TESIS DOCTORAL"Streptococcus pneumoniae", también llamado neumococo, es una bacteria Gram positiva caracterizada por la severidad de las infecciones que produce en la especie humana, siendo responsable de una elevada morbilidad y letalidad, especialmente en niños y ancianos, colectivos particularmente sensibles a sus consecuencias. La emergencia de cepas de S. pneumoniae resistentes a antibióticos como la penicilina y otros beta-lactámicos, comúnmente utilizados en el tratamiento de las infecciones neumocócicas, ha llevado a la utilización de nuevos agentes antimicrobianos como las fluoroquinolonas. Sin embargo, su extensa utilización y el uso prolongado y en ocasiones inadecuado de esta clase de antibióticos ha desencadenado el rápido desarrollo y selección de bacterias resistentes. La ciprofloxacina proporciona un marcador valioso de evaluación de la actual y potencial emergencia de la resistencia a fluoroquinolonas en esta especie, por ser la fluoroquinolona más utilizada en las últimas dos décadas y la que ha ejercido una mayor presión de selección en S. pneumoniae. Uno de los objetivos iniciales de este trabajo fue el de poner de manifiesto el posible papel de otros estreptococos orales en la eventual transferencia de genes de resistencia a quinolonas en "S. pneumoniae". Concretamente, los experimentos de transformación de la cepa de "S. pneumoniae" R6 con DNA procedente de cepas de estreptococos del grupo "viridans" resistentes a ciprofloxacina permitieron demostrar la posible transferencia génica horizontal de la resistencia a fluoroquinolonas entre cepas de estreptococos.El siguiente objetivo fue el estudio de los mecanismos implicados en la resistencia a fluoroquinolonas en cepas clínicas de "S. pneumoniae". En esta bacteria se han descrito dos posibles mecanismos de resistencia a las fluoroquinolonas: alteraciones en las dianas de esta clase de antibióticos y una disminución de la acumulación intracelular debida a la sobreexpresión de la bomba de reflujo PmrA.Los mecanismos de resistencia a ciprofloxacina en las cepas clínicas de "S. pneumoniae" estudiadas fueron debidos, principalmente, a mutaciones en las dianas de las fluoroquinolonas parC, parE y gyrA. Los niveles bajos de resistencia se debieron a mutaciones en el gen parC, mientras que se detectaron niveles de resistencia más elevados en aquellas cepas que presentaron mutaciones en parC y gyrA. Por otro lado, dos de las cepas de "S. pneumoniae" estudiadas presentaron una concentración mínima inhibitoria de ciprofloxacina considerable pero su resistencia no respondió a mutaciones en las dianas de las fluoroquinolonas. En estas dos cepas se estudió la posible implicación de un mecanismo de reflujo en su destacada resistencia, mediante la determinación de las concentraciones mínimas inhibitorias de distintos compuestos así como realizando ensayos de inhibición del crecimiento y fluorimétricos, en presencia y ausencia de un inhibidor de los sistemas de reflujo, la reserpina. Estos ensayos indicaron la posible implicación de un mecanismo de reflujo en la resistencia de dichas cepas a ciprofloxacina, que podría deberse a la acción de la bomba PmrA La inactivación del gen pmrA en transformantes de reflujo de R6, obtenidos con DNA de estas dos cepas, indicó que la bomba PmrA no estaba implicada en la resistencia a ciprofloxacina, sugiriendo la presencia de otra bomba de reflujo distinta de PmrA en "S. pneumoniae", también inhibible por reserpina.El análisis comparativo de secuencias BLAST entre el genoma de R6 y distintas proteínas de reflujo descritas en otras bacterias Gram positivas evidenciaron la posible existencia de al menos otra bomba de reflujo no descrita hasta el momento en "S. pneumoniae". Analizados los dos mecanismos principales de resistencia, se aplicó una metodología basada en la técnica de "microarrays", que mostró el potencial de esta valiosa herramienta en la determinación de nuevos genes involucrados en la resistencia a fluoroquinolonas en "S. pneumoniae".

DE LA TESI DOCTORAL: L'augment de la incidència de bacteris amb resistència als agents antimicrobians és deguda a les característiques intrínseques de les soques antimicrobianes, a una pressió selectiva per l'ús extensiu dels antibiòtics i a uns canvis socials i tecnològics que ha facilitat la transmissió d'organismes resistents o de gens de resistència. Aquest constitueix un problema sanitari de primera magnitud. Els bacteris presenten característiques que poden influir poderosament en l'emergència i la transmissió dels gens que codifiquen per a la resistència als agents antimicrobians.Els mecanismes de resistència dels bacteris als antibiòtics poden ser diversos. Des de la inactivació enzimàtica de l'antibiòtic, la modificació de la diana de l'antibiòtic així com mecanismes de caire més generals com la disminució de la permeabilitat de la membrana, l'expressió de bombes de reflux i l'intercanvi de material genètic per transferència de plasmidis, transposons o integrons. Precisament aquests últims mecanismes són objecte de la present tesi doctoral.El nostre grup de recerca ha treballat durant anys sobre diferents mecanismes de resistència als antibiòtics en diferents espècies bacterianes, continuant a l'actualitat amb aquesta activitat investigadora.Com a objectiu general d'aquesta tesi ens plantegem la caracterització molecular i funcional dels mecanismes de resistència d'un bacteri Gram negatiu: Morganella morganii. I en concret s'ha centrat en els següents punts:1. Investigar la susceptibilitat antimicrobiana de diverses soques de Morganella morganii d'origen clínic. 2. Investigar la importància de la permeabilitat de les envoltes cel·lulars bacterianes de Morganella morganii a diferents antibiòtics.3. Realitzar experiments de transformació i conjugació amb les soques clíniques resistents.4. Obtenir la porina de Morganella morganii purificada i realitzar estudis físico-químics seguint la tècnica de lipid planar bylayer.5. Investigar sobre l'existència d'integrons en la soca de Morganella morganii resistent i obtenir les seqüències dels gens de resistència inserits en aquests integrons.6. Estudiar la possible funcionalitat de bombes de reflux que puguin expulsar els antibiòtics fora de la cèl·lula.

La capacidad de Acinetobacter baumannii para causar infecciones nosocomiales se relaciona con su habilidad para desarrollar rápidamente resistencia a los antibióticos, junto con la capacidad que tiene este organismo para sobrevivir durante largos períodos de tiempo en el hábitat hospitalario.A pesar de ser un problema emergente en la UCIs, falta mucha información sobre los mecanismos de virulencia y resistencia a los antimicrobianos, a la desecación y a la desinfección. Los objetivos principales de este trabajo fueron estudiar los mecanismos de resistencia a diferentes agentes antimicrobianos en cepas clínicas de la especie Acinetobacter, haciendo énfasis en la identificación de nuevas bombas de expulsión y porinas, junto con un estudio del efecto que produce la formación de biopelícula en el éxito de A. baumannii como patógeno.Con A. baumannii, se ha estudiado la prevalencia de bombas de expulsión específicas para tetraciclinas (TetA y TetB) y β-lactamasas en una colección de cepas clínicas españolas. Adicionalmente, se ha estudiado el efecto de la secuencia de inserción ISAba1 como promotor de estas β-lactamasas y se ha concluido que este elemento móvil, que puede ser adquirido o perdido en el ámbito hospitalario, se está convirtiendo en un activador importante de estos genes de resistencia. Paralelamente, se ha analizado la actividad de ceftobiprole y doripenem, dos nuevos β-lactámicos, frente a cepas clínicas de este microorganismo que únicamente ofrecen una pequeña mejoría frente a las antiguas carbapenemas y cefalosporinas. También se ha detectado y secuenciado un gen homológo a mdfA en Escherichia coli que codifica una bomba de expulsión en una cepa clínica de A. baumannii.Aproximaciones genómicas y proteómicas han demostrado ser metodologías importantes para la identificación y caracterización de nuevos mecanismos de resistencia. Se ha hecho un análisis proteómico de una fracción enriquecida en proteínas de membrana en una cepa clínica y un estudio proteómico entre una cepa clínica sensible a quinolonas y un mutante isogénico resistente a quinolonas con la obtención de diversas proteínas de membrana que se sobre-expresaban en el mutante resistente; estas porinas podrían hacer la membrana bacteriana más impermeable a los agentes antimicrobianos. Un análisis de la membrana en mutantes resistentes a colistina demuestran que esta resistencia puede estar asociada a cambios a nivel proteico y a un incremento en la producción de lipopolisacáridos.Finalmente se ha analizado la formación de biopelícula en una colección de cepas clínicas de A. baumannii, estudiando la relación entre la formación de biopelícula y otras características clínicas o microbiológicas. Se ha demostrado que hay una clara asociación entre formación de biopelícula y sensibilidad a imipenem y ciprofloxacino; las cepas resistentes a quinolonas son menos propensas a formar biopelícula que sus equivalentes sensible debido a una expresión reducida de una fimbria de tipo 1, el primer paso en la formación de biopelícula. Además, pacientes tratados previamente con aminoglucósidos tienen un riesgo de ser colonizados o infectados con cepas de A. baumannii formadoras de biopelícula.En este trabajo también se han considerado otras genospecies y se han estudiado los mecanismos de resistencia a quinolonas y colistina, concretamente en cepas de la Genospecie 3 y 13. Cepas clínicas no pertenecientes al grupo A. baumannii están probablemente siendo subestimadas como agentes patogénicos porque las cepas resistentes pueden ser clasificadas como A. baumannii por equivocación. A pesar de que estas cepas son generalmente más sensibles a los antibióticos, están adquiriendo nuevos mecanismos de resistencia.

INTRODUCCIÓN:Tanto en países desarrollados como en vías de desarrollo las Salmonellas son responsables de un alto nivel de morbilidad y mortalidad. Este problema es especialmente relevante en áreas en vías de desarrollo donde la carencia de fuentes económicas no permite disponer de un amplio potencial antibacteriano. Además, en algunas de estas áreas tanto la situación social como la presencia de otras enfermedades favorecen la infección por estos microorganismos. El género Salmonella está compuesto por 2501 serotipos con diferentes características fenotípicas y genotípicas y aunque usualmente produce una infección autolimitada, la duración o la severidad de los síntomas pueden requerir tratamiento antibiótico.Las especies de Salmonella disponen de altos niveles de resistencia natural a los agentes antimicrobianos más usados, sin embargo la aparición de cepas de Salmonella mostrando resistencia a uno o más agentes antibacterianos ha aumentado considerablemente probablemente debido a la continua presión antibiótica, lo cual constituye un importante problema para la salud pública. La resistencia a algunos antibióticos, tales como β-lactámicos, tetraciclina, cloranfenicol, o trimetoprim-sulfametoxazol está siendo reportada con alta frecuencia. Además se ha descrito el desarrollo de resistencia a quinolonas. Una eficiente ruta de adquisición de esta resistencia es a través de elementos genéticos tales como, plámidos, transposones e integrones.El principal objetivo de este estudio fue analizar la evolución de la resistencia en aislamientos de Salmonella de origen clínico, caracterizar los mecanismos de resistencia a diferentes agentes antimicrobianos y analizar el potencial de diseminación de clones resistentes.MATERIALES Y MÉTODOS:En este estudio se analizaron cepas (n=62) aisladas de muestras de heces procedentes de viajeros que padecían diarrea del viajero y cepas (n=34) aisladas de muestras de heces de pacientes con gastroenteritis aguda de diferentes regiones de Cuba. El estudio se llevó a cabo en el Laboratorio de Microbiología Clínica del Hospital Clínic de Barcelona. Los patógenos diarreagénicos encontrados fueron identificados por métodos convencionales. El serotipo se determinó utilizando antisueros somáticos y flagelares. La fase flagelar fue determinada por el método de inversión de fase descrito por Kauffman y White y siguiendo las recomendaciones de Edward y Ewing. También se identificaron los fagotipos de los serotipos Enteritidis, Typhimurium, Hadar y Virchow. Se determinó la susceptibilidad antimicrobiana por el método de Kirby-Bauer a diferentes agentes antimicrobianos: ampicilina, amoxicilina-ácido clavulánico, ácido nalidíxico, tetraciclina, trimetoprim-sulfametoxazol, cloranfenicol, gentamicina, amikacina, espectinomicina, imipenem, norfloxacino, ciprofloxacino y ceftazidima. La interpretación de los resultados se llevó a cabo según las normas del CLSI. Staphylococcus aureus ATCC 29213, Escherichia coli ATCC 25922 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 se utilizaron como cepas controles.Para determinar los mecanismos moleculares de resistencia a quinolonas se detectaron las mutaciones en los genes gyrA y parC mediante la técnica de PCR con iniciadores específicos. La presencia de los genes cmlA y floR asociados con la resistencia a cloranfenicol se determinó por PCR. La actividad cloranfenicol acetiltransferasa se determinó mediante un ensayo colorimétrico. La detección de los genes que codifican para beta-lactamasas (tipo tem, carb, shv, y oxa) así como la determinación de los mecanismos de resistencia a tetraciclina relacionados con la presencia de los genes tetA, tetB y tetG también fue determinada por PCR. Para determinar el mecanismo de resistencia a trimetoprim-sulfametoxazol la presencia de dihidrofolato reductasas fue determinada con primers genéricos y análisis del polimorfismo de los fragmentos de restricción. La detección de integrones Clase 1 también se determinó utilizando primes específicos ya descritos.Los productos de las diferentes PCR fueron visualizados en un gel de agarosa al 2%. El producto de la PCR visualizado en el gel fue secuenciado y analizado en un secuenciador automático usando el kit de secuenciación Big Dye3.1.La clonalidad de los aislamientos se determinó mediante análisis del ADN cromosómico digerido con XbaI y separación en electroforesis en campo pulsante.RESULTADOS:Los serotipos más frecuentes fueron Salmonella enteritidis y Salmonella typhimurium. La mayoría de las cepas mostraron resistencia al menos a uno de los agentes antimicrobianos utilizados, encontrándose un alto porcentaje de multirresistencia. Los antibióticos frente a los cuales se observó mayor resistencia fueron: tetraciclina, ampicilina, cloranfenicol, ácido nalidíxico y trimetoprim-sulfametoxazol. Una simple sustitución de aminoácidos en las posiciones 83 y 87 del gen gyrA ha sido descrita con anterioridad como causa de resistencia frente al ácido nalidíxico, mientras que sustituciones en ambas posiciones más sustituciones en el gen parC confieren elevada resistencia a fluoroquinolonas. En nuestro estudio se encontró resistencia al ácido nalidíxico y sensibilidad disminuida a ciprofloxacino y norfloxacino. Destacándose como principal causa de esta resistencia mutaciones en el gen gyrA. No se encontraron mutaciones en el gen parC. Ocho aislamientos mostraron resistencia a ampicilina provocada por la presencia de beta-lactamasas tipo CARB, TEM y OXA. Es algunas cepas productoras de beta-lactamasas tipo TEM también se encontraron niveles intermedios de sensibilidad a amoxicilina-ácido clavulánico. Está demostrado que la sobreexpresión de estas enzimas provoca sensibilidad disminuida o resistencia frente a este antibiótico.El principal mecanismo de resistencia involucrado en la resistencia al trimetoprim-sulfametoxazol fue la presencia de dihidrofolato reductasas presentes en cuatro aislamientos, específicamente dfrA1, dfrA12, dfrA14 y dfrA17. La resistencia al cloranfenicol estuvo determinada por la presencia de los genes cmlA, floR y la actividad cloranfenicol acetil transferasa (CAT). De los aislamientos resistentes a tetraciclina, el gen tetA fue el principal responsable de la resistencia. Los genes de resistencia localizados en integrones fueron asociados con resistencia a aminoglucosidos, beta-lactamasas, trimetoprim y cloranfenicol. El campo pulsante reveló la existencia y diseminación de un clon resistente de Salmonella typhimurium en diferentes regiones de Cuba.CONCLUSIONES:Nuestros resultados muestran niveles importantes de resistencia en cepas de Salmonella, principalmente frente al ácido nalidíxico, además de una gran heterogeneidad de mecanismos moleculares de resistencia frente a antibióticos de primera línea. A nuestro parecer con nuestro estudio contribuimos a mantener la vigilancia de esos microorganismos y así tener información de los niveles de resistencia para mejorar el tratamiento y desarrollar estrategias en la prevención de la diseminación de la resistencia.

Aquesta tesi doctoral se centra en l'estudi de l'aplicació de pèptids antimicrobians en la lluita contra agents patògens de cultius de plantes d'interès econòmic.L'estratègia sintètica s'ha portat a terme utilitzant metodologies convencionals de síntesi de pèptids en fase sòlida com l'estratègia tridimensional ortogonal Fmoc/tBut/Allyl. Ha calgut fer la recerca de les condicions òptimes per a l'eliminació del grup Allyl i la ciclació. D'entre els pèptids cíclics de 4-10 aminoacids sintetitzats, el decapèptid c(Lys-Leu-Lys-Leu-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Gln) ha resultat ésser el més efectiu i s'ha pres com a base per al disseny d'una quimioteca de 56 pèptids. Dels resultats obtinguts s'ha sintetitzat una segona quimioteca basada en l'estructura general c(X1-X2-X3-X4-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Gln) determinada com la que posseix el millor perfil d'activitat. Els pèptids més efectius obtinguts constituixen els primers exemples de pèptids cíclics actius contra E. amylovora i poden ser considerats com a bons candidats pel desenvolupament d'agents antimicrobians efectius en protecció vegetal. / This PhD thesis was centred on the study of the application of de novo designed head-to-tail cationic cyclic peptides as inhibitors of the plant pathogenic microorganisms responsible for diseases in plants of great economic importance.The solid-phase synthesis of the cyclopeptides was carried out using a three-dimensional orthogonal Fmoc/tBut/Allyl strategy. The optimisation study of the allyl group removal and of the head-to-tail cyclization of linear peptides on SynPhase Lanterns was required for the syntheses. From the synthesized cyclic peptides of 4 to 10 residues, the cyclodecapeptide c(Lys-Leu-Lys-Leu-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Gln) was the most active and has been used as parent peptide in a using a combinatorial chemistry approach. From the results, a second library based on the structure c(X1-X2-X3-X4-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Gln) has been synthesized. The best cyclodecapeptides are the first examples of cyclic peptides effective against E. amylovora and make them potential candidates for the development of antimicrobial agents for use in plant protection.