TORRES, Alba Fabiola Costa. Ação antibacteriana antifúngica e antiparasitária de veneno de serpentes do gênero Bothrops e suas frações fosfolipase A2 e L-Aminoácido oxidase. 2009. 101 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Fortaleza, 2009. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-12-14T14:38:42Z No. of bitstreams: 1 2009_dis_afctorres.pdf: 2178640 bytes, checksum: 4644d2bdefaf8f6b7927d8188303e1ef (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2012-12-17T13:51:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_dis_afctorres.pdf: 2178640 bytes, checksum: 4644d2bdefaf8f6b7927d8188303e1ef (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-17T13:51:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_dis_afctorres.pdf: 2178640 bytes, checksum: 4644d2bdefaf8f6b7927d8188303e1ef (MD5) Previous issue date: 2009 / Snakes venoms contain biologically active substances primarily consisting of proteins (90-95%). Some of these present enzymatic activities, such as phospholipases A2 and the L-amino acid oxidases. In this study we verify the action of Bothrops leucurus (BleuTV) and Bothrops marajoensis (BmarTV) venoms, and fractions PLA2 (BleuPLA2 and BmarPLA2) and LAAO (BleuLAAO and BmarLAAO) on strains of bacteria, yeast, Leishmania sp and T. cruzi. The susceptibility of bacterial and yeast strains was analyzed through disc-diffusion assay, for determination of antimicrobial potential; and the microdilution method, for determination of MIC and MLC, with modifications. The antiparasitic activity was evaluated through of the culture treatment of parasites with different concentrations of venoms or their fractions. The forms promastigotes of Leishmania sp. had been cultived, during 72h, in NNN/Schneider media, 28ºC; and the forms epimastigotes of T. cruzi had been cultived in LIT media, during 5d, 28ºC. The macrophages were cultured in RPMI 1640 media, during 24h, 37ºC and 5% of CO2, with different concentrations of venoms or fractions. After, they were analyzed by MTT method. The results was statistically analyzed with t test or ANOVA followed the Bonferroni’s test, when appropriated, with p<0.05. The BmarLAAO was able to inhibit the growth of gram negative P. aeruginosa, of yeast C. albicans and of gram positive S. aureus; and the BleuTV inhibited the growth of S. aureus, being the inhibitions dose-dependent. The order of susceptibility of microorganisms tested against BmarLAAO was S. aureus > C. albicans > P. aeruginosa. On the other hand the BmarTV, BmarPLA2, BleuPLA2 and BleuLAAO had not provided any degree of inhibition on strains in study. The inhibitory effect was more significant on S. aureus presenting CIM= 50µg/mL and CLM=200µg/mL for BmarLAAO, and CIM=CLM=25µg/mL for the BleuTV. In concentrations greater than 1.56µg/mL BmarLAAO was able to inhibit the growth of promastigotes forms of L. chagasi and L.amazonensis, after 72h of culture. The IC50 values were 2.55µg/mL for L. amazonenis, and 2.86 µg/mL for L. chagasi. BmarTV and BleuTV also provided significant inhibition of the parasitic growth, with an IC50 value of 86.56 µg/mL for L. amazonensis and 79.02 µg/mL for L. chagasi, when treated with BmarTV; and 5.49µg/mL for L. amazonensis and 1.94µg/mL for L. chagasi, when treated with BleuTV. The venoms and BmarLAAO showed inhibitory effect on epimastigotes forms of T. cruzi. The IC50 value for BleuTV, BmarTV and BmarLAAO where, respectively 1.14µg/mL, 24.19µg/mL and 0.89µg/mL.This effects presented behavior dose-dependent. The fractions BmarPLA2, BleuPLA2 and BleuLAAO had not been capable to promote any inhibition on the growth of these parasites. The BmarLAAO, BmarTV and BleuTV presented low toxicity in studied concentrations. In conclusion, the whole venoms as well as the L-amino acid oxidase from Bothrops marajoensis showed to be capable to interfere in the growth of several microorganisms as S.aureus, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Leishmania sp. and T. cruzi. / Os venenos de serpentes contem substâncias biologicamente ativas, primariamente consistindo de proteínas (90-95%). Algumas delas apresentam atividade enzimática como as fosfolipases A2 e L-aminoácido oxidase. O presente estudo verificou a ação dos venenos de Bothrops leucurus (BleuVT) e Bothrops marajoensis (BmarVT), e suas frações PLA2 (BleuPLA2 e BmarPLA2) e LAAO (BleuLAAO e BmarLAAO) sobre cepas de bactéria, C. albicans, Leishmania sp e T. cruzi, bem com sua toxicidade sobre macrófagos murinos. A susceptibilidade das cepas bacterianas e fúngica foi analisada através do método de difusão em ágar, para determinação do potencial antimicrobiano; e microdiluição em caldo, para determinação da CIM e CLM, com modificações. A atividade antiparasitária foi avaliada através do tratamento das culturas de parasitos com diferentes concentrações dos venenos ou de suas frações. As formas promastigotas de Leishmania sp. foram cultivadas, durante 72h, em meio NNN/Schneider a 28ºC; e as formas epimastigotas de T. cruzi foram cultivadas em meio LIT, durante 5 dias, a 28ºC. Os macrófagos foram cultivados em meio RPMI 1640, em presença de diferentes concentrações dos venenos e frações, durante 24h, e submetidos ao ensaio com MTT. Os resultados foram estatisticamente analisados através do teste t ou ANOVA seguida do teste Bonferroni, quando apropriado, com p<0.05. A BmarLAAO foi capaz de inibir o crescimento bacteriano do Gram-negativo P. aeruginosa, da levedura C. albicans e do Gram-positivo S. aureus; e o BleuTV inibiu o crescimento de S. aureus, sendo a inibição dose-dependente. A ordem de susceptibilidade dos microorganismos testados com BmarLAAO foi S. aureus > C. albicans > P. aeruginosa. Por outro lado o BmarTV, BmarPLA2, BleuPLA2 e BleuLAAO não apresentaram nenhum grau de inibição sobre as cepas em estudo. O potencial inibitório foi mais significante sobre S. aureus apresentando CIM= 50µg/mL e CLM=200µg/mL para BmarLAAO, e CIM=CLM=25µg/mL para BleuTV. Em concentrações maiores que 1.56µg/mL a BmarLAAO foi capaz de inibir o crescimento de formas promastigotas de L. chagasi e L.amazonensis, sendo os valores de IC50, após 72h de cultivo, para L. amazonenis, 2.55µg/mL e 2.86 µg/mL para L. chagasi. BmarTV e BleuTV também apresentaram significante inibição sobre o crescimento parasitário, sendo os valores de IC50 86.56 µg/mL para L. amazonensis e 79.02µg/mL para L. chagasi, quando tratado com BmarTV; e 5.49µg/mL para L. amazonensis e 1.94µg/mL para L. chagasi, quando tratado com BleuTV. Os venenos e BmarLAAO mostraram efeito inibitório sobre formas epimastigotas de T. cruzi. Os valores de IC50 para BleuTV, BmarTV e BmarLAAO foram, respectivamente, 1.14µg/mL, 24.19µg/mL e 0.89µg/mL. As frações BmarPLA2, BleuPLA2 e BleuLAAO não foram capazes de promover nenhum efeito inibitório sobre os parasitos em estudo. O BmarLAAO , BmarTV e BleuTV apresentaram baixa toxicidade sobre macrófagos nas concentrações estudadas. Em conclusão, os veneno de B. leucurus e de B. marajoensis, bem como a L-aminoácido oxidase de Bothrops marajoensis mostraram ser capazes de interferir no crescimento de diferentes microorganismos como S.aureus, C. albicans, P. aeruginosa, Leishmania sp. e T. cruzi.

SOUSA, Fabíola Carine Monteiro de. Avaliação dos efeitos renais induzidos pelo veneno e PLA, LYS 49 e ASP 49 da serpente Bothropoides erythromelas (Amaral, 1923) : análise dos mediadores envolvidos. 2010. 214 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2010. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-07-26T16:36:48Z No. of bitstreams: 1 2010_tese_fcmsousa.pdf: 4619146 bytes, checksum: d8b1a37dd28f0be3b597cd8b5416322c (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-08-06T11:53:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_tese_fcmsousa.pdf: 4619146 bytes, checksum: d8b1a37dd28f0be3b597cd8b5416322c (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-06T11:53:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_tese_fcmsousa.pdf: 4619146 bytes, checksum: d8b1a37dd28f0be3b597cd8b5416322c (MD5) Previous issue date: 2010 / Bothropoides erythromelas is responsible for a great deal of snakebites in Northeastern from Brazil. The venom of this snake induces acute renal failure. Isolated kidneys from Wistar rats, weighting 250 to 300g, were perfused with Krebs-Henseleit solution containing 6g% of bovine serum albumin for 120 min. The whole venom of Bothropoides erythromelas been previously studied (SOUSA, 2004) and used in this study for comparison with the treated groups with the PLA2 fractions Lys 49 and Asp 49 of the venom. The whole venom (10mg/mL) and the fractions PLA2 Lys 49 and Asp 49 of B. erythromelas (5mg/mL) were added into the system 30 min after the beginning of each experiment. The parameters studied included perfusion pressure (PP), renal vascular resistance (RVR), glomerular filtration rate (GFR), urinary flow (UF), percent sodium, potassium and chloride tubular transport (%TNa+, %TK+ and %TCl-), percent sodium, potassium and chloride proximal transport (%pTNa+, %pTK+ and %pTCl-), sodium, potassium and chloride excretion (ENa+, EK+ e ECl-) and osmotic clearance (Cosm) (p< 0.05*). The control group perfused with albumin was functionally stable for over 120 min. The infusion of venom caused a significant increase in UF, ENa+, ECl- and Cosm and a decreased in PP, RVR, %TNa+, %TK+, %TCl-, %pTNa+, %pTK+ and %pTCl-. The GFR and the EK+ decreased at 60 min and increased at 90 and 120 min when compared with control group. The infusion of Lys 49 caused a significant increase in PP, UF, ENa+, EK+ and Cosm and decreased the GFR and the %TNa+ when compared with control group. Lys49 did not modify the others functional kidney parameters. The infusion of Asp 49 only modify the functional kidney parameters %pTK+ (decreased) and EK+ (increase) when compared with control group. Lys 49 showed a similar effect at whole venom in parameters UF, %TNa+, ENa+, EK+ and Cosm and Asp 49 in parameters %pTK+ and EK+. The histological analysis showed a mild amount of a proteinaceous substance in the renal tubules and glomeruli of kidneys perfused with the venom, Lys 49 and Asp 49, as well as focal areas of apoptosis/necrosis in perfused kidneys with Lys 49 e Asp 49. MDCK cells were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% vv fetal bovine serum and then assessed in the presence of the whole venom, Lys 49 and Asp 49 of B. erythromelas in the concentrations (100; 50; 25; 12.5; 6.25 and 3.125mg/mL). The analysis of cytotoxic effects on MDCK cells was performed by MTT method. The venom promoted cytotoxic effect in the concentrations of 50 and 100mg/mL (IC50 =93.31mg/mL). Lys 49 promoted cytotoxic effect in the concentrations of 6.25; 12.5; 25; 50 and 100 mg/mL (IC50 = 38.29mg/mL). Asp 49 promoted cytotoxic effect in the concentrations of 50 and 100 mg/mL (IC50 = 158mg/mL). Also the levels of lactic dehydrogenase (LDH) were measured and no significant increase was observed with whole venom and Asp 49. Lys 49 promoted a significant increase in the levels of LDH only in the concentration of 100mg/mL. After culture of MDCK cells with the whole venom, at concentrations of 46.65 and 23.32µg/mL, was performed the real time polymerase chain reaction for evaluation of pro (Caspase-3, Caspase-8 and Bax) and antiapoptotic (Bcl-XL and Mcl-1) genes expression. The evaluation of pro and antiapoptotic genes expression with Lys 49 e Asp 49 did not realized. In the expression of pro-apoptotic genes the whole venom caused increase of caspase-3 at concentration of 23.32µg/mL and of caspase-8 at concentrations of 46.65 and 23.32µg/mL, when compared with negative (PBS) and positive (DOXO) controls and decreased the expression of Bax in both concentrations. In the expression of anti-apoptotic genes the whole venom caused significant induction of Mcl-1 only at a concentration of 46.65µg/mL and did not modify the expression of Bcl-XL, when compared with the negative control. The venom and the fractions PLA2 Lys 49 e Asp 49 of Bothropoides erythromelas is able to promote significant effects on renal function parameters and on MDCK cells, with indications of cell death by apoptosis through the extrinsic pathway. / Bothropoides erythromelas é responsável por muitos acidentes no Nordeste do Brasil. O veneno desta serpente induz insuficiência renal aguda. Rins isolados de ratos Wistar, pesando 250 a 300g, foram perfundidos durante 120 min com solução Krebs-Henseleit contendo 6g% de albumina bovina. O veneno total de Bothropoides erythromelas foi estudado anteriormente (SOUSA, 2004) e utilizado neste estudo para posterior comparação com os grupos tratados com as frações PLA2 Lys 49 e Asp 49 do veneno. O veneno total (10mg/mL) e as frações PLA2 Lys 49 e Asp 49 (5mg/mL) de B. erythromelas foram adicionados ao sistema 30 min após o início de cada experimento. Os parâmetros estudados incluíram pressão de perfusão (PP), resistência vascular renal (RVR), ritmo de filtração glomerular (RFG), fluxo urinário (FU), percentual de transporte tubular de sódio, potássio e cloreto (%TNa+, %TK+ e %TCl-), percentual de transporte proximal de sódio, potássio e cloreto (%pTNa+, %pTK+ e %pTCl-), excreção de sódio, potássio e cloreto (ENa+, EK+ e ECl-) e clearance osmótico (Cosm) (p< 0,05*). O grupo controle perfundido com albumina foi funcionalmente estável por todos os 120 min. A infusão do veneno causou um aumento significante no FU, ENa+, ECl- e Cosm e uma diminuição na PP, RVR, %TNa+, %TK+, %TCl-, %pTNa+, %pTK+ e %pTCl-. O RFG e a EK+ diminuíram aos 60 min e aumentaram aos 90 e 120 min quando comparado com o grupo controle. A infusão de Lys 49 causou um aumento significante na PP, FU, ENa+, EK+ e Cosm e diminuiu o RFG e o %TNa+ quando comparada com o grupo controle. Lys 49 não modificou os outros parâmetros funcionais renais. A infusão de Asp 49 modificou apenas os parâmetros funcionais renais %pTK+ (diminuição) e EK+ (aumento) quando comparada ao grupo controle. Lys 49 apresentou um efeito similar ao veneno total nos parâmetros FU, %TNa+, ENa+, EK+ e Cosm e Asp 49 nos parâmetros %pTK+ e EK+. A análise histológica mostrou uma quantidade moderada de material proteináceo nos glomérulos e túbulos de rins perfundidos com o veneno, Lys 49 e Asp 49, bem como regiões focais de apoptose/necrose em rins perfundidos com Lys 49 e Asp 49. Células MDCK foram cultivadas em meio de cultura RPMI 1640 suplementado com 10% vv de soro bovino fetal e então avaliadas na presença do veneno total, Lys 49 e Asp 49 de B. erythromelas nas concentrações (100; 50; 25; 12,5; 6,25 e 3,125mg/mL). A análise dos efeitos citotóxicos em células MDCK foi executada pelo método MTT. O veneno promoveu efeito citotóxico nas concentrações de 50 e 100mg/mL (IC50 =93,31mg/mL). Lys 49 promoveu efeito citotóxico nas concentrações de 6,25; 12,5; 25; 50 e 100mg/mL (IC50 = 38,29mg/mL). Asp 49 promoveu efeito citotóxico nas concentrações de 50 e 100mg/mL (IC50 = 158mg/mL). Também foram mensurados os níveis de lactato desidrogenase (LDH) e nenhum aumento significante foi observado com veneno total e Asp 49. Lys 49 promoveu um aumento significante nos níveis de lactato desidrogenase apenas na concentração de 100mg/mL. Após o cultivo de células MDCK com o veneno total, nas concentrações de 46,65 e 23,32mg/mL, foi realizada a reação de polimerase em cadeia em tempo real para a avaliação da expressão de genes pró (Caspase-3, Caspase-8 e Bax) e antiapoptóticos (Bcl-XL e Mcl-1). Não foi realizada avaliação da expressão de genes pró e antiapoptóticos com Lys 49 e Asp 49. Na expressão de genes pró-apoptóticos o veneno total promoveu um aumento da expressão de caspase-3 na concentração de 23,32µg/mL e de caspase-8 nas concentrações de 46,65 e 23,32µg/mL, quando comparado com os controles positivo (DOXO) e negativo (PBS) e diminuiu a expressão de Bax em ambas as concentrações. Na expressão de genes antiapoptóticos o veneno total promoveu indução significativa de Mcl-1 somente na concentração de 46,65mg/mL e não modificou a expressão de Bcl-XL, quando comparado com o controle negativo. O veneno e as frações PLA2 Lys 49 e Asp 49 da serpente Bothropoides erythromelas é capaz de promover significativos efeitos sobre os parâmetros de função renal e sobre células MDCK, com indicativo de morte celular por apoptose através da via extrínseca.

Resumo: As aranhas do gênero loxoceles são espalhadas mundialmente e suas picadas podem se manifestar em indivíduos de duas formas, primeiro como quadro cutâneo ou dermonecrótico e segundo como quadro sistêmico, sendo consideradas como problema de saúde pública. Independente da espécie da aranha, o veneno pode causar dermonecrose, hemólise, disfunção renal e resposta inflamatória sistêmica. De acordo com estudos, um importante componente do veneno responsável por hemólise e dermonecrose é a Fosfolipase D. Os objetivos deste trabalho foram avaliar os efeitos diretos e sistêmicos da toxina recombinante Fosfolipase D (PLD) em músculos papilares, anéis de aorta e corações isolados perfundidos. Avaliamos em músculo cardíaco e liso de ratos Wistar parâmetros de contratilidade como geração de força e pressão, velocidade máxima de contração e de relaxamento. Nossos estudos demonstraram que em corações isolados de animais pré-tratados, a administração intraperitoneal de fosfolipase D reduziu o valor máximo de pressão intraventricular, a velocidade máxima de relaxamento (-dP/dt). Não foram observados efeitos diretos da toxina em parâmetros de contratilidade de músculos papilares isolados e anéis de aorta. Esses dados sugerem que o efeito da Fosfolipase D é decorrente de sua ação sistêmica.

Orientador : Prof. Dr. Silvio Sanches Veiga / Coorientador : Prof. Dr. Olga Meiri Chaim / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 25/02/2016 / Inclui referências : f. 33-34;53-61 / Área de concentração :Biologia Celular e Molecular / Resumo: Loxoscelismo é a denominação do quadro clínico provocado em pacientes picados por aranhas do gênero Loxosceles, caracterizado principalmente por causar lesão dermonecrótica com intensa resposta inflamatória no local da picada, e raramente ocorrem manifestações sistêmicas, como distúrbios renais e hematológicos. O veneno loxoscélico é um líquido cristalino e incolor composto essencialmente por proteínas e peptídeos entre 5 a 40kDa, contendo cerca de 30?g de proteínas. Sabe-se que as toxinas da família das fosfolipases-D são capazes de desencadear a maioria dos efeitos biológicos causados pelo envenenamento, tornando-se necessário o aprofundamento da ação completa desta toxina. Algumas isoformas de fosfolipases-D de veneno de aranha-marrom já foram identificadas e biologicamente caracterizadas. Após análise do transcriptoma da glândula produtora de veneno de Loxosceles intermedia, algumas prováveis novas isoformas desta toxina foram identificadas e, entre elas, uma se destacou por sua presença em proporção relevante. O objetivo deste trabalho foi a clonagem, expressão heteróloga e purificação desta nova isoforma de toxina dermonecrótica, de modo a permitir sua avaliação biológica por testes in vitro e in vivo. A partir de técnicas de biologia molecular, foi possível obter a sequência nucleotídica e, por sua vez, aminoacídica completas da LiRecDT7, relatando que esta possui uma substituição conservativa no resíduo de aminoácido Asp233'Glu233. Houve pouco rendimento na expressão da toxina recombinante na forma solúvel e o processo de purificação por cromatografia mostrou-se pouco eficiente. Os testes de atividade esfingomielinásica sugerem que esta toxina como enzima está ativa. Os resultados obtidos até o presente demonstram que esta toxina é uma nova isoforma de fosfolipase-D presente no veneno de L. intermedia. Ainda assim, o processo de expressão e purificação devem ser otimizados, para avaliá-la biologicamente, contribuindo para a compreensão da composição do veneno dessa espécie, além de ser mais uma alternativa de ferramenta com potencial de aplicação biotecnológica. Palavras-chave: aranha, Loxosceles intermedia, veneno, fosfolipase-D / Abstract: Loxoscelism is the name of the clinical picture provoked in patients bitten by Loxosceles spiders. It is mainly characterized by dermonecrotic lesions with an intense inflammatory response at the site of the bite, and rarely systemic manifestations such as renal and hematological disorders. The venom produced by Loxosceles spiders is a crystalline, colorless liquid consisting mainly of proteins and peptides between 5 and 40kDa. It is known that the phospholipase-D family of toxins present in this venom is capable of causing most of the biological effects observed in accidents with the spiders. Some isoforms of phospholipases-D have been identified in the Loxosceles venom and biologically characterized. Transcriptome analysis of the venom gland of Loxosceles intermedia revealed some potential novel isoforms of this toxin and among them, one stood out for its presence in significant proportion. The aim of this work was the cloning, heterologous expression and purification of this new isoform of dermonecrotic toxin, named LiRecDT7, to allow their biological evaluation by in vitro and in vivo analysis. Using molecular biology techniques, it was possible to obtain the nucleotide sequence and, in turn, the complete amino acid sequence of LiRecDT7. Further analysis showed a conservative substitution at amino acid residue Glu233'Asp233. The expression of recombinant toxin in soluble form resulted in a low yield and the process of purification by chromatography proved to be inefficient. Nevertheless, preliminary assays that tested the sphingomyelinasic activity of LiRecDT7 suggest that this toxin is active as an enzyme. The results show that LiRecDT7 is a new isoform of phospholipase-D present in the venom of L. intermedia. Still, the expression and purification process must be optimized to allow further assessments. Thus, the results will help to expand the knowledge concerning the composition of the venom of this species, besides being an alternative tool with potential biotechnological applications. Key-words: spider, Loxosceles intermedia, venom, phospholipase-D

Orientador: Glaucia Maria Pastore / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-28T02:26:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Siloto_AngelitaMarinsPeixoto_M.pdf: 11862801 bytes, checksum: ac5cde8aa6ccff9ad828cccc4e5d74ad (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: Seiscentas linhagens de fungos foram isoladas a partir de amostras de solo, frutos, resíduos industriais e testadas quanto à capacidade de hidrolisar fosfoglicerídeos (Iecitina de soja comercial) através da produção de fosfolipase extracelular. Destas linhagens, 96 foram pré-selecionadas como produtoras de fosfolipase por apresentarem formação de halo ao redor da colônia quando cultivadas em meio composto por ágar lecitina contendo o corante rodamina B. Para se verificar as melhores linhagens produtoras de fosfolipase, tais linhagens pré- selecionadas foram cultivadas em meio contendo 5% de caldo de maceração de milho (com steep liquor), 1% de glicose, 0,51% NaNO3, 0,1% KH2PO4, 0,025% MgSO4.7H2O, 0,0046% CaCI2, 0,000632% FeSO4.7H20 e 0,0000234% CuSO4.5H20, tendo seu pH ajustado para 4,5, a 25QC por 72 horas com agitação de 200 rpm. Duas linhagens (nQ212 e nQ 1068) foram escolhidas por apresentarem maior produção de fosfolipase. Alguns parâmetros para a produção de fosfolipase pelas linhagens escolhidas foram estudados, como a seleção do melhor meio de cultivo, efeito da incorporação de diferentes fontes de carbono e relação entre temperatura e tempo de incubação. As fosfolipases das linhagens 212 e 1068 foram caracterizadas bioquimicamente e apresentaram atividade ótima em pH 4,5 a 45°C. Ambas as enzimas não apresentaram atividade na ausência de CaCI2. Através de cromatografia de camada delgada (CCD) constatou-se que ambas as enzimas brutas foram capazes de hidrolisar a lecitina de soja comercial, transformando-a em lisolecitina. / Abstract: The screening of phospholipase producing filamentous fungi was performed including 600 strains of microorganisms which were isolated from samples of soil, fruits and industrial residues. They were tested for phospholipase activity using a method based on lecithin agar and Rhodamine B. 96 strains were selected and its enzyme production were done using medium containing 5% com steep liquor, 1% glucose, 0,51% NaNO3,0,1% KH2PO4, 0,025% MgSO4.7H20, 0,0046% CaCI2, 0,000632% FeSO4.7H20 e 0,0000234% CuSO4.5H20, pH 4,5 at 25 for 72 hours. Two strains (212 and 1068)showed high phospholipaseactivity. The effect of olive oil as carbon source were examined in the culture medium. The crude enzymes showed high activity at 45°C and pH 4,5. The enzymes required Ca+2for the activity. / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador: Sergio Marangoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T00:13:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bonfim_VeraLucia_M.pdf: 864621 bytes, checksum: a69159638df711b5aa8e490b77c0ddee (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Bothrops jararacussu é uma espécie de grande importância epidemiológica no estado do Rio de Janeiro. No entanto a sua distribuição é ampla, pois pode ser encontrada nos estados de Santa Catarina, Paraná, Mato Grosso, São Paulo, Minas Gerais, Espírito Santo, Sul da Bahia e também na Argentina, Paraguai e Bolívia. De um modo geral, os venenos botrópicos das espécies brasileiras foram pouco estudados tanto em relação aos seus componentes isolados como quanto ao veneno total, devido 'a falta de otimização das técnicas de purificação capazes de revelar a presença de novos componentes ou de suas isoformas. Desta forma justifica-se o interesse no isolamento e caracterização de duas novas isoformas de BthTX-II PLA2 (D49), lembrando que esta última citada é uma fração importante no veneno de Bothrops jararacussu. As isoformas foram isoladas em uma coluna de troca iônica catiônica (Protein Pack SP 5PW Waters) acoplada a um sistema LC 650 (Waters), sendo caracterizadas como isoformas de BthTX-II e denominadas como Bj-IV e Bj-V. O alto grau de pureza foi revelado ao serem re-purificadas em uma coluna de hidrofobicidade µ-Bondapack C18 acoplada a um sistema de HPLC de fase reversa, sendo eluídas em tempos de retenção muito próximos (Bj-IV 31,25 ± 0,31 minuto e para Bj-V 31,31 ± 0,28 minuto). A caracterização físico-química revelou o fato de serem isoformas, pois apresentaram vários fatores similares como, a tendência para a formação de dímeros na eletroforese com ausência de redutores, sendo que o valor de massa molecular relativa encontrada para isoformas foi de ~14 kDa, através da eletroforese em SDS-PAGE Tricina (16,5%) também, a basicidade semelhante e o alto grau de hidrofobicidade, confirmados pela composição de aminoácidos. A caracterização cinética das isoformas de BthTX-II PLA2 (D49) mostrou que tais isoformas são altamente estáveis e apresentam um pH ótimo ao redor de 8,0 e temperatura próxima a 37ºC. Frente a diferentes concentrações de substrato as isoformas mostraram um comportamento tipo alostérico, em nossas condições experimentais. Na ausência de Ca+2 (1Mm) e na presença de alguns íons divalentes tais como Mn+2, Mg+2, Zn+2, Cu+2 (na concentração de 10 mM) as isoformas Bj-IV e V foram inibidas, já na presença de Ca+2 (1mM) e com os mesmos íons divalentes citados elas mostraram uma discreta atividade. Também foi demonstrado o efeito inibitório de crotapotinas crotálicas sobre a atividade PLA2 das isoformas, fato que sugere a possível presença de crotapotinas ¿like¿ no veneno botrópico. A análise da composição de aminoácidos confirmou o comportamento estável de sua atividade cinética, ao mostrar um alto conteúdo de aminoácidos hidrofóbicos, assim como a presença de 14 cisteínas envolvidas em possíveis sete pontes dissulfeto. A presença de um alto conteúdo de aminoácidos básicos como Lys, His e Arg, também confirmaram o caráter básico das isoformas, característica própria do veneno deste tipo de víperide sul americano. O estudo de homologia seqüencial da região N-terminal entre ambas isoformas e também com outras PLA2 (D49) revelou um alto grau de homologia, no entanto, foram encontradas algumas substituições que não contribuíram com diferenças significativas, tanto com relação à atividade catalítica quanto neurotóxica. O efeito neurotóxico das isoformas de BthTX-II PLA2 (D49) Bj-IV e V, foi avaliado usando-se duas preparações farmacológicas: nervo frênico-diafragma isolado de camundongo e biventer cervicis de pintainho. Foram encontradas diferenças em ambas preparações, pois o efeito de bloqueio da resposta contrátil evidenciou-se de maneira significativa na preparação nervo frênico-diafragma isolado de camundongo, nas concentrações empregadas (50 e 100 µg/mL), enquanto que na preparação biventer não houve efeito notório. No entanto, para a dosagem de 100 µg/mL, no caso do veneno total na preparação biventer cervicis de pintainho evidenciou-se um efeito miotóxico indireto pois, foi observada uma diminuição nas respostas contraturante dadas pela diminuição das curvas de KCl e Acetilcolina (ACh). A importância do isolamento das isoformas de BthTX-II, Bj-IV e V, está apoiada no fato de ter sido possível a obtenção destas duas novas isoformas, usando-se métodos que garantiram a manutenção da sua atividade biológica, sendo assim possível correlacionar a estrutura e a função desta família de proteínas / Abstract: Bothrops jararacussu is a species of great importance in the state of Rio de Janeiro, but its has a wide distribution: from Argentina, state of Santa Catarina, Paraná, Mato Grosso, São Paulo, Minas Gerais, Espírito Santo, south of Bahia, Paraguay and Bolivia. In a general the venom botropics of the Brazilian species, were probably rarely studied in relation to their isolated components as the total venom, due to a lack in the optimization of technologies to isolate the presence of new components or isoforms. In this way it justified to isolate and to characterize two new isoforms of these of BthTX-II PLA2 (D49) is a important fraction in the venom of Bothrops jararacussu, which were isolated through a column of exchange cationic (Protein Pack SP 5 PW Waters) coupled to a system LC 650 (Waters), being characterized as isoforms of BthTX-II and denominated Bj- IV and Bj-V. The high degree of purity was revealed and was eliminated in very close times of retention (Bj-IV 31.25 ± 0.31 minutes and Bj-V 31.31 ± 0.28). The physical-chemistry characterization revealed the reason of being isoforms, because they present several similar factors, such as the tendency of forming aggregates through the electrophoreses PAGE in the absence of SDS, as well as the mass is around 14 kDa characterized in the electrophoreses SDS-PAGE Tricina (16%). The kinetic characterization of the isoforms of BthTX-II PLA2 (D49) showed that isoforms are higly stable and they present good pH around 8,0 and a good temperature around 37 0C. Different concentration substrates showed a behavior type allosteric under our experimental conditions. In the presence of some ions such divalents as Mn+2, Mg+2, Zn+2, Cu+2 (in the concentration of 10 Mm) and in the absence of Ca+2 the isoforms Bj-IV and Bj-V, were inhibited. But in the presence of Ca+2 (1mM) the isoforms showed a discreet activity. The effect of the inhibition of crotapotins crotalics were also demonstrated in the activity PLA2, it is suggested that there is probably a presence crotapotin in these PLA2. The analysis composition of amino acids confirmed the stable behavior of its enzymatic kinetics when showing a high content of amino acids hidrophobics, as well as the presence of 14 cysteine involved in 14 bridges disulfide. The presence of a high content of basic amino acids as Lys, His and Arg confirmed the basic character of the isoforms. The study of the N-terminal region of both isoforms in relation to other PLA2 reveals a high homology degree, nevertheless some substitutions observed didn't show significant differences in the catalytic and neurotoxic activity. The neurotoxic effect of the isoforms of BthTX-II PLA2 (D49): Bj-IV and Bj-V were evaluated using two pharmacological preparations: nerve isolated frenic-diaphragm a mouse and a chick biventer cervicis muscle. There were differences in both preparations, because the blockade effect of the concentration was more significant in the preparation of the mouse. It observed in the 100 ug/ml dose to total venom a indirect effect miotoxic in the preparation chick biventer cervicis. The importance of the isolation of the isoforms of BthTX-II Bj-IV and Bj-V are not restricted to the fact of having used optimized methodologies that guaranteed the biological function of these, being able to correlate the structure and function in this proteins family of great importance in the study of venom of snakes / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Stephen Hyslo / Texto em portugues e ingles / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-25T22:16:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Buzin_MartaPitali_M.pdf: 1367075 bytes, checksum: 0cb4a0823b2f60768cef97911f39e13a (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: Os venenos de insetos da Classe Hymenoptera contêm enzimas, peptídeos, aminas e aminoácidos excitatórios. Neste trabalho, investigamos as atividades enzimáticas e biológicas de um extrato aquoso do saco de veneno (ESV) da vespa social Po/istes lanio lanio. O ESV de P. l. lanio possui baixa atividade fosfodiesterásica, elastásica, fosfatásica (ácida e alcalina) e L-amino-ácido oxidase; moderados níveis de hialuronidase e protease e um alto nível de fosfolipase. A eletroforese (SDS-P AGE) revelou a presença de mais de 10 componentes com pesos moleculares variando de 14.000-100.000. A cromatografia de ESV em Sephacryl S200 HR resultou em sete picos, o primeiro destes contém atividades hemolítica e fosfolipásica. O ESV exibiu uma potente atividade hemolítica direta em eritrócitos humanos, sendo dose (12,5-200 ~g/ml) e tempo (até 5 h) dependente (n=3). Eritrócitos humanos e de cão não foram aglutinados pelo ESV (2,5 mg/ml; n=3). Comparado ao ADP (3 lJM), ESV (50-400 ~g/ml) produziu uma agregação dose¬ dependente fraca em plasma humano rico em plaquetas (n=3). Por outro lado, ESV (400 ~g/ml) não agregou plaquetas humanas lavadas, porém desencadeou agregação por doses não agregantes de trombina (n=3). Em íleo isolado de rato, o ESV produziu contrações dose-dependente (4-16 ~g/ml), as quais não foram afetadas pelo pré-tratamento do tecido com atropina (antagonista de receptor muscarínico, 0,6 ~g/ml) ou ciproheptadina (antagonista de histamina e serotonina, 0,2 ~g/ml), mas foram completamentes abolidas pelo HOE-140 (1 ~g/ml, n=3), antagonista do receptor B2 da bradicinina, sugerindo a presença de cininas no ESV. Estes resultados indicam que as atividades enzimáticas e biológicas do ESV de P. l. lanio são similares às de outras vespas sociais / Abstract: Hymenopteran venoms contain enzymes, peptides, amines and excitatory amino acids. We have examined the enzymatic and biological activities of an aqueous venom sac extract (VSE) ITom the Brazilian social wasp Po/istes lanio lanio. The VSE had low phosphodiesterase, elastase, acid and alkaline phosphatase and L-amino acid oxidase activities, moderate levels of hyaluronidase and protease and high phospholipase activity. SDS-P AGE revealed the presence of several components with molecular weights of 14,000-100,000. Gel filtration ofVSE resulted in seven peaks, the first ofwhich contained the hemolytic and phospholipase activities. The VSE exhibited potent direct hemolytic activity on human erythrocytes which was dose- (12.5-200 ~g!ml) and time- (up to 5 h) dependent. VSE (50-400 ~g!ml) produced weak, dose-dependent aggregation of human platelet-rich plasma and did not aggregate human washed platelets (400 ~g!ml), but potentiated the responses to non-aggregatory doses of thrombin. Dog and human erythrocytes were not agglutinated by VSE (2.5 mg!ml). In the rat isolated ileum, VSE (4-16 ~g!ml) produced contractions which were not prevented by atropine (muscarinic receptor antagonist, 0.6 ~g!ml) or cyproheptadine (histamine and serotonin receptor antagonist, 0.2 ~g!ml), but were abolished by the bradykinin B2 receptor antagonist HOE¬140 (1 ~g/ml), suggesting the presence of kinins. These results indicate that the composition of P. 1. lanio VSE is similar to that of other wasp species / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Sergio Marangoni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-25T23:09:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Toyama_MarcosHikari_D.pdf: 9361968 bytes, checksum: eaf1e7ea3745e2860f46c214010b9739 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: As serpentes do gênero Bothrops incluem várias espécies, que são amplamente distribuídas na América do Sul e do Norte. Entre as proteínas bioativas do veneno de Bothrops, as Fosfolipases Az (PLAz,E.c. 3.1.14) e as miotoxinas PLAz"like" destacam-se como seus componentes majoritários. Fosfolipases Az são enzimas cálcio dependentes que hidrolisam a ligação 2-éster do 1,2 diacil-3sn fosfoglicerídeo (Chang et aI., 1994, Shimohigachi et aI., 1995, Ogawa, et aI., 1996). Estas enzimas são encontradas em muitos tecidos, principalmente no suco pancrácio de mamíferos,no veneno de serpentes e insetos. Enzimas PLAz são classificados dentro de quatro grupos (I, lI, III e IV) de acordo com sua origem extracelular ou intracelular, de acordo com sua estrutura primária e pontes de sulfeto (Denis et aI., 1994). Nesta tese, trabalhos com o veneno total de Bothrops pirajai e suas frações fosfolipases Az miotóxicas. Num primeiro instante, nos desenvolvemos uma nova estratégia de purificaçãodestas miotoxinasem HPLC(HPLCde fase reversa, troca iônicae exclusão molecular) e em cromatografia convencional de baixa pressão (CM-Sepharose). Em nossas condições experimentais, observamos que o HPLCde fase reversa (RP HPLC)tem vantagens sobre o método convencional, em relação ao tempo da corrida cromatográfica, a resolução dos picos e a manutenção da integridade molecular da PLAz. O primeiro trabalho feito por Toyama et aI., (1995) apresenta os resultados da purificação da principal miotoxina PLAz"Iike" (MPI e MPII) do veneno total de Bothrops pirajai, usando uma única etapa cromatográfica em HPLCde fase reversa. Este novo protocolo de purificação restringe a quantidade de proteína a ser colocada na coluna algumas mg. O rendimento final é 35% melhor do que na cromatografia de troca iônica de baixa pressão. Em Soares et aI., (1998), propusemos um uma outra alternativa de purificação das miotoxinas PLAz "like" majoritárias usando coluna convencional, uma vez que o RP HPLC não aceita grandes quantidades de amostras. No procedimento convencional,a eluição das miotoxinasPLAz"like" era eluídausando acetato de amônia em altas concentraçõe se altos valor de pH. Atroca do acetato de amônio por bicarbonato de amônia permitiu o uso de tampões com baixo pH e baixas concentrações salinas. Outros venenos de Bothrops jararacussu, Bothrops asper, Bothrops atrox, Bothrops pirajai, Bothrops moojeni, Bothrops alternatus e Bothrops (Bothriopsis) bilineata foram fracionados usando procedimentos simplificados baseados na cromatografia em CMSepharose a pH 8.0 ou em RP HPLC. O uso de NH4HC03ou de acetonitrila como tampões nestes procedimentos cromatográficosdescritos acima, tem outras vantagens como a omissãode desalificaçãoe facilidadena liofilização. Isto permite uma melhorrecuperação das proteínas eluídas e redução do tempo de corrida. O método em CM-Sepharosee RP-HPLCdescritos aqui são recomendados para escalas preparativas e analíticas, respectivamente. Nos métodos previamente descritos usam dois ou mais passos cromatográficos para o isolamento de miotoxinas. Em adição as colunas preparativas wBondapack C18 mostraram também ser conveniente para a purificação de PLA2S. Ambos os métodos descritos aqui separam os componentes principaisdo veneno usando unicamente passo cromatográfico. Os perfis cromatográficos mostraram importantes diferenças no conteúdo de miotoxinas destes venenos. O veneno de B. alternatus, B. atrox e Bothriopsis bilineata não contem a miotoxina principal encontrada em outros venenos. O sequenciamento de aminoácidos dos primeiros 50 resíduos da região N-terminal destas miotoxinas PLA2"like" mostram uma homologia de 90 a 96% com outras miotoxinas botropicas. Todas as miotoxinas isoladas induzem edema de pata, aumentando o nível de creatinina quinase pancreática e indução da mionecrose junto com a infiltraçãode células polimorfonucleares. Nesta tese, nos apresentamos o isolamento, purificação e a determinação da estrutura primária de três miotoxinas fosfolipase A2"like" do veneno de Bothrops pirajai, denominadas como PrTX-I,PrTX-IIe MP-III4R. PrTX-I ou Piratoxina I foi isolado por Mancuso et ai., (1995), e completamente seqüênciada por Toyama et ai., (1998). PrTX-Ié a principal PLA2 miotóxica encontrado no veneno total de Bothrops pirajai, composto por 121 resíduos de aminoácidos, uma DLso de cerca de 8mg/kg em camundongos e uma dose edematogênica mínima de 39.5 :t 1.8 Ilg. A modificação química da His 48 da PrTX-I pelo p-BPB praticamente aboliu sua atividade biológica. PrTX-II ou Piratoxina II foi a segunda miotoxina importante isolada do veneno de Bothrops pirajai que foi sequenciada por Toyama et aI., (1999, submetido). Tem 121 resíduos de aminoácido de baixa atividade PLA2 devido substituição do Asp49 por Lys49e alteração do "Ioop" de ligação do cálcio pela substituição de Gly32 por Leu32 e outras modificações foram importantes para a perda da flexibilidadedo sítio de ligação do cálcio. PrTX-II tem somente um único amino ácido modificado (D132 para A132) em relação a PrTX-I esta mudança confere a PrTX-II um ligeiro caráter básico. A MP-III 4R foi a terceira miotoxina isolada do veneno de Bothrops pirajai. Esta miotoxina PLA2 "Iike" tem uma atividade PLA2moderada se comparada com outras enzimas encontradas em venenos Crotálicos. MP-III4R é um raro exemplode PLA2 com atividade fosfolipase A2, anticoagulante e miotóxica. Sua atividade PLA2 moderada é devido a substituição do resíduo E53 pelo K53 e seu efeito anticoagulante é devido a atividade PLA2.Amiotoxicidade não é devido a sua atividade catalítica. O alinhamento de amino ácidos da PrTX-I,PrTX-II mostra um alto nível (95%) de homologia sequencial entre esta miotoxina e outras PLA2botropicas. Contudo, estes valores diminuem para 80% para as não botropicas e para 70-75% para as PLA2Asp49. Ambas toxinas foram caracterizadas como miotoxinas potentes e tem um atividade PLA2 residual. MP-III 4R mostra uma homologia seqüencial de mais de 50% com outras PLA2 D-49. Maso alinhamento de aminoácidos da MP-III4R com PLA2K-49diminui para cerca de 60% de homologia. PrTX-II e PrTX-III foram cristalizados e difratados usando uma resulução de 2.04 e 2.7 A. Recentemente, a estrutura tridimensional da PrTX-IIfoi resolvida e mostrou uma estrutura dimérica / Abstract: The genus Bothrops comprises severaI species, which are widely distributed in South and North America. Among the bioactive proteins from Bothrops venoms, the phospholipase A2(PLA2,E.C.3.1.14) and PLA2-likemyotoxin are outstanding as their major components. Phospholipase A2Sare calcium-dependent enzymes which hydrolyze the 2 ester bonds of 1,2 diacyl-3sn phosphoglycerides (Chang et aI., 1994, Shimohigachi et aI., 1995, Ogawa, et aI., 1996). They are found in most tissues, mainly in the pancreatic juice of mammals, venom of snakes and insects. PLA2enzymes are classified onto four groups (I, II, III and IV), according to their extracellular or intracellular origin, their primary structure and disulfide bonding (Denis et aI., 1994). In this thesis, we work with Bothrops pirajai whole venom and its myotoxic phospholipase A2fractions. At first time, we develop a new strategy of purification of this myotoxinon the HPLC(reverse phase, ion exchange, and molecular exclusion) and in the convention low-pressure chromatography (CM-Sepharose). In our experimental condition, we observed that Reverse Phase HPLC(RP HPLC) has advantageous on the conventional method about the time of chromatographic run, the resolution of some proteins and preservation of integrity of PLA2 molecule. The first work made by Toyama et aI., (1995) presents the results of the purification of the main myotoxin PLA2"Iike" (MPI and MPII) from the whole venom of Bothrops piraja.,using only chromatographicstep on the RPHPLC. This novel purification protocol restricts the amount of protein to be loaded on each column in few mg. The final yield is 35% better than to in low-pressure ion exchange chromatography. In the Soares et aI., (1998), we proposed to increase the purification grade of main PLA2 "like" myotoxin using conventional column, because the RP HPLC does not accept great amount of samples. In the conventional procedure, the elution of the PLA2 "like" myotoxin was eluted using ammonium acetate at high salt and pH values. The exchange of the ammonium acetate by ammonium bicarbonate allowed using low pH and ionic salt concentration. PrTX-II or Piratoxin II was a second important myotoxin from Bothrops pirajai that has been sequecianated by Toyama (Submitted). It has 121 amino acid residues and has low PLA2activity arose of the substitution of Asp49 by Lys49and alteration of the calcium binding loop sequence by replacement of Gly32 by Leu32 and other modification were important for 1055of the flexibility the calcium ion binding site. PrTX-II I have only one amino acid change (0132 to A132) to PrTX-I, this change confer to PrTX-II a slight basic character. The MP-III 4R was thirty myotoxin isolated from the Bothrops pirajai venom. This PLA2 like myotoxinhasa moderate PLA2activity if comparedto other enzymesfound in the Crotalic venom. MP-III 4R is a rare example of PLA2 with phospholipase A2, anticoagulant and myotoxic activities. Its moderate PLA2activity is due to the replacement of E53 by K53 and its anticoagulant effects is due to that PLA2activity. The myotoxicity is not due to the catalytic activity. The aminoacid alignment of PrTX-I, PrTX-II shows a high levei(95%) of sequential homology between this myotoxin and other bothropic Lys-49 PLA2. However, these values fali to 80% for nonbothropic and to 70-75% for the Asp 49 PLA2S. 80th toxins were characterized as very potent myotoxin and have a residual PLA2 activity. MP-III 4R 049 exhibit a sequence homology with other 0-49 PLA2up 75%. But the amino acid alignment of MP-III 4R with K-49 PLA2falls to around 60% of homology. PrTX-II and PrTX-III were crystallizedand were diffractedat resolution of 2.04 and 2.7 of resolution, respectively. Recently, the three-dimensional structure of PrTX-II was solved and showed a dimeric structure. Other venoms from Bothropsjararacussu, Bothrops asper, Bothrops atrox, Bothrops pirajai, Bothrops moojeni, Bothrops alternatus and Bothrops (Bothriopsis) bilineata were fractionated using a simplified procedure based on ion-exchange chromatography on CMSepharose at pH 8.0 or reverse phase HPLC. The use of NH4HCO3or acetonitrile as the buffer in these chromatographic procedure described above, has other advantages as omissionof desalting and easy for freeze-drying. This allows a best recoveryof the proteins eluted and reduction of run time. The CM-Sepharose and the RP-HPLC methods described here are recommended for preparative and analytical purpose, respectively. Previous reported methods use two or more chromatographic steps for the isolation of myotoxins. In addition, the preparative WBondapackC18 column was also useful for the purificationof PLA2S. Both methods described here allow separating the major components of the venom using an only one chromatographic step. The resulting elution profiles showed important differences in the myotoxin content of these venoms. The venoms from B. alternatus, B. atrox and Bothriopsis bilineata did not contain the major myotoxin found in the other venoms. The amino acid sequence of the first 50 residues of the N-terminal region of the PLA2-like myotoxins showed a homology of 90-96% with other botropic myotoxins. All of the myotoxins isolated induced rat paw edema, increased the levei of plasma creatine kinase and produced myonecrosis together with polymorphonuclear cell infiltration. In this thesis, we present the isolation; purification and determination of primary structure of three phospholipase A2"like" myotoxin from the Bothrops pirajai snake venom denominated as PrTX-I, PrTX-II and MP-III 4R. PrTX-I or Piratoxin I was firstly isolated by Mancuso et aI., (1995), and full sequenced by Toyama et aI., (1998). PrTX-Iis the main miotoxic PLA2found in the whole Bothrops pirajai venom, composed by 121 amino acid residues, a DLso around 8mg/kg in mice and a minimal edematogenic dose of 39.5 :t 1.8 /.lg. The chemical modification of His-48 of PrTX-I by p-BPB practically destroyed its biological activity / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Albetiza Lobo de Araujo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-31T20:11:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Arruda_VanessaAlves_M.pdf: 4146158 bytes, checksum: f0e713e7eea1481aed7e0751064dba89 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: No presente trabalho investigou-se a capacidade do veneno de Bothrops lanceolatus (VBL) em induzir a migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal de camundongos. A injeção intraperitoneal do veneno causou um aumento na migração de neutrófilos tempo-dependente, com pico máximo 4 horas após a injeção, na dose de 750 ng/cavidade. A capacidade do veneno em induzir a migração de neutrófilos foi reduzida significativamente, quando os animais foram pré-tratados com dexametasona (inibidor indireto da fosfolipase A2; 0,5 mg/kg, s.c.,) ou AA 861 (inibidor da 5-lipoxigenase; 0.1 mg/kg, s.c.). O tratamento dos animais com indometacina (inibidor não seletivo da cic1ooxigenase; 5 mg/kg, s.c.), meloxicam (inibidor da COX-2; 5 rng/kg, s.c.) ou WEB 2086 (antagonista do PAF; 40 rng/kg, s.c.) não reduziu a migração de neutrófilos. Dexametasona e AA 861 também inibiram a migração de neutrófilos, quando administradas imediatamente após a injeção do veneno. A possibilidade da migração de neutrófilos ser causada pela contaminação com endotoxina bacteriana foi eliminada uma vez que o tratamento do veneno com polimixina B não reduziu a migração. O aquecimento do veneno (97°C, 2 min) reduziu a atividade fosfolipásica e esta foi acompanhada por uma redução na migração de neutrófilos O agente quelante EDT A reduziu parcialmente a migração de neutrófilos e a atividade fosfolipásica do veneno. Entretanto, outros componentes do veneno podem estar envolvidos na migração, visto que houve redução de apenas 30% na migração de neutrófilos com a atividade fosfolipásica do veneno totalmente abolida. Os resultados sugerem que metabólitos da lipoxigenase estão envolvidos no processo quimiotático observado, e que macrófagos residentes peritoneais são células importantes no processo, uma vez que a migração de neutrófilos foi potencializada em animais pré-tratados com tioglicolato, mas reduziu-se quando a cavidade peritoneal foi lavada com salina estéril / Abstract: The ability of Bothrops lanceolatus venom (BLV) to induce neutrophil migration into the peritoneal cavity of mice was investigated. Intraperitoneal injection of venom caused time-dependent neutrophil migration, which peaked with 750 ng of BLV/cavity 4 h after venom injection. The venom-induced neutrophil migration was significantly reduced by pretreatment with dexamethasone (0.5 mg/kg, s.c), an indirect inhibitor of phospholipase A2 (PLA2), and AA861 (0.1 mg/kg, s.c), a 5-lipoxygenase inhibitor. In contrast, the neutrophil migration was not modified by pretreatment with indomethacin (2 mg/kg, s.c), an inhibitor of the cyclooxygenase pathway, meloxicam (5 mg/kg, s.c), an inhibitor of the cyclooxygenase-2 pathway, or the PAF inhibitor WEB2086 (40 mg/kg, s.c). Dexamethasone and AA861 also inhibited the neutrophil migration by 60% and 70%, respectively when administered immediately after venom injection. BLV induced neutrophil migration was not due to contamination by endotoxin since polymyxin B-treated BLV retained its activity. Heating the venom (97°C, 2 min) reduced the PLA2 activity and this was accompanied by a corresponding reduction in neutrophil migration. The chelating agent EDTA partially reduced the neutrophil migration and the venom phospholipase activity. Thus, other components in BLV must contribute to the observed effect, since the neutrophil migration was reduced by 30% when the PLA2 activity was abolished. These results suggest that arachidonate-derived lipoxygenase metabolities are involved in the chemotaxis observed. Macrophages may be an important cell, since the migratory response to BLV was potentiated in mice pretreated with thioglycollate, but reduced when the peritoneal cavity was washed with sterile saline / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Edson Antunes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-23T23:47:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Castro_RogerioCardosode_M.pdf: 3886561 bytes, checksum: c35ba664a45d32de30c0463da101357e (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: Bothropstoxina-I (BthTX-I) e Bothropstoxina-II (BthTX-II) são sPLAzs homólogas com atividade miotóxica isoladas do veneno de Bothrops jararacussu. A primeira é completamente destituída de atividade enzimática in vitro ao passo que a BthTX-II apresenta atividade fosfolipásica muito baixa. Piratoxina-I (prTX-I) é uma sPLAz homóloga com atividade miotóxica isolada do veneno de Bothrops pirajai. Esta sPLAz também é destituída de atividade enzimática. O objetivo deste estudo foi investigar a atividade edematogênica da PrTX-I em pata e pele de ratos. Também avaliamos a participação do sítio catalítico e do conteúdo de cargas catiônicas presentes nesta sPLAz sobre o aumento de permeabilidade vascular. Em uma segunda etapa, o objetivo foi investigar a capacidade da PrTX-I, BthTX-I e BthTX-II de induzir migração leucocitária comparado com a sPLAz do veneno de Naja naja (atividade enzimática alta) e sPLAz pancreática (atividade enzimática intermediária). O envolvimento de mastócitos na migração leucocitária induzida pelas sPLAz homólogas também foi investigado. O edema de pata foi induzido pela injeção subplantar da PrTX-I na pata posterior esquerda dos animais e o volume da pata foi determinado utilizando um hidropletismômetro. O edema de pele foi determinado pelo acúmulo local de albumina humana marcada com lZ51 administrada por via intravenosa em ratos anestesiados (Sagatal; 30 mglkg,ip.). A degranulação de mastócitos pleurais e peritoneais foi conduzida pela determinação da liberação de [14C]5-HT utilizando um contador. A migração leucocitária foi determinada através da injeção das sPLAzs na cavidade pleural de ratos anestesiados com éter. Os animais foram sacrificados nos intervalos de 6, 12 e 48 h e a cavidade pleural foi lavada com 5 ml de PBS heparinizado (10 UI/ml). A contagem total e diferencial de leucócitos foi avaliada no lavado pleural A PrTX-I promoveu aumento de permeabilidade vascular em pele e pata de rato levando à formação de edema. A atividade edematogênica nos dois locais foi praticamente abolida nos animais pré-tratados com ciproheptadina (2 mglkg, i.p. 0.5 h antes). O p-BPB reduziu acentuadamente o edema induzido pela PrTX-I em pata e pele de ratos. O poliânion heparina reduziu significativamente o edema de pata (50 UI/pata), como também o edema de pele (5 UI/sítio) induzidos pela PrTX-I. Além disso, a PrTX-I (100 Ilglml) causou degranulação de mastócitos pleurais e peritoneais in vitro. O p-BPB e a heparina (50 UI/ml) inibiram significativamente a liberação de [14C]5-HT induzida pela PrTX-I em mastócitos pleurais e peritoneais de rato. Nossos resultados indicam que a formação de edema induzido pela PrTX-I é devido à degranulação in vivo de mastócitos. Uma vez que a PrTX-I não é ativa enzimaticamente sugerimos que a atividade pró-inflamatória das sPLA2s não está, necessariamente, ligada à atividade enzimática destas enzimas. Assim, sugerimos que o efeito da PrTX-I deva ser decorrente de um possível sítio farmacológico que seria formado principalmente por cargas catiônicas distribuídas na molécula da PrTX-I. Além disso, nós sugerimos cautela quanto ao uso do brometo de p-bromofenacil como ferramenta para avaliar o papel da atividade enzimática nos efeitos farmacológicos induzidos pelas sPLA2s. A sPLA2 de Naja naja (10 J.1g/cavidade) e BthTX-II (30 J.1g/cavidade) induziram influxo leucocitário de forma dose e tempo-dependentes caracterizado pela infiltração de neutrófilos e células mononucleares em 6 h. Na pleurisia induzida pela sPLA2 de Naja naja esta migração foi acompanhada por uma migração de eosinófilos em 12 h. Na pleurisia induzida pela BthTX-I e PrTX I (30 J.1g/cavidade cada) o pico de infiltração celular foi em 12 h e formado, tanto por células mononucleares e neutrófilos, como também por eosinófilos. O brometo de p-bromofenacil (P-BPB), um inbidor enzimático das sPLA2s, aboliu a atividade enzimática da sPLA2 de Naja naja e BthTX-II mas não apresentou efeito na pleurisia induzida pela sPLA2 de Naja naja, BthTX-I e Bth'FX-U. Surpreendentemente, o p-BPB reduziu parcialmente a pleurisia induzida pela PrTX-I. O tratamento prévio dos ~mais com ciproheptadina (10 mg/Kg, i.p.) não modificou a pleurisia induzida pela sPLA2 de Naja naja e BthTX-II. A depleção dos estoques de histaminalS-HT por injeções repetidas do composto 48/80 também não alterou a pleurisiã induzida pelas BthTXs e PrTX-I. ossos resultados demonstram que a migração leucocitária induzida pela sPLA2 de Naja naja, Bt}},TX-I, BthTX-II e PrTX-I independe da degranulação de mastócitos pleurais. Além disso, a hidrólise de fosfolipídeos por estas sPLA2s não é essencial para a infiltração leucocitária para cavidade pleural / Abstract: Bothropstoxin I (BthTX-I) and Bothropstoxin 11 (BthTX-II) are sPLAzs homologues with myotoxic activity isolated ITom Bothrops jararacussu venom. The former is devoided of enzymatic activity in egg yolk lecithin whereas the latter has low phospholipase activity in this substrate. Piratoxin-I (PrTX-I) is a PLAz homologue with myotoxic activity isolated ITom Bothrops pirajai venom. This sPLAz is also devoided of enzymatic activity. The aim of this study was to investigate the ability of PrTX-I, BthTX-I and BthTX-II to induce leucocyte migration compared with Naja naja PLAz (known to contain high enzymatic activity) and bovine pancreatic PLAz (known to contain intermediate enzymatic activity). We have also investigate the role of mast cells in the leucocyte migration induced by PrTX-I, BthTX-I and BthTX-II. Leucocyte migration was determined through of the injection of sPLAzs into the pleural cavity of male Wistar rats under ether anaesthesia. The animals were killed at 6, 12 and 48 h later and the pleural cavity rinsed with 5 rnl of PBS containing heparin (20 IU/rnl). Total and differencial leucocyte counts were evaluated in the pleural exudate. Naja naja PLAz (10 ~g/cavity) and BthTX-II (30 ~g/cavity) induced a dose- and time dependent rat pleural leucocyte influx characterized by an early neutrophil and mononuclear cells infiltration (6 h). This migration was followed by a late eosinophil and mononuclear cells influx (12 h) in the Naja naja PLAz- induced pleurisy. BthTX-I and PrTX-I (30 ~g/cavity each) induced dose and time-dependent rat pleural leucocyte influx characterized by an infiltration of neutrophils, eosinophils and mononuclear cells at 12 h. p-Bromophenacyl bromide (P-BPB), a compound known to inhibit phospholipase Az activity, abolished the enzymatic activity of Naja naja PLAz and BthTX11 but it had no effect on the pleurisy induced by Naja naja PLAz, BthTX-I and BthTX-II. Interestingly, p-bromophenacyl partially reduced the PrTX=:I-fuduced pleurisy. Previous treatment of the animals with cyproheptadine (10 mg/kg, i.p.) did not affect the pleurisy induced by Naja naja PLAz and BthTX-II. The depletion ofhistamine and 5-HT stores by repeated injections of compound 48/80 also failed to modify the pleurisy induced by BthTXs and PrTX-1. Qur results demonstrate that pleurisy mediated by Naja naja PLAz, BthTX-I, BthTX-II and PrTX-I is not dependent on pleural mast cell degranulation. Furthermore, hydrolysis of phospholipids by these sPLAzs is not essencial for the pleuralleucocyte infiltration. In the second part of this study the aim was to investigate the ability of PrTX-I to induce local oedema formation in both rat paw and skin in vivo. The importance of their catalytic and cationic sites were evaluated using p-BPB and heparin, respectively. Male Wistar rats were used. Paw oedema was induced by a subplantar injection of PrTX-I into the left hind-paw of animals and paw volume was measured using a hydroplethysmometer. Skin oedema formation was measured as the local accumulation of i.v. injected C25I]-human serum albumin into the skin sites of anaesthetized rats (Sagatal; 30 mglkg, i.p.). In vitro pleural and peritoneal mast cells degranulation was carried out by measuring the released [14C]5-HT using a f3 counter. PrTX-I caused dose-dependent rat paw and skin oedema. These oedematogenic activity were largely reduced in animals pretreated with cyproheptadine (2 mg/Kg, Lp. 0.5 h before). Similarly, pBPB significantly inhibited rat paw and skin oedema induced by PrTX-I. The polyanion heparin significantly reduced the paw oedema (50 IU/paw) as well as the skin oedema (5 IU/site) induced by PrTX-I. In addition, PrTX-I (100 Jlglrnl) caused in vitro pleural and peritoneal mast cells degranulation. p-BPB and heparin (50 IU/rnl) significantly inhibited the C4C]5-HT release induced by PrTX-I in both pleural and peritoneal mast cells. Our results indicate that oedema formation induced by PrTX-I is mostly dependent on in vivo mast cell degranulation. Since heparin reduced the oedematogenic activity of this sPLA2 homologue, it is likely that the cationic charge of this substance plays a role in the mast cell activation. Our results also indicate that p-bromophenacyl bromide may not be a suitable pharmacological tool to investigate th~ correlation between enzymatic activity and the inflammatory effects of phospholipases A2 / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Ciências