potencial mesenquimático de fibroblastos humanos de dermis (hNDFs) en cultivos 3D y su diferenciación subsecuente a linajes adipogénico y cardiogénico. Únicamente los hNDFs cultivados en hidrogeles de RAD16-I adquieren una potenciación mesenquimática. Las células adoptan espontáneamente propiedades parecidas a las células madre mesenquimáticas mientras que la diferenciación a adipogénesis y cardiogénesis requiere medio de inducción. En segundo lugar, hemos comparado el grado de diferenciación cardíaca de células madre humanas pluripotentes inducidas (hiPSCs) cultivadas en ambientes 2D versus 3D y hemos evaluado el efecto del ácido ascórbico (AA) en el proceso. En nuestro trabajo y como ya se había demostrado en publicaciones previas, el AA resultó acelerar y mejorar la diferenciación cardíaca de hiPSCs en cultivos 2D. A demás, los resultados presentados sugieren que las hiPSCs cultivadas en 3D aumentan su grado de diferenciación y adquieren un potencial cardiogénico 105 veces más elevado que en los cultivos 2D. En tercer lugar, hemos diseñado un parche cardíaco basado en cultivos 3D de células adultas porcinas progenitoras del tejido adiposo del mediastino (pMATPCs) inyectados en matrices naturales (pericardio humano descelularizado). Hemos implantado la bio-prótesis miocárdica in vivo y hemos determinado que el bio-andamio favorece la migración celular y la regeneración de la zona infartada en el modelo porcino. En conclusión, hemos analizado el potencial cardiogénico de células adultas somáticas (hNDFs), células madre adultas (pMATPCs) y células madre pluripotentes (hiPSCs) en cultivos 3D basados en hidrogeles de RAD16-I para futuras aplicaciones en el tratamiento de enfermedades cardíacas. / Cardiac failure is the primary cause of mortality throughout the world. One of the leading causes of heart failure is myocardial infarction, which results from a reduced flow of blood to a part of the heart. This leads to cardiomyocyte death and myocardial necrosis. In the past decade, various strategies for cardiac reparative medicine have been investigated, from tissue engineering to stem cell-based therapy. Herein, we characterized the cardiac potential of different cell types cultured in three-dimensional (3D) scaffolds based on the peptide hydrogel RAD16-I. Firstly, we studied the mesenchymal potential acquisition of human Normal Dermal Fibroblasts (hNDFs) in 3D cultures and further commitment into adipogenic and cardiogenic lineages. We suggest that only hNDFs cultured in RAD16-I hydrogels undergo a mesenchymal potentiation. Cells spontaneously acquired mesenchymal stem cell-like properties whereas they required induction media to differentiate into adipogenic- and cardiogenic-like lineages. Secondly, we compared the degree of cardiac commitment of human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) when cultured in 2D versus 3D and the effect of ascorbic acid (AA), which has been proven to promote cardiac differentiation, on the process. In fact, AA seemed to accelerate and improve the cardiac commitment of hiPSCs in 2D cultures. Results suggested that hiPSCs in 3D cultures displayed an increased level of differentiation and acquired 105-fold more cardiogenic potential than cells cultured in 2D. Thirdly, we designed a cardiac patch based on 3D cultures of adult porcine Mediastinal Adipose Tissue Progenitor Cells (pMATPCs) injected into natural matrices (decellularized human pericardium). We implanted the myocardial bioprosthesis in vivo and determined that the bioscaffold supported cell migration and regeneration into the infarcted area in swine. In summary, we studied the cardiogenic potential of adult somatic cells (hNDFs), adult stem cells (pMATPCs) and pluripotent stem cells (hiPSCs) in 3D cultures based on RAD16-I hydrogels for potential future applications in the treatment of heart disease.

Els actuals mètodes ab initio per a la resolució d'estructures macromoleculars estan generalment limitats a casos de proteïnes petites que difracten a resolució atòmica (1.2Å màxim) llevat que continguin àtoms pesats. ARCIMBOLDO1 és un mètode general per a la resolució d'estructures amb dades de difracció de fins 2Å que s'executa en un entorn de multiso lució. Està basat en l'ús del programa Phaser2, per a la localització de petits fragments model com α-hèlixs (la seva presència es pot predir per endavant) combinat amb els algoritmes de modificació de la densitat implementats en el programa SHELXE. ARCIMBOLDO va ser especialment dissenyat per funcionar en un supercomputador o en un grid d'ordinadors coordinat per Condor3. A part d'explotar la presència d'α-hèlixs com informació de partida, a l'ARCIMBOLDO es poden incorporar també altres fonts d'informació, per exemple, es poden proposar com a models de recerca fragments més complexos que la ubiqua cadena principal de l'α-hèlix mitjançant el modelatge de cadenes laterals sobre la cadena principal. També es poden utilitzar estructures macromoleculars amb baixa homologia per extreure petits fragments de recerca, perquè tot i que les estructures en general no siguin prou semblants com per fer un ús convencional del mètode de reemplaçament molecular, les similituds locals es poden explotar amb èxit. Per a aquests casos el programa executa en paral•lel una bateria de prova amb models alternatius i selecciona el més prometedor d'acord amb una determinada figura de mèrit. Una altra font d'informació de partida pot ser la informació experimental, la mateixa pot incorporar-se al mètode de les dues maneres següents: • Localització d'un fragment anòmal explotant les diferències anòmales o dades de l'experiment de MAD5. • Localització d'un fragment model quan una subestructura anòmala ha estat previament determinada per un altre programa. Les dues fonts d'informació poden combinar-se en el procés d'expansió, però en qualsevol dels casos anteriors, la clau de l'èxit consisteix en el control del flux de treball per maximitzar les probabilitats d'èxit, mentre s'evita la creació d'un nombre intractable de processos paral•lels. Referències: 1 DD Rodrguez, C Grosse, S Himmel, C Gonzalez, IM de Ilarduya, S Becker, GM Sheldrick, and I Uson. Crystallographic ab initio protein structure solution below atomic resolution. Nature methods, 6(9):651{653, 2009. 2 AJ McCoy, RW Grosse-Kunstleve, PD Adams, MD Winn, LC Storoni, and RJ Read. Phaser crystallographic software. Journal of applied crystallography, 40(4):658{674, 2007. 3 GM Sheldrick. Experimental phasing with SHELXC/D/E: combining chain tracing with density modification. Acta Crystallographica Section D, 66(4): 479{485, 2010. 4 D Thain, T Tannenbaum, and M Livny. Distributed computing in practice: The condor experience. Concurrency and Computation: Practice and Experience, 17(2-4):323{356, 2005. 5 WA Hendrickson and CM Ogata. Phase determination from multiwavelengthanomalous diffraction measurements. Methods in Enzymology, 276:494{523,1997. / ARCIMBOLDO, un método de supercomputación para la determinación cristalográfica ab initio de estructuras de proteínas con resolución inferior a la atómica. RESUMEN: Los actuales métodos Ab initio para la resolución de estructuras macromoleculares están generalmente limitados a casos de proteínas pequeñas que difractan a resolución atómica (1.2Å máximo) a menos que contengan átomos pesados. ARCIMBOLDO1 es un método general para la resolución de estructuras con datos de difracción de hasta 2Å que se ejecuta en un entorno de multisolución. Está basado en el uso del programa Phaser2, para la localización de pequeños fragmentos modelos como α-hélices -cuya presencia puede predecirse de antemano- combinado con los algoritmos de modificación de la densidad implementados en el programa SHELXE3. ARCIMBOLDO fue especialmente diseñado para funcionar en un supercomputador o en un grid de computadoras coordinado por Condor4. Aparte de explotar la presencia de α-hélices como información de partida, en ARCIMBOLDO se pueden incorporar también otras fuentes de información, por ejemplo, se pueden proponer como modelos de búsqueda fragmentos más complejos que la ubicua cadena principal de la α-hélice mediante el modelado de cadenas laterales sobre la cadena principal. También se pueden utilizar estructuras macromoleculares con baja homología para extraer pequeños fragmentos de búsqueda, porque aún cuando las estructuras en general no sean suficientemente parecidas como para hacer un uso convencional del método de reemplazo molecular, las similitudes locales pueden explotarse exitosamente. Para estos casos el programa ejecuta en paralelo una batería de prueba con modelos alternativos y selecciona el más prometedor de acuerdo con una determinada figura de mérito. Otra fuente de información de partida puede ser la información experimental, la misma puede incorporarse al método de las dos siguientes maneras: • Búsqueda de un fragmento anómalo explotando las diferencias anómalas o datos del experimento de MAD5. • Búsqueda de un fragmento modelo cuando una subestructura anómala ha sido previamente determinada por otro programa. Ambas fuentes de información pueden combinarse en el proceso de expansión, pero en cualquiera de los casos anteriores, la clave del éxito radica en el control del flujo de trabajo para maximizar las probabilidades de éxito, a la vez que se evita la creación de un número intratable de procesos paralelos. Referencias: 1 DD Rodrguez, C Grosse, S Himmel, C Gonzalez, IM de Ilarduya, S Becker, GM Sheldrick, and I Uson. Crystallographic ab initio protein structure solution below atomic resolution. Nature methods, 6(9):651{653, 2009. 2 AJ McCoy, RW Grosse-Kunstleve, PD Adams, MD Winn, LC Storoni, and RJ Read. Phaser crystallographic software. Journal of applied crystallography, 40(4):658{674, 2007. 3 GM Sheldrick. Experimental phasing with SHELXC/D/E: combining chain tracing with density modification. Acta Crystallographica Section D, 66(4): 479{485, 2010. 4 D Thain, T Tannenbaum, and M Livny. Distributed computing in practice: The condor experience. Concurrency and Computation: Practice and Experience, 17(2-4):323{356, 2005. 5 WA Hendrickson and CM Ogata. Phase determination from multiwavelengthanomalous diffraction measurements. Methods in Enzymology, 276:494{523,1997. / Ab initio macromolecular phasing has been so far limited to small proteins diffracting at atomic resolution (beyond 1.2Å) unless heavy atoms are present. ARCIMBOLDO1 is a general ab initio phasing method for 2Å data, that works in a multosilution framework, based on the combination of localizing predicted small model fragments (like α-helices) with Phaser2, and density modification with SHELXE3. The method was designed to perform in a grid of computer or a supercomputer running Condor. Further than the use of α-helices as starting information, other sources of stereochemical or experimental information can be exploited as well, fragments that are more sophisticated than the ubiquitous main-chain α-helix can be proposed by modelling side chains onto the main-chain or extracted from low-homology models -even if the conventional molecular-replacement approach has been unsuccessful- since locally their structure may be similar enough to the unknown one. In such cases, the program may test a set of alternative models in parallel against a specified figure of merit and proceed with the selected one(s). Experimental information can also be incorporated to the method in two ways: • Searching within ARCIMBOLDO for an anomalous fragment against anomalous differences or MAD5 data. • Finding model fragments when an anomalous substructure has been determined with another program. Both sources of information may be combined in the expansion process. In any of the above cases the key is to control the workflow to maximize the chances of success while avoiding the creation of an intractable number of parallel processes. KEYWORDS: ab initio phasing, fragment search, molecular replacement, density modification, supercomputing. References: 1 DD Rodrguez, C Grosse, S Himmel, C Gonzalez, IM de Ilarduya, S Becker, GM Sheldrick, and I Uson. Crystallographic ab initio protein structure solution below atomic resolution. Nature methods, 6(9):651{653, 2009. 2 AJ McCoy, RW Grosse-Kunstleve, PD Adams, MD Winn, LC Storoni, and RJ Read. Phaser crystallographic software. Journal of applied crystallography, 40(4):658{674, 2007. 3 GM Sheldrick. Experimental phasing with SHELXC/D/E: combining chain tracing with density modification. Acta Crystallographica Section D, 66(4): 479{485, 2010. 4 D Thain, T Tannenbaum, and M Livny. Distributed computing in practice: The condor experience. Concurrency and Computation: Practice and Experience, 17(2-4):323{356, 2005. 5 WA Hendrickson and CM Ogata. Phase determination from multiwavelengthanomalous diffraction measurements. Methods in Enzymology, 276:494{523,1997.

L'objectiu del projecte és el desenvolupament de nous processos químics per a la modificació dels subproductes obtinguts en la producció del biodiésel, per obtenir ésters de propietats millorades com lubricants. Les tres propietats més importants que ha de tenir un fluid per al seu ús com lubricant són: viscositat, propietats en fred i estabilitat oxidativa. Els biolubricants de 1ª generació mostren una sèrie de limitacions quan són comparats amb els seus equivalents en base petroli. A causa de les condicions d'operació, els lubricants han de suportar altes temperatures (estabilitat química i oxidativa), igual que tenir unes bones propietats en fred (punt de fluència i de terbolesa). Aquestes propietats estan intrínsecament lligades a l'estructura química dels àcids grassos utilitzats en els biolubricants de 1a generació, on les insaturacions infereixen bones propietats en fred però una baixa estabilitat oxidativa degut a la seva alta reactivitat. Per obtenir biolubricants de 2ª generació es requereix la substitució de les insaturacions per ramificacions per tal d'augmentar l'estabilitat oxidativa dels compostos mantenint unes bones propietats en fred. En el present treball s'ha desenvolupat una nova via sintètica en tres passos utilitzant l'estratègia de epoxidació-obertura de les insaturacions, per obtenir compostos on les insaturacions han estat substituïdes per ramificacions éster-éster asimètriques. S'han caracteritzat els nous productes sintetitzats (densitat, viscositat, punt de fluència ...) per tal d'estudiar la relació estructura propietats. L’introducció de la ramificació produeix una millora substancial de l'estabilitat oxidativa dels compostos mantenint unes bones propietats en fred, la viscositat cinemàtica experimenta un notable increment a causa del procés de ramificació i algunes propietats poden ser modulades mitjançant la longitud de la ramificació. Les propietats dels nous compostos han estat comparades amb les propietats d'altres biolubricants de 2ª generació descrits a la bibliografia mostrant la gran diferència que produeix l'ús d'enllaços tipus èter o èster i la simetria o asimetria en les ramificacions. Un estudi computacional mitjançant dinàmica molecular dels diferents tipus de ramificació possibles, ha permès la racionalització del comportament dels diferents tipus de ramificació a nivell molecular. Finalment s'ha realitzat un estudi sobre la possibilitat d'obtenir aquests productes mitjançant tècniques de biotecnologia blanca, concretament l'esterificació d'alcohols altament impedits utilitzant lipases. Els resultats han mostrat que és possible obtenir compostos amb un alt valor afegit mitjançant un procés que millori els processos basats en la química tradicional. / El objetivo del proyecto es el desarrollo de nuevos procesos químicos para la modificación de los subproductos obtenidos en la producción del biodiésel, para obtener ésteres de propiedades mejoradas como lubricantes. Las tres propiedades más importantes que debe tener un fluido para su uso como lubricante son: viscosidad, propiedades en frío y estabilidad oxidativa. Los biolubricantes de 1ª generación muestran una serie de limitaciones cuando son comparados con sus equivalentes en base petróleo. Debido a las condiciones de operación, los lubricantes deben soportar altas temperaturas (estabilidad química y oxidativa), al igual que tener unas buenas propiedades en frío (punto de fluencia y de turbidez). Estas propiedades están intrínsecamente ligadas a la estructura química de los ácidos grasos utilizados en los biolubricantes de 1ª generación, donde las insaturaciones infieren buenas propiedades en frío pero una baja estabilidad oxidativa debido a su alta reactividad. Para la obtención de biolubricantes de 2ª generación se requiere la sustitución de las insaturaciones por ramificaciones con el fin de aumentar la estabilidad oxidativa de los compuestos manteniendo unas buenas propiedades en frío. En el presente trabajo se ha desarrollado una nueva vía sintética en tres pasos utilizando la estrategia de epoxidación-apertura de las insaturaciones, para obtener compuestos donde las insaturaciones han sido sustituidas por ramificaciones éster-éster asimétricas. Se han caracterizado los nuevos productos sintetizados (densidad, viscosidad, punto de fluencia…) con el fin de estudiar la relación estructura propiedades. La introducción de la ramificación produce una mejora sustancial de la estabilidad oxidativa de los compuestos manteniendo unas buenas propiedades en frío, la viscosidad cinemática experimenta un notable incremento debido al proceso de ramificación y algunas propiedades pueden ser moduladas mediante la longitud de la ramificación. Las propiedades de los nuevos compuestos han sido comparadas con las propiedades de otros biolubricantes de 2ª generación descritos en la bibliografía, mostrando la gran diferencia que produce el uso de enlaces tipo éter o éster y la simetría o asimetría en las ramificaciones. Un estudio computacional mediante dinámica molecular de los distintos tipos de ramificación posibles, ha permitido la racionalización del comportamiento los distintos tipos de ramificación a nivel molecular. Finalmente se ha realizado un estudio sobre la posibilidad de obtener estos productos mediante técnicas de biotecnología blanca, concretamente la esterificación de alcoholes altamente impedidos utilizando lipasas. Los resultados han mostrado que es posible obtener compuestos con un alto valor añadido mediante un proceso que mejore los procesos basados en la química tradicional. / The project aims to develop new chemical processes for the modification of the byproducts obtained in the production of biodiesel in order to obtain esters with improved properties as lubricants. The three most important properties that an oil should have to be used as a lubricant are: viscosity, cold properties and oxidative stability. The 1st generation biolubricants show some limitations when compared with their petroleum based counterparts. Due to the operating conditions, lubricants must withstand high temperatures (chemical and oxidative stability), as well as having good cold properties (pour point and turbidity). These properties are inherent to the chemical structure of the fatty acids used in 1st generation biolubricants, where the good cold properties are inferred by the unsaturations while giving low oxidative stability because of their high reactivity. To obtain 2nd generation biolubricants, it requires the unsaturation replacement by branches in order to increase the oxidative stability of the compounds while maintaining good cold properties. In this work we have developed a new synthetic pathway in three steps using the strategy of epoxidation-ring opening of unsaturations, in order to obtain compounds where the unsaturations have been replaced by ester-ester asymmetric branches. We have characterized the new synthesized products (density, viscosity, pour point ...) in order to study the relationship between structure properties. The introduction of branching produces a substantial improvement of the oxidative stability of the compounds while maintaining good cold properties, kinematic viscosity substantially increases due to branching and some properties can be modulated by the length of the branch. The properties of the new compounds have been compared with the properties of other 2nd generation bio-lubricants described in the literature, showing the difference produced by the use of ether or ester bonds and the symmetry or asymmetry of the branches. A computational study using molecular dynamics of different possible types of branching, has allowed the rationalization of the behavior of different types of branching at the molecular level. Finally, we have conducted a study on the possibility of obtaining such products through white biotechnology techniques, namely the esterification of hindered alcohols using lipases. The results have shown that it is possible to obtain compounds with high added value through a process which improves the available processes based on traditional chemistry.

L’enginyeria metabòlica és una estratègia molt útil per produir molècules d’alt valor afegit mitjançant microorganismes. Molècules d’interès per la seva funció biològica, d’estructura complexa i amb dificultats en la seva obtenció i síntesi s’han obtingut de forma molt satisfactòria mitjançant aquesta metodologia. En el laboratori de Bioquímica de l’IQS s‘estudia la glicosiltransferasa de Micoplasma genitalium codificada pel gen mg517 i responsable de la síntesi de glicoglicerolípids (Andrés et al., 2010). S’ha vist que aquesta proteïna sobreexpressada en E.coli és funcional i acumula diferents glicoglicerolípids en la membrana plasmàtica. Aquests glicoglicerolípids mostren diferents punts d’interès. D’una banda, són tensioactius d’alt valor afegit que permeten la construcció de niosomes per l’alliberament controlat de fàrmacs i, d’altra banda, s’han relacionat com agents terapèutics amb inhibició de tumors cancerígens. Degut al creixent interès d’aquests productes,en el present treball s‘ha escollit E. coli com a microorganisme a modificar per enginyeria metabòlica per la producció de glicoglicerolípids, ja que per una banda, no presenta aquests lípids però sí sintetitza els seus precursors UDP-glucosa i diacilglicerol (DAG). S’han dissenyat diferents soques d’E.coli on se sobreexpressen la glicosiltransferasa MG517 i, a més, la uridiltransferasa GalU procedent d’E.coli JM109, que sintetitza el precursor UDP-glucosa a partir de glucosa 1-fosfat, i l’aciltransferasa PlsC involucrada en la biosíntesi del precursor DAG. En les soques on les proteïnes GalU i PlsC s’han sobreexpressat, les seves activitats han augmentat 220 i 80 vegades, respectivament. La glicosiltransferasa MG517 és activa en totes les soques però, sorprenentment, la seva activitat després de les cinc hores d‘inducció és10 vegades inferior quan es dóna la coexpressió de MG517 i PlsC. S’observa que la sobreproducció de UDP-glucosa no incrementa la quantitat total de glicoglicerolípids mentre que el DAG sí, de manera que la soca AbC amb els gens mg517 i plsC és la que sintetitza més glicoglicerolípids, arribant a nivells de 1059 nM per biomassa. Dels tres glicoglicerolípids formats, el diglucosilacilglicerol és sempre el més abundant i el seu percentatge varia entre 57 i 82% en funció de la coexpressió dels enzims. La producció d’aquests nous lípids en la membrana d’E. coli implica que el percentatge del fosfolípid fosfatidiletanolamina disminueixi un 20%, mentre els fosfolípids anionis es mantenen constants. Es conclou que la soca modificada d’E. coli AbC és una bona plataforma per la producció de nous glicolípids amb diferent estructura. / La ingeniería metabólica es una estrategia muy útil para producir moléculas de valor añadido mediante microorganismos. Moléculas de interés por su función biológica, de estructura compleja y con dificultades en su obtención y síntesis se han obtenido de forma muy satisfactoria con el uso de esta metodología. En el laboratorio de Bioquímica del IQS se estudia la glicosiltransferasa de Micoplasma genitalium codificada por el gen mg517 y responsable de la síntesis de glicoglicerolípidos (Andrés et al. 2011). Se ha observado que esta proteína sobreexpresada en E.coli es funcional y acumula estos lípidos en la membrana plasmática. Los glicoglicerolípidos muestran diferentes puntos de interés. Por una parte, son tensioactivos que permiten la construcción de niosomas para la liberación controlada de fármacos y, por otra parte, se han seleccionado como agentes terapéuticos con inhibición de tumores cancerígenos. Debido al creciente interés de estos productos, en el presente trabajo, se ha escogido E.coli como microorganismo a modificar por ingeniería metabólica para la producción de glicoglicerolípidos, ya que no presenta estos lípidos pero sí sintetiza sus precursores UDP-glucosa y diacilglicerol (DAG). Se han diseñado diferentes cepas de E.coli donde se sobreexpressa la glicosiltransferasa MG517 y, además, la uridiltransferasa GalU de E.coli JM109, que sintetiza el precursor UDP-glucosa, y la aciltransferasa PlsC involucrada en la biosíntesis del precursor DAG. En las cepas donde las proteínas GalU y PlsC se han sobreexpressado, sus actividades han aumentado 220 y 80 veces, respectivamente. La glicosiltransferasa MG517 es activa en todas las cepas pero, sorprendentemente, su actividad después de inducir es 10 veces inferior cuando se da la coexpresión de MG517 y PlsC. Se observa que la sobreproducción de UDP-glucosa no incrementa la cantidad total de glicoglicerolípidos mientras que el DAG sí, de forma que la cepa AbC con los genes mg517 y plsC es la que sintetiza más glicoglicerolípidos, llegando a niveles de 1059 nM por biomasa. De los tres glicoglicerolípidos formados, el diglucosildiacilglicerol es siempre el más abundante y su porcentaje varía entre 57 y 82% en función de la coexpressión de las enzimas. La producción de los nuevos lípidos en la membrana de E.coli implica que el porcentaje del fosfolípido fosfatidiletanolamina disminuya un 20%, mientras los fosfolípidos aniónicos se mantienen contantes. Se concluye que la cepa modificada de E.coli AbC es una buena plataforma para la producción de nuevos glicolípidos con distinta estructura. / Metabolic engineering is a useful strategy to achieve target molecules using microorganisms. Molecules of high biological value, with complex estructure and difficulties to be obtained and synthesised, as for example, glycoconjugates, have been successfully obtained by this methodology (Ruffing i Chen, 2010). Our group studies the Mycoplasma genitalium glycosyltransferase encoded by mg517 gene and responsible of glycoglycerolipid synthesis. (Andrés et al., 2010). This protein overexpressed in E. coli is functional and accumulates the glycolipids in its plasma membrane. These glycoglycerolipids have different points of interest. On one hand, they are biosurfactants and evencan form niosomes for drug delivery systems. On the other hand, they have been related to inhibition of cancer tumors. Due to growing interest of these products, and in order to improve production of glycoglycerolipids, different metabolic engineered E. coli strains have been designed in this work. This microorganism has been chosen since on the one hand, it does not produce these lipids but its metabolism produces the glicoglicerolipids precursors, UDP-glucose and diacylglycerol (DAG). In these strains, the glycosyltransferase is coexpressed with genes related to biosynthesis of both precursors. Therefore coexpression of the glycosyltransferase MG517, the uridyl transferase GalU from E. coli JM109, which synthesizes the precursor Glc-UDP from glucose-1-phosphate, and the acyl transferase PlsC involved in the biosynthesis of the precursor DAG have been studied. Once modified strains were constructed, their phenotype have been analysed. On one hand, the three enzymatic activities have been determined in vitro from the cell extracts. When GalU and PlsC were overexpressed, their activities increased 220 and 80-fold, respectively, compared to the controls. The glycosyltransferase MG517 was active in these modified strains but, surprisingly, its activity decreases 10-fold when MG517 and PlsC were coexpressed. It is observed that overproduction of UDP-glucose does not increase total glycolipids amount while DAG have a positive impact on this production, being strain with mg517 and plsC genes which produces more glycolipids achieving 1059 nM per biomass. . Furthermore, the modified strains showed different glycoglycerolipids profiles. In all strains the disaccharide glycoglycerolipid is the most abundant but its percentage varies from 57% to 82% depending on enzyme coexpression. Production of these new lipids in E. coli membrane implies less synthesis of phosphatidylethanolamine phospholipid, which is characteristic of this microorganism. Our results show the modified E. coli strain with mg517 and plsC genes is a good platform microorganism for the production of new glicolipids with different structure.

Aquesta tesi se centra en l’estudi de les possibles glicosiltransferases de Micoplasma genitalium involucrades en la síntesi de glicolípids. Aquests compostos formen part de la membrana plasmàtica del microorganisme, únic envolcall que el protegeix del seu entorn ja que no disposa de paret cel•lular. La hipòtesi sobre la qual s’ha desenvolupat el treball és la possibilitat que aquests glicolípids i els enzims encarregats de la seva producció, les glicosiltransferases, siguin essencials per a la viabilitat del micoplasma i per tant, la seva inhibició sigui una forma d’eradicar les infeccions causades pel patògen. De les tres seqüències classificades com a glicosiltrasferases en el genoma de Mycoplasma genitalium, mg025, mg060 i mg517, s’ha determinat que mg025 és l’únic dels tres gens que no és essencial per al bacteri, tot i que s’ha observat que els tres s’expressen tant a la fase exponencial com a la fase estacionària del seu creixement. La funció de mg025 i mg060 és encara desconeguda, mentre que mg517 és la glicosiltransferasa encarregada de la síntesi dels dos principals glicolípids del micoplasma, el monoglicosildiacilglicerol (MGlcDG) i el diglicosildiacilglicerol (DGlcDG). En aquesta tesi s’ha desenvolupat un protocol d’expressió per a la glicosiltransferasa codificada per mg517, anomenada GT-MG517, el qual fa ús d’una coexpressió amb xaperones i solubilitza la proteïna amb detergents, glicerol i una elevada força iònica. Aquesta metodologia ha estat necessària ja que GT-MG517 és una proteïna associada a membrana i la seva expressió recombinant en E.coli presenta dificultats. La proteïna s’ha purificat mitjançant cromatografia d’afinitat per Ni, tot i que el grau de puresa assolit no ha estat suficient per a intentar la seva cristal•lització. Les diverses proves realitzades usant cromatografia d’exclusió molecular han permès determinar que GT-MG517 forma oligòmers d’alt pes molecular. A partir de la proteïna purificada s’ha realitzat un estudi cinètic de la seva doble activitat glicosildiacilglicerolsintasa. D’aquest estudi s’extreu que GT-MG517 pot transferir un sucre, Glc o Gal, a una molècula principalment hidrofòbica, com és el DOG, i a una molècula molt més hidrofílica, com el MGlcDG. Ambdós compostos però posseeixen un alcohol primari sobre el qual té lloc la transferència creant l’enllaç (16). Amb qualsevol dels substrats acceptors provats, l’enzim presenta activitats específiques superiors si el substrat donador és UDP-Gal. L’acceptor preferit de GT-MG517 és el lípid DOG, però la glicosiltransferasa és capaç d’elongar, ja sigui amb una Glc o amb una Gal, glicolípids com el MGlcDG i el MGDEG, preferint en aquest cas el compost amb una Gal a l’extrem no reductor. Tot i això, l’afinitat de l’enzim és superior per a donadors amb Glc (KM inferiors a les dels donadors amb Gal). D’altra banda, s’ha demostrat que el lípid aniònic DOPG es comporta com a activador de l’activitat enzimática. GT-MG517 posseeix un teòric domini d’unió d’UDP-Glc a l’extrem N-terminal. Aquesta zona presenta similitud de seqüència amb altres glicosiltransferases i permet la classificació de GT-MG517 dins de la família GT-2. En canvi, el seu extrem C-terminal presenta una seqüència particular que no s’alinea amb altres proteïnes. En aquesta tesi es formula la hipòtesi que aquesta zona podria ser d’interacció amb la membrana i, a més, que aquesta interacció podria regular l’activitat enzimàtica. Per això es preparen diverses formes truncades de GT-MG517, en les quals s’eliminen alguns aminoàcids de l’extrem C-terminal, i una forma en la qual només es conserva l’hipotètic domini d’unió d’UDP-Glc. Aquestes noves proteïnes s’expressen, solubilitzen i purifiquen aplicant el protocol establert per a la forma completa. Amb l’anàlisi dels glicolípids sintetitzats s’estableix que els deu últims aminoàcids de GT-MG517 són prescindibles per a la seva activitat, ja que les formes truncades corresponents continuen tenint la capacitat de sintetitzar glicolípids. No obstant, l’eliminació d’un nombre superior de residus, inactiva la proteïna. La purificació de l’hipotètic domini d’unió d’UDP-Glc posa de manifest que forma oligòmers, de la mateixa forma que ho fa la proteïna completa. / Esta tesis se centra en el estudio de las posibles glicosiltransferasas de Mycoplasma genitalium involucradas en la síntesis de glicolípidos. Estas moléculas constituyen parte de la membrana plasmática del miroorganismo, única estructura de protección frente al entorno ya que los micoplasmas carecen de pared celular. La hipótesis sobre la cual se ha desarrollado el trabajo es la posibilidad que los mencionados glicolípidos y las enzimas encargadas de su producción, las glicosiltransferasas, sean esenciales para la viabilidad del micoplasma y, por tanto, su inhibición sea una forma de erradicar las infecciones causadas por el patógeno. De las tres secuencias clasificadas como glicosiltransferasas en el genoma de Mycoplasma genitalium, mg025, mg060 y mg517, se determinó que mg025 es el único de los tres genes que no es esencial para la bacteria, aunque se observó que los tres se expresan tanto en la fase exponencial como en la fase estacionaria de su crecimiento. Se desconoce todavía la función de mg025 y mg060. En cambio, se conoce que mg517 es la glicosiltransferasa responsable de la síntesis de los dos principales glicolípidos del micoplasma, el monoglicosildiacilglicerol (MGlcDG) y el diglicosildiacilglicerol (DGlcDG). En esta tesis se desarrolló un protocolo de expresión para la glicosiltransferasa codificada por mg517, llamada GT-MG517, el cual emplea una coexpresión con chaperonas y solubiliza la proteína con detergentes, glicerol y una fuerza iónica elevada. Dicha metodología fue necesaria ya que GT-MG517 es una proteína asociada a membrana y su expresión recombinante en E.coli presenta dificultades. La proteína se purificó mediante cromatografía de afinidad por Ni pero el grado de pureza obtenido no fue suficiente para intentar su cristalización. Distintas pruebas realizadas usando cromatografía d’exclusión molecular permitieron determinar que GT-MG517 forma oligómeros de alto peso molecular. Con la proteína purificada se realizó un estudio cinético de su doble actividad glicosildiacilglicerolsintasa. De este estudio se extrae que GT-MG517 puede transferir un azúcar, Glc o Gal, a una molécula principalmente hidrofóbica, como es el DOG, y a una molécula mucho más hidrofílica, como el MGlcDG. Pese a su diferencia, los dos compuestos poseen un alcohol primario sobre el que tiene lugar la transferencia creándose el enlace (16). Con cualquiera de los sustratos aceptores probados, la enzima presenta actividades específicas superiores si el sustrato dador es UDP-Gal. El aceptor preferido de GT-MG517 es el lípido DOG, aunque la glicosiltransferasa es capaz de elongar, ya sea con una Glc o con una Gal, glicolípidos como el MGlcDG y el MGDEG, prefiriendo en este caso el compuesto con una Gal en el extremo no reductor. Aún así, la afinidad de la enzima es superior para dadores con Glc (KM inferiores a las de los dadores con Gal). Por otro lado, se demostró que el lípido aniónico DOPG se comporta como activador de la actividad enzimática. GT-MG517 posee un dominio teórico de unión de UDP-Glc en su extremo N-terminal. Esta zona presenta similitud de secuencia con otras glicosiltransferasas y permite la clasificación de GT-MG517 dentro de la familia GT-2. En cambio, su extremo C-terminal presenta una secuencia particular que no se alinea con otras proteínas. En esta tesis se formula la hipótesis que dicha zona podría ser de interacción con la membrana y, además, que dicha interacción podría regular la actividad enzimática. Por eso se prepararon distintas formas trucadas de GT-MG517, en las cuales se eliminaron algunos aminoácidos del extremo C-terminal, y una forma en la cual sólo se conservó el hipotético dominio de unión de UDP-Glc. Las nuevas proteínas se expresaron, solubilizaron y purificaron aplicando el protocolo establecido para la forma completa. Con el análisis de los glicolípidos sintetizados se determinó que los diez últimos aminoácidos de GT-MG517 eran prescindibles para su actividad, ya que las correspondientes formas truncadas conservaban su capacidad de sintetizar glicolípidos. No obstante, la eliminación de un número superior de residuos inactiva la proteína. La purificación del hipotético dominio de unión de UDP puso de manifiesto que forma oligómeros, de la misma forma en que lo hace la proteína completa. / This thesis is focused on the glycolipid producing glycosyltransferases from Mycoplasma genitalium. Glycolipids are part of the microorganism plasma membrane, which is the external covering of mycoplasmas since they lack a cell wall. Our working hypothesis is that glycolipids and the enzymes responsible for their production are essential to mycoplasma. Thus, glycosyltransferase inhibition could be a way to eradicate this pathogen caused infections. There are three genes described as putative glycosyltransferases in Mycoplasma genitalium genome, mg025, mg060 and mg517. We determined that mg025 is the only one essential to the bacteria, although the three of them are expressed both during the exponential and stationary growth phases. The function of mg025 and mg060 still remains unknown, whereas mg517 codifies for the glycosyltransferase responsible for monoglycosyldiacylglycerol (MGlcDG) and diglycosyldiacylglycerol (DGlcDG) synthesis, main mycoplasma glycolipids. In this work an expression protocol for mg517 codified glycosyltransferase was designed. The protocol included chaperone coexpression and protein solubilization with detergents, glycerol and high ionic strength. This methodology was necessary since GT-MG517 is a membrane associated protein and its recombinant expression in E.coli presents some difficulties. GT-MG517 was purified by Ni affinity chromatography. However, a suitable purity degree to attempt protein crystallization was not achieved. Some experiments using size exclusion chromatography revealed that GT-MG517 forms high molecular weight oligomers. A kinetic study of the protein double glycosyldiacylglycerol synthase activity was performed. From this study we learned that GT-MG517 is able to transfer a sugar moiety, Glc or Gal, both to a hydrophobic molecule such as DOG or to a more hydrophilic compound such as MGlcDG. These acceptor substrates share a primary alcohol where the sugar transfer takes place forming a (16) bond. The enzyme presents higher specific activities when UDP-Gal acts as reaction donor, regardless of the acceptor tested. DOG is the preferred acceptor although the enzyme is able to transfer Glc or Gal moieties to glycolipids such as MGlcDG and MGDEG. In this case, the reaction is faster with acceptors with Gal in the non-reducing end. As for donor substrate, enzyme’s affinity is higher for Glc containing molecules, with lower KM values than for Gal donors. In addition, our study proved the anionic lipid DOPG to act as an enzymatic activity enhancer. GT-MG517 has a putative binding domain for UDP-Glc in the N-terminal end. This sequence is similar to other glycosyltransferases and allows its classification in Cazy’s GT-2 family. On the contrary, the C-terminal end has a particular sequence which does not match up with any other protein. Our hypothesis was that this C-terminal end of GT-MG517 could contain a membrane interaction sequence, which could at the same time modulate enzymatic activity. To test this hypothesis some truncated forms of GT-MG517, where C-terminal aminoacids had been removed, were prepared. Moreover, a form where only the putative UDP-Glc binding domain was conserved was also expressed. All these proteins were expressed, solubilized and purified with the same protocol used for the full-length form of GT-MG517. Glycolipids produced by truncated forms were analysed and results implied that the last ten aminoacids were not involved in the enzyme’s activity. Elimination of a higher number of aminoacids caused protein inactivation. When the putative UDP-binding domain was purified, it showed high molecular weight oligomers such as those developed by the complete form of the protein.

El éxito clínico de los implantes dentales, fabricados en titanio comercialmente puro (Ti c.p.), está basado en la consecución de la osteointegración, es decir, la conexión directa estructural y funcional entre el hueso vivo, ordenado, y la superficie del implante. La mejora de la osteointegración a corto y largo plazo es función de múltiples factores, de entre los cuales, la calidad superficial del implante (fisicoquímica y topográfica) es de gran importancia. De hecho, todas las interacciones biológicas y mecánicas que se dan entre el implante y los tejidos circundantes son a través de la interfaz creada entre dichos tejidos y la superficie del material implantado.En este trabajo se estudian y desarrollan distintos tratamientos aplicados sobre la superficie de los implantes dentales con el objetivo final de obtener implantes con una mejor osteointegración, tanto a corto como a largo plazo. En la primera parte se obtienen superficies rugosas por medio del tratamiento del granallado.La rugosidad de las superficies de Ti c.p. granalladas depende no sólo del tamaño de las partículas abrasivas de proyección empleadas (125 - 300 m; 425 - 600 m; 1000 - 1400 m), sino también de su naturaleza química (Al2O3, SiC, TiO2 y ZrO2) y su forma. Esta rugosidad se debe cuantificar con, al menos, dos parámetros, uno de altura (Ra) y otro de espaciado (Pc). Además, cualquiera que sea la naturaleza química de las partículas empleadas, quedan restos de las mismas sobre las superficies tratadas. Con estas premisas, las propiedades de la superficie del Ti c.p. granallado se han podido optimizar, ya que la respuesta de adhesión y diferenciación de los osteoblastos está influenciada por la rugosidad y la naturaleza de las partículas de proyección. Además, aunque el aumento de rugosidad y las tensiones residuales que se inducen con el granallado influyen sobre el comportamiento electroquímico del material, éste es adecuado con respecto a su resistencia a la corrosión, de acuerdo a su posible utilización como material para la fabricación de implantes dentales.En la segunda parte se obtienen superficies rugosas y bioactivas por medio de un tratamiento en dos pasos: en primer lugar se granalla el implante (con las condiciones óptimas determinadas en la primera parte); y después se aplica un tratamiento termoquímico. El tratamiento termoquímico consiste en atacar el metal con NaOH y obtener en su superficie un gel hidratado de titanato de sodio. Este gel se deshidrata y densifica con un tratamiento térmico a 600 oC. En estas condiciones, el Ti c.p. es bioactivo.Las superficies de Ti c.p. granalladas con Al2O3 y tratadas termoquímicamente, demuestran su potencial bioactividad porque hacen crecer por vía química in vitro, sobre su superficie, una capa de apatita; y la confirman, al crecer también in vivo. Sin embargo, la presencia de los restos de partículas de SiC sobre la superficie del metal inhibe su bioactividad. Estas superficies rugosas y bioactivas se estudian de forma comparativa, in vitro e in vivo, con otras no rugosas y/o bioinertes. La respuesta de diferenciación de los osteoblastos y la osteointegración a corto y medio plazo se ven favorecidas por la combinación sinérgica de la rugosidad y la bioatividad del metal. Como consecuencia, los implantes rugosos y bioactivos son candidatos preferenciales para ser utilizados en los procedimientos clínicos de carga inmediata.

La present tesi investiga l'ús de la modelització amb elements finits per a l'estudi de la biomecànica lumbar per a l'avaluació clínica. Els estudis bibliogràfics del capítol 1 mostren relacions funcionals clares entre les forces externes i les estructures i formes del teixit lumbar. Els estudis clínics demostraren que independentment del seu origen, el dolor lumbar pot veure's empitjorat per sobrecàrregues dels teixits. Les mesures experimentals són insuficients per descriure la distribució de càrrega entre els diferents teixits lumbars, és així que s'han utilitzat models d'elements finits. No obstant, la fiabilitat dels models a l'hora de predir les càrregues locals en els teixits no ha estat demostrada, essent aquest un dels objectes d'estudi.En el Capítol 2 s'elaborà un model bisegment de la columna lumbar. El model inicial es completà incloent el còrtex vertebral, una definició complerta de les juntes sinovials, les plaques terminals de cartílag i una descripció millorada de l'estructura de l'anell. Es van simular càrregues simplificades per als estudis in vitro per calcular les distribucions de tensions, deformacions i energia. El model bisegment és vàlid per interpretar les distribucions de càrrega funcionals a L3-L5 en el cas d'estructures conegudes de teixit, però el conjunt de la geometria L3-L5 necessitava ser millorat.Així al Capítol 3 es creà un model geomètric bisegment precís de L3-L5. El nou model incloïa les corregides: dimensions i formes, alçades de disc, localitzacions del nucli, formes posteriors de l'os, i distribució dels lligaments. Després de comparar a nivell biomecànic l'antiga geometria amb la nova, els resultats mostraren que els rols relatius dels teixits modelats depenen de la geometria. En general, les distribucions de càrrega predites eren més fisiològiques en el nou model. En canvi, ambdós models, reprodueixen rangs experimentals de moviment, així doncs la seva validació hauria de tenir en compte les transferències de càrrega locals.El Capítol 4 es centra en la variabilitat dels angles creuats del col·lagen de l'anell. Es crearen quatre models bisegment amb organitzacions d'anell fibrós basats en la bibliografia comparant-se sota diverses càrregues. A més es proposà un paràmetre d'estabilització de l'anell per analogia a un tub de parets gruixudes. La biomecànica del model depenia en gran mesura de l'organització de l'anell fibrós, però el paràmetre d'estabilització era soviet contradictori amb les tensions i forces predites. Així, s'assumí que la geometria de la columna i l'organització de l'anell fibrós estaven lligades. Les xarxes d'anell de col·lagen adaptades es poden determinar numèricament, però els models d'anell haurien d'estar bastats en relacions mecanobiològiques.Al Capítol 5 es presenta un model de disc artificial acoblat amb el model de L3-L5. Models bisegment amb i sense implant van ser comparats amb càrregues controlades per força o desplaçament, incloent o no l'aproximació del pes del cos. La rigidesa de la pròtesi alterava generalment les distribucions de càrrega i les rotacions controlades per desplaçament conduint a grans efectes adjacents. Incloent el pes del cos les condicions de contorn semblaven més fisòlogiques que sense. Malgrat la rigidesa del nou disc, aquest sembla més prometedor que altres dispositius comercials.En aquesta tesi s'han creat sis models nous elements finits de la columna lumbar osteoligamentosa. Les simulacions han mostrat que l'ús fiable dels models requereix d'una descripció precisa de les càrregues locals i respostes mecàniques de teixits. Les prediccions locals van estar limitades qualitativament degudes al desconeixement de les estructures de teixit tou, equacions constitutives i condicions de contorn. En canvi, els models poden ser emprats com a laboratoris in silico per superar aquestes limitacions. Basat en la informació numèrica i experimental, s'ha proposat un procediment jeràrquic per al desenvolupament qualitativament fiable de models elements finits de la columna lumbar. / This PhD thesis investigated the use of finite element modelling to study lumbar spine biomechanics for clinical assessment. Bibliographic studies reported in the first Chapter showed clear functional relations between external forces and lumbar spine tissue structures and shapes. Clinical research revealed that independently of its origin, low back pain may be worsened by altered tissue mechanical environments. Experimental measurements alone cannot truly describe the load distributions between the different lumbar spine tissues. Thus, finite element models have been used in the past. But model reliability in predicting local tissue loadings is still not manifest and has been explored in this thesis as described in the following chapters.In Chapter 2, a L3-L5 lumbar spine bi-segment model was built. An initial model was completed to include the vertebral cortex, a full definition of the facet joints, the cartilage endplates, and an improved description of the annulus fibre-reinforced structure. Simplified load-cases used for in vitro studies were simulated to calculate stress and strain energy distributions. Predictions within the L3-L5 lumbar spine bi-segment model could be interpreted in terms of functional load distributions related to known tissue structures, but the overall L3-L5 bisegment model geometry needed further update.Thus, in Chapter 3, a geometrically accurate L3-L5 lumbar spine bi-segment model was created. The new model included corrected L3 and L5 body shapes and dimensions, corrected disc heights and nucleus placements, corrected posterior bone shapes, dimensions, and orientations, and corrected ligament distributions. The new and old geometries were biomechanically compared. Results showed that the relative roles of modelled tissues greatly depend on the geometry. Predicted load distributions were generally more physiological in the new model. However, new and old models could both reproduce experimental ranges of motion, meaning that their validation should take into account local load transfers.Chapter 4 focuses on the variability of the annulus collagen criss-cross angles. Four bi-segment models with literature-based annulus fibre organizations were created and compared under diverse loads. Moreover, an annulus stabilization parameter was proposed by analogy to a thick walled pipe. Model biomechanics greatly depended on the annulus fibre organization, but annulus stabilization parameter was often contradictory with the predicted stresses and strains. Spine geometry and annulus fibrous organization were hypothesized to be linked together. Adapted annulus collagen networks may be numerically determined, but annulus modelling should be based on mechano-biological relationships.In Chapter 5, a case-study of a novel artificial disc design coupled with the L3-L5 lumbar spine model is presented. Bi-segment models with and without implant were compared under load- or displacement-controlled rotations, with or without body-weight like load. Prosthesis stiffness generally altered the load distributions and displacement-controlled rotations led to strong adjacent level effects. Including body weight-like loads seemed to give more realistic results. Although the novel disc substitute is too stiff, it is more promising than other existing commercial devices.In this thesis, six new osteoligamentous lumbar spine bi-segment finite element models were created. Simulations showed that reliable use of lumbar spine finite element models requires precise descriptions of local tissue loading and response. Local predictions were qualitatively mainly limited by a lack of knowledge about soft tissue structural organisations, constitutive equations, and boundary conditions. However, models can be used as in silico laboratories to overcome such limitations. A hierarchical procedure for the development of qualitatively reliable lumbar spine finite element models was proposed based on available numerical and experimental inputs.

El treball que es presenta en aquesta tesi pretén contribuir al camp de la ciència de superfícies biològiques, amb el desenvolupament de superfícies adaptades amb cadenes lateral reactives per tal de unir covalentment biomolècul·les d'interès a la superfície.La polimerització assistida per plasma del recobriments actius és un mètode atractiu per tal d'obtenir cadenes laterals reactives, mitjançant pel·lícules nanomètriques amb densitats de grups funcionals adaptats. Sota control de les condicions experimentals, l'estructura del dipòsit polimèric es pot control i les estructures químiques obtingudes poden variar des de xarxes polimèriques altament funcionalitzades amb baixa reticulació fins a xarxes altament reticulades amb baix contingut funcional. La recerca descrita en aquesta tesi tracta de la modificació de superfície de diversos substrats per polimerització de plasma. La part essencial del treball es dirigeix cap al funcionalització amb grups èster de pentafluorofenil a la superfície, durant la polimerització per grafting i polimerització de plasma pulsat de pentafluofenil metacrilat. Aquesta classe de grup làbil és de gran interès per a la seva fàcil reactivitat amb molècules amb mines terminals, com pèptids. Altres monòmers comercials també s'han emprat al començament de l'estudi, com a primera aproximació a les tècniques de plasma. La caracterització d'aquestes superfícies s'ha fet a través de tècniques analítiques com FTIR, XPS, AFM o ToF - SIMS entre d'altres.A més, s'ha dut a terme un estudi per fer a mida el polímer de PFM per a millorar la retenció de la seva estructura, i així com un estudi profund de la seva reactivitat davant de molècules amb amines terminals diferents d'interès, afegint SPR o l'aplicació de sensors microcantiliver a les tècniques de caracterització per aconseguir una millor comprensió de la química i cinètica de la reacció.Sobre el propòsit d'aconseguir superfícies funcionalitzades útils, s'ha realitzat un patterning de les superfícies amb l'ús de màscares per a capa selectiva de les mostres per controlar les àrees modificades. Això s'ha fet per a l'aplicació d'aquesta pel·lícula a dispositius reals, així com a prova de la seva biocompatibilitat per cultiu cel·lular i per assaigs in vivo. / El trabajo que se presenta en esta tesis pretende contribuir al campo de la ciencia de superficies biológicas, con el desarrollo de superficies adaptadas con cadenas lateral reactivas con el fin de unir covalentemente biomoléculas de interés a la superficie.La polimerización asistida por plasma de recubrimientos activos es un método atractivo con el fin de obtener cadenas laterales reactivas, mediante películas nanométricas con densidades de grupos funcionales adaptados. Bajo control de las condiciones experimentales, la estructura del depósito polimérico se puede control y las estructuras químicas obtenidas pueden variar desde redes poliméricas altamente funcionalitzadas con baja reticulación hasta redes altamente reticuladas con bajo contenido funcional.La investigación descrita en esta tesis trata de la modificación de superficie de diversos sustratos por polimerización de plasma. La parte esencial del trabajo se dirige hacia el funcionalización con grupos éster de pentafluorofenilo en la superficie, durante la polimerización por grafting y polimerización de plasma pulsado de pentafluofenilmetacrilato. Esta clase de grupo lábil es de gran interés para su fácil reactividad con moléculas con minas terminales, como péptidos. Otros monómeros comerciales también se han servido al principio del estudio, como primera aproximación a las técnicas de plasma. La caracterización de estas superficies se ha hecho a través de técnicas analíticas como FTIR, XPS, AFM o ToF - SIMS entre otros. Además, se ha llevado a cabo un estudio para hacer a medida el polímero de PFM para mejorar la retención de su estructura, y así como un estudio profundo de su reactividad delante de moléculas con aminas terminales diferentes de interés, añadiendo SPR o la aplicación de sensores microcantiliver a las técnicas de caracterización para conseguir una mejor comprensión de la química y cinética de la reacción.Sobre el propósito de conseguir superficies funcionalizadas útiles, se ha realizado un patterning de las superficies con el uso de máscaras para capa selectiva de las muestras para controlar las áreas modificadas. Eso se ha hecho para la aplicación de esta película en dispositivos reales, así como a prueba de su biocompatibillidad por cultivo celular y para ensayos in vivo. / The work presented in this thesis has the main aim to contribute in the field of biological surface science, by developing tailored surfaces with reactive side chains in order to attach desired biomolecules to the surface by a covalent link. Plasma polymerization of surface active coatings is an attractive method to obtain reactive side chains, by making nanometer thick films of tailored functional group densities. By controlling the experimental conditions, the structure of the polymer deposit can be largely controlled and the chemical structures obtained can range from highly functional polymer networks of low cross link density to polymer networks of low functional group but high cross link densities. The research described in this thesis deals with the surface modification of various substrates by plasma polymerization. The major part of the work is directed towards the funtionalization with pentafluorophenyl ester groups on the surface, through the grafting polymerization and pulsed plasma polymerization of pentafluophenyl methacrylate. This kind of labile group is of high interest for its easy reactivity to amino terminated molecules, such as peptides. Other commercial monomers were also used at the beginning of the study, as a first approach to the plasma techniques. The characterization of these surfaces is done through several analytical techniques as FTIR, XPS, AFM or ToF-SIMS among others. Furthermore, a study for tailoring the PFM polymer for better structure retention and deep study of its reactivity in front of different amino terminated molecules of interest was performed, adding SPR or the implementation of microcantilever sensors to the characterization techniques to achieve a better understanding of the chemistry and kinetic of the reaction, in order to achieve the best peptide binding for reliable well characterized bioactive interface..On the aim of achieving useful functionalized surfaces, a patterning of the surfaces with the use of masks for selective coating of the samples has been performed to control the modified areas. This has been done for application of this film to real devices, as well as to test of its biocompatibility by cell culture and in vivo assays.

En aquesta Tesi, un nou biomaterial de disseny composat per seqüències peptídiques repetitives i amfifíliques, que per autoensamblatge forma xarxes de nanofibres (i hidrogels), AcN-RADARADARADARADA-CONH2, s´ha utilitzat com a anàleg de la matriu extracel·lular per al manteniment, proliferació i diferenciació cel·lular. Aquest pèptid s'ha funcionalititzat amb motius biològicament actius procedents de proteïnes de la matriu extracel·lular incloent laminina-1 i colàgen IV. El scaffold peptídic autoensamblant RAD16-I i els seus derivats biològicament actius s´han caracteritzat i provat utilitzant diferents sistemes cel·lulars com pot ser les cèl·lules d'aorta humanes (HAEC), hepatocits madurs i la línea progenitora de fetge (Lig-8). La proteòlisi d'aquest pèptid s'ha avaluat utilitzant tripsina com a enzim proteolític, i els fragments resultants s'han analitzat per MALDI-TOF i AFM. Així mateix, la segona generació de biomaterials basats en el RAD16-I s'ha provat tant amb HAEC com amb hepatocits madurs. Amb aquests sistemes hem demostrat que el desenvolupament d'una matriu biomiètica reforça, a la vegada que manté, les funcions específiques de cada teixit. En particular, els resultats obtinguts en diferenciació, proliferació i manteniment de la funció cel·lular utilitzant pèptids sintètics autoensamblants són comparables amb els resultats que s'obtenen utilitzant matrius biològiques (Colàgen I i Matrigel). Això indica que els nostres anàlegs de la matriu extracel·lular poden substituir als materials naturals, i suggereix l'ús d'aquests materials intel·ligents amb capacitat instructiva en aplicacions terapèutiques. Així mateix s'ha provat que l'ús d'aquests pèptids auto-ensamblants és eficient en la construcció d'un nínxol de cèl·lules mare. Hem sigut capaços de controlar la cinètica cel·lular (de simètrica a assimètrica) induint diferenciació funcional, a la vegada que es mantenia una petita proporció de cèl·lules no diferenciades. Aquests resultats indiquen clarament que hem sigue capaços d'obtenir un nínxol on cèl·lules primitives (Lig-8) es diferencien adquirint funcions d'hepatocits madurs. Hem desenvolupat una plataforma de biomaterials que es podrien utilitzar per la funcionalització amb innumerables biomolècules amb capacitat d'induir processos biològics com la diferenciació, proliferació i funció metabòlica. Aquests biomaterials, preveiem que tindran un gran impacte a l'àrea terapèutica i biología regenerativa. / En esta Tesis, un nuevo biomaterial de diseño compuesto por secuencias peptídicas repetitivas y amfifílicas que por autoensamblaje forma redes de nanofibras (e hidrogeles), AcN-RADARADARADARADA-CONH2 (RAD16-I), se ha utilizado como análogo de la matriz extracelular para el mantenimiento, proliferación y diferenciación celular. Este péptido se ha funcionalizado con motivos biológicamente activos procedentes de proteínas de la matriz extracelular incluyendo laminina-1 y colágeno IV. El scaffold peptídico autoensamblante RAD16-I y sus derivados biológicamente activos se han caracterizado y probado utilizando diferentes sistemas celulares como puede ser células endoteliales de aorta humanas (HAEC), hepatocitos maduros y la línea progenitora de hígado Lig-8. La proteólisis de este péptido se ha evaluado utilizando tripsina como enzima proteolítico, y los fragmentos resultantes se han analizado por MALDI-TOF y AFM. Asimismo, la segunda generación de biomateriales basados en el RAD16-I se ha probado tanto con HAEC como hepatocitos maduros. Con estos sistemas hemos demostrado que el desarrollo de una matriz biomimética refuerza a la vez que mantiene las funciones específicas de cada tejido. En particular, los resultados obtenidos en diferenciación, proliferación y mantenimiento de la función celular utilizando los péptidos sintéticos auto-ensamblantes son comparables con los resultados que se obtienen usando matrices biológicas (Colágeno I y Matrigel). Esto indica que nuestros análogos de la matriz extracelular pueden reemplazar a los materiales naturales, y sugiere el uso de estos materiales inteligentes con capacidad instructiva en aplicaciones terapéuticas. Asimismo, se ha probado que el uso de estos péptidos auto-ensamblantes es eficiente en la construcción de un nicho de células madre. Hemos sido capaces de controlar la cinética celular (de simétrica a asimétrica) induciendo diferenciación funcional, a la vez que se mantenía una pequeña proporción de células no diferenciadas. Estos resultados indican claramente que hemos sido capaces de obtener un nicho donde células primitivas (Lig-8) se diferencian adquiriendo funciones de hepatocitos maduros. Hemos desarrollado una plataforma de biomateriales que se podrían utilizar para la funcionalización con innumerables biomoléculas con capacidad de inducir procesos biológicos como la diferenciación, proliferación y función metabólica. Estos biomateriales preveemos que tendrán un gran impacto en el área terapéutica y biología regenerativa. / In this Thesis, a new designed biomaterial made out of short repetitive amphiphilic peptide sequence AcN-RADARADARADARADA-CONH2 (RAD16-I) that self-assembles forming nanofiber networks (hydrogel scaffold) has been used as synthetic extracellular matrix analog for cell maintenance, proliferation and differentiation. This peptide has been functionalized with biological active motifs from extracellular matrix proteins including laminin-1 and collagen IV. The prototypic self-assembling peptide scaffold RAD16-I and its biologically active derivatives have been characterized and tested using several cellular systems such as human aortic endothelial cells (HAEC), mature hepatocytes and a putative liver progenitor cell line, Lig-8. The proteolysis of the peptide RAD16-I has been evaluated using trypsin as a proteolytic enzyme and the resulting fragments have been analyzed by MALDI-TOF and AFM. Moreover the second generation of RAD16-I-based biomaterials have been tested using HAEC and mature hepatocytes. With these systems we have shown that the development of a biomimetic matrix enhances as well as maintain tissue-specific functions. In particular, the results obtained in cell differentiation, proliferation and maintenance of cell function using the synthetic self-assembling peptide matrices, are comparable with the results obtained using natural biological matrices counterparts (Collagen-I and Matrigel). This indicates that our extracellular matrix analogs can replace the use of naturally-derived materials and suggests the use of these smart biomaterials with instructive capacity for cells in therapeutics. Moreover, the use of the self-assembling peptide RAD16-I in the recreation of a stem-cell niche proved to be highly efficient. We were able to control stem-cell kinetics (from symmetric to assymetric) inducing functional differentiation while maintaining a small proportion of undifferentiated cells. This striking results clearly indicate that we were able to obtain a stem-cell niche where primitive cells (Lig-8) undergo differentiation acquiring mature hepatic functions. We have developed a biomaterial platform that can be used for functionalization with innumerable biomolecules, with capacity to induce biological processes like differentiation, control of proliferation, metabolic function, etc. These biomaterials will have a strong impact in therapeutics and regenerative biology.