En el presente estudio se evaluó la equivalencia in Vitro entre dos formulaciones que contienen el principio activo ciclosporina, Sandimmun Neoral® (producto de referencia) y Supramunn® (producto en estudio), mediante la comparación de los perfiles de disolución a tres pHs diferentes (1.2; 4.5 y 6.8), tomando como referencia la metodología establecida en la Farmacopea de los Estados Unidos (USP 32), así como los parámetros establecidos por la FDA (Food and Drug Administration), OMS (Organización Mundial de la Salud) y EMA (European Medicine Agency). Los resultados obtenidos muestran una diferencia significativa en los porcentajes de disolución de las dos formulaciones de ciclosporina, lo cual evidencia que el producto de referencia y el producto en estudio tienen un comportamiento físico-químico diferente que puede deberse a cambios en la formulación y la solubilidad del producto. Finalmente, se concluye que el producto de referencia y el producto en estudio, no presentan una equivalencia in Vitro, lo que podría significar también un comportamiento in vivo diferente. Sin embargo, es necesaria la realización de un estudio de bioequivalencia y la determinación de la correlación in Vivo – in Vitro a fin de establecer el grado de intercambiabilidad entre ambos productos. Palabras Clave: ciclosporina; equivalencia in Vitro; perfil de disolución, bioequivalencia, intercambiabilidad. / In the current study, the in vitro equivalence of two formulations that contain the active ingredient cyclosporine, Sandimmun Neoral® (reference product) and Supramunn® (test product), was evaluated through the comparison of the dissolution profiles at three different pHs (1.2; 4.5 and 6.8) taking the United States Pharmacopoeia (USP 32) established methodology as reference as well as the parameters from the FDA (Food and Drug Administration), WHO (World Health Organization) and EMA (European Medicine Agency). The obtained results show a significant difference in the dissolution percentages of the two cyclosporine formulations, which proves that the reference product and the test product have a different chemo-physical behavior that could be due to changes in the formulation and solubility of the product. Finally, the conclusion is that the reference product and the test product do not have an in vitro equivalence which could imply a different in vivo behavior as well. However, it is necessary to perform a bioequivalence study and to determine the in vivo – in vitro correlation hence to establish the degree of interchangeability among both products. Key words: cyclosporine, in vitro equivalence, dissolution profile, bioequivalence, interchangeability.

Orientador: Denise Vaz de Macedo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-23T04:31:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 El-Khatib_Soraya_M.pdf: 6333671 bytes, checksum: 5c4191d777bf9617a7ca7cd1502b61c7 (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: A natureza do Poro de Transição de Permeabilidade (PIP) existente em mitocôndrias isoladas tem sido estudada desde a década de 70 até os dias de hoje por diversos autores, sem ainda haver um concenso a respeito de sua composição molecular. Vários trabalhos formularam a hipótese de que o carreador ADP/ATP (AAC) poderia fazer parte da estrutura do PTP. Outros, mostraram que a abertura do PTP poderia ocorrer em situações de isquemia/reperfusão. Porém, na literatura, ainda não foi excluída a possibilidade de estar se estudando um artefato, pois estes trabalhos sempre se basearam no efeito de concentrações suprafisiológicas de Ca2+ (acima de 10 µM) ou seja, concentrações muito distantes das que poderiam ocorrer 'in vivo¿. Neste trabalho, procuramos verificar a ocorrência de abertura do PTP na presença de concentrações fisiopatológicas de Ca2+ (0-500 nM) em condições que simulassem 'in vitro' as conseqüências de um processo de isquemia/reperfusão para as mitocôndrias. Ainda nestas condições, tentamos verificar o envolvimento do AAC na formação do PTP. Para tanto, variamos diferentes parâmetros dos ensaios como: [Ca2+], tempo de pré-incubação na presença do íon e temperatura do meio de reação. A caracterização da abertura do PTP, sensível a ciclosporina A (CsA), foi feita através da medida da velocidade de consumo de O2 nos estados respiratórios 3 e 4 (V3 e V4 respectivamente) e controle respiratório (CR); formação de potencial elétrico de membrana (??), através da captação do cátion lipofílico TPP+ e inchamento mitocondrial. Para verificar como a abertura do PTP, nestas condições experimentais, influenciava a atividade do AAC realizamos uma titulação com CAT (carboxiatractilato) e extração e dosagem de nucleotídeos de adenina. Os resultados mostraram que nossas condições experimentais de baixas concentrações de Ca2+, foram suficientes para induzir abertura do PTP. Aparentemente a ação do Ca2+ é potencializada pelo aumento do período de pré-incubação das organelas com o íon, onde observamos uma diminuição em V3 e ligeiro estímulo em V4, levando à queda no CR; aumento na permeabilidade da membrana a H+ e inchamento mitocondrial de baixa amplitude. Embora muitos trabalhos na literatura tenham mostrado algumas destas interrelações, a originalidade do nosso trabalho está em mostrar, pela primeira vez, a ocorrência da abertura do PTP em condições fisiopatológicas. A diminuição em V3 sugere que nestas condições ocorreu uma inibição na atividade do AAC. Esta inibição poderia ocorrer ou devida a uma diminuição no conteúdo de AAC ativos, que poderia estar se mobilizando para fazer parte da estrutura do poro, ou devida à perda de nucleotídeos de adenina endógenos com a abertura do poro, essenciais para troca obrigatória que o carreador catalisa. Nossos dados mostraram que o período de pré-incubação com concentrações fisiopatológicas de Ca2+, foi suficiente para induzir despolarização da membrana e perda de nucleotídeos de adenina do interior das organelas, sugerindo um envolvimento do AAC com a abertura do PTP nos seus estágios iniciais / Abstract: Although the mitochondrial permeability transition pore (PTP) has been studied since the late 70s, there is no precise knuoledge about its molecular structure. Ischemia and reperfusion process has been pointed as one of the conditions that might trigger the PTP opening and some authors suggest that the ADP/ATP carrier (AAC) is one of the proteins involved in the pore structure. This process is Ca2+- dependent and, due to the high Ca2+ concentrations (above 10 µM) used throughout the literature, the possibility of the PTP be na artifact and not occur 'in vivo', under physiological conditions, could not be excluded. Here we have studied the occurrence of the PTP in the presence of Ca2+ concentration (0-500 nM), under conditions where na ischemia/reperfusion process was simulated and the involviment of the AAC was analysed. The mitochondria were incubated at Ca2+ concentrations, preincubation times in the presence of Ca2+ and at different temperatures. The CsA-sensitive PTP opening was studied through the determination of O2 consumption under respiratory States 3 and 4 (V3 and V4 respectively) and of the respiratory control (RC= v3/v4); through the generation of membrane electrical potential (??), using the uptake of the lipophilic cation TPP+ and also trough the mitochondrial swelling. Under the same conditions the involvement of the AAC was analysed by a titration with carboxyatractilate (CAT) and extration followed by the determination of adenine nucleotide release. Our results showed that these experimental concentrations were enough to open the PTP. It seems that the Ca2+ effect is potencialized by na increase on the mitochondria preincubation time in the presence of the ion, without addition of exogenous respiratory substrates. A decrease in V3 and a slight increase in V4 was observed, leading to a decrease in RC. There was also an increased permeability to H+ and a small amplitude mitochondrial swelling. Although most of these effects have already been reported in the literature, the originality of ours results is to show, for the first time, the PTP occurrence under phisiopathological Ca2+ concentrations. The observed decrease in V3 suggests a possible inhinition of the AAC activity. This could be explained either through a decrease of active carriers beeing mobilized to form PTP or due to endogenous adenine nucleotides loss, which are needed to the exchange the carrier catalyses. Our data show that preincubation under physiopathological concentrations was sufficient to induce a membrane despolarization and loss of internal adenine nucleotides, suggesting the involviment of the AAC at the very beginning of PTP generation / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Edgard Graner / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-26T10:19:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bolzani_Glaucia_M.pdf: 3179083 bytes, checksum: 274f319bc587a077d6785bd696b3bc19 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: A ciclosporina-A (CSA) é uma droga imunossupressora, seletiva para linfócitos T, muito usada atualmente na prevenção da rejeição de transplantes de órgãos e de medula óssea. Dentre os efeitos colaterais da CSA está o aumento gengival, caracterizado principalmente por um acúmulo excessivo de matriz extracelular. Como o mecanismo através do qual a CSA atua na regulação da síntese e degradação de matriz extracelular ainda não é conhecido, o objetivo do presente trabalho foi estudar seu efeito sobre a produção das metaloproteinases de matriz (MMPs) e do colágeno tipo I por fibroblastos gengivais, através de eletroforese em SDS - PAGE, zimografia e western blots. Para isto, ratos foram tratados diariamente com 10mg/kg de peso corporal de CSA por, via subcutânea durante 30 e 60 dias, sendo que todos os animais tratados desenvolveram aumento gengiva!. A atividade gelatinolítica dos meios de cultura condicionados com os fragmentos de tecido gengival foi menor nos animais tratados com CSA que nos grupos controle. A atividade enzimática também foi inibida no meio de cultura condicionado por fibroblastos tratados com CSA. A análise através de western blots demonstrou que a produção de colagenase de fibroblastos (MMP-1 ) e de estromelisina-1 (MMP-3) por 7 diferentes linhagens de fibroblastos gengivais humanos em cultura também foi significativamente reduzida pela ação da CSA. Com relação ao colágeno tipo I, foi detectada uma maior quantidade desta glicoproteína na matriz extracelular da gengiva dos ratos tratados com CSA, em comparação com os controles, assim como em culturas primárias de fibroblastos gengivais tratados com esta droga / Abstract: Cyclosporin A (CyA) is an immunossupressant drug used to prevent rejection of allograft transplants and in the management of various autoimmune diseases that acts blocking interleukin-2 synthesis by CD4+lymphocytes. The gingival overgrowth affecting the attached gingiva of 25-80% of the treated patients, is a frequent side effect of CyA treatment in the oral cavity. The aim of the present work was to evaluate the effect of CyA on matrix metalloproteinases (MMPs) synthesis and activity as well as type I collagen production by gingival fibroblasts. Wistar rats were treated daily with 10mg/kg of body weight of CyA during 30 and 60 days to induce gingival overgrowth. After these periods, the gingival tissue was removed and used to study MMPs activity in zymographic assays as well as type I collagen deposition by SDS-PAGE. Primary cultures of fibroblasts from rats and 7 different clinically healthy human gingiva were established and used to analyze secretion and activity of MMPs in the culture medium. The cells were treated with different concentrations of CyA and analised by zymographic assays and western blots. The gelatinolytic activity of MMP-2 was strongly reduced by CyA treatment, both "in vivo" and in cell culture. In addition, the relative amounts of MMP-1 and MMP-3 in the culture medium was significanty reduced by CyA treatment and the amount of type I collagen in the hyperplastic rat gingival tissue was higher than in control animais. Our data clearly showed that CyA strongly reduces the activity and production of MMPs by gingival fibroblasts, probably leading to the accumulation of type I collagen and other macromolecules in the gingival connective tissue / Mestrado / Mestre em Biologia e Patologia Buco-Dental

Orientador: Gilberto de Nucci / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T03:29:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mendes_GustavoDuarte_M.pdf: 15864596 bytes, checksum: 09970d46e36b10883e44d62f84b26e12 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: O objetivo deste estudo foi comparar a biodisponibilidade de duas formulações (Sigmasporin Microoral® da Novaquímica Divisão Nature's Plus, Brasil, formulação teste e Sandimmun Neoral® da Novartis Biociências S.A, Brasil, como formulação referência) de cápsula de ciclosporina em 24 voluntários sadios do sexo masculino. O estudo foi conduzido aberto, aleatorizado, dois períodos com intervalo de uma semana entre as doses. Amostras de sangue total foram obtidas em intervalos de até 12 horas após administração de cada cápsula de ciclosporina. As concentrações sanguíneos de ciclosporina foram quantificadas por Imunoensaio de Fluorescência Polarizada (FPIA) produzidos por Abbott e por radioimunoesnaio (RIA) produzidos por DiaSorin. Utilizando estes testes obtivemos as curvas de concentrações sanguíneos de ciclosporina e os parâmetros farmacocinéticos (ASC último, ASCinf, Cmax). A média geométrica e os intervalos de confiança de 90% para Microoral®/Neoral® foram94.5% (90.8-98.4%) para ASC último,93.8 % (89.7-98.1%) para ASC inf e 98.1% (94.5-101.8%) para Cmax no FPIA e foram 96.1% (91.9-100.6%) para ASC último,95.2 % (90.2-100.5%) para ASC inf, and 99.4% (96.4-102.4%) para Cmax no RIA. Considerando que os intervalos de 90% para as razões geométricas de Cmax, ASC último e ASC inf estão dentro dos intervalos estabelecidos pela Food and Drug Administration (80-125%), conclui-se que a formulação de cápsula de 100 mg de ciclosporina elaborada pelos laboratórios Nature's Plus Farmacêutica Ltda/Sigma Pharma é bioequivalente à cápsula de 100 mg de ciclosporina (Sandimmun Neoral® elaborada pelos Laboratórios Novartis Biociências S.A, tanto para a taxa como para extensão da absorção / Abstract: Objective: the aim of study was to compare the bioavailability of two cyclosprine capsule formulations (100 mg; SigmasporinMicrooral® from NovaquímicaDivisão Nature's Plus Farmaceutica Ltd., Brazil, as test formulation and Sandimmun Neoral® from Novartis Biociências S.A., Brazil, as reference formulation) in 24 healthy male volunteers. Methods: The study was conducted in an open, randomized, two-period crossover fashion with an one-week washout interval between doses. Blood samples were obtained over a 12-hour interval after each cyclosporine oral administration (2 capsules of 100 mg of each formulation). Cyclosporine blood concentrations were quantified by a Fluorescence Polarization Immunoassay (FPIA) System provided by Abbott Axsym® System and by Cyclo- Trac® SP - Whole Blood Radioimmuoassay (RIA) kit provided by DiaSorin®.Using these assays we obtained the time curves of cyclosporin blood concentration and the following pharmacokinetic parameters were also evaluated: AUClast, AUCinf, Cmax. Results: geometric mean and 90% confidence intervals (CI) of Microoral® /Neoral@percent ratio were 94.5% (90.8-98.4%) for AUC last, 93.8% (89.7-98.1%) for AUCinf,and 98.1% (94.5-101.8%) for Cmax asdetermined by using FPIA and were 96.1% (91.9-100.6%) for AUClast,95.2 % (90.2-100.5%) for AUCinf, and 99.4% (96.4-102.4%) for Cmaxas determined by using RIA. Conclusion: since the 90% CI for Cmax,AUClastand AUCinf ratio were within the 80-125% interval proposed by US-FDA, it is concluded that Sigmasporin Microoral@100 mg capsule formulation is bioequivalent to Sandimmun Neoral®100 mg capsule formulation for both the rate and the extent of absorption / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Farmacologia

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Ciclosporina (CsA) es un fármaco inmunosupresor utilizado para prevenir el rechazo de órganos en pacientes trasplantados. Sin embargo, esta droga se caracteriza por poseer un rango terapéutico estrecho y una alta variación farmacocinética inter- e intra-individual por lo cual se recomienda monitorear este medicamento constantemente para prevenir efectos adversos. Por lo tanto, entender la variabilidad farmacocinética de CsA es de crucial importancia para maximizar los resultados clínicos de los pacientes trasplantados de órganos. En este estudio se investigaron variantes genéticas involucradas en la metabolización y transporte de CsA que pueden afectar la farmacocinética de este fármaco. Para esto, pacientes trasplantados renales fueron genotipificados para CYP3A4*1B, CYP3A5*3, MDR1 3435 C>T y MDR1 2677 G>T/A mediante PCR-RFLP. Los genotipos obtenidos fueron relacionados con efectos adversos, episodios de rechazo y concentraciones C2 ajustadas de CsA. También se estudió la influencia de estos genotipos en la dosis administrada diaria de CsA y los niveles de creatinina. Los resultados mostraron una asociación entre el polimorfismo CYP3A5*3 y las concentraciones C2 ajustadas en los primeros días del tratamiento. Sin embargo, con el resto de los polimorfismos no se observaron asociaciones estadísticas significativas. Similarmente, al evaluar la influencia de los genotipos en la dosis diaria de CsA, sólo CYP3A5*3 demostró asociación. En cuanto a los episodios de rechazo se encontraron asociaciones en el gen MDR1, en el cual la variante alélica corresponde a un factor de riesgo ante estos episodios. Para los análisis de los efectos adversos y creatinina, no se encontraron asociaciones para ningún polimorfismo. En conclusión, en este estudio se encontró que posiblemente el polimorfismo CYP3A5*3 estaría relacionado a la respuesta farmacocinética de CsA, y el gen MDR1 estaría ligado al rechazo del órgano. Mientras tanto, como proyección se propone investigar polimorfismos adicionales que puedan clarificar el aporte de los otros genes. Además, aumentar el número de pacientes e incluir factores no genéticos y/o epigenéticos nos entregaría una respuesta más completa a la variabilidad farmacocinética de este inmunosupresor / Cyclosporine (CsA) is an immunosuppressive drug used to prevent allograft rejection. However, it is characterized by a narrow therapeutic index and high inter and intra individual pharmacokinetics variations. Thus, monitoring of this drug is highly recommended in order to prevent adverse effects. Therefore, understanding the pharmacokinetic variations of CsA is a crucial to maximize clinical outcomes in transplanted patients. In this study we investigated genetics variants involved in the metabolism and transport of CsA which could affect the pharmacokinetics of the drug. For this purpose, renal transplanted patients were genotyped for CYP3A4*1B, CYP3A5*3, MDR1 3435 C>T and MDR1 2677 G>T/A genes through PCR-RFLP. Afterwards, genotypes were correlated with adverse effects, rejection episodes and dose-adjusted C2 CsA levels in order to establish potential associations. Also, was studied the influence of this genotypes on the daily dose of CsA and creatinine levels. The results showed statistical association between CYP3A5*3 polymorphism and doseadjusted C2 CsA levels at the first post-transplant days, whereas no association were observed for CYP3A4*1B, MDR1 3435 C>T and MDR1 2677 G>T/A. Similarly, only CYP3A5*3 showed association with daily dose of CsA. Regarding to rejection episodes, the allelic variant of MDR1 gen was observed as a risk factor. On the other hand, when adverse effects and creatinine levels were analyzed no correlations were observed for any polymorphisms. In conclusion, in this study was found that CYP3A5*3 is possibly associated to CsA pharmacokinetics variation and MDR1 gen is related to rejection episodes. However, it is proposed to investigate additional polymorphisms which could clarify the contribution of other genes besides CYP3A5. Additionally, the number of patients needs to be increased to have higher statistical power. Finally, non- genetic and/or epigenetic factors must be incorporated to the study in order to have a more complete response on the variability of CsA

En el presente estudio se evaluó la equivalencia in Vitro entre dos formulaciones que contienen el principio activo ciclosporina, Sandimmun Neoral® (producto de referencia) y Supramunn® (producto en estudio), mediante la comparación de los perfiles de disolución a tres pHs diferentes (1.2; 4.5 y 6.8), tomando como referencia la metodología establecida en la Farmacopea de los Estados Unidos (USP 32), así como los parámetros establecidos por la FDA (Food and Drug Administration), OMS (Organización Mundial de la Salud) y EMA (European Medicine Agency). Los resultados obtenidos muestran una diferencia significativa en los porcentajes de disolución de las dos formulaciones de ciclosporina, lo cual evidencia que el producto de referencia y el producto en estudio tienen un comportamiento físico-químico diferente que puede deberse a cambios en la formulación y la solubilidad del producto. Finalmente, se concluye que el producto de referencia y el producto en estudio, no presentan una equivalencia in Vitro, lo que podría significar también un comportamiento in vivo diferente. Sin embargo, es necesaria la realización de un estudio de bioequivalencia y la determinación de la correlación in Vivo – in Vitro a fin de establecer el grado de intercambiabilidad entre ambos productos. -- Palabras Clave: ciclosporina; equivalencia in Vitro; perfil de disolución, bioequivalencia, intercambiabilidad. / -- In the current study, the in vitro equivalence of two formulations that contain the active ingredient cyclosporine, Sandimmun Neoral® (reference product) and Supramunn® (test product), was evaluated through the comparison of the dissolution profiles at three different pHs (1.2; 4.5 and 6.8) taking the United States Pharmacopoeia (USP 32) established methodology as reference as well as the parameters from the FDA (Food and Drug Administration), WHO (World Health Organization) and EMA (European Medicine Agency). The obtained results show a significant difference in the dissolution percentages of the two cyclosporine formulations, which proves that the reference product and the test product have a different chemo-physical behavior that could be due to changes in the formulation and solubility of the product. Finally, the conclusion is that the reference product and the test product do not have an in vitro equivalence which could imply a different in vivo behavior as well. However, it is necessary to perform a bioequivalence study and to determine the in vivo – in vitro correlation hence to establish the degree of interchangeability among both products. -- Key words: cyclosporine, in vitro equivalence, dissolution profile, bioequivalence, interchangeability. / Tesis

FÉLIX, Francisco Hélder Cavalcante. Modelo de implante de tumor de Walker no cérebro de ratos. 2001. 177 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2001. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-03-27T13:08:04Z No. of bitstreams: 1 2001_dis_fhcfelix.pdf: 4918370 bytes, checksum: 720386029513bd002287f139bb860805 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-03-27T15:59:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2001_dis_fhcfelix.pdf: 4918370 bytes, checksum: 720386029513bd002287f139bb860805 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-27T15:59:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2001_dis_fhcfelix.pdf: 4918370 bytes, checksum: 720386029513bd002287f139bb860805 (MD5) Previous issue date: 2001 / The disabling effects of central nervous system (CNS) tumors are out of proportion to their low incidence. They’re second only to stroke as neurologic mortality causes. Brain metastases are the commonest intracranial tumors in adults, almost 10 times more frequent than primary brain tumors. Their diagnosis and treatment have met significant advances, although much more research about drug resistance and new treatment modalities are needed. New and even better brain tumor animal models will help to evaluate novel drug regimens and adjuvant therapies for CNS neoplasms. In the present work, the author presents a simple and easily reproducible brain tumor model utilizing the tumor cell line W256 transplanted to Wistar rats. They tested a drug widely used for palliative treatment of tumoral brain edema (dexamethasone), for survival impact. They also have tested the effects of a drug newly proposed as multidrug resistance reversal agent (cyclosporin – CS). Wistar albino rats had stereotaxic intracranial tumor inoculation after the surgical installation of a permanent canulla on the area of interest (right subfrontal caudate). The brain tumor model, as a model of metastatic brain disease, was successful, with reproducible tumor growth (95%), low incidence of extracranial tumor implantation (21% local, no distant metastasis) and few evidence of surgical site infection (21%). The median survival of the animals was 12.5 days (control), 13 days (CS vehicle treated), 11 days (CS treated), 9.5 and 9 days (dexamethasone 0.3 and 3.0 mg/kg/day). These differences were not significant, although the survival rates on the 12th day post-inoculation have showed a significant survival decrease for the case of dexamethasone 3,0 mg/kg/day (p < 0.05), but not for CS treatment (Fischer’s Exact Test). The estimated tumor volume was 17.08 ± 6.7 mm3 (control) and 12.61 ± 3.6 mm3 (CS treatment, not significant, Student’s t-test). The tumor volume in the 9th day post-inoculation was estimated in 67,25 ± 19,8 mm3. The doubling time was 24.25 h. This model behaved as an undifferentiated tumor, with local invasiveness features compared with that of primary brain tumors. It fits well, in this way, for the study of tumor cell migration on CNS parenchyma. Phenomena like neuronal degeneration, neuron cell edema and death, and gliosis, as well as perivascular cell infiltrates, were seen frequently. One could find, also, neoangiogenesis, satellite tumor growth, and tumor cell migration in normal brain parenchyma. Besides heavy parenchymatous infiltration, it was also disclosed markedly tumor cell migration along white matter tracts, such as callosal fibers and infiltration in the Virchow-Robins perivascular space. The model presents as a dual brain tumor and leptomeningeal carcinomatosis model. It could be used for the study and treatment test in the scenario of these two pathologies. The intracerebral tumor growth induced peripheral blood neutrophil count elevation (ANOVA, p < 0.01), higher chance for neutrophilia (Fischer’s Exact Test, p < 0.01), higher chance for lymphopenia (Fischer’s Exact Test, p < 0.01) and brain weight increase (Student’s t-test, p < 0.001) comparing to control. There was no significant change in any of the other hematologic, biochemical and biological parameters tested. CS treatment did not alter any of the tests, as compared to non-treated brain tumor animals. The only exception was the mean animal weight on the first week post-inoculation (ANOVA, p < 0.05). CS, in this way, was responsible for an early cachexia in the brain tumor inoculated animals. CS treatment of brain tumor animals did show non-significant effects indicating a volume (26%) and weight tumor decrease, and tumor infiltrating neutrophil increase (odds ratio - OR = 5.6). This indicates the necessity to further study morphologically and functionally the local inflammation in brain tumor inoculated animals, as well the effects of CS administration. In conclusion, the W256 intracerebral tumor model is simple, easily performed, reproducible and of great potential utility. In this model, tumor inoculation can lead to hematologic and biologic modifications in the experimental animals. CS could apparently lead to early tumor caquexia in this tumor model. However, CS treatment did not modify the survival chance of the brain tumor animals, in sharp contrast to dexamethasone 3.0mg/kg/day, a much-used drug in the treatment of brain tumors, which decreased the animal survival. / Os importantes efeitos incapacitantes dos tumores do sistema nervoso central (SNC) são desproporcionais a sua baixa incidência. Mesmo assim, entre as doenças neurológicas, ficam atrás apenas dos acidentes vasculares do SNC como causa de morte. Metástases cerebrais constituem os tumores intracranianos mais comuns do adulto, ocorrendo até 10 vezes mais freqüentemente que tumores primários. Avanços significativos ocorreram em seu diagnóstico e tratamento, embora mais pesquisa sobre os fenômenos que diminuem o efeito de drogas em metástases cerebrais e tratamentos eficazes para estas patologias sejam cada vez mais necessários. O desenvolvimento de melhores modelos animais de tumores do SNC será necessário para a avaliação in vivo de novas formas de quimioterapia (QT) e terapia adjuvante para tumores cerebrais. No presente trabalho, o autor objetivou desenvolver um modelo de tumor cerebral simples e de fácil reprodução utilizando a linhagem W256, além de testar o efeito na sobrevida animal de uma droga largamente usada para o tratamento de efeitos secundários a edema cerebral (dexametasona). O autor também testou uma droga envolvida numa nova proposta de reversão de multirresistência a drogas anti-neoplásicas em tumores cerebrais (ciclosporina – CS). Ratos albinos (Wistar) tiveram o tumor inoculado através de estereotaxia, após a instalação cirúrgica de uma cânula no ponto escolhido (caudato subfrontal direito). O modelo de tumor implantado no cérebro de ratos, simulando uma metástase cerebral, mostrou-se bem sucedido e reprodutível (95% de crescimento tumoral), com baixa incidência de disseminação tumoral extracraniana local (21%), baixa evidência de infecção local (21%), ausência de metástases à distância e ausência de sinais de infecção sistêmica. Os animais sobreviveram uma mediana de 12,5 dias (grupo controle), 13 dias (tratados com veículo da CS), 11 dias (tratados com CS), 9,5 e 9 dias (dexametasona 0,3 e 3,0 mg/kg/dia, respectivamente). As diferenças entre estas medianas não foram significantes (teste de Kruskal-Wallis), embora as diferenças entre as taxas de sobrevida no 12o dia após a inoculação tenham mostrado redução significante no grupo que recebeu dexametasona 3,0 mg/kg/dia (p < 0,05), mas não no grupo tratado com CS (teste de Fischer). O volume tumoral estimado (VTE) no sétimo dia pós-inoculação (7DPI) foi de 17,08 ± 6,7 mm3 no controle e 12,61± 3,6 mm3 após tratamento com CS, sem diferença significante (teste t-Student). O VTE no 9DPI de animais do grupo Tumor foi de 67,25 ± 19,8 mm3. O tempo de duplicação foi de 24,25 h. O modelo comportou-se como um tumor de características indiferenciadas, apresentando invasividade local comparada à de tumores primários do SNC, prestando-se ao estudo da migração de células tumorais no SNC. Observaram-se fenômenos como degeneração neuronal hidrópica, edema celular neuronal, sinais de morte celular neuronal e gliose, além da presença de infiltrados celulares tumorais e inflamatórios perivasculares. Observaram-se, também, neoformação vascular, formação de nódulos tumorais satélites ao tumor principal e migração celular tumoral no parênquima cerebral normal. Observou-se, além da infiltração parenquimatosa, marcante migração celular tumoral ao longo de tratos de substância branca (corpo caloso) e ao longo dos espaços perivasculares de Virchow-Robins. O modelo apresenta-se como um misto de tumor cerebral intraparenquimatoso e carcinomatose leptomeníngea, podendo ser utilizado para estudar o comportamento e testar formas de tratamento para ambas as patologias. O crescimento tumoral intracerebral induziu aumento do número de neutrófilos no sangue periférico (ANOVA, p < 0,01), maior chance de apresentar neutrofilia (teste de Fischer, p < 0,01), maior chance de apresentar linfopenia (teste de Fischer, p < 0,01) e aumento do peso dos cérebros dos animais experimentais (teste t-Student, p < 0,001) em relação ao controle. Nenhum dos outros valores hematológicos, bioquímicos e biológicos foi alterado de maneira significante. O tratamento de animais inoculados com tumor com a CS, não alterou nenhuma das medidas hematológicas, bioquímicas ou biológicas em relação aos animais inoculados com tumor e não tratados, exceto o peso dos animais na primeira semana após inoculação tumoral (ANOVA, p < 0,05). A CS, dessa forma, induziu significantemente uma caquexia precoce nos animais inoculados com tumor cerebral. O tratamento com CS de animais inoculados com tumor mostrou tendências não significantes a diminuir volume (26%) e massa (7%) tumorais e aumentar número de neutrófilos infiltrantes de tumor (razão de chance - RC = 5,6) e necrose tumoral, indicando a necessidade de posteriores estudos para caracterizar morfológica e funcionalmente a resposta inflamatória local em animais inoculados com tumor e a influência da CS neste processo, além do efeito da CS na angiogênese tumoral. Concluindo, o modelo de W256 intracerebral mostrou-se simples, de fácil execução, reprodutível e útil. Neste modelo, a inoculação tumoral induz modificações hematológicas e biológicas nos animais. A CS pareceu exarcebar a caquexia tumoral neste modelo. A CS, todavia, não alterou a chance de sobrevida de animais inoculados com tumor cerebral, ao contrário da dexametasona 3,0 mg/kg/dia, que reduziu esta chance. A CS, assim, parece ser mais segura neste modelo tumoral que uma droga largamente utilizada para tratamento de pacientes com metástase cerebral.

Orientador: Luís Carlos Spolidorio / Banca: Rosemary Adriana Chiérici Marcantonio / Banca: Cassiano Kuchenbecker Rosing / Resumo: A administração da CsA tem sido associada a osteopenia ou aumento na remodelação óssea. O objetivo do estudo foi avaliar o efeito da CsA no processo alveolar de ratos com doença periodontal induzida, por meio de análises sérica, estereométrica, histológica e histométrica. 24 ratos foram divididos em 4 grupos de 6 animais cada: Grupo 1: Controle; Grupo 2: ligadura ao redor do 1° molar inferior; Grupo 3: ligadura ao redor do 1° molar inferior e tratamento com CsA a 10mg/Kg de peso corporal/dia; Grupo 4: tratamento com CsA a 10mg/Kg de peso corporal/dia. Após 30 dias os animais foram sacrificados e os níveis séricos de cálcio e fosfatase alcalina foram mensurados. Após análise histológica, uma análise histométrica da junção cemento-esmalte até a crista óssea alveolar, da área de tecido ósseo e de reabsorção, mais espessura de cemento foi realizada conjuntamente com os parâmetros estereológicos: densidade volumétrica de osteoclastos multinucleados (Vo), osso alveolar (V-osso), medula (V-medula) e relação de superfície reabsorvida/superfície óssea (Sr/So) foram analisados na região mesial do osso alveolar. Diminuição significante foi observada no cálcio sérico nestes grupos que receberam terapia com CsA. Não foi observada mudança significante na fosfatase alcalina sérica. A terapia com CsA combinada com ligadura diminuiu o V-osso e aumentou o Vo, V-medula e Sr/So na superfície mesial dos primeiros molares inferiores, dados esses concordantes com a análise histométrica e comprovada pela leitura histológica. Além disso a espessura de cemento foi aumentada nos grupos tratados com CsA em relação aos não tratados. Entretanto, apesar da falta de efeitos diretos na altura do osso alveolar, a terapia com CsA intensifica o desequilíbrio da homeostasia do osso alveolar em ratos com doença periodontal induzida. / Abstract: The administration of CsA has been associated with significant bone loss and increased bone remodeling. The present investigation was designed to evaluate the effects of CsA on alveolar bone of rats subjected to experimental periodontitis, using serum, stereometric and histological analysis. 24 rats were divided in groups 6 animal each: 1-control; 2-rats with ligature around the lower 1st.molars; 3-rats with ligature around the lower 1st.molars and were treated with 10mg/kg body weight/day CsA; 4-rats were treated with 10mg/kg body weight/day CsA. At the end 30 days, rats were sacrificed and calcium and alkaline phosphatase levels were measured. After histological processing, the histomorfometric analysis of the distance cemento-enamel junction and alveolar bone crest, bone area, eroded bone area and cemento surface together with stereological parameters: volume densities of multinucleated osteoclasts(Vo), alveolar bone(V-bone), marrow(V-marrow), and relation of eroded surface/bone surface(Es/Bs) were assessed at the mesial region of the alveolar bone. Significant decreases in serum calcium were observed in groups with CsA therapy. No significant changes in serum alkaline phosphatase were observed. The CsA therapy combined with ligature placement decreased the V-bone and increased the Vo, V-marrow and Es/Bs at the mesial surface and the results at the histologic and histomorfometric analysis showed the same combination and changes. Significant increase on the cemento height were observed in the CsA therapy groups. Therefore, in spite of the lack of a direct effect on the alveolar bone height, the CsA therapy intensified the imbalance of the alveolar bone homeostasia in a rat model of experimental periodontitis. / Mestre

Orientador: Benedito de Oliveira Filho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T05:29:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Valente_RichardHemmi_M.pdf: 3746690 bytes, checksum: b9cf26d655ff09edd9111b030c9a6161 (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: A crotoxina, isolada e cristalizada em 1938 por Slotta e Fraenkel-Conrat a partir do veneno total de Crotalus durissus terrificus mostrou ser um complexo resultante da interação quaternária de duas sub-unidades representadas por uma proteína ácida com massa molecular de 9 kDa denominada crotapotina e um componente básico, com massa molecular de 14,5 kDa que foi identificado como sendo uma fosfolipase A2 (PLA2 ). Esta última é considerada o principal componente responsável pelo desencadeamento dos efeitos farmacológicos induzidos pelo complexo crotoxina. Estudos mais recentes demonstraram a ocorrência de várias isoformas de PLA2, presentes em diferentes lotes de veneno coletados de várias serpentes, sendo tais isoformas decorrentes da expressão de diferentes RNAs mensageiros. As PLA2 (EC 3.1.1.4.) são enzimas que catalisam especificamente a reação de hidrólise da ligação acil-ester na posição sn-2 de fosfoglicerídeos numa reação dependente de álcio, liberando quantidades equimolares de ácidos graxos livres e lisofosfolipídeos. Já foi demonstrado que trações puras de PLA2 apresentam efeitos inibitórios marcantes sobre várias funções mitocondriais, reduzindo as atividades da NADH oxidase, das succinato e NADH-desidrogenase e da capacidade de fosforilação. Além disso, as PLA2 podem modificar a microviscosidade da fase lipídica da bicamada hidrofóbica de membranas, afetando a atividade funcional de enzimas ligadas à membrana, e, através desse mecanismo, regular vários processos metabólicos. No presente trabalho purificamos e caracterizamos, a partir da crotoxina, três isoformas de PLA2 (F1, F2 e F3) com elevado grau de pureza. As isoformas apresentaram massa molecular aparente com valor igual a 15 kDa e alta homologia seqüencial dos 20 resíduos N-terminais em comparação a isoformas já descritas na literatura. o efeito de cada isoforma de PLA2 purificada sobre mitocôndrias isoladas de fígado de rato foi determinado através de consumo de oxigênio durante o estado respiratório 4 e de inchamento mitocondrial. FI apresentou um estímulo dose dependente do consumo de oxigênio enquanto F2 e F3 causaram estímulo apenas em baixas concentrações e inibição em quantidades maiores. Esses efeitos foram completamente abolidos quando soro albumina bovina a 0,1% ou EGTA a 0,5mM estavam presentes no meio de incubação. Usando-se o inchamento mitocondrial como um parâmetro comparativo, todas as isoformas apresentaram o mesmo comportamento com intensidades diferentes, levando à permeabilização da membrana mitocondrial. Neste caso, a adição de EGTA preveniu o inchamento enquanto a soro albumina bovina foi ineficiente, indicando que o microambiente lipídico foi realmente afetado. Esses resultados sugerem que ácidos graxos livres liberados pela ação das isoformas são diretamente responsáveis pelos efeitos observados nos experimentos de consumo de oxigênio. A proteção oferecida pela CSA contra o inchamento causado pelas isoformas, principalmente quando estas estavam presentes em baixas concentrações, sugere que a ligação da CSA a um sítio da membrana mitocondrial protege esta última contra o ataque das PLA2. Já a pequena proteção oferecida pelo CAT, bem como o prevalecimento do pequeno efeito protetor do CAT quando utilizamos simultaneamente CSA e CAT, sugerem que a ligação do CAT ao seu sítio no carreador ADP/ATP impede a proteção conferida pela CSA / Abstract: Crotoxin, isolated and cristalized in 1938 by Slotta and Fraenkel-Conrat from Crotalus durissus terrificus venom showed to be a complex resultant from the quaternary association between two sub-units: an acidic protein with a molecular mass of 9 kDa named crotapotin and a basic component, with a molecular mass of 14.5 kDa which was identified as a phospholipase A2 (PLA2). This last one is considered to be the main component responsible for the pharmacological effects induced by the crotoxin complex. Recent studies have demonstrated the existence of several PLA2 isoforms which were present in different venom batches collected from several snakes. These isoforms result from the expression of different menssager RNAs. The PLA2 (EC 3.1.1.4) are enzimes that specifically catalyse the hydrolysis of the acyl-ester bond at the sn-2 position of phosphoglycerides in a calcium dependent reaction, producing equimolar amounts of ftee fatty acids and Iysophospholipids. It has already been demonstrated that purified PLA2 fractions show marked inhibitory effects on several mitochondrial features, decreasing NADH-oxidase, succinate and NADH-dehydrogenase activities and phosphorylation capacity. It is also known that PLA2 can modify the microviscosity of the lipid phase of the hydrophobic membrane bilayer, affecting the functional activity of membrane-bound enzymes, and through this mechanism regulate various metabolic processes. In the present work, we have purified and characterized, from crotoxin, three PLA2 isoforms (F1, F2 and F3) with high degree of purity. The isoforms presented an apparent molecular mass of 15 kDa and a high degree of homology regarding the 20 N terminal aminoacid residues when compared to other isoforms already described in the literature. The effect of each purified phospholipase A2 isoform on isolated rat liver mitochondria was determined through mitochondrial swelling and Oz consumption during respiratory state 4. FI showed a dose-dependent stimulation of O2 consumption while F2 and F3 caused stimulation only at low doses and inhibition at higher amounts. These effects were completely suppressed by the presence of 0.1% bovine serum albumin or 0.5mM EGTA in the incubation medium. Taking the mitochondrial swelling as a comparative parameter, alI of them presented the same behaviour at different intensities, leading to permeabilization of the mitochondrial membrane. In this case, addition of EGTA prevented it whereas bovine serum albumin was ineffective, indicating that the lipid microenvironrnent was actualIy,affected. These results suggest that free fatty acids must be directly responsible for the observed effects induced by hospholipase A2 isoforms on oxygen consumption experiments. The protection confered by cyclosporin-A on swelling induced by the isoforms, mainly when they were present in low concentrations, suggests that cyclosporin-A binding to a mitochondrial membrane site protects the membrane against the phospholipase A2 attack. On the other hand, the smalI protection confered by CAT, as well as the prevailment of the small protective CAT effect when we used both CSA and CAT, suggest that the CAT binding to the ADP/ ATP carrier inhibits the protection confered by CSA / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Unidad de práctica para optar al título de Químico Farmacéutico / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento / Existe controversia por la utilización de bioequivalentes de ciclosporina, por la alta variabilidad inter e intra individual de sus parámetros farmacocinéticos y su estrecho margen terapéutico. Se diseñó este estudio para determinar la evolución que tuvo la población de pacientes trasplantados renales del Hospital Clínico de la Universidad de Chile (HCUCH) a quienes se les sustituyó la ciclosporina original (Neoral®) por otra bioequivalente (Equoral®). Metodología: se trata de un estudio retrospectivo y longitudinal, que incorporó 26 pacientes trasplantados renales que retiran mensualmente sus medicamentos en el HCUCH. Se compararon parámetros bioquímicos, cambios de prescripción y gastos en medicamentos durante los 10 últimos meses con el fármaco original y los primeros 10 meses con el bioequivalente. Además se evaluó la percepción del paciente respecto a la sustitución de medicamentos. Resultados: en el estudio se incluyeron 26 pacientes, 18 de sexo masculino, con edad promedio de 52 ± 11 años. Los parámetros bioquímicos evaluados no presentaron cambios entre un período y otro. Sin embargo, los valores de creatinina, nitrógeno ureico en sangre (BUN), ácido úrico y triglicéridos se encuentran elevados en ambos períodos y la velocidad de filtración glomerular (VFG) se encuentra disminuida. Los cambios de prescripción de fármacos inmunosupresores aumentaron de 8 a 17. Los cambios de prescripción de fármacos concomitantes más frecuentes fueron antiácidos, anti anémicos y agentes que actúan sobre el sistema renina – angiotensina (SRA). El gasto en ciclosporina disminuyó un 25,7%, mientras que el gasto total en medicamentos disminuyó 21,2%. En la encuesta participaron 14 pacientes, 11 de los cuales encontraron diferencias en el color de la cápsula de ciclosporina, sin representar una dificultad para la toma normal del medicamento. No se registraron episodios de rechazo durante el período estudiado y hubo un fallecimiento a causa de una endocarditis infecciosa, sin ser atribuida al cambio de marca de ciclosporina. Se pudo concluir que el cambio de marca de ciclosporina redujo de manera importante el gasto en medicamentos y no produjo consecuencias clínicas graves a corto plazo en la población estudiada. Sin embargo, se requiere de un control más exhaustivo sobre todo en los niveles plasmáticos de ciclosporina, para prevenir posibles complicaciones relacionadas a su infra o sobredosificación, además de continuar con su seguimiento para determinar la evolución a largo plazo