L’enginyeria metabòlica és una estratègia molt útil per produir molècules d’alt valor afegit mitjançant microorganismes. Molècules d’interès per la seva funció biològica, d’estructura complexa i amb dificultats en la seva obtenció i síntesi s’han obtingut de forma molt satisfactòria mitjançant aquesta metodologia. En el laboratori de Bioquímica de l’IQS s‘estudia la glicosiltransferasa de Micoplasma genitalium codificada pel gen mg517 i responsable de la síntesi de glicoglicerolípids (Andrés et al., 2010). S’ha vist que aquesta proteïna sobreexpressada en E.coli és funcional i acumula diferents glicoglicerolípids en la membrana plasmàtica. Aquests glicoglicerolípids mostren diferents punts d’interès. D’una banda, són tensioactius d’alt valor afegit que permeten la construcció de niosomes per l’alliberament controlat de fàrmacs i, d’altra banda, s’han relacionat com agents terapèutics amb inhibició de tumors cancerígens. Degut al creixent interès d’aquests productes,en el present treball s‘ha escollit E. coli com a microorganisme a modificar per enginyeria metabòlica per la producció de glicoglicerolípids, ja que per una banda, no presenta aquests lípids però sí sintetitza els seus precursors UDP-glucosa i diacilglicerol (DAG). S’han dissenyat diferents soques d’E.coli on se sobreexpressen la glicosiltransferasa MG517 i, a més, la uridiltransferasa GalU procedent d’E.coli JM109, que sintetitza el precursor UDP-glucosa a partir de glucosa 1-fosfat, i l’aciltransferasa PlsC involucrada en la biosíntesi del precursor DAG. En les soques on les proteïnes GalU i PlsC s’han sobreexpressat, les seves activitats han augmentat 220 i 80 vegades, respectivament. La glicosiltransferasa MG517 és activa en totes les soques però, sorprenentment, la seva activitat després de les cinc hores d‘inducció és10 vegades inferior quan es dóna la coexpressió de MG517 i PlsC. S’observa que la sobreproducció de UDP-glucosa no incrementa la quantitat total de glicoglicerolípids mentre que el DAG sí, de manera que la soca AbC amb els gens mg517 i plsC és la que sintetitza més glicoglicerolípids, arribant a nivells de 1059 nM per biomassa. Dels tres glicoglicerolípids formats, el diglucosilacilglicerol és sempre el més abundant i el seu percentatge varia entre 57 i 82% en funció de la coexpressió dels enzims. La producció d’aquests nous lípids en la membrana d’E. coli implica que el percentatge del fosfolípid fosfatidiletanolamina disminueixi un 20%, mentre els fosfolípids anionis es mantenen constants. Es conclou que la soca modificada d’E. coli AbC és una bona plataforma per la producció de nous glicolípids amb diferent estructura. / La ingeniería metabólica es una estrategia muy útil para producir moléculas de valor añadido mediante microorganismos. Moléculas de interés por su función biológica, de estructura compleja y con dificultades en su obtención y síntesis se han obtenido de forma muy satisfactoria con el uso de esta metodología. En el laboratorio de Bioquímica del IQS se estudia la glicosiltransferasa de Micoplasma genitalium codificada por el gen mg517 y responsable de la síntesis de glicoglicerolípidos (Andrés et al. 2011). Se ha observado que esta proteína sobreexpresada en E.coli es funcional y acumula estos lípidos en la membrana plasmática. Los glicoglicerolípidos muestran diferentes puntos de interés. Por una parte, son tensioactivos que permiten la construcción de niosomas para la liberación controlada de fármacos y, por otra parte, se han seleccionado como agentes terapéuticos con inhibición de tumores cancerígenos. Debido al creciente interés de estos productos, en el presente trabajo, se ha escogido E.coli como microorganismo a modificar por ingeniería metabólica para la producción de glicoglicerolípidos, ya que no presenta estos lípidos pero sí sintetiza sus precursores UDP-glucosa y diacilglicerol (DAG). Se han diseñado diferentes cepas de E.coli donde se sobreexpressa la glicosiltransferasa MG517 y, además, la uridiltransferasa GalU de E.coli JM109, que sintetiza el precursor UDP-glucosa, y la aciltransferasa PlsC involucrada en la biosíntesis del precursor DAG. En las cepas donde las proteínas GalU y PlsC se han sobreexpressado, sus actividades han aumentado 220 y 80 veces, respectivamente. La glicosiltransferasa MG517 es activa en todas las cepas pero, sorprendentemente, su actividad después de inducir es 10 veces inferior cuando se da la coexpresión de MG517 y PlsC. Se observa que la sobreproducción de UDP-glucosa no incrementa la cantidad total de glicoglicerolípidos mientras que el DAG sí, de forma que la cepa AbC con los genes mg517 y plsC es la que sintetiza más glicoglicerolípidos, llegando a niveles de 1059 nM por biomasa. De los tres glicoglicerolípidos formados, el diglucosildiacilglicerol es siempre el más abundante y su porcentaje varía entre 57 y 82% en función de la coexpressión de las enzimas. La producción de los nuevos lípidos en la membrana de E.coli implica que el porcentaje del fosfolípido fosfatidiletanolamina disminuya un 20%, mientras los fosfolípidos aniónicos se mantienen contantes. Se concluye que la cepa modificada de E.coli AbC es una buena plataforma para la producción de nuevos glicolípidos con distinta estructura. / Metabolic engineering is a useful strategy to achieve target molecules using microorganisms. Molecules of high biological value, with complex estructure and difficulties to be obtained and synthesised, as for example, glycoconjugates, have been successfully obtained by this methodology (Ruffing i Chen, 2010). Our group studies the Mycoplasma genitalium glycosyltransferase encoded by mg517 gene and responsible of glycoglycerolipid synthesis. (Andrés et al., 2010). This protein overexpressed in E. coli is functional and accumulates the glycolipids in its plasma membrane. These glycoglycerolipids have different points of interest. On one hand, they are biosurfactants and evencan form niosomes for drug delivery systems. On the other hand, they have been related to inhibition of cancer tumors. Due to growing interest of these products, and in order to improve production of glycoglycerolipids, different metabolic engineered E. coli strains have been designed in this work. This microorganism has been chosen since on the one hand, it does not produce these lipids but its metabolism produces the glicoglicerolipids precursors, UDP-glucose and diacylglycerol (DAG). In these strains, the glycosyltransferase is coexpressed with genes related to biosynthesis of both precursors. Therefore coexpression of the glycosyltransferase MG517, the uridyl transferase GalU from E. coli JM109, which synthesizes the precursor Glc-UDP from glucose-1-phosphate, and the acyl transferase PlsC involved in the biosynthesis of the precursor DAG have been studied. Once modified strains were constructed, their phenotype have been analysed. On one hand, the three enzymatic activities have been determined in vitro from the cell extracts. When GalU and PlsC were overexpressed, their activities increased 220 and 80-fold, respectively, compared to the controls. The glycosyltransferase MG517 was active in these modified strains but, surprisingly, its activity decreases 10-fold when MG517 and PlsC were coexpressed. It is observed that overproduction of UDP-glucose does not increase total glycolipids amount while DAG have a positive impact on this production, being strain with mg517 and plsC genes which produces more glycolipids achieving 1059 nM per biomass. . Furthermore, the modified strains showed different glycoglycerolipids profiles. In all strains the disaccharide glycoglycerolipid is the most abundant but its percentage varies from 57% to 82% depending on enzyme coexpression. Production of these new lipids in E. coli membrane implies less synthesis of phosphatidylethanolamine phospholipid, which is characteristic of this microorganism. Our results show the modified E. coli strain with mg517 and plsC genes is a good platform microorganism for the production of new glicolipids with different structure.

[EN] Carbamoyl phosphate synthetase 1 (CPS1), a 1462-residue mitochondrial enzyme, catalyzes the entry of ammonia into the urea cycle, which converts ammonia, the neurotoxic waste product of protein catabolism, into barely toxic urea. The urea cycle inborn error and rare disease CPS1 deficiency (CPS1D) is inherited with mendelian autosomal recessive inheritance, being due to CPS1 gene mutations (>200 mutations reported), and causing life-threatening hyperammonemia. We have produced recombinantly human CPS1 (hCPS1) in a baculovirus/insect cell expression system, isolating the enzyme in active and highly purified form, in massive amounts. This has allowed enzyme crystallization for structural studies by X-ray diffraction (an off-shoot of the present studies). This hCPS1 production system allows site-directed mutagenesis and enzyme characterization as catalyst (activity, kinetics) and as protein (stability, aggregation state, domain composition). We have revealed previously unexplored traits of hCPS1 such as its domain composition, the ability of glycerol to replace the natural and essential CPS1 activator N-acetyl-L-glutamate (NAG), and the hCPS1 protection (chemical chaperoning) by NAG and by its pharmacological analog N-carbamyl-L-glutamate (NCG). We have exploited this system to explore the effects on the activity, kinetic parameters and stability/folding of the enzyme, and to test the disease-causing nature, of mutations identified in patients with CPS1 deficiency (CPS1D). These results, supplemented with those obtained with other non-clinical mutations, have provided novel information on the functions of three non-catalytic domains of CPS1. We have introduced three CPS1D-associated mutations and one trivial polymorphism in the glutaminase-like domain of CPS1, supporting a stabilizing and an activity-enhancing function of this non-catalytic domain. Two mutations introduced into the bicarbonate phosphorylation domain have shed light on bicarbonate binding and have directly confirmed the importance of this domain for NAG binding to the distant (in the sequence) C-terminal CPS1 domain. The introduction of 18 CPS1D-associated missense mutations mapping in a clinically highly eloquent central non-catalytic domain have proven the disease-causing nature of most of these mutations while showing that in most of the cases they trigger enzyme misfolding and/or destabilization. These results, by proving an important role of this domain in the structural integration of the multidomain CPS1 protein, have led us to call this domain the Integrating Domain. Finally, we have examined the effects of eight CPS1D-associated mutations, of one trivial polymorphism and of five non-clinical mutations, all of them mapping in the C-terminal domain of the enzyme where NAG binds, whereas we have re-analyzed prior results with another four clinical and five non-clinical mutations affecting this domain. We have largely confirmed the pathogenic nature of the clinical mutations, predominantly because of decreased activity, in many cases due to hampered NAG binding. A few mutations had substantial negative effects on CPS1 stability/folding. Our analysis reveals that NAG activation begins with a movement of the final part of the ß4-¿4 loop of the NAG site. Transmission of the activating signal to the phosphorylation domains involves helix ¿4 from this domain and is possibly transmitted by the mutually homologous loops 1313-1332 and 778-787 (figures are residue numbers) belonging, respectively, to the carbamate and bicarbonate phosphorylation domains. These two homologous loops are called from here on Signal Transmission Loops. / [ES] La carbamil fosfato sintetasa 1 (CPS1), una enzima mitocondrial, cataliza la entrada del amonio en el ciclo de la urea, que convierte esta neurotoxina derivada del catabolismo de las proteínas en urea, mucho menos tóxica. El déficit de CPS1 (CPS1D) es un error innato del ciclo de la urea, una enfermedad rara autosómica recesiva, que se debe a mutaciones en el gen CPS1 (>200 mutaciones descritas) y que cursa con hiperamonemia. Hemos producido CPS1 humana recombinante (hCPS1) en un sistema de expresión de células de insecto y baculovirus, y la hemos aislado en forma activa, muy pura y en cantidad elevada. Este sistema de producción de hCPS1 permite la realización de mutagénesis dirigida y la caracterización de la enzima como catalizador (actividad, cinética) y como proteína (estabilidad, estado de agregación y composición de dominios). Hemos revelado características de la hCPS1 antes no exploradas como es la composición de dominios, la capacidad que tiene el glicerol para reemplazar al activador natural y esencial de la CPS1, N-acetil-L-glutamato (NAG), y la protección de la hCPS1 por NAG y por su análogo farmacológico N-carbamil-L-glutamato (NCG) (chaperonas químicas). Hemos utilizado este sistema para explorar los efectos en actividad, parámetros cinéticos y estabilidad/plegamiento de la enzima, y para comprobar la naturaleza patogénica de mutaciones identificadas en pacientes con CPS1D. Estos resultados, junto con los obtenidos con otras mutaciones no clínicas, han aportado información novedosa sobre tres de los dominios no catalíticos de CPS1. Las observaciones realizadas tras introducir en el dominio de tipo glutaminasa de la enzima tres mutaciones asociadas a CPS1D y un polimorfismo trivial, apoyan la contribución de este dominio no catalítico a la estabilidad y a aumentar la actividad de la enzima. Dos mutaciones introducidas en el dominio de fosforilación de bicarbonato han arrojado luz sobre el modo de unión del bicarbonato (un sustrato). Los resultados de estas mutaciones también han confirmado la contribución de este dominio para la unión de NAG, cuyo sitio de unión se encuentra en el dominio C-terminal de CPS1, bastante alejado (en la secuencia) del dominio de fosforilación de bicarbonato. Además, hemos introducido 18 mutaciones de cambio de sentido asociadas a CPS1D, las cuales están localizadas en un dominio no catalítico, central y de elevada elocuencia clínica. Estos resultados han demostrado la naturaleza patogénica de estas mutaciones, ya que en la mayoría de los casos estas mutaciones producen un mal plegamiento o/y desestabilización de la enzima. Debido a que estos resultados han puesto de manifiesto el importante papel de este dominio en la integración estructural de la proteína multidominio CPS1, lo hemos llamado Dominio Integrador. Finalmente, hemos examinado los efectos de 8 mutaciones asociadas a CPS1D, de un polimorfismo trivial y de 5 mutaciones no clínicas, todas localizadas en el dominio C-terminal de la enzima, donde se une NAG. Además, hemos reanalizado resultados anteriores con otras 4 mutaciones clínicas y 5 no clínicas afectando a este dominio. Hemos confirmado el carácter patogénico de las mutaciones clínicas, las cuales predominantemente causan una disminución en la actividad enzimática, en muchos casos debida a que la unión de NAG se encuentra obstaculizada. Unas pocas mutaciones mostraron efectos negativos en la estabilidad/plegamiento de CPS1. Nuestros análisis revelan que la activación por el NAG empieza con un movimiento de la parte final del bucle ß4-¿4 del sitio de NAG. La transmisión de la señal activadora a los dominios de fosforilación implica a la hélice ¿4 de este dominio y posiblemente se transmite a través de los bucles homólogos 1313-1332 y 778-787 (numeración de residuos) pertenecientes, respectivamente, a los dominios de fosforilación de carbamato y bicarbonato. Por ello, hemos llamado a ambos bucles Bucles de / [CAT] La carbamil fosfat sintetasa 1 (CPS1), un enzim mitocondrial, catalitza l'entrada d'amoni en el cicle de la urea, que convertix l'amoni, producte neurotòxic del catabolisme de les proteïnes, en urea, una molècula molt poc tòxica. El dèficit de CPS1 (CPS1D) és un error innat del cicle de la urea, una malaltia rara autosòmica recessiva, que es deu a mutacions en el gen CPS1 (>200 mutacions descrites) i que cursa amb hiperamonièmia. Hem produït CPS1 humana recombinant (hCPS1) en un sistema d'expressió de cèl·lules d'insecte i baculovirus, i l'hem aïllada en forma activa, molt pura i en gran quantitat. Això ha permés la cristal·lització de l'enzim per a estudis estructurals amb difracció de raios-X (treball no inclòs en esta tesi Aquest sistema de producció de hCPS1 permet la realització de mutagènesi dirigida i la caracterització de l'enzim com a catalitzador (activitat, cinètica) i com a proteïna (estabilitat, estat d'agregació i composició de dominis). Hem revelat característiques de la hCPS1 no explorades abans com és la composició de dominis, la capacitat que té el glicerol per a reemplaçar l'activador natural i essencial de CPS1, N-acetil-L-glutamat (NAG), i la protecció de la hCPS1 per NAG i pel seu anàleg farmacològic N-carbamil-L-glutamat (NCG) (xaperones químiques) . Hem utilitzat aquest sistema per a explorar els efectes en l'activitat, els paràmetres cinètics i l'estabilitat/plegament de l'enzim, i per a comprovar la naturalesa patogènica de mutacions identificades en pacients amb CPS1D. Aquestos resultats, junt amb els obtinguts amb altres mutacions no clíniques, han aportat informació nova sobre tres dels dominis no catalítics de la CPS1. Les observacions, després d'introduir tres mutacions associades a CPS1D i un polimorfisme trivial en el domini tipus glutaminasa de CPS1, recolzen la contribució d'aquest domini no catalític a l'estabilitat i a l'optimització de l'activitat enzimàtica. Dues mutacions introduïdes en el domini de fosforilació de bicarbonat han esclarit el mode d'unió de bicarbonat. Els resultats d'aquestes mutacions també han confirmat la contribució d'aquest domini per a la unió de NAG, el lloc d'unió de la qual es troba en el domini C-terminal de CPS1, prou allunyat (en la seqüència) del domini de fosforilació de bicarbonat. A més, hem introduït 18 mutacions de canvi de sentit associades a CPS1D, les quals estan localitzades en un domini no catalític, central i d'elevada eloqüència clínica. Aquestos resultats han demostrat la naturalesa patogènica d'aquestes mutacions, ja que, en la majoria dels casos produïxen un mal plegament o/i desestabilització de l'enzim. Pel fet que aquestos resultats han posat de manifest l'important paper d'aquest domini en la integració estructural de la proteïna multidomini CPS1, l'hem anomenat Domini Integrador. Finalment, hem examinat els efectes de huit mutacions associades a CPS1D, un polimorfisme trivial i cinc mutacions no clíniques, totes elles localitzades en el domini C-terminal de l'enzim, on s'unix NAG. A més, hem reanalitzat resultats anteriors amb altres quatre mutacions clíniques i cinc no clíniques que afecten aquest domini. Hem confirmat el caràcter patogènic de les mutacions clíniques, les quals predominantment causen una disminució en l'activitat enzimàtica, en molts casos pel fet que la unió de NAG es troba obstaculitzada. Unes poques mutacions van mostrar efectes negatius substancials en l'estabilitat/plegament de CPS1. Les nostres anàlisis revelen que l'activació de NAG comença amb un moviment de la part final del bucle ß4-¿4 del lloc de NAG. La transmissió del senyal activadora als dominis de fosforilació involucra l'hèlix ¿4 d'aquest domini i es transmet, possiblement, a través dels bucles homòlegs 1313-1332 i 778-787 (numeració dels residus), pertanyents, respectivament, als dominis de fosforilació de carbamato i bicarbonat. Per això, hem anomenat a ambd / Díez Fernández, C. (2015). USING RECOMBINANT HUMAN CARBAMOYL PHOSPHATE SYNTHETASE 1 (CPS1) FOR STUDYING THIS ENZYME'S FUNCTION, REGULATION, PATHOLOGY AND STRUCTURE [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/52855 / TESIS