TESIS DOCTORAL"Streptococcus pneumoniae", también llamado neumococo, es una bacteria Gram positiva caracterizada por la severidad de las infecciones que produce en la especie humana, siendo responsable de una elevada morbilidad y letalidad, especialmente en niños y ancianos, colectivos particularmente sensibles a sus consecuencias. La emergencia de cepas de S. pneumoniae resistentes a antibióticos como la penicilina y otros beta-lactámicos, comúnmente utilizados en el tratamiento de las infecciones neumocócicas, ha llevado a la utilización de nuevos agentes antimicrobianos como las fluoroquinolonas. Sin embargo, su extensa utilización y el uso prolongado y en ocasiones inadecuado de esta clase de antibióticos ha desencadenado el rápido desarrollo y selección de bacterias resistentes. La ciprofloxacina proporciona un marcador valioso de evaluación de la actual y potencial emergencia de la resistencia a fluoroquinolonas en esta especie, por ser la fluoroquinolona más utilizada en las últimas dos décadas y la que ha ejercido una mayor presión de selección en S. pneumoniae. Uno de los objetivos iniciales de este trabajo fue el de poner de manifiesto el posible papel de otros estreptococos orales en la eventual transferencia de genes de resistencia a quinolonas en "S. pneumoniae". Concretamente, los experimentos de transformación de la cepa de "S. pneumoniae" R6 con DNA procedente de cepas de estreptococos del grupo "viridans" resistentes a ciprofloxacina permitieron demostrar la posible transferencia génica horizontal de la resistencia a fluoroquinolonas entre cepas de estreptococos.El siguiente objetivo fue el estudio de los mecanismos implicados en la resistencia a fluoroquinolonas en cepas clínicas de "S. pneumoniae". En esta bacteria se han descrito dos posibles mecanismos de resistencia a las fluoroquinolonas: alteraciones en las dianas de esta clase de antibióticos y una disminución de la acumulación intracelular debida a la sobreexpresión de la bomba de reflujo PmrA.Los mecanismos de resistencia a ciprofloxacina en las cepas clínicas de "S. pneumoniae" estudiadas fueron debidos, principalmente, a mutaciones en las dianas de las fluoroquinolonas parC, parE y gyrA. Los niveles bajos de resistencia se debieron a mutaciones en el gen parC, mientras que se detectaron niveles de resistencia más elevados en aquellas cepas que presentaron mutaciones en parC y gyrA. Por otro lado, dos de las cepas de "S. pneumoniae" estudiadas presentaron una concentración mínima inhibitoria de ciprofloxacina considerable pero su resistencia no respondió a mutaciones en las dianas de las fluoroquinolonas. En estas dos cepas se estudió la posible implicación de un mecanismo de reflujo en su destacada resistencia, mediante la determinación de las concentraciones mínimas inhibitorias de distintos compuestos así como realizando ensayos de inhibición del crecimiento y fluorimétricos, en presencia y ausencia de un inhibidor de los sistemas de reflujo, la reserpina. Estos ensayos indicaron la posible implicación de un mecanismo de reflujo en la resistencia de dichas cepas a ciprofloxacina, que podría deberse a la acción de la bomba PmrA La inactivación del gen pmrA en transformantes de reflujo de R6, obtenidos con DNA de estas dos cepas, indicó que la bomba PmrA no estaba implicada en la resistencia a ciprofloxacina, sugiriendo la presencia de otra bomba de reflujo distinta de PmrA en "S. pneumoniae", también inhibible por reserpina.El análisis comparativo de secuencias BLAST entre el genoma de R6 y distintas proteínas de reflujo descritas en otras bacterias Gram positivas evidenciaron la posible existencia de al menos otra bomba de reflujo no descrita hasta el momento en "S. pneumoniae". Analizados los dos mecanismos principales de resistencia, se aplicó una metodología basada en la técnica de "microarrays", que mostró el potencial de esta valiosa herramienta en la determinación de nuevos genes involucrados en la resistencia a fluoroquinolonas en "S. pneumoniae".