Synthetic Biology is a relatively new and multi-faceted interdisciplinary emergent field of research that combines biology with technology in novel and exciting ways. One of its main branches aims to see living systems engineered in a rational and straightforward bottom-up approach, like in other engineering disciplines. The inherent complex nature of living systems turns them into a difficult and challenging substrate where to apply common engineering principles such as standardization, abstraction and modularity. Efforts to overcome these limitations and adapt such principles for working upon living systems have been devoted, though yet with relative success. The aim of this Thesis is to critically explore what is Synthetic Biology and how far it is from a veritable engineering discipline. In this Thesis, we first present a review that thoroughly explores and discusses this scenario. Then, we present two works that shall contribute to this ambitious and hard goal. First, within the context of standardization, we address the need for better genetic parts characterization by providing an example of a biologically grounded framework inspired by classical enzymology theory. Second, and in relation with the principle of modularity, we provide a theoretical framework, in this case inspired by the Ohm’s law of electric theory, that describes the unintended coupling of the coexisting genetic loads within a given host cell due to sharing a limited common pool of machinery and resources. Together, both works contribute, on one hand, to increase our understanding of the organizing principles of living systems, and on the other hand, to improve how engineering principles are applied to synthetic circuit design. Finally, these works emphasize the need to find better experimentally backed-up theoretical frameworks or models that should allow us to jump from the current time-consuming, trial-error and ad hoc Synthetic Biology to a well-established engineering discipline as fruitful and efficient with the living systems realm as other engineering disciplines are. / La Biologia Sintètica és un camp de recerca emergent relativament nou i multi-facètic que combina la biologia amb la tecnologia de formes innovadores i emocionants. Una de les seves principals branques té com a objectiu aconseguir ingenieritzar els sistemes vius des d’abaix de manera racional i senzilla, tal com passa en altres tipus d’enginyeria. La naturalesa inherentment complexa dels éssers vius els converteix en un substrat difícil sobre el qual aplicar principis d’enginyeria com l’abstracció, l’estandardització i la modularitat. S’han dedicat esforços per superar aquestes limitacions i adaptar aquests principis perquè funcionin sobre sistemes vius, tot i que encara que amb un èxit relatiu. L’objectiu d’aquesta tesi és explorar críticament què és la Biologia Sintètica i quan lluny està de ser una veritable enginyeria. En aquesta tesi, primer presentem un article de revisió que explora i discuteix a fons aquest escenari. Després presentem dos treballs que han de contribuir a aquest ambiciós i difícil objectiu. En primer lloc, en el context de l’estandardització, adrecem la necessitat d’una millor caracterització de les parts genètiques oferint un exemple de marc teòric amb fonaments biològics que esta inspirat en teoria enzimològica clàssica. En segon lloc, i relacionat amb el principi de modularitat, oferim un marc teòric, aquest cop inspirat en la llei de Ohm de la teoria elèctrica, que descriu l’aparellament no intencionat de les carregues genètiques coexistents dins d’una cèl.lula hoste qualssevol degut al fet de compartir un conjunt comú limitat de recursos i maquinària cel•lular. Ambdós treballs contribueixen, per un cantó, a incrementar el nostre coneixement sobre els principis d’organització dels éssers vius, i per l’altre, a millorar com s’apliquen els principis d’enginyeria pel disseny de circuits sintètics. Finalment, aquests treballs emfatitzen la necessitat de trobar millors marcs teòrics o models recolzats experimentalment que haurien de permetre’ns fer un salt des de l’actual Biologia Sintètica ad hoc, farregosa i basada en assaig-error, a un tipus d’enginyeria ben establerta que pugui ser tan profitosa i eficient en el reialme dels éssers vius com ho són les altres enginyeries.

Les cèl.lules T reguladores naturals (nTregs) són limfòcits que es generen durant la selecció tímica i que formen part dels mecanismes que té el sistema immunitari per mantenir la seva homeostasi i controlar respostes autoreactives que poden conduir a l’autoimmunitat. Les nTregs són emigrants tímics que expressen de forma estable FOXP3, gràcies a canvis epigenètics que ocorren durant la seva maduració i que li permeten mantenir les funcions supressores. Les nTregs expressen també la cadena α del receptor de la IL-2, CD25 i això els hi confereix un fenotip activat. A més de CD25, les nTregs expressen altres marcadors com són: CTLA-4, GITR, CD127lo, CCR6, entre altres, i que són molècules que també s’indueixen en cèl.lules T activades durant la resposta. Tot i ser un marcador exclusiu al timus, l’expressió intracel·lular de FOXP3 el fa incompatible amb el seu ús per la purificació de les nTregs. Més endavant es va descriure que les cèl.lules T humanes activades també poden convertir-se en FOXP3+ i adquirir un fenotip supresor, tot i que la seva expressió és transitòria. Aquest fet, juntament amb l’absència de marcadors exclussius, fa que l’ús d’aquestes cèl.lules en immunoteràpia representi encara un repte. Per això, a partir de diverses aproximacions hem estudiat el fenotip de les cèl.lules T reguladores al timus i a la perifèria. De l´estudi exhaustiu d´una àmplia col.lecció de timus pediàtrics (n=35) d´edats compreses entre els 2 dies i els 8 anys, hem confirmat que la freqüència de les poblacions tímiques varia amb l´edat, tal i com s´havia descrit prèviament. A més, i per primera vegada, s´ha observat que la freqüència de les nTregs disminueix amb l´edat. El fenotip d´aquesta població és estable amb el temps, a excepció de CD95, membre de la familia del TNF involucrat en apoptosi i activació cel.lulars. La freqüència de cèl.lules CD95+ dins de la població de nTregs incrementa amb l´edat, i suggeriria un augment en susceptibilitat a l´apoptosi mediada per CD95 que explicaria la davallada d´aquesta població amb l´edat. Un cop les nTregs s´exporten des de timus a la perifèria, es barregen amb cèl.lules T activades i cèl.lules T de memòria amb les que comparteixen diversos marcadors. En el nostre laboratori vam abordar la cerca de molècules característiques de nTreg fent servir una aproximació proteòmica seguida d´una anàlisi d´expressió gènica. De la comparació de cèl.lules nTreg de timus i nTreg de perifèria vam definir la galectina3 com a marcador d´aquesta població que s´adquireix a perifèria. En cèl.lules Treg activades, funcionalment supressores, la seva expressió es troba a nivells similars de dos dels marcadors característics d´aquestes cèl.lules, FOXP3 i CTLA4. Finalment, es va abordar l´estudi d´aquesta població en pacients amb diabetes tipus 1. Es va fer un estudi exhaustiu de caracterització fenotípica en mostres de sang de pacients en comparació amb controls, que va revel.lar una disminució de GITR en les Tregs. Aquest defecte no afectava a la seva capacitat de supressió, en canvi podria estar associat a una major susceptibilitat a l´apoptosi. / Natural regulatory T cells (nTreg) are lymphocytes generated during thymic selection and are part of the mechanisms that the immune system uses to keep homeostasis and control autoreactive responses that can lead to autoimmunity. nTreg are thymic emigrants that stably express FOXP3 thanks to epigenetical changes that take place during its maturation, which allow them to maintain their supressor functions. Besides, nTregs express the alpha chain of the IL-2 receptor, CD25, which confers them an activated phenotype. Other Treg markers are CTLA-4, GITR, CD127low and CCR6, but they are also induced in activated T cells during the immune response. Despite being an exclusive marker in the thymus, the intracelular expression of FOXP3 makes it non compatible with its use for Treg purification. Later it was described that activated human T cells can also express FOXP3 and even acquire a suppresive phenotype, although transitory. This fact, together with the absence of exclussive markers, makes difficult the use of these cells in immunotherapy. Thus, using several approaches, we have studied the phenotype of these cells in the thymus and in the periphery. After studing a numerous cohort of paediatric thymus (n=35) from donors aged from 2 days until 8 years old, we confirmed that the frequency of thymic populations changes with age, as previously described. Also, and for the first time, we observed that nTreg frequency diminishes with age. The phenotype of this population is stable during time, except for CD95, a member of the TNF family involved in apoptosis and cellular activation. The frequency of CD95+ cells in nTreg population increases with age, which suggests a higher susceptibility to CD95-mediated apoptosis, and that could explain the decrease of nTreg with time. Once nTregs are exported from the thymus to the periphery, they are mixed with activated T cells and memory T cells with which they share several markers. In our laboratory we searched for characteristical Treg molecules using a proteomic approach followed by a genetic expression analysis. From the comparison of thymic nTreg and peripheral Treg we defined galectin 3 as a marker acquired in periphery by nTregs. In activated Treg, functionally supressive, galectin 3 expression is found at similar levels as those of FOXP3 and CTLA-4, very characterical Treg markers. Finally, we studied this population in type 1 diabetes patients. We carried out an extensive phenotypical study in PBMCs from patients compared to donors that revealed a diminished proportion of GITR+ cells among nTregs. This defect did not affect to their suppressive ability, instead could be associated to an increased susceptibility to apoptosis.

El cáncer de mama es el más frecuente en las mujeres de todo el mundo. Además de los factores genéticos, epigenéticos y hormonales, existen evidencias epidemiológicas y experimentales de que los factores nutricionales y ambientales tienen un papel en la etiología y el desarrollo de esta enfermedad. Los lípidos de la dieta se han relacionado directamente con el cáncer, fundamentalmente, el de mama. El grupo de investigación ha contribuido al mejor conocimiento de los efectos y de los mecanismos de acción de las dietas hiperlipídicas de aceite de maíz, rico en ácidos grasos poliinsaturados, PUFA n-6, y el aceite de oliva virgen extra, rico en ácidos grasos monoinsaturados, MUFA n-9, y diversos compuestos bioactivos, en el cáncer de mama experimental, obteniendo un efecto estimulador y potencialmente protector, respectivamente. Estas dietas actuaron fundamentalmente sobre la etapa de la promoción de la carcinogénesis. El objetivo de este trabajo ha sido investigar si estos lípidos podían intervenir, además, sobre la iniciación mediante la modulación de la metabolización y/o detoxificación de los agentes iniciadores carcinogénicos, tanto a nivel hepático como de la propia glándula mamaria. Los resultados proceden de dos series experimentales diferentes, desarrolladas en el modelo experimental de cáncer de mama inducido en la rata con el hidrocarburo aromático policíclico 7,12-dimetilbenz(a)antraceno (DMBA). En ambas se estudiaron las enzimas metabolizadoras de xenobióticos (XMEs) de la fase I: CYP1A1, CYP1A2 y CYP1B1, y de la fase II: GSTP1 y NQO1. En la primera serie se evaluó el efecto de los lípidos de la dieta sobre la expresión en hígado y glándula mamaria de las XMEs en edades clave del desarrollo (prepuberal, puberal y postpuberal/adulta). En la segunda, se estudiaron específicamente las horas inmediatamente posteriores a la administración del carcinógeno y se analizó el efecto de los lípidos de la dieta sobre el metabolismo hepático, la generación de compuestos reactivos y el daño genómico provocado en la glándula mamaria. Los resultados han mostrado que los lípidos de la dieta son capaces de modular la expresión de las XMEs en distintas etapas del desarrollo postnatal. Además, la dieta rica en PUFA n-6 incrementó la expresión de las enzimas de fase I, en edades previas a la administración del DMBA, y aumentó la actividad de los CYP1s en las horas inmediatamente posteriores (12 y 24 horas post inducción), al mismo tiempo que disminuyó la actividad enzimática de la fase II, principalmente de NQO1. El número de metabolitos reactivos generados en hígado y el daño genómico en la glándula en los animales alimentados con la dieta rica en aceite de maíz fue mayor que en los otros dos grupos. Por otro lado, la dieta rica en aceite de oliva virgen extra y la dieta control normolipídica presentaron una actividad de fase I y II mejor coordinada, presentando una menor producción de metabolitos reactivos y menor daño en el ADN en la glándula mamaria. La concordancia de estos resultados con los parámetros de la carcinogénesis en ambas series demostró el efecto de los lípidos sobre la iniciación de la carcinogénesis mamaria experimental, además de la ya descrita modulación durante las fases de promoción/progresión. Los resultados de este trabajo, junto con otros previos sobre los efectos de los lípidos durante la maduración sexual y la diferenciación de la glándula mamaria, sugieren que estos nutrientes, en función de la cantidad y del tipo, pueden modificar diferencialmente la susceptibilidad o resistencia de la glándula mamaria al desarrollo del cáncer y, por tanto, modular las ventanas de susceptibilidad frente a la exposición a carcinógenos ambientales. / Breast cancer is the most common malignancy among women all over the World. Besides the genetic, epigenetic and hormonal factors, there are epidemiologic and experimental evidences that nutritional and environmental factors have a role in the etiology and the development of this cancer. The dietary lipids are directly related with cancer, mainly breast cancer. The research group has contributed to the best understanding of the effects and the mechanisms of action of the high corn oil, rich in polyunsaturated fatty acid (PUFA) n-6, and the high extra virgin olive oil diets, rich in monounsaturated fatty acids (MUFA) n-9 and several bioactive compounds, in the experimental breast cancer, resulting in a stimulating and a potentially protective effect, respectively. These diets mostly acted on the carcinogenesis promotion stage. The aim of this work has been to research on the intervention of these lipids, furthermore, over the initiation through the modulation of the bioactivation and/or detoxification of the carcinogenic initiator agents, both in hepatic level and the mammary gland itself. Results proceed from two different experimental series, developed in the experimental breast cancer model induced in the rat with the polycyclic aromatic hydrocarbon 7,12-dimethylbenz(a)anthracene (DMBA). In both series the xenobiotic metabolizing enzymes (XMEs) were studied, CYP1A1, CYP1A2 and CYP1B1 from the phase I, and GSTP1 and NQO1 from the phase II. The first series analyzed the effect of the dietary lipids on the XMEs expression in the liver and the mammary gland in critical development ages (prepubertal, pubertal and postpubertal/adult). The second series studied specifically the hours immediately after the carcinogen administration and analyzed the effect of the dietary lipids on its hepatic metabolism, the generation of reactive compounds and the genomic damage in the mammary gland. Results showed that dietary lipids may modulate the XMEs expression in different stages of the postnatal development. Additionally, the diet rich in PUFA n-6 increased the expression of phase I enzymes, in ages previous to DMBA administration, and raised CYP1s activity in the hours immediately after induction (12 and 24 hours), while reducing the enzyme activity of phase II, mainly NQO1. The number of reactive metabolites generated in the liver and the genomic damage in the mammary gland of the animals fed the high corn oil diet was higher than in the other groups. On the other hand, the high extra virgin olive oil diet and the normolipidic control diet exhibit a better coordinated phase I and phase II activity, showing a lower production of reactive metabolites and smaller DNA damage in the mammary gland. Concordance between these results and the carcinogenesis parameters in both series showed the effect of lipids on the initiation of the experimental mammary carcinogenesis, besides the already described modulation during promotion/progression stages. Results of this work, along with previous others on the effects of lipids during sexual maturity and mammary gland differentiation suggest that these nutrients, depending on the amount and type, can differently modify the mammary gland susceptibility or resistance to cancer development, and therefore, modulate the windows of susceptibility over the exposure to environmental carcinogens.

Campylobacter i Salmonella són els bacteris enteropatogens transmesos pels aliments més importants a nivell mundial. Les infeccions causades per aquests bacteris representen un greu problema econòmic i de salut pública. Ambdós bacteris tenen la capacitat d’infectar diferents espècies d’animals domèstics i silvestres. El contacte proper entre aquests animals i l’home és un factor de risc d’infeccions humanes. Tot i així, hi ha poques dades sobre la incidència, susceptibilitat antimicrobiana i diversitat genètica de Campylobacter i Salmonella en aus silvestres i aus de corral criades a l’aire lliure al sud d’Europa. Per aquest motiu es va realitzar un ampli mostreig amb la finalitat d’avaluar quina és la contribució de les aus domèstiques (aus de corral criades a l’aire lliure) i silvestres (ànecs i gavines) en l’epidemiologia i resistència antimicrobiana de Salmonella spp. i Campylobacter spp. a l’àrea del Mediterrani occidental i Atlàntic oriental. En aquests estudis vam trobar que les aus de cria a l’aire lliure i algunes espècies d’ànecs i gavines (en especial la gavina corsa) són un reservori important de Campylobacter. L’espècie de Campylobacter aïllada amb més freqüència en aus domèstiques i gavines va ser C. jejuni, en canvi en els ànecs ho va ser C. coli. D’altra banda, ni les aus de cria a l’aire lliure ni els ànecs són reservoris importants de Salmonella spp., mentre que les gavines (gavina corsa i gavià argentat) són reservoris importants d’aquest patogen. Es van aïllar una gran diversitat de serotips de Salmonella procedents de gavines, alguns d’ells de gran importància per a la salut pública. A la majoria de les colònies de gavines estudiades s’hi van aïllar S. Enteriditis i S. Typhimurium, els dos serotips més importants que causen malalties transmeses per aliments a l’home. És destacable la diferència entre les diferents espècies d’aus portadores de Campylobacter o Salmonella. Les espècies amb hàbits copròfags i/o carronyers van presentar una gran prevalença d’aquests bacteris. Les aus silvestres no entren en contacte amb antimicrobians de manera natural. No és sorprenent, doncs, que tots els aïllats de Campylobacter procedents d’ànecs fossin susceptibles a tots els antimicrobians estudiats. En canvi, les soques de Salmonella i Campylobacter aïllades de gavines i aus de cria a l’aire lliure van presentar resistència a diversos antimicrobians. Les resistències principals van ser a fluoro(quinones) i a tetraciclines, cosa que representa un problema de salut pública important ja que són els agents més utilitzats per a tractar infeccions entèriques humanes. Es va avaluar la diversitat genètica de Campylobacter i Salmonella mitjançant ERIC-PCR i PFGE. La gran diversitat de soques de Campylobacter i Salmonella trobades en aus silvestres suggereix l’existència de més d’una font d’infecció. Per altra banda, en diverses ocasions es va detectar la mateixa soca de Salmonella en diferents colònies i espècies de gavines. Aquest resultat suggereix un origen comú de la infecció o una dispersió de soques de Salmonella mitjançant moviments migratoris o de dispersió de les gavines. La detecció del mateix patró PFGE de Salmonella Kottbus tant en aus domèstiques com en gavines suggereix l’existència d’una circulació d’aquests bacteris entre aus de granja i aus silvestres. Tot i així, calen més estudis per a confirmar-ho. Les dades proporcionades en aquesta tesi confirmen la importància de les aus domèstiques i silvestres com a portadores i disseminadores de Campylobacter i Salmonella així com de resistències antimicrobianes a l’ambient, al sud d’Europa. Cal millorar els esforços de vigilància i desenvolupar estratègies de control adequades per a reduir l’exposició de l’ésser humà a Campylobacter i Salmonella. / Campylobacter y Salmonella son las bacterias enteropatógenas transmitidas por los alimentos más importantes a nivel mundial. Las infecciones causadas por dichas bacterias representan un grave problema económico y de salud pública. Ambas bacterias tienen la capacidad de infectar distintas especies de animales domésticos y silvestres. El estrecho contacto entre éstos y el hombre constituye un riesgo de infecciones humanas. Sin embargo, hay pocos datos sobre la incidencia, susceptibilidad antimicrobiana y diversidad genética de Campylobacter y Salmonella en aves silvestres y aves de corral criadas al aire libre en el sur de Europa. Por ello, se realizó un amplio muestreo con el fin de evaluar cuál es la contribución de las aves domésticas (aves de corral criadas al aire libre) y silvestres (ánades y gaviotas) en la epidemiología y resistencia antimicrobiana de Salmonella spp. y Campylobacter spp. en el área del Mediterráneo occidental y Atlántico oriental. En estos estudios encontramos que las aves de cría al aire libre y algunas especies de ánades y gaviotas (en especial las gaviotas de Audouin) son un reservorio importante de Campylobacter. La especie de Campylobacter aislada con más frecuencia en aves domésticas y gaviotas fue C. jejuni, mientras que en las ánades fue C. coli. Por el contrario, ni las aves de cría al aire libre ni las ánades constituyen un reservorio importante de Salmonella spp, mientras que las gaviotas (gaviota de Audouin y gaviota patiamarilla) son reservorios importantes de este patógeno. Se aislaron una gran diversidad de serotipos de Salmonella procedentes de gaviotas, algunos de ellos de gran importancia para la salud pública. En la mayoría de las colonias de gaviotas estudiadas se aislaron S. Enteriditis y S. Typhimurium, los dos serotipos más importantes que causan enfermedades transmitidas por los alimentos en humanos. Es destable la diferencia entre las distintas especies de aves portadoras de Campylobacter o Salmonella. Las especies con hábitos coprófagos y/o carroñeros presentaron una alta prevalencia de estas bacterias. Las aves silvestres no entran en contacto con antimicrobianos de manera natural. No es pues sorprendente que todos los aislados de Campylobacter procedentes de ànades fuesen susceptibles a todos los antimicrobianos estudiados. Sin embargo, las cepas de Salmonella y Campylobacter aisladas de gaviotas y aves de cría al aire libre presentaron resistencia a varios antimicrobianos. Las principales resistencias fueron a fluoro(quinolonas) y a tetraciclinas, lo que representa un problema de salud pública importante puesto que éstos son los agentes más usados para tratar infecciones entéricas humanas. Se evaluó la diversidad genética de Campylobacter y Salmonella mediante ERIC-PCR y PFGE. La gran diversidad de cepas de Campylobacter y Salmonella encontradas en aves silvestres sugiere la existencia de más de una fuente de infección. Por otro lado, en diversas ocasiones se detectó la misma cepa de Salmonella en diferentes colonias y especies de gaviotas. Este resultado sugiere un origen común de la infección o una dispersión de cepas de Salmonella mediante movimientos migratorios o de dispersión de las gaviotas. La detección del mismo patrón PFGE de Salmonella Kottbus tanto en aves domésticas como en gaviotas sugiere que existe una circulación de estas bacterias entre aves de granja y aves silvestres. Sin embargo, se necesitan más estudios para confirmarlo. Los datos proporcionados en esta tesis confirman la importancia de las aves domésticas y silvestres como portadoras y diseminadoras de Campylobacter y Salmonella así como de resistencias antimicrobianas al ambiente, en el sur de Europa. Es necesario mejorar los esfuerzos de vigilancia y desarrollar estrategias de control adecuadas para reducir la exposición del ser humano a Campylobacter y Salmonella. / Campylobacter and Salmonella are the most important foodborne enteropathogenic bacteria worldwide. Infections caused by these bacteria are of significant economic and public health concern. Both bacteria have the ability to infect a variety of domestic and wild animal species. The close contact between humans, domestic and wild animals is an important factor contributing to human infections with these bacteria. However, limited data exists on the occurrence, antimicrobial susceptibility and genetic diversity of Campylobacter and Salmonella in wild birds and poultry reared outdoors in southern Europe. Therefore, a wide sampling was performed in order to assess the contribution of domestic (poultry reared outdoors) and wild birds (waterfowl and seagulls) in the epidemiology and antimicrobial resistance of Salmonella spp. and Campylobacter spp. in the western Mediterranean and eastern Atlantic Ocean. In these studies, we found that poultry reared outdoors, as well as certain waterfowl species and seagulls (particularly Audouin’s gulls) are an important reservoir for Campylobacter. The most common Campylobacter species isolated from poultry reared outdoors and seagulls was C. jejuni, while from waterfowl was C. coli. On the contrary, poultry reared outdoors and waterfowl seems not to be an important reservoir of Salmonella spp, while seagulls (yellow-legged gulls and Audouin’s gulls) are important carriers of this pathogen. A great diversity of Salmonella serotypes was isolated from seagulls, some of them of important public health concern. The two most important serotypes causing human food-borne disease, S. Enteriditis and S. Typhimurium, were isolated in most of the studied seagull colonies. It is noteworthy the differences of Campylobacter or Salmonella carriage among different birds species. Those with coprophagic and/or scavenging habits showed a high occurrence of these bacteria. Wild birds do not naturally come into contact with antimicrobials. Thus, it was not surprising the susceptibility to all of the antimicrobials tested of all Campylobacter isolates from waterfowl. However, Salmonella and Campylobacter strains isolated from seagulls and poultry reared outdoors showed resistance to several antimicrobial agents. The main resistances found were to fluoro(quinolones) and tetracycline, which is of public health concern, since these agents are the ones of choice to treat enteric infections in humans. Genetic diversity of Campylobacter and Salmonella was assessed by ERIC-PCR and PFGE. The high diversity of Campylobacter and Salmonella strains found in wild birds suggests bird infections by multiple sources. On the other hand, several common Salmonella strains were detected in different seagull colonies and different seagull species (yellow-legged gull and Audouin’s gull). This finding suggests a common origin of infection or the contribution of seagulls to the spread of Salmonella strains by dispersal or migrating movements. The detection of the same PFGE pattern of Salmonella Kottbus in poultry reared outdoors and seagulls suggests a circulation of the bacteria between farm and wild birds. However, more studies are needed in order to confirm this. The data provided in this thesis highlights the importance of domestic and wild birds as carriers and dispersal agents of Campylobacter and Salmonella and antibiotic resistance traits to the environment, in southern Europe. An improvement of surveillance efforts and development of appropriate control strategies are needed in order to reduce Campylobacter and Salmonella exposure to humans.

Small pelagic fish are species that live in the water column and have little relationship with the sea bottom. During the day they may form schools with feeding, defence or energetic efficiency purposes and disperse during the night. The importance of small pelagic fishes within the marine ecosystem rely in the proportion of biomass they represent and the clue function they develop as intermediate links in the energy transfer between lower and upper levels of the trophic chain. Their populations are particularly sensitive to environmental fluctuations (Cole and McGlade, 1998; Lloret et al., 2004) and frequently highly exploited by commercial fisheries. These may occasionally collapse the stocks affecting both the marine ecosystem and the fisheries they sustain. In the Mediterranean, almost 50% of the total annual landings are attributable to small pelagic fishes (Lleonart and Maynou, 2003). In the Western Mediterranean Sea, sardine (Sardina pilchardus) and anchovy (Engraulis encrasicolus) are the two most important species in terms of landed biomass and commercial interest (Lleonart and Maynou, 2003). Despite their importance little is known about the spatial distribution of these stocks or about the relationship between the spatial distribution and environmental variables. Since the ‘90s acoustic surveys are annually performed in the Spanish Mediterranean continental shelf in late autumn (Abad et al., 1998 a,b) coinciding with anchovy’s recruitment and the beginning of the spawning season for sardine (Abad and Giráldez, 1993; Giráldez and Abad, 1995). Although the main goal of these surveys is to estimate abundance and biomass of sardine and anchovy, data about the whole pelagic community has also been gathered. Furthermore, in the last decade it was detected an increasing appearance of other small and medium-sized pelagic species and the application of a multi-species approach to Mediterranean fisheries assessment was advised (Lleonart and Maynou, 2003). The present work is structured in two sections. The first section of the work will analyse the spatial distribution (1D and 2D) of sardine and anchovy by means of geostatistical techniques, both transitive and intrinsic methods (Matheron, 1969). Special attention will be paid to the estimation of the uncertainty associated to abundance estimations and, concretely, the uncertainty caused by sampling scheme which is thought to be one of the main contributors to random error (ICES, 1998). The second section will explore the environmental factors that drive the presence or absence of anchovy and sardine in late autumn. Satellite environmental data as sea surface temperature, salinity, chlorophyll-a, photosintethic active radiation, sea level anomalies or bottom depth will be related to the presence-absence of sardine and anchovy stocks through Generalised Additive Models (GAM) to try to depict the relationships that may be found between both (Bellido et al., 2008; Giannoulaki et al., 2008). The spawning area of sardine will also be studied in order to model the presence-absence of sardine eggs and try to understand the evolution of their stocks. / Los pequeños peces pelágicos son especies que viven en la columna de agua y que tienen poca relación con el fondo marino. Durante el día forman bancos de peces con el objetivo de alimentarse, defenderse de potenciales depredadores o por motivos de eficiencia energética, dispersándose durante la noche. La importancia de los pequeños pelágicos en el ecosistema marino radica en la proporción de biomasa que representan y en la función clave que desempeñan como eslabones intermedios, transfiriendo energía entre los niveles tróficos inferiores y superiores de la cadena trófica. Sus poblaciones son particularmente sensibles a las fluctuaciones ambientales (Cole and McGlade, 1998; Lloret et al., 2004) y frecuentemente se encuentran en un régimen de explotación elevado por parte de las pesquerías comerciales. Esto puede comportar de manera ocasional el colapso de sus poblaciones explotables, afectando al ecosistema marino y a las pesquerías que las mantinen. Casi el 50% del total de la biomssa anual desembarcada en los puertos del Mediterráneo provienen de los pequeños peces pelágicos (Lleonart and Maynou, 2003). En el Mediterráneo Occidental, la sardina (Sardina pilchardus) y el boquerón (Engraulis encrasicolus) son las dos especies más importantes, tanto en términos de biomasa como capturada como por su interés comercial (Lleonart and Maynou, 2003). A pesar de su importancia, la distribución espacial de las poblaciones explotables es poco conocida así como también lo es la relación de la distribución espacial con los parámetros ambientales. Desde principios de los años 90, se llevan a cabo campañas acústica en la plataforma continental española del Mediterráneo a finales de otoño (Abad et al., 1998 a,b), coincidiendo con el reclutamiento de la anchoa y la época de puesta de la sardina (Abad and Giráldez, 1993; Giráldez and Abad, 1995). A pesar de que el principal objetivo de estas campañas es la estimación de la abundancia y de la biomas de la sardina y el boquerón, datos de la comunidad pelágica en conjunto también se recogen periódicamente. Además, a lo largo de la última década se ha detectado una aparición incremental de otras especies de pequeños y medianos pelágicos y por tanto, se aconsejó la aplicación de un enfoque multiespecífo en la evaluación de pesquerías del Mediterráneo (Lleonart and Maynou, 2003). El presente trabajo se estructura en dos seciones. La primera sección del trabajo analizará la distribución espacial (1D y 2D) de la sardina y el boquerón por medio de técnicas geoestadísticas, tanto transitivas como intrínsecas (Matheron, 1969). Se prestará especial atención a la incertidumbre asociasda a las estimaciones de abundancia y, concretamente, a la incertidumbre asociada al diseño de muestro que se considera uno de los factores que contribuyen con mayor intensidad al error aleatorio (ICES, 1998). La segunda sección explorará los factores ambientales que condicioinan la presencia o ausencia de sardina y boquerón a finales de otoño. Datos ambientales obtenidos de satélite, como la temperatura superficial del mar, la salinidad, clorofila, radiación fotosintéticamente activa, anomalía del nivel del mar y la profundidad del fondo marino se relacionarán con la presencia-ausencia de las poblaciones explotables de sardina y boquerón mediante modelos aditivos generalizados (GAM, del acrónimo inglés) para determinar las relaciones existentes (Bellido et al., 2008; Giannoulaki et al., 2008). El hábitat de la puesta de sardina será igualmente estudiada para modelar la presencia-ausencia de huevos de sardina e intentar entender la evolución de las especies explotables. / Els petits peixos pelàgics són espècies de peixos que viuen a la columna d’aigua i que tenen poca relació amb el fons marí. Durant el dia formen bancs de peixos amb l’objectiu alimentar-se, defensar-se en front potencial depredadors o per eficiència energètica, dispersant-se durant la nit. La importància dels petits pelàgics a l’ecosistema marí radica en la proporció de biomassa que representen i en la funció clau que exerceixen com esglaons intermedis, transferint energia entre les nivells inferiors i superiors de la cadena tròfica. Les seves poblacions són particularment sensibles a les fluctuacions ambientals (Cole and McGlade, 1998; Lloret et al., 2004) i freqüentment es troben baix un règim d’explotació elevat per part de les pesqueres comercials. Això pot comportar de manera ocasional el col·lapse de les seves poblacions explotables, afectant a l’ecosistema marí i a les pesqueries que sostenen. Gairebé el 50% del total de la biomassa anual desembarcada als ports del Mediterrani prové dels petits peixos pelàgics (Lleonart and Maynou, 2003). Al Mediterrani Occidental, la sardina (Sardina pilchardus) i l’aladroc (Engraulis encrasicolus) són les dues espècies més importants, tant en termes de biomassa capturada com pel seu interès comercial (Lleonart and Maynou, 2003). Malgrat la seva importància, la distribució espaial de les poblacions explotables és poca coneguda així com també ho és la relació d’aquesta distribució espaial amb variables ambientals. D’ençà de principis dels anys 90, es duen a terme campanyes acústiques a la plataforma continental del Mediterrani espanyol a finals de la tardor (Abad et al., 1998 a,b), coincidint amb el reclutament de l’aladroc i amb l’època de posta de la sardina (Abad and Giráldez, 1993; Giráldez and Abad, 1995). Tot i que el principal objectiu d’aquestes campanyes és l’estimació de l’abundància i de la biomassa de la sardina i l’aladroc, dades del conjunt de la comunitat pelágica també es recolleixen. A més a més, al llarg de la darrera dècada s’ha detectat una aparició incremental d’altres espècies de petits i mitjans pelàgics i per tant, es va aconsellar l’aplicació d’un enfoc multiespecífic a l’avaluació de les pesqueres del Mediterrani (Lleonart and Maynou, 2003). El present treball s’estructura en dues seccions principals. La primera secció del treball analitzarà la distribució espaial (1D i 2D) de la sardina i l’aladroc per mitjà de tècniques geoestadístiques, tant transitives com intrínseques (Matheron, 1969). Es prestarà especial atenció a la incerteza associada a les estimacions d’abundància i, concretament, a la incertesa originada pel disseny de mostreig que és considerat un dels factors que contribueixen amb més intensitat a l’error aleatori (ICES, 1998). La segona secció explorarà els factors ambientals que condicionen la presència o absència de sardina i aladroc a finals de tardor. Dades ambientals obtingudes de satèl·lit, com la temperatura superficial de la mar, la salinitat, clorofil·la, radiació fotosintèticament activa, anomalies del nivell de la mar i la profunditat del fons marí es relacionaran amb la presència-absència de les poblacions explotables de sardina i aladroc mitjançant models additius generalitzats (GAM, de l’acrònim anglès) per determinar les relacions existents (Bellido et al., 2008; Giannoulaki et al., 2008). L’hàbitat de la posta de la sardina serà igualment estudiada per tal de modelar la presència-absència d’ous de sardina i intentar entendre l’evolució de les seves poblacions explotables.

La dosimetria biològica permet estimar la dosi d’una exposició a radiacions ionitzants mitjançant l’anàlisi d’un biomarcador, i és un element imprescindible en el camp de la radioprotecció. Entre els diferents biomarcadors que es poden utilitzar, els cromosomes dicèntrics presents en metafases de limfòcits de sang perifèrica, es consideren els més útils ja que la seva freqüència s’ajusta acuradament a les variacions de dosi. Això és cert per dosis fins 4-5 Gy, a dosis superiors el nombre de cèl·lules que arriben a metafase és molt petit dificultant-se molt l’anàlisi. Per superar aquesta limitació, la inhibició del checkpoint G2/M amb l’addició de cafeïna i la optimització de la durada del cultiu, ha permès mitigar el retard mitòtic, obtenint suficients metafases per a realitzar l’estudi citogenètic. Amb aquesta nova metodologia s’ha pogut establir una corba dosi-efecte amb dosis de fins a 25 Gy, basada en un model Gompertz (no utilitzat fins al moment en dosimetria biològica). La fiabilitat d’aquest model ha estat testat tan en simulacions d’irradiació total com parcial. Per altra banda, en molts accidents radiològics on la irradiació no és homogènia, fins el moment el seu estudi es basava en considerar que una part del cos havia estat irradiada homogèniament mentre que l’altre part no havia estat irradiada. Aquesta consideració resulta poc realista ja que a la majoria d’accidents, els individus exposats reben un gradient de dosis. Amb l’objectiu d’estudiar les exposicions heterogènies s’han fet simulacions barrejant sang irradiada d’un home i una dona a dues dosis diferents, amb aquesta metodologia s’ha pogut distingir l’origen de cadascuna de les cèl·lules analitzades. Mitjançant l’aplicació d’un model de mixtura de Poissons s’ha pogut determinar la freqüència de dicèntrics de cadascuna de les dues fraccions irradiades i estimar la dosi de radiació rebuda i la fracció inicial de cèl·lules irradiades a cada dosi. La possibilitat de poder estimar dosis altes de radiació, així com poder diferenciar millor les irradiacions no homogènies és una aportació molt important en el camp de la radioprotecció. / Biological dosimetry allow us to estimate the dose to an exposure to ionizing radiation thought the analysis of a biomarker, and is an essential element in radiation protection. Among various biomarkers that can be used, dicentric chromosomes in metaphase from peripheral blood lymphocytes are considered the most useful, because their frequency is correlated in variations of the dose. This is true for doses up to 4-5 Gy, in higher doses the numbers of cells that achieve metaphase are very few and for this reason analysis becomes increasingly difficult. To overcome this limitation, the inhibition of the G2/M checkpoint by the addition of caffeine and the optimization of the culture duration, allows the mitigation of the mitotic delay, getting enough metaphases to perform the cytogenetic analysis. Through this methodology, a dose effect curve has been established for doses up to 25 Gy, it is based in a Gompertz model (that has never been used so far in biological dosimetry). The reliability of this model has been tested for whole and partial simulations. Furthermore, in most of radiological accidents where the irradiation is not homogeneous, up to now, its study was based in considering that one part of the body had been irradiated while the other part had not. This consideration becomes unrealistic because in the majority of accidents the exposed individuals received a gradient of doses. In order to study the heterogeneous exposures simulations, mixing irradiated blood at two different doses from a male and a female, allows the differentiation of the origin of each analyzed cell. Through the application of a mixture Poisson model the dicentric frequency from each fraction has been determined as well as the received dose and the initial proportion of cells irradiated at each dose. The possibility to estimate the received dose after high doses of exposure, as well as the better differentiation for the study of non homogeneous exposures is a very important contribution to the radioprotection field.

La dosimetria biològica és un camp que s’ha desenvolupat dins la radioprotecció i permet estimar la dosi d’una exposició a radiacions ionitzants en casos en que no es coneix o no és prou fiable la dosimetria física. En dosimetria biològica, la metodologia més establerta per estimar la dosi d’una exposició a radiacions es basa en obtenir la freqüència d’una determinada alteració cromosòmica i, extrapolar‐la a una corba dosi‐efecte prèviament elaborada. Hi ha diversos factors que poden fer variar la freqüència de les alteracions cromosòmiques, entre aquests hi ha el cas de les irradiacions parcials, que es dona quan una irradiació només afecta una part del cos, i no la seva totalitat. En aquests casos si és realitza dosimetria biològica l’estimació de la dosi serà menor de la que en realitat és. Per tal de simular irradiacions parcials és va irradiar sang perifèrica a 2, 3, 4 i 5 Gy amb raigs X, i es va barrejar amb sang no irradiada per tal de tenir diferents percentatges de sang irradiada (87,5, 75, 50, 25 i 12,5%). Es va realitzar l’anàlisi mitjançant tècniques de FISH, pintant els cromosomes 1, 4 i 11 conjuntament amb tots els centròmers. Les alteracions cromosòmiques detectades es van expressar en nomenclatura PAINT, PAINT modificada i convencional. Es van utilitzar el test u i el test s (basat en el model de Poisson inflat en el zero) per avaluar la sobredispersió causada per les cèl∙lules no irradiades. Es va estimar la dosi per a cada tipus d’alteració considerada amb el mètode Dolphin i les corbes dosi‐efecte prèviament elaborades (usant les mateixes sondes cromosòmiques). Només es va detectar sobredispersió a dosis altes i a percentatges de sang irradiada baixos. Els dos mètodes usats per detectar desviacions de la distribució de Poisson van mostrar resultats molt similars. El total d’alteracions aparentment simples van ser el tipus d’alteració que l’estimació de la dosi va ser més propera a la dosi real que es va irradiar. Les tècniques de FISH utilitzades van tenir la mateixa eficiència detectant dicèntrics com translocacions. Comparant els resultats obtinguts amb tècniques de FISH amb els obtinguts analitzant dicèntrics amb tinció uniforme, amb aquest últim mètode s’obtenen millors resultats tant en la detecció de d’irradiacions parcials com en l’estimació de la dosi. Un altre factor que influeix en l’estimació d’una dosi és el temps transcorregut després d’una irradiació, ja que no totes les alteracions cromosòmiques presenten la mateixa estabilitat al llarg del temps. Per avaluar quines alteracions són més útils alhora d’estimar la dosi d’una exposició anterior (dosimetria biològica retrospectiva) es va fer un estudi utilitzant com a model la línia cel∙lular limfoblastoide Jurkat de cariotip normal i estable. Es van irradiar cèl∙lules Jurkat en G0 a dosis de 0,2, 2 i 2Gy amb raigs X, un cop irradiades es van mantenir en cultiu durant tres setmanes i es van extreure alíquotes a diferents temps. Les alteracions cromosòmiques induïdes es van analitzar mitjançant tècniques de pintat dels cromosomes 1, 4 i 11 conjuntament amb tots els centròmers per avaluar la persistència de translocacions i dicèntrics, i la tècnica d’mFISH per avaluar la freqüència, la complexitat, la participació de cada cromosoma de les alteracions radioinduïdes i les associacions cromosòmiques preferencials en les mostres inicials i finals en el cultiu control i en els irradiats a 2 i 4 Gy. En l’estudi realitzat amb pintat cromosòmic a totes les dosis la freqüència (x100) de dicèntrics i d’alteracions complexes van disminuir de forma ràpida fins arribar a valors popers a 0. La freqüència (x100) de translocacions es va mantenir força constant als cultius irradiats a 0,2 i 2 Gy mentre que als cultius irradiats a 4 Gy es va observar un descens que en les mostres inicials era pronunciat i en les finals era suau. La tècnica d’mFISH va mostrar que són les alteracions simples incompletes les que desapareixen al llarg del temps i que el grau de complexitat de les alteracions cromosòmiques augmenta amb la dosi i disminueix amb el temps post‐irradiació. No es van detectar desviacions respecte a la participació a l’atzar de cada cromosoma quan es van considerar les alteracions tipus intercanvi, però si que es van detectar quan es van considerar el total de alteracions cromosòmiques radioinduïdes. Es van detectar diferencies significatives en associacions cromosòmiques preferencials en la mostra inicial i en la final del cultiu de cèl∙lules Jurkat. / Biological dosimetry is is a field that has developed within the radioprotection to estimate the dose of ionizing radiation exposure in cases that physical dosimetry is not enough reliable or is unkown. In biological dosymetry, the more established methodology for estimating the dose of radiation exposure is based on extrapolate the frequency of a specific chromosomal alteration in a dose‐effect curve previously prepared. There are several factors that can vary the frequency of chromosome aberrations among these is the case of partial body irradiations, which occurs when radiation affects only a part of the body. In those cases the dose will be underestimated. In order to simulate partial body dose irradiations peripheral blood samples were irradiated at 2, 3, 4 and 5 Gy of X‐rays, and mixed with non‐irradiated blood to obtain the following percentages of irradiated blood: 87.5, 75, 50, 25 and 12.5. FISH painting was performed using whole chromosome painting probes for chromosomes 1, 4, and 11 in combination with a pancentromeric probe. Chromosome aberrations were recorded using the PAINT nomenclature, and later converted to the modified PAINT and conventional nomenclature. The u‐test was initially used to evaluate the expected overdispersion due to the presence of unexposed cells, but a test based on the zero‐inflated Poisson model (s‐test) is also proposed. Dose‐estimations for the different types of chromosome aberrations were calculated by Dolphin’s method and using the FISH dose‐effect curves previously obtained using the same whole‐chromosome probes. The expected overdispersion due to the presence of unirradiated cells was only detected at high doses and low percentages of irradiated blood. The two methods used to detect the deviation from the Poisson distribution showed a similar ability. Dose estimations for the irradiated fraction were closer to the real values for total apparently simple aberrations. In general, using FISH techniques similar results were obtained for dicentrics and translocations. In comparison to solid‐stain dicentric analysis, the use of FISH painting techniques is less suitable to detect partial irradiations, and for dose estimation assessment. Another factor in the estimation of a dose is the time elapsed after irradiation, as not all chromosome aberrations have the same stability over time. To evaluate which aberrations were more useful to estimate the dose for a retrospective exposure an irradiated cell line was studied. A follow‐up study on the persistence of the different types of chromosome aberrations was carried out. The lymphoblastoid cell line Jurkat was irradiated at 0.2, 2 and 4 Gy of X‐rays. After irradiation, the cultures were maintained for three weeks and samples were harvested at different times. Chromosome aberrations were detected using two FISH techniques: painting of chromosomes 1, 4 and 11, to assess the persistence of translocations and dicentrics, and mFISH to evaluate the frequency, the complexity, the chromosome involvement on the radiation‐induced chromosome aberrations and the preferential chromosome‐chromosome associations in the initial and final samples in the control and irradiated cultures at 2 and 4 Gy. In the study performed with painted technique, in all doses, the frequencies (x100) of dicentrics decreased clearly in the successive samples until values near zero. The frequencies (x100) of translocations, at 0.2 and 2Gy, were relatively constant until the last sample, whilst at 4Gy there was an initial steeped decrease in the first samples followed by a slight decrease in the last ones. The technique mFISH showed that simple incomplete aberrations disappear over time and the complexity of chromosome aberrations increases with dose and decreases with post‐irradiation time. The chromosome involvement was random for radiation‐induced exchange aberrations and non‐random for total aberrations. Preferential chromosome‐chromosome associations were observed in the initial and final samples in the Jurkat cell line.

Les interaccions antigen/anticòs són un dels tipus més interessants d’interaccions proteiques. La millor manera de prevenir les malalties causades per patògens és mitjançant l’ús de vacunes. L’aparició de la genòmica permet fer cerques a tot el genoma de nous candidats vacunals, tècnica anomenada vaccinologia inversa. L’estratègia més comuna on s’aplica la vaccinologia inversa és al disseny de vacunes de subunitats recombinants, que en general generen resposta immune humoral a causa de la presència d’epítops B en les proteïnes del patogen. Un problema important d’aquesta estratègia és la identificació de les proteïnes immunogèniques protectives del surfoma del patogen. El mimetisme epitòpic pot donar lloc a fenòmens autoimmunes relacionats amb diverses malalties humanes. El Capítol I d’aquesta tesi descriu una anàlisi computacional basat en la seqüència on, mitjançant l’aplicació de l’algorisme BLASTP, es van comparar bases de dades d’epítops B lineals coneguts i també de seqüències de proteïnes de superfície dels principals patògens bacterians respiratoris humans amb el proteoma humà. Es va trobar que cap dels 7353 epítops B lineals analitzats tenien regions d’identitat de seqüència amb proteïnes humanes capaces de generar anticossos i alhora que només l'1% de les 2175 proteïnes analitzades contenien alguna zona de seqüència compartida amb el proteoma humà. Aquestes troballes suggereixen l’existència d’un mecanisme per evitar l’autoimmunitat. També proposem una estratègia per corroborar o advertint sobre la viabilitat d’una proteïna que contingui un cert epítop B lineal de ser un bon candidat vacunal mitjançant estudis de vaccinologia inversa. En resum, els epítops sense cap tipus d’identitat de seqüència amb proteïnes humanes han de ser bons candidats vacunals, i al l’inrevés. El docking proteic és un mètode computacional per predir la millor manera en què interactuen les proteïnes, però, és possible identificar quina és la millor solució d’un programa de docking? La resposta habitual a aquesta pregunta és la solució que tingui més alta puntuació als outputs dels programes de docking, però les interaccions entre proteïnes són processos dinàmics, i moltes vegades la regió d’interacció és prou àmplia com per permetre diferents orientacions i/o energies d'interacció entre elles. En alguns casos, com en un multímer, es poden donar diverses regions d’interacció entre els monòmers. Aquests processos dinàmics impliquen interaccions, amb desplaçaments de superfície entre proteïnes, que porten a assolir la configuració funcional del complex proteic. Així doncs, en molts casos no hi ha una solució estàtica i única per a la interacció entre proteïnes, sinó que es donen diverses configuracions que també haurien de ser analitzades perquè podrien ser importants. Per extreure el conjunt de solucions més representatives dels outputs dels programes de docking, al Capítol II d’aquesta tesi es detalla el desenvolupament d’una aplicació de clústering no supervisada i automàtica, anomenada DockAnalyse. Aquesta aplicació es basa en el mètode ja existent de clústering DBscan, mitjançant el qual es busquen continuïtats entre els clústers generats per la representació de les dades dels outputs de docking. El mètode de clústering DBSCAN és molt robust i resol alguns dels problemes d’inconsistència dels mètodes clàssics de clústering com el tractament dels valors atípics i la dependència alhora de definir prèviament el nombre de clústers. Mitjançant representacions gràfiques i molt visuals, DockAnalyse fa que la interpretació de les solucions de docking sigui més fàcil permetent-nos trobar les més representatives. S’ha utilitzat aquesta nova aplicació per analitzar diverses interaccions proteiques i així poder modelar el comportament dinàmic de la interacció entre les proteïnes d’un complex. DockAnalyse també pot fer-se servir per a descriure regions d’interacció entre proteïnes i, per tant, orientar en futurs assajos de docking flexibles. L’aplicació (feta amb el paquet R) és oberta i accessible. La construcció dels Clústers Ferro-Sofre (ISC) en eucariotes implica interaccions entre diferents proteïnes, entre els quals es troba la proteïna Frataxina. Dèficits d'aquesta proteïna s'han associat amb excés de ferro dins del mitocondri i alteracions en la biogènesi dels ISC ja que es proposa que Frataxina actua com a donadora de ferro per a la construcció d'aquests ISC en aquest orgànul. Una reducció dràstica de Frataxina causa l'Atàxia de Friedreich, una malaltia neurodegenerativa hereditària humana que afecta principalment l'equilibri, la coordinació, els músculs i el cor. Aquest síndrome és l'atàxia autosòmica recessiva més comuna. Entre els mecanismes moleculars d' humans i de llevat que involucren Frataxina s'han trobat moltes similituds així que els llevats representen un bon model per a estudiar aquest procés. En llevat, el complex proteic que forma la plataforma central de muntatge dels passos inicials de la biogènesi dels ISC està composta per la Frataxina homòloga de llevat, el dímer Nfs1-Isd11 i la proteïna Isu. En general, està acceptat que la funció de les proteïnes implica interaccions amb altres proteïnes associades, però en aquest cas no se sap prou sobre l'estructura del complex de proteïnes i, per tant, com funciona exactament. En el Capítol III d'aquesta tesi es proposa un model del complex proteic necessari per a la biogènesi dels ISC amb el que es pretén aprofundir en detalls estructurals que expliquin la funció biològica. Per aconseguir aquest objectiu s'han utilitzat diverses eines de la bioinformàtiques, així com tècniques de modelització i programes de docking de proteïnes. Com a resultat, s'ha modelat l'estructura d'aquest complex proteic i també s'ha suggerit el comportament dinàmic dels seus components, juntament amb la dels àtoms de ferro i sofre necessaris per a la formació dels ISC. Aquestes hipòtesis podrien ajudar a comprendre millor la funció i les propietats moleculars de la proteïna Frataxina, així com els de les seves companyes presents al complex proteic. / Antigen/antibody interactions are one of the most interesting kinds of protein interactions. The best way to prevent diseases caused by pathogens is by the use of vaccines. The advent of genomics enables genome-wide searches of new vaccine candidates, called reverse vaccinology. The most common strategy to apply reverse vaccinology is by designing subunit recombinant vaccines, which usually generate humoral immune response due to B-cell epitopes in proteins. A major problem for this strategy is the identification of protective immunogenic proteins from the surfome of the pathogen. Epitope mimicry may lead to auto-immune condition related to several human diseases. Chapter I of this thesis describes a sequence-based computational analysis that was carried out applying the BLASTP algorithm where databases containing the known linear B-cell epitopes and the surface-protein sequences of the main human respiratory bacterial pathogens were compared to the human proteome. We found that none of the 7353 linear B-cell epitopes analyzed share any sequence identity region with human proteins capable of generating antibodies, and that only 1% of the 2175 exposed proteins analyzed contain a stretch of shared sequence with the human proteome. These findings suggest the existence of a mechanism to avoid autoimmunity. We also propose a strategy for corroborating or warning about the viability of a protein linear B-cell epitope to be a putative vaccine candidate in reverse vaccinology studies. Therefore, epitopes without any sequence identity with human proteins should be good vaccine candidates, and the other way around. Protein docking is a computational method to predict the best way by which proteins interact, but, is it possible to identify what the best solution of a docking program is? The usual answer to this question is the highest score solution, but interactions between proteins are dynamic processes, and many times the interaction regions are wide enough to permit protein-protein interactions with different orientations and/or interaction energies. In some cases, as in a multimeric protein complex, several interaction regions are possible among the monomers. These dynamic processes involve interactions with surface displacements between the proteins to finally achieve the functional configuration of the protein complex. Consequently, there is not a static and single solution for the interaction between proteins, but there are several important configurations that also have to be analyzed. To extract those representative solutions from the docking output datafile, Chapter II of this thesis details the development of an unsupervised and automatic clustering application, named DockAnalyse. This application is based on the already existing DBscan clustering method, which searches for continuities among the clusters generated by the docking output data representation. The DBscan clustering method is very robust and, moreover, solves some of the inconsistency problems of the classical clustering methods like, for example, the treatment of outliers and the dependence of the previously defined number of clusters. DockAnalyse makes the interpretation of the docking solutions through graphical and visual representations easier by guiding the user to find the representative solutions. We have applied our new approach to analyze several protein interactions and model the dynamic protein interaction behavior of a protein complex. DockAnalyse might also be used to describe interaction regions between proteins and, therefore, guide future flexible dockings. The application (implemented in the R package) is accessible. The assembly of Iron-Sulfur Clusters (ISCs) in eukaryotes involves interactions between different proteins, among which is important the protein Frataxin. Deficits in this protein have been associated with iron inside the mitochondria and impaired ISC biogenesis as it is postulated to act as the iron donor for ISCs assembly in this organelle. A pronounced lack of Frataxin causes Friedreich's Ataxia, which is a human neurodegenerative and hereditary disease mainly affecting the equilibrium, coordination, muscles and heart. Moreover, it is the most common autosomal recessive ataxia. High similarities between the human and yeast molecular mechanisms that involve Frataxin have been suggested making yeast a good model to study that process. In yeast, the protein complex that forms the central assembly platform for the initial step of ISC biogenesis is composed by yeast Frataxin homolog, Nfs1-Isd11 and Isu. In general, it is commonly accepted that protein function involves interaction with other protein partners, but in this case not enough is known about the structure of the protein complex and, therefore, how it exactly functions. In Chapter III of this thesis a model of the ISC biogenesis protein complex was proposed in order to gain insight into structural details that could end up with its biological function. To achieve this goal several bioinformatics tools, modeling techniques and protein docking programs were used. As a result, the structure of the protein complex and the dynamic behavior of its components, along with that of the iron and sulfur atoms required for the ISC assembly, were modeled. This hypothesis might help to better understand the function and molecular properties of Frataxin as well as those of its ISC assembly protein partners.

Las proteínas quinasas p38 y JNK se activan por diversos tipos de estrés ambiental, tal como la radiación UV y el shock hiperosmótico, y regulan múltiples procesos biológicos, entre ellos la proliferación y la muerte celular. El conocimiento de algunas propiedades básicas de estas proteínas quinasas, como la ultrasensibilidad, histéresis y respuesta digital, es importante para el control de los procesos irreversibles. Resultados previos de nuestro grupo han mostrado que el estrés hiperosmótico induce apoptosis en los oocitos de Xenopus laevis y activación de las proteínas quinasas AMPK y JNK. Mediante el uso de este modelo celular, se muestra que p38 también se activa por shock hiperosmótico en los oocitos de Xenopus, que tiene un comportamiento ultrasensible, que no presenta histéresis, y que la activación a nivel de célula individual es bimodal. Por otro lado, se describe el papel de las proteínas quinasas de estrés p38 y JNK, así como la contribución de Smac/DIABLO y las calpaínas, en la apoptosis inducida por el shock hiperosmótico. La inhibición de la vía de p38 con los compuestos SB203580 o BIRB796, o bien la inhibición de la vía de JNK con SP600125, no afectan a la apoptosis inducida por el shock hiperosmótico, mientras que la inhibición simultánea de la vía de p38 y JNK con SP600125 + BIRB796 inhibe parcialmente la salida de citocromo c y la activación de caspasa-3. El shock hiperosmótico induce la activación de p38α, p38β, y p38γ. La expresión de un constitutivo activo de MKK6 acelera la apoptosis inducida por shock hiperosmótico, efecto que es inhibido por SB203580 o por BIRB796. Además, la expresión de un constitutivo activo de p38 β acelera la activación de caspasa-3 y la salida de citocromo c inducida por el estrés osmótico, indicando que la isoforma β tiene un papel más pro-apoptótico que el resto de isoformas. La expresión de un constitutivo activo de MEKK1 acelera la apoptosis inducida por el shock osmótico, efecto que es parcialmente inhibido por SP600125 y con mayor claridad por SB203580 y BIRB796, indicando que ambas vías de señalización (JNK y p38) regulan la apoptosis de los oocitos. Por otro lado, el shock hiperosmótico induce la activación de JNK1-1 y JNK1-2 en los oocitos de Xenopus, y la expresión de un constitutivo activo de MKK7 junto con JNK1-1 o JNK1-2 acelera la apoptosis inducida por el shock hiperosmótico. Además, el shock hiperosmótico induce la salida rápida de Smac/DIABLO mitocondrial y la activación de las calpaínas. La inhibición de las calpainas reduce la salida de citocromo c y la activación de caspasa-3. El bloqueo de Smac/DIABLO inyectando un anticuerpo específico inhibe la salida de citocromo c y la activación de caspasa-3, indicando que la salida temprana de Smac/DIABLO mitocondrial regula la salida tardía de citocromo c. El inhibidor general de caspasas Z-VAD.fmk retrasa la apoptosis inducida por el estrés hiperosmótico, de forma independiente a la caspasa-3, sugiriendo que alguna otra caspasa podría ser activada antes de la salida de citocromo c. En resumen, la activación sostenida de las proteínas quinasas de estrés p38 y JNK, junto a la salida rápida de Smac/DIABLO al citosol y la activación de las calpaínas son responsables de la apoptosis inducida por el shock hiperosmótico. / p38 and JNK stress protein kinases are activated by different stimuli like UV and hyperosmotic shock, and regulate multiple biological processes, from proliferation to cell death. Some properties of signalling systems, like ultrasensitivity, hysteresis, and all-or-none responses at a single cell level, are considered to be basic for understanding the regulation of irreversible processes. Previous results in our group have shown that hyperosmotic stress induces apoptosis in Xenopus oocytes and activation of the stress protein kinases AMPK and JNK. Using this cell model, we show now that hyperosmotic shock activates the p38 signalling pathway in oocytes with an ultrasensitive and bimodal response in a time-dependent manner and without hysteresis. Furthermore, we describe the role of stress proteins kinases p38 and JNK, and the contribution of Smac/DIABLO and calpains in the apoptosis induced by hyperosmotic shock. Inhibition of the p38 pathway with the chemical compounds SB203580 or BIRB796, or inhibition of JNK pathway with SP600125 do not block hyperosmotic shock-induced apoptosis, while simultaneous inhibition of p38 and JNK pathways with SP600125 + BIRB796 partially reduces cytochrome c release and caspase-3 activation. Hyperosmotic shock induces activation of p38α, p38β, and p38γ. Expression of a constitutive active MKK6 accelerates apoptosis induced by hyperosmotic shock, an effect that is inhibited by SB203580 or BIRB796. Furthermore, expression of a constitutive active p38β accelerates the activation of caspase-3 and cytochrome c release induced by osmotic stress, indicating that the β isoform has a more pro-apoptotic role that other isoforms. Expression of a constitutive active MEKK1 accelerates apoptosis induced by osmotic shock, an effect that is partially inhibited by SP600125 and more clearly by SB203580 or BIRB796, indicating that both signaling pathways (JNK and p38) regulate apoptosis. Furthermore, hyperosmotic shock induces activation of JNK1-1 and JNK1-2 in Xenopus oocytes, and expression of a constitutive active MKK7 with JNK1-1 or JNK1-2 accelerates apoptosis induced by hyperosmotic shock. In addition, hyperosmotic shock induces rapid release of Smac/DIABLO from the mitochondria and calpain activation. The inhibition of calpains reduces cytochrome c release and caspase-3 activation. Blockage of Smac/DIABLO by injecting a specific antibody inhibits cytochrome c release and caspase-3 activation, indicating that early release of Smac/DIABLO regulates late citocrome c release. The general caspase inhibitor Z-VAD.fmk delays apoptosis induced by hyperosmotic stress, independently of caspase-3, suggesting that some other caspase might be activated before cytochrome c release. In summary, sustained activation of stress protein kinases JNK and p38, combined with rapid release of Smac/DIABLO into the cytosol and activation of calpains are responsible of the cell death induced by hyperosmotic shock.

Les partícules similars a virus (VLP) ofereixen un gran potencial com a candidates per a la nova producció de vacunes. En aquest treball es presenta el desenvolupament i l'optimització d'un protocol de producció de VLP de Gag d’VIH-1 mitjançant l'expressió gènica transitòria en cultius de cèl·lules HEK 293 en suspensió. La transfecció transitòria permet una generació ràpida de proteïnes recombinants en quantitat i qualitat suficient per realitzar assajos preclínics, i és particularment interessant en les fases primerenques del desenvolupament. Aquest treball es divideix en quatre capítols principals. Al primer capítol, el medi comercial lliure de sèrum Freestyle 293 s'optimitza mitjançant l'ús de components d'origen no animal. L'ús de medis químicament definits i sense components derivats d'animals és un requisit bàsic per una vacuna destinada als éssers humans. La densitat cel·lular màxima assolida utilitzant el medi de cultiu optimitzat (suplementat amb 0,9X de mescla de lípids, 19,8 mg/L d’insulina recombinant i 1,6 mg/L de transferrina recombinant) és 5,4×106 cèl·lules/ml en discontinu, gairebé el doble del que s’assoleix utilitzant el medi sense suplementar (2.9×106 cèl·lules / ml). A més a més, després de l'optimització del medi, també s'ha millorat el protocol de transfecció. La millor producció s’aconsegueix quan les cèl·lules es transfecten a la meitat de la fase logarítmica (2-3 x 106 cèl·lules/ml) amb recanvi de medi en el moment de la transfecció utilitzant 1 g/(ml de cultiu) d'ADN i 2 g/(mL de cultiu) de polietilenimina. Mitjançant l'ús d'aquest protocol, els títols de VLP es van incrementar 2,4 vegades, obtenint 2,7 × 109 VLP/ml. Tant el medi de cultiu optimitzat com el protocol de transfecció s'utilitzen a la resta del treball. Al capítol dos, la cinètica del procés de transfecció transitòria s'estudia amb l'objectiu de caracteritzar i comprendre el procés complet a nivell intracel·lular que condueix a la producció de VLP, per tal de determinar els punts importants per poder millorar el procés. Els poliplexes comencen a interactuar amb la membrana cel·lular just després de la seva addició al cultiu. Després d’una hora i mitja es detecten al citoplasma de les cèl·lules i arriben al nucli al voltant de 4 hores després de la transfecció. Després de 10 hores es pot detectar la fluorescència GFP dins de les cèl·lules, però no s'observa la sortida de les VLPs de les cèl·lules, per gemmació, fins 48 hores després de la transfecció. El moment òptim de recollida del producte s’ha fixat a les 72 hores post transfecció ja que la producció de VLPs és màxima mentre es manté una viabilitat del cultiu alta. Al capítol 3, s'estudia la millora de la producció de VLPs utilitzant compostos específics. Es proven dos grups de potenciadors de la transfecció, un grup utilitzat per facilitar l'entrada de complexes de ADN/PEI a la cèl·lula o al nucli i un altre grup seleccionat per augmentar els nivells d'expressió gènica. Entre els vuit additius utilitzats (tricostatina A, àcid valproic, butirat de sodi, DMSO, acetat de liti, cafeïna, hidroxiurea i Nocodazol) s’identifica una combinació òptima que permet obtenir el màxim d’expressió. L'addició de 20 mM d’acetat de liti, 3,36 mM d’acid valproic i 5,04 mM de cafeina augmenta els nivells de producció 4 vegades, mentre la viabilitat del cultiu es manté al 94%. Atès que l'expressió transitòria (TGE) es basa en l'expressió episomal d'ADN plàsmidic, està limitada a un període curt de producció, d’en general unes 96 h, fet que limita la productivitat. Al capítol 4, es desenvolupa un protocol nou, anomenat expressió gènica extesa (EGE). L'objectiu de l’EGE és perllongar el període de producció, combinant el recanvi de medi i la transfecció repetida del cultiu per millorar la producció de proteïnes. L'avantatge d'aquesta metodologia és avaluada per a la producció de tres productes recombinants model: la GFP intracel·lular, la GFP secretada, i una partícula similar a virus Gag-GFP (VLP). Utilitzant aquesta nova estratègia EGE, el període de producció es perllonga entre 192 i 240 h amb un augment de producció d’entre 4-12 vegades en els nivells de producció, depenent del tipus de producte considerat. / Virus-like particles (VLPs) offer great potential as candidates for new vaccine production. In this work, the development and optimization of an HIV-1 Gag VLP production protocol by transient gene expression in HEK 293 suspension cultures is presented. Transient transfection enables a rapid generation of recombinant proteins of sufficient quantity and quality to perform pre-clinical trials, and it is particularly VLP production, and to determine important time points to drive process improvement. Polyplexes start to interact with the cell membrane just after addition to the culture. After 1.5 hpt complexes are detected in the cytoplasm of the cells and reach the nucleus around 4 hours post transfection. After 10 hours post transfection GFP fluorescence is detected inside the cells, but generalized budding of VLPs from the cells is not observed until 48 hours post transfection. The optimal harvest time is determined as 72 hpt as VLP production is highest while high viability of the culture is maintained. In chapter three, the enhancement of VLP production using specific compounds is studied. Two main groups of transfection enhancers are tested, selected on the basis that they can either facilitate the entry of PEI/DNA transfection complexes into the cell or nucleus or they can increase the levels of gene expression. Among the eight transfection-enhancers tested (Trichostatin A, Valproic acid, Sodium Butyrate, DMSO, Lithium Acetate, Caffeine, Hydroxiurea and Nocodazole) an optimal combination of compounds exhibiting the greatest effect on gene expression is subsequently identified. The addition of 20 mM Lithium Acetate, 3.36 mM Valproic Acid and 5.04 mM Caffeine increases production levels by 4 fold, while maintaining cell culture viability at 94 %. As transient gene expression (TGE) is based on episomal plasmid DNA expression, conventional TGE is limited to a short production period of usually about 96 h, therefore limiting productivity. In chapter four, a novel gene expression approach termed extended gene expression (EGE) is proposed. The aim of EGE is to prolong the production period by the combination of medium exchange and repeated transfection of cell culture with plasmid DNA to improve overall protein production. The benefit of this methodology is evaluated for the production of three model recombinant products: intracellular GFP, secreted GFP, and a Gag-GFP virus-like particle (VLP). Using this novel EGE strategy, the production period is prolonged between 192 and 240 h with a 4–12-fold increase in production levels, depending on the product type considered. interesting in the early development phases. This work is divided in four main chapters. In the first chapter, the serum-free commercial medium Freestyle 293 is optimized using non-animal derived components as supplements. The use of chemically defined animal derived component free media and supplements is a basic requirement for any further use of a vaccine for humans. The maximum cell density attained using the optimized medium (supplemented with 0.9X of Lipid mixture, 19.8 mg/L of r-insulin and 1.6 mg/L of r- transferrin) was 5.4 × 106 cells/mL in batch mode, almost double of that observed using the unsupplemented medium (2.9×106 cells/mL). Moreover, after the medium optimization, the transfection protocol is also improved. Best production performance is attained when cells were transfected at mid-log phase (2–3 × 106 cells/mL) with medium exchange at the time of transfection using 1 μg/(mL of culture) of plasmid DNA and 2 μg/(mL of culture) of polyethylenimine. By using this protocol, VLP titers are increased 2.4-fold, obtaining 2.7 × 109 VLPs/mL. The optimized medium and transfection protocol defined in this chapter are used in the rest of the work. In chapter two, the kinetics of the transient transfection process is studied with the aim to characterize and understand the complete process at intracellular level leading to the this methodology is evaluated for the production of three model recombinant products: intracellular GFP, secreted GFP, and a Gag-GFP virus-like particle (VLP). Using this novel EGE strategy, the production period is prolonged between 192 and 240 h with a 4–12-fold increase in production levels, depending on the product type considered.