En la presente tesis se ha pretendido avanzar en el conocimiento de la resistencia al virus de la tristeza de los cítricos (CTV) con el propósito de diseñar estrategias de mejora más eficientes.En este trabajo se ha obtenido un nuevo grupo de marcadores moleculares derivados de retrotransposones del tipo gypsy y se ha analizado la presencia, heterogeneidad y distribución de dichos elementos en especies de los géneros Citrus y Poncirus. A partir de una variedad de mandarino clementino se han aislado ocho clones que contienen una parte de la región codificante POL de los retrotransposones tipo gypsy. El análisis de sus secuencias parece indicar que cuatro de estos clones corresponden a elementos potencialmente activos, puesto que presentan intactos, sin codones de paro ni desplazamiento de la pauta de lectura correcta, todos los motivos conservados indispensables para la retrotransposición. En la mejora genética de cítricos uno de los principales objetivos es la resistencia a CTV. La tristeza de los cítricos es la principal virosis que afecta al cultivo de los cítricos en el mundo. La obtención de plantas resistentes a su agente causal (CTV) sería la forma más adecuada de combatir la enfermedad. P. trifoliata es una especie resistente al virus y sexualmente compatible con las especies del género Citrus, por lo que tradicionalmente en los programas de mejora de cítricos se le ha considerado como la mejor candidata para transferir su resistencia a los cítricos cultivados. Varios estudios anteriores han definido la resistencia de P. trifoliata a CTV como un carácter controlado por un único gen (Ctv-R) con el objetivo de obtener cítricos comerciales resistentes al virus a partir de la transformación genética con el gen de resistencia a CTV. En la presente tesis se ha saturado con distintos tipos de marcadores moleculares la región donde previamente se había situado Ctv-R. Para ello se han utilizado dos familias segregantes derivadas de P. trifoliata, una por autopolinización y la otra por cruce con C. aurantium (naranjo amargo), un patrón bien adaptado a las condiciones semi-áridas típicas de la cuenca mediterránea. El seguimiento de la infección con CTV en la familia AxPa ha proporcionado resultados sorprendentes. Amargo resulta tan resistente al aislado del virus ensayado (T-346) como P. trifoliata. Los mapas saturados resultantes de este estudio se han utilizado para localizar la resistencia al virus bajo la hipótesis de transmisión monogénica. El análisis genético de la interacción virus-planta en la familia AxPa tras la infección crónica con CTV ha revelado cinco tipos distintos de interacción lo cual es incompatible con la hipótesis de un sólo gen de resistencia. Los resultados obtenidos indican que la transferencia del gen Ctv-R de P. trifoliata al naranjo amargo podría no evitar los síntomas típicos de decaimiento ("decline") en naranjo dulce injertado sobre este nuevo patrón.Los mapas saturados obtenidos con anterioridad en este trabajo se han utilizado para localizar la resistencia a CTV considerándola como carácter cuantitativo (acumulación de virus) mediante análisis de QTLs ("quantitative trait loci"), evitando así la asunción de control monogénico de la resistencia. Los resultados revelan la presencia de tres QTLs de resistencia principales, dos en P. trifoliata y uno en naranjo amargo, en la región donde se había localizado Ctv-R en otras progenies. Además, se han detectado otros QTLs de acumulación donde se localizan genes de menor efecto. También se han detectado interacciones epistáticas implicadas en el control genético del carácter. / Citrus is an extensively apomictic genus and transposable elements might be importantly involved in its genetic instability and genome evolution. The presence of gypsy-like retrotransposons, their heterogeneity and genomic distribution in Citrus and Poncirus have been investigated. Eight clones containing part of the POL coding region of gypsy- like retrotransposons have been isolated from a commercial variety of C. clementina, one of the few sexual species in Citrus. Four of the eight clones might correspond to active elements given that they present all the conserved motifs described in the literature as essential for activity, no in-frame stop codon and no frame-shift mutation. Nested copies of gypsy-like elements are scattered along the Citrus and Poncirus genomes. IRAPs based on gypsy and copia types of retrotransposons seem to distribute differently providing a new, complementary set of molecular markers now available in Citrus to study and follow genetic variability, specially for disease resistance. Several studies have reported markers linked to a putative resistance gene from Poncirus trifoliata (Ctv-R) located at linkage group 4 that confers resistance against one of the most important citrus pathogens, citrus tristeza virus (CTV). Two progenies derived from P. trifoliata, by self-pollination and by crossing with sour orange, the well-adapted citrus rootstock to arid and semi-arid areas, were used for linkage group 4 marker enrichment. Two new methodologies were used to enrich this region with expressed sequences. The enrichment of group 4 resulted in the fusion of several C. aurantium linkage groups. Surprisingly, sour orange resulted as resistant to the CTV isolate tested as P. trifoliata was. The genetic analysis of virus-plant interaction in the family derived from C. aurantium after a CTV chronic infection showed the segregation of five types of interaction which is not compatible with the hypothesis of a single gene controlling resistance. Transferring Ctv-R from P. trifoliata to sour orange might not avoid the CTV decline of sweet orange trees. Resistance against CTV was analysed as a quantitative trait (CTV accumulation) by QTL analysis to avoid the assumption of monogenic control. Three major resistance QTLs were detected. Up to 5 minor QTLs were also detected.

Aquesta tesi doctoral se centra en l'estudi de l'aplicació de pèptids antimicrobians en la lluita contra agents patògens de cultius de plantes d'interès econòmic.L'estratègia sintètica s'ha portat a terme utilitzant metodologies convencionals de síntesi de pèptids en fase sòlida com l'estratègia tridimensional ortogonal Fmoc/tBut/Allyl. Ha calgut fer la recerca de les condicions òptimes per a l'eliminació del grup Allyl i la ciclació. D'entre els pèptids cíclics de 4-10 aminoacids sintetitzats, el decapèptid c(Lys-Leu-Lys-Leu-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Gln) ha resultat ésser el més efectiu i s'ha pres com a base per al disseny d'una quimioteca de 56 pèptids. Dels resultats obtinguts s'ha sintetitzat una segona quimioteca basada en l'estructura general c(X1-X2-X3-X4-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Gln) determinada com la que posseix el millor perfil d'activitat. Els pèptids més efectius obtinguts constituixen els primers exemples de pèptids cíclics actius contra E. amylovora i poden ser considerats com a bons candidats pel desenvolupament d'agents antimicrobians efectius en protecció vegetal. / This PhD thesis was centred on the study of the application of de novo designed head-to-tail cationic cyclic peptides as inhibitors of the plant pathogenic microorganisms responsible for diseases in plants of great economic importance.The solid-phase synthesis of the cyclopeptides was carried out using a three-dimensional orthogonal Fmoc/tBut/Allyl strategy. The optimisation study of the allyl group removal and of the head-to-tail cyclization of linear peptides on SynPhase Lanterns was required for the syntheses. From the synthesized cyclic peptides of 4 to 10 residues, the cyclodecapeptide c(Lys-Leu-Lys-Leu-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Gln) was the most active and has been used as parent peptide in a using a combinatorial chemistry approach. From the results, a second library based on the structure c(X1-X2-X3-X4-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Gln) has been synthesized. The best cyclodecapeptides are the first examples of cyclic peptides effective against E. amylovora and make them potential candidates for the development of antimicrobial agents for use in plant protection.

[ES] Las plantas de vid (Vitis vinifera L.) están expuestas a una gran variedad de patógenos. En la actualidad, las enfermedades fúngicas de la madera de la vid (GTDs) se encuentran entre los principales factores que limitan la productividad de este cultivo. Una vez las vides están infectadas, la productividad de la planta disminuye, provocando una muerte lenta o apoplética. La investigación de agentes de control biológico (BCAs) capaces de prevenir, o al menos minimizar, el impacto de las GTDs, se considera una prioridad de investigación. En esta Tesis Doctoral se caracterizó un agente de biocontrol potencial y, junto con un producto comercial biológico ya registrado, fueron probados contra varios patógenos agentes causales de GTDs, en invernadero bajo condiciones controladas, y también durante el proceso de propagación de la vid en vivero. Los resultados del análisis genómico completo de Bacillus subtilis PTA-271 muestran un sistema funcional de motilidad de enjambre, una fuerte capacidad de supervivencia y un conjunto de genes que codifican sustancias bioactivas conocidas por estimular el crecimiento o las defensas de las plantas, influir en la microbiota beneficiosa y contrarrestar la agresividad de los patógenos. Cuando Bs PTA-271 se probó contra Neofusicoccum parvum BT67 en plantas injertadas de invernadero, Bs PTA-271 y Ta SC1 demostraron que el cultivar contribuye a los efectos beneficiosos de Bs PTA-271 y Ta SC1 contra Np-Bt67. La aplicación simultánea de ambos BCAs demostró ser beneficiosa contra este patógeno en vides del cultivar Tempranillo. El análisis transcriptómico de las mismas muestras mostró ampliamente los cambios en la fisiología de la planta inducidos tanto por Bs PTA-271 como por Ta SC1 para proteger la vid ante la infección por Np-Bt67. En Chardonnay, las plantas infectadas con Np-Bt67 presentan genes sobreexpresados que están implicados en las vías de señalización del acido absicico (ABA). En Tempranillo, la infección con Np-Bt67 provoca cambios de expresión en más de 200 genes, relacionados sobre todo con la importación de aminoácidos, procesos relacionados con el cloroplasto y el fotosistema, respuestas de la planta a estímulos bióticos y biosíntesis de metabolitos secundarios. La protección de Ta SC1 en las plantas de Tempranilllo implica un mayor número de cambios, que abarcan tanto el metabolismo primario como el secundario, relacionados con cambios en las señales hormonales, como con el aicdo absicico (ABA). Durante el proceso de producción de la vid en vivero, los resultados demostraron una reducción significativa del porcentaje de plantas infectadas con los patógenos asociados a las enfermedades de decaimiento por Botryosphaeria y Pie negro en el material de vivero tratado con Ta SC1 y Bs PTA-271 respectivamente. Los tratamientos simultáneos con ambos BCAs presentaron una reducción en el porcentaje de plantas infectadas con ambos tipos de patógenos. Al probar el efecto de Bs PTA-271 y Ta SC1 en el microbioma de la rizosfera de la vid de dos suelos diferentes infectados con patógenos del pie negro, los resultados muestran que la inoculación de los BCAs parece mejorar las redes del microbioma de la rizosfera y el estado de saneamiento, sin embargo, el efecto beneficioso de los BCAs puede ser dependiente del suelo. En general, este estudio aportó nuevos conocimientos sobre el uso de uno o más BCAs contra varios patógenos asociados a las GTDs, tanto en el vivero como en vides adultas (viñedo). Además, se destacó el modo de acción de ambos BCAs en la protección de la vid. Por lo tanto, estos hallazgos proporcionan, no sólo una mejor comprensión de las interacciones entre los BCAs, la vid y los patógenos, sino que también son una fuerte contribución a una estrategia de gestión sostenible de las GTDs. / [CA] Les plantes de vinya (Vitis vinifera L.) estan exposades a una gran varietat de patògens. En l'actualitat, les malalties fúngiques de la fusta de la vinya (GTDs) es troben entre els principals factors que limiten la productivitat d'aquest cultiu. Una vegada les vinyes estan infectades, la productivitat de la planta disminueix, provocant una mort lenta o apoplética. La investigació d'agents de control biològic (BCAs) capaços de previndre, o almenys minimitzar, l'impacte de les GTDs, es considera una prioritat d'investigació. En aquesta Tesi Doctoral es va caracteritzar en profunditat un agent de biocontrol potencial i, juntament amb un producte comercial biològic ja registrat, tots dos BCAs van ser provats contra diversos patògens agents causals de GTDs, en hivernacle sota condicions controlades, i també durant el procés de propagació de la vinya en viver. Els resultats de l'anàlisi genòmica completa de Bs PTA-271 mostren un sistema funcional de motilitat d'eixam, una forta capacitat de supervivència i un conjunt de gens que codifiquen substàncies bioactivas conegudes per estimular el creixement o les defenses de les plantes, influir en la microbiota beneficiosa i contrarestar l'agressivitat dels patògens. Quan Bs PTA-271 es va provar contra Np BT67 en plantes empeltades d'hivernacle, Bs PTA-271 i Ta SC1 van demostrar que la cultivar contribueix als efectes beneficiosos de Bs PTA-271 i Ta SC1 contra Np-Bt67. L'aplicació simultània de tots dos BCAs va demostrar ser beneficiosa contra aquest patogen en vinyes del cultivar Ull de llebre. L'anàlisi transcriptómico de les mateixes mostres va mostrar àmpliament els canvis en la fisiologia de la planta induïts tant per Bs PTA-271 com per Ta SC1 per a protegir la vinya davant la infecció per Np-Bt67. En Chardonnay, les plantes infectades amb Np-Bt67 presenten gens sobreexpresados que estan implicats en les vies de senyalització de l'acidifique absicico (ABA). En Ull de llebre, la infecció amb Np-Bt67 provoca canvis d'expressió en més de 200 gens, relacionats sobretot amb la importació d'aminoàcids, processos relacionats amb el cloroplast i el fotosistema, respostes de la planta a estímuls biòtics i biosíntesis de metabòlits secundaris. La protecció de Bs PTA-271 en Chardonnay implica gens relacionats amb la biosíntesi d'ABA, les vies dels fenilpropanoides, els metabòlits secundaris, i l'estructura i organització de la paret cellular. La protecció de Ta SC1 en les plantes de Tempranilllo implica un major nombre de canvis, que abasten tant el metabolisme primari com el secundari, relacionats amb canvis en els senyals hormonals, com amb l'acid abcísic (ABA). Durant el procés de producció de la vinya en viver, els resultats van demostrar una reducció significativa del percentatge de plantes infectades amb els patògens associats a les malalties de decaïment per Botryosphaeria i Peu negre en el material de viver tractat amb Ta SC1 i Bs PTA-271 respectivament. Els tractaments simultanis amb tots dos BCAs van presentar una reducció en el percentatge de plantes infectades amb tots dos tipus de patògens. En provar l'efecte de Bs PTA-271 i Ta SC1 en el microbioma de la rizosfera de la vinya de dos sòls diferents infectats amb patògens del Peu negre, els resultats mostren que la inoculació dels BCAs sembla millorar les xarxes del microbioma de la rizosfera i l'estat de sanejament, no obstant això, l'efecte beneficiós dels BCAs pot ser dependent del sòl. En general, aquest estudi va aportar nous coneixements sobre l'ús d'un o més BCAs contra diversos patògens associats a les GTDs, tant en el viver com en vinyes adultes. A més, es va destacar la manera d'acció de tots dos BCAs en la protecció de la vinya. Per tant, aquestes troballes proporcionen, no sols una millor comprensió de les interaccions entre els BCAs, la vinya i els patògens, sinó que també són una forta contribució a una estratègia de gestió sostenible de les GTDs. / [EN] Grapevine (Vitis vinifera L.) plants are exposed to a wide variety of pathogens. Nowadays, grapevine fungal trunk diseases (GTDs) are amongst the main constraints for the productivity of this crop. Once infected, plant productivity is decreased, leading to a plant slow or apoplectic death. Investigation of biocontrol agents (BCAs) capable to forestall or at least to minimize the impact of GTDs, while being a sustainable treatment, is viewed as a research priority. One potential BCA was deeply characterized, and together with a biological commercial product, both BCAs were tested against several GTD pathogens, in greenhouse under controlled conditions, and during the grapevine propagation process. Results from the full genomic analysis of Bacillus subtilis PTA-271 (as BCA with a potential) show a functional swarming motility system, strong survival capacities and a set of genes encoding for bioactive substances known to stimulate plant growth or defenses, influence beneficial microbiota, and counteract pathogen aggressiveness. When tested against Neofusicoccum parvum Bt67 (thereafter Np-Bt67) in greenhouse cuttings, B. subtilis PTA-271 (Bs PTA-271) and T. atroviride SC1 (Ta SC1) proved that the cultivar contributes to their beneficial effects against Np-Bt67. The simultaneous application of both BCAs was further proved to be even more effective to protect Tempranillo cuttings. Moreover, the transcriptomic analysis from the same samples showed extensively the plant physiology changes induced by the pathogen but also by each BCA, Bs PTA-271 on Chardonnay and Ta SC1 on Tempranillo, to protect grapevine from Np-Bt67 infection. Thus, Chardonnay cuttings infected with Np-Bt67 showed overexpressed genes implicated on abscisic acid (ABA) biosynthesis and signaling pathways. In Tempranillo, the infection with Np-Bt67 leads to more substantial changes in gene expression, related mostly with amino acid import, chloroplast and photosystem related processes, plant responses to biotic stimulus, and biosynthesis of secondary metabolites. Protection induced by Bs PTA-271 in Chardonnay targets genes related to ABA biosynthesis, phenylpropanoid pathways and secondary metabolites, and cell wall structure/organization in relationship with carbohydrate metabolism that requires much more consideration. Protection with Ta SC1 in Tempranilllo requires a larger number of changes related to transporters, cell wall integrity and extension, cell division and pathogen induced cell death, multidirectional active proteins, and microbiome interactions. During the grapevine nursery process, the results demonstrated a significant reduction on the percentage of infected plants with Botryosphaeria dieback and Black-foot pathogens in the material treated with Ta SC1 and Bs PTA-271 respectively. The simultaneous treatments with both BCAs presented a reduction on infected plants with both Botryosphaeria dieback and Black foot pathogens. When testing the effect of Bs PTA- 271 and Ta SC1 in grapevine rhizosphere microbiome of two different soil infected with Black foot pathogens, results show that the inoculation of BCAs seems to improve the rhizosphere microbiome networks and sanitation status, however, the beneficial effect of BCAs can be soil-dependent. Moreover, as observed in the other experiments, the combination of both BCAs improves their beneficial effect in the rhizosphere microbiome. Overall, this study brought new insights on the use of one or more BCAs against several GTD pathogens, from nursery to adult grapevines. Moreover, highlighted both BCAs mode of action in grapevine protection. Thus, these findings provide, not only a better understanding of BCAs, grapevine, and pathogens interactions, but are also a strong contribution for the future development of sustainable GTDs management strategies. / Cunha Maia Leal, CD. (2022). Sustainable Management of Grapevine Trunk Diseases in Vineyard: Deliver Biocontrol Agents and Associated Molecules [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/191261