Orientadores : Julia Prado Franceschi, François Radvanyi / Tese (doutorado) - Universidade Estadualde Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-13T22:57:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Araujo_AlbetizaLobode_D.pdf: 9308594 bytes, checksum: 5d373ae25e509c651bc76131bf282c5e (MD5) Previous issue date: 1990 / Resumo: No presente trabalho procuramos inicialmente obter informações gerais sobre o veneno total de Bothrops lanceolatust comparando suas atividades enzimaticas com aquelas das Bothrops brasileiras, encontrando valores medios entre B. jararaca e B. jararacussu para atividade litica sobre caseina e TAME, como tambem em relação a atividade hemorragica. Apesar de não exibir efeito coagulante sobre o plasma, o veneno total coagula o fibrinogênio, apresenta atividade hemolitica indireta e prolonga o tempo de tromboplastina parcial ativada. Como esses dois ultimos efeitos foram mais evidentes com a fração F32 podemos caracteriza-la como uma fosfolipase A2 acida e anticoagulante. ... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: In the presente work we initially obtained some information on the crude venom of Bothrops lanceolatus comparing its enzymatic activities with those of Brazilian Bothrops species. Caseinolytic, TAMEesterase and "hemorrhagic activities were intermediate to those of B. jararaca and B. jararacussu. Despite having no coagulant effect on plasma, crude venom clotted fibrinogen, possessed indirect hemolytic activity and prolonged the partial thromboplastin time. Since these last two activities were most marked with fraction F32, this fraction may be characterized anticoagulant acidic phospholipase A2'. ... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Doutorado / Doutor em Ciências Biológicas

Submitted by Rosana Amâncio (rosana.amancio@ufcg.edu.br) on 2018-07-11T20:08:46Z No. of bitstreams: 1 propriedades eletronicas, ópticas e vibracionais da região C.pdf: 18345145 bytes, checksum: e90bc1985f0f75d2e3d83ecaa39d4a34 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-11T20:08:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 propriedades eletronicas, ópticas e vibracionais da região C.pdf: 18345145 bytes, checksum: e90bc1985f0f75d2e3d83ecaa39d4a34 (MD5) Previous issue date: 2016-07-29 / Neste trabalho, apresentamos um estudo das propriedades eletrônicas, ópticas, vibracionais e termodinâmicas da região C-Terminal de Fosfolipases A2 Lisina 49 (PLA2s Lys 49). Este foi realizado por meio de cálculos quânticos através da Teoria do Funcional da Densidade (DFT), utilizando a aproximação da densidade local (Local Density Approximation - LDA) e a aproximação do gradiente generalizado (Generalized Gradient Approximation - GGA). Também foram realizados cálculos baseados no modelo tight binding. As PLA2 Lys 49 compõe um grupo de miotoxinas que apresentam pouca ou nenhuma atividade catalítica e ainda assim são capazes de atuarem na membrana celular por meio de um mecanismo alternativo propiciando a morte da célula. A região C-terminal destas proteínas, em particular a região compreendida entre os aminoácidos 115-129, é apontada como responsável pelo dano as membranas. Pouco se sabe sobre as características que propiciam a esta região tal capacidade e como acontece a sua interação com a membrana celular. Este trabalho realizou uma caracterização das propriedades físicas desta região. Buscando, portanto, estabelecer uma relação entre as propriedades físicas expressas por essa região e seu potencial de dano celular. Um resultado inicial obtido por este estudo foram as curvas corrente-voltagem (I-V ) para nove diferentes peptídeos que correspondem as regiões 115-129 de PLA2 de diferentes espécies de serpentes. As curvas I-V foram obtidas por meio do modelo tight binding. Elas demostraram que os peptídeos estudados apresentam características de semicondutores. Também apresentam semelhança com resultados experimentais obtidos por LOMONTE et al, 2003. Usando a DFT, foram realizados os cálculos da área acessível ao solvente, da densidade eletrônica, análise populacional de cargas, orbitais de fronteira, densidade de estados. Também foram realizados cálculos de propriedades vibracionais como espectro infravermelho, de propriedades ópticas e das propriedades termodinâmicas como capacidade térmica, entropia, entalpia e energia livre. As propriedades eletrônicas demostram que há a possibilidade de que a interação da região C-Terminal com a membrana seja predominantemente eletrostática. A análise populacional de carga demostrou que o aminoácido Lisina 122 possui carga igual a zero. Este fato indica que ele pode não possuir papel importante como é descrito na literatura. Os resultados obtidos para a área acessível ao solvente indicam que um peptídeo com maior área disponível para interagir com a membrana não causará maior dano. Os resultados ópticos apresentaram picos de absorção dentro da região visível. Estes resultados juntamente com os resultados vibracionais servem como uma "digital" para a identificação dos peptídeos estudados. Os resultados termodinâmicos apresentados neste trabalhos podem ser utilizados em futuras pesquisas envolvendo PLA2s Lisina 49. / In this work, we present a study of the electrical properties, optical, vibrational and thermodynamic of the C-terminal Phospholipase A2 Lysine region 49 (PLA2 Lys 49). This was done by means of quantum calculations by Density Functional Theory (DFT), using the approach of Local Density Approximation (LDA) and the approach of the Generalized Gradient Approximation (GGA). They were also made calculations based on the model tight binding. The PLA2 Lys 49 composes myotoxins group that presents a little or no catalytic activity and still are able to act on the cell membrane by providing an alternative mechanism of cell's death. The C-terminal region of these proteins, in particular the region between amino acids 115-129 is identi_ed as responsible for the damage the membranes. Little is known about the characteristics that propitiate to this region such capacity and how are their interaction with the cell membrane. This work constitutes a characterization of the physical properties of this region. Searching, therefore, establish a relationship between the physical properties expressed by this region and its potential for cell damage. An initial results obtained in this study were current-voltage curves (I-V) for nine di_erent peptides corresponding to regions 115-129 PLA2 from di_erent snake species. The (I-V) curves were obtained by the model tight binding. They demonstrate that the peptides studied have semiconductor characteristics. They also have similarity with experimental results obtained by LOMONTE et al., 2003. Using the DFT were performed the calculations of the area accessible to the solvent, the electron density, population analysis of load, orbital border, and density of states. They were also carried out calculations of vibrational properties as infrared spectrum, optical properties and thermodynamic properties such as heat capacity, entropy, enthalpy and free energy. The electronic properties show that there is a possibility the interaction of the C-terminal region with the membrane it's predominantly electrostatic. The load population analysis showed that the amino acid Lysine 122 has load zero. This indicates that it may not have important role as described in the literature. The consequences obtained for the solvent accessible area indicates that a peptide with the largest area available to interact with the membrane not cause greater damage. The optical results presented absorption peaks in the visible region. These results together with the results vibrational serve like a "digital"to identify the studied peptides. The Thermodynamic results presented in this work can be used in future research involving PLA2 Lysine 49.

BARBOSA, Paulo Sérgio Ferreira. Efeitos renais de miotoxinas e lectinas purificadas dos venenos das serpentes Bothrops jararacussu e Bthrops moojeni : papel da ciclooxigenase e endotelina. 2006. 175 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2006. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-09-06T11:39:45Z No. of bitstreams: 1 2006_tese_psfbarbosa.pdf: 4134390 bytes, checksum: 386687118259e7d665fe77b7ce37b254 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-09-06T12:25:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_tese_psfbarbosa.pdf: 4134390 bytes, checksum: 386687118259e7d665fe77b7ce37b254 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-06T12:25:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_tese_psfbarbosa.pdf: 4134390 bytes, checksum: 386687118259e7d665fe77b7ce37b254 (MD5) Previous issue date: 2006 / Acute renal failure is one of the most common systemic complications after snakebite. However, its pathogenesis remains obscure. In this study, we evaluated the renal effects of Bothrops jararacussu myotoxins I and II (Bthtx-I Lys 49 and BthtxII, Asp 49), Bothrops moojeni myotoxin I and the lectins from Bothrops moojeni and Bothrops jararacussu. Attempting to investigate the mechanisms involved in the renal effects of the mentioned toxins, we tested indomethacin, an unespecific cyclooxigenase inhibitor. Additionally, tezosentan, an endothelin receptor blocker, was used to evaluate the role of endothelin in the renal effects of Bothrops moojeni myotoxin I. All myotoxins (5 µg/mL) and lectins (10µg /mL) were added to the perfusion system 30 min after the beginning of each perfusion. Indomethacin (10µg/mL) and tezosentan (10 µg /mL) were always added 30 minutes before the tested substances. The renal effects were compared against a control group, where kidneys were perfused only with the modified Krebs-Henseleit solution. Myotoxins from Bothrops jararacussu and the lectin from Bothrops moojeni increased the perfusion pressure (C120= 110.28 ± 3.09, Bthtx I120= 171.20 ± 6.3 * ,Bthtx II120= 175.50 ± 7.20 * and BmLec120= 152.50 ± 2.10 *), the renal vascular resistance (C120= 5.46 ± 0.54, Bthtx I120= 8.62 ± 0.37 *, Bthtx II120= 8.90 ± 0.36 * and BmLec120= 7.77 ± 0.30*), the urinary flow (C120= 0.143 ± 0.008, Bthtx I120= 0.326 ± 0.048*, and Bthtx II120= 0.373 ± 0.085* ), the glomerular filtration rate (C120= 0.678 ± 0.065, Bthtx I120= 0.855 ± 0.133 *, Bthtx II120= 1.224 ± 0.282* and BmLec120= 1.037 ± 0.055*) and the sodium, potassium and chloride excretion. On the other hand, the same substances decreased the percent of renal tubular transport of sodium (C120= 79.76 ± 0.56, Bthtx I120= 62.23 ± 4.12*, Bthtx II120= 70.96 ± 2.93* and BmLec60= 77.25 ± 1.36*), potassium (C60= 66.38 ± 3.31, Bthtx I60= 55.79 ± 5.57 *, Bthtx II60= 50.86 ± 6.16* and BmLec60= 59.78 ± 3.49*). Indomethacin inhibited the renal effects induced by Bothrops jararacussu myotoxin I and Bothrops moojeni lectin, but partially blocked the effects promoted by myotoxin II and the lectin of Bothrops jararacussu, and the effects of myotoxin I of Bothrops moojeni. Tezosentan inhibited the renal effects induced by B. moojeni myotoxin I. In conclusion, prostaglandins are involved in the renal alterations induced by myotoxins and lectins purified from the snake venoms of Bothrops jararacussu and Bothrops moojeni. In addition, endothelin is the main mediator of the renal alterations promoted by Bothrops moojeni myotoxin I / A insuficiência renal aguda é uma das complicações mais freqüentes nos envenenamentos ofídicos. Contudo, a sua patogênese permanece obscura. Em nossos estudos foram avaliados os efeitos renais causados pelas miotoxinas purificadas dos venenos das serpentes Bothrops jararacussu (Bthtx I, Lys 49 e Bthtx II, Asp 49) e Bothrops moojeni (BmTx I, Lys 49), assim como pelas lectinas dos venenos de Bothrops moojeni (BmLec) e Bothrops jararacussu (BJcuL). Tentando avaliar o mecanismo envolvido nos efeitos renais das substâncias acima mencionadas, foram testados os efeitos da indometacina, um bloqueador inespecífico de ciclooxigenase. Adicionalmente, foram avaliados os efeitos inibitórios do Tezosentan, um bloqueador de receptor de endotelina, nos efeitos renais causados pela miotoxina I da serpente Bothrops moojeni. Para tanto, as miotoxinas, na dosagem de 5µg/mL, ou as lectinas, na dosagem de 10µg/mL foram adicionadas 30 minutos depois do início dos experimentos. Contudo, a indometacina e o tezosentan foram adicionados no sistema de perfusão sempre no início de cada experimento na dosagem de 10µg/mL. Os efeitos renais foram comparados com um grupo controle, onde os rins foram perfundidos somente com a solução de Krebs-Henseleit modificada. Bthtx I, BthtxII e BmLec aumentaram a pressão de perfusão (C120= 110,28 ± 3,09, Bthtx I120 = 171,20 ± 6,3 *, Bthtx II120 = 175,50 ± 7,20 * e BmLec120 = 152,50 ± 2,10 *), a resistência vascular renal (C120= 5,46 ± 0,54, Bthtx I120= 8,62 ± 0,37 *, Bthtx II120= 8,90 ± 0,36 * e BmLec120= 7,77 ± 0,30*), o fluxo urinário (C120= 0,143 ± 0,008, Bthtx I120= 0,326 ± 0,048*, e Bthtx II120= 0,373 ± 0,085*, BmLec120= 0,085 ± 0,007* ), o ritmo de filtração glomerular (C120= 0,678 ± 0,065, Bthtx I120= 0,855 ± 0,133 *, Bthtx II120= 1,224 ± 0,282*, BmLec120=1,037 ± 0,055*) e a excreção de sódio potássio e cloreto (ENa+, EK+, ECl-). Porém, diminuíram os percentuais dos transportes tubulares de sódio (C120= 79,76 ± 0,56, Bthtx I120= 62,23 ± 4,12*, Bthtx II120= 70,96 ± 2,93* e BmLec60= 77,25 ± 1,36*) e potássio (C60= 66,38 ± 3,31, Bthtx I60= 55,79 ± 5,57 *, Bthtx II60= 50,86 ± 6,16* e BmLec60= 59,78 ± 3,49). A indometacina foi capaz de bloquear os efeitos causados pela miotoxina I da B. jararacussu e lectina da B. moojeni, mas reverteu parcialmente os efeitos causados pelas miotoxinas II e lectina da B. jararacussu e miotoxina I da B. moojeni. O tezosentan, por sua vez, bloqueou os efeitos causados pela miotoxina I da B. moojeni. Foi concluído que prostaglandinas estão envolvidas nas alterações renais promovidas pelas substâncias isoladas das serpentes B. jararacussu e B. moojeni, enquanto que endotelina seria o principal mediador nas alterações renais causadas pela miotoxina I da B. moojeni.

Resumo: No Brasil, existem vários animais de importância médica, as aranhas do gênero Loxosceles e as lagartas do gênero Lonomia em especial apresentam índices alarmantes de acidentes com humanos. Esses animais peçonhentos e traumatizantes podem provocar morbidez importante e algumas vezes mortalidade em humanos. Após a picada da aranha marrom (Loxosceles intermedia), as vítimas apresentam lesões cutâneas necróticas ao redor da picada e, em menor freqüência, sinais sistêmicos tais como insuficiência renal, coagulação intravascular disseminada e hemólise. Enquanto, o contato acidental com as cerdas pontiagudas contendo o veneno da lagarta (Lonomia obliqua) leva a dor em queimação, edema, eritema e em alguns casos hemorragias, hemólise e insuficiência renal. Neste presente trabalho, nós caracterizamos bioquímica e biologicamente seis isoformas recombinantes e uma isoforma mutada de fosfolipase-D presentes no veneno de Loxosceles intermedia. O tratamento de eritrócitos provenientes de sangue humano com as toxinas induziu experimentalmente hemólise direta de modo concentração- e tempo-dependentes. Os eritrócitos expostos à toxina fosfolipase-D recombinante apresentaram alterações morfológicas no tamanho e na forma, agregação dos lipid rafts e externalização de fosfatidilserina. A lise direta dos eritrócitos induzida pela fosfolipase-D recombinante depende da espécie do animal testado, já que eritrócitos obtidos a partir de humanos, de coelhos e de carneiros sofreram hemólise em uma porcentagem muito superior do que a observada com eritrócitos de cavalo. Em ensaios de microscopia confocal e imunofluorescência indireta, bem como em citometria de fluxo, utilizando uma toxina fluorescente recombinante GFPfosfolipase- D mostraram a ligação direta da toxina à membrana dos eritrócitos humanos. Além disso, observou-se que está enzima promove a hidrólise de fosfolipídios como a esfingomielina e lisofosfatidilcolina da membrana dos eritrócitos, formando ácido lisofosfatídico e ceramida-1-fosfato respectivamente, que são capazes de ativar uma série de enzimas intracelulares que culminam na morte e ruptura dos eritrócitos. Além disso, o tratamento com a fosfolipase-D recombinante estimula o influxo de cálcio detectado através de uma sonda fluorescente sensível ao cálcio (Fluo-4). Este influxo de cálcio mostrou ser mediado por canais de cálcio do tipo-L. Fazendo o uso de alguns inibidores sugere-se duas possíveis vias que explicam a hemólise induzida pela fosfolipase-D. A primeira através da formação de ácido lisofosfatídico e ativação dos receptores LPA1/LPA3 acoplados a proteína G e a segunda pela formação de eramida-1-fosfato e da sua interconversão em ceramida, esfingosina e esfingosina-1-fosfato. Desse modo, os resultados aqui descritos fornecem evidências de que as fosfolipases-D do veneno de L. intermedia desencadeiam a hemólise direta sobre de eritrócitos humanos de maneira dependente da atividade catalítica e que a ruptura das células ocorre com a formação de metabolitos bioativos que ativam cascatas de sinalização. Por fim, foi clonada uma nova fosfolipase A2 presente nas cerdas de Lonomia obliqua. Esta nova toxina foi parcialmente caracterizada, porém futuramente será feita uma avaliação mais aprofundada das suas características bioquímicas, estruturais e biológicas. Logo, esse estudo sobre as fosfolipases presente nos venenos de Loxosceles intermedia e de Lonomia obliqua pode auxiliar o melhor entendimento dos efeitos fisiopatológicos desenvolvidos nos acidentes com esses animais, assim como para o esenvolvimento de novas manobras terapêuticas e aplicações biotecnológicas e industriais.

Orientador: Sergio Marangoni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T03:14:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_MaristelaFreitas_D.pdf: 2808897 bytes, checksum: 76995e83de7c8efb20af2307e7a092b9 (MD5) Previous issue date: 1995 / Doutorado / Genetica / Doutor em Ciências Biológicas

Orientador: Benedito de Oliveira Filho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T05:29:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Valente_RichardHemmi_M.pdf: 3746690 bytes, checksum: b9cf26d655ff09edd9111b030c9a6161 (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: A crotoxina, isolada e cristalizada em 1938 por Slotta e Fraenkel-Conrat a partir do veneno total de Crotalus durissus terrificus mostrou ser um complexo resultante da interação quaternária de duas sub-unidades representadas por uma proteína ácida com massa molecular de 9 kDa denominada crotapotina e um componente básico, com massa molecular de 14,5 kDa que foi identificado como sendo uma fosfolipase A2 (PLA2 ). Esta última é considerada o principal componente responsável pelo desencadeamento dos efeitos farmacológicos induzidos pelo complexo crotoxina. Estudos mais recentes demonstraram a ocorrência de várias isoformas de PLA2, presentes em diferentes lotes de veneno coletados de várias serpentes, sendo tais isoformas decorrentes da expressão de diferentes RNAs mensageiros. As PLA2 (EC 3.1.1.4.) são enzimas que catalisam especificamente a reação de hidrólise da ligação acil-ester na posição sn-2 de fosfoglicerídeos numa reação dependente de álcio, liberando quantidades equimolares de ácidos graxos livres e lisofosfolipídeos. Já foi demonstrado que trações puras de PLA2 apresentam efeitos inibitórios marcantes sobre várias funções mitocondriais, reduzindo as atividades da NADH oxidase, das succinato e NADH-desidrogenase e da capacidade de fosforilação. Além disso, as PLA2 podem modificar a microviscosidade da fase lipídica da bicamada hidrofóbica de membranas, afetando a atividade funcional de enzimas ligadas à membrana, e, através desse mecanismo, regular vários processos metabólicos. No presente trabalho purificamos e caracterizamos, a partir da crotoxina, três isoformas de PLA2 (F1, F2 e F3) com elevado grau de pureza. As isoformas apresentaram massa molecular aparente com valor igual a 15 kDa e alta homologia seqüencial dos 20 resíduos N-terminais em comparação a isoformas já descritas na literatura. o efeito de cada isoforma de PLA2 purificada sobre mitocôndrias isoladas de fígado de rato foi determinado através de consumo de oxigênio durante o estado respiratório 4 e de inchamento mitocondrial. FI apresentou um estímulo dose dependente do consumo de oxigênio enquanto F2 e F3 causaram estímulo apenas em baixas concentrações e inibição em quantidades maiores. Esses efeitos foram completamente abolidos quando soro albumina bovina a 0,1% ou EGTA a 0,5mM estavam presentes no meio de incubação. Usando-se o inchamento mitocondrial como um parâmetro comparativo, todas as isoformas apresentaram o mesmo comportamento com intensidades diferentes, levando à permeabilização da membrana mitocondrial. Neste caso, a adição de EGTA preveniu o inchamento enquanto a soro albumina bovina foi ineficiente, indicando que o microambiente lipídico foi realmente afetado. Esses resultados sugerem que ácidos graxos livres liberados pela ação das isoformas são diretamente responsáveis pelos efeitos observados nos experimentos de consumo de oxigênio. A proteção oferecida pela CSA contra o inchamento causado pelas isoformas, principalmente quando estas estavam presentes em baixas concentrações, sugere que a ligação da CSA a um sítio da membrana mitocondrial protege esta última contra o ataque das PLA2. Já a pequena proteção oferecida pelo CAT, bem como o prevalecimento do pequeno efeito protetor do CAT quando utilizamos simultaneamente CSA e CAT, sugerem que a ligação do CAT ao seu sítio no carreador ADP/ATP impede a proteção conferida pela CSA / Abstract: Crotoxin, isolated and cristalized in 1938 by Slotta and Fraenkel-Conrat from Crotalus durissus terrificus venom showed to be a complex resultant from the quaternary association between two sub-units: an acidic protein with a molecular mass of 9 kDa named crotapotin and a basic component, with a molecular mass of 14.5 kDa which was identified as a phospholipase A2 (PLA2). This last one is considered to be the main component responsible for the pharmacological effects induced by the crotoxin complex. Recent studies have demonstrated the existence of several PLA2 isoforms which were present in different venom batches collected from several snakes. These isoforms result from the expression of different menssager RNAs. The PLA2 (EC 3.1.1.4) are enzimes that specifically catalyse the hydrolysis of the acyl-ester bond at the sn-2 position of phosphoglycerides in a calcium dependent reaction, producing equimolar amounts of ftee fatty acids and Iysophospholipids. It has already been demonstrated that purified PLA2 fractions show marked inhibitory effects on several mitochondrial features, decreasing NADH-oxidase, succinate and NADH-dehydrogenase activities and phosphorylation capacity. It is also known that PLA2 can modify the microviscosity of the lipid phase of the hydrophobic membrane bilayer, affecting the functional activity of membrane-bound enzymes, and through this mechanism regulate various metabolic processes. In the present work, we have purified and characterized, from crotoxin, three PLA2 isoforms (F1, F2 and F3) with high degree of purity. The isoforms presented an apparent molecular mass of 15 kDa and a high degree of homology regarding the 20 N terminal aminoacid residues when compared to other isoforms already described in the literature. The effect of each purified phospholipase A2 isoform on isolated rat liver mitochondria was determined through mitochondrial swelling and Oz consumption during respiratory state 4. FI showed a dose-dependent stimulation of O2 consumption while F2 and F3 caused stimulation only at low doses and inhibition at higher amounts. These effects were completely suppressed by the presence of 0.1% bovine serum albumin or 0.5mM EGTA in the incubation medium. Taking the mitochondrial swelling as a comparative parameter, alI of them presented the same behaviour at different intensities, leading to permeabilization of the mitochondrial membrane. In this case, addition of EGTA prevented it whereas bovine serum albumin was ineffective, indicating that the lipid microenvironrnent was actualIy,affected. These results suggest that free fatty acids must be directly responsible for the observed effects induced by hospholipase A2 isoforms on oxygen consumption experiments. The protection confered by cyclosporin-A on swelling induced by the isoforms, mainly when they were present in low concentrations, suggests that cyclosporin-A binding to a mitochondrial membrane site protects the membrane against the phospholipase A2 attack. On the other hand, the smalI protection confered by CAT, as well as the prevailment of the small protective CAT effect when we used both CSA and CAT, suggest that the CAT binding to the ADP/ ATP carrier inhibits the protection confered by CSA / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador : Sergio Marangoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-01T04:10:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ponce-Soto_LuisAlberto_M.pdf: 12886909 bytes, checksum: d45d6b46b5f324d21504b1ca07ebdfde (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: Crotalus durissus collilineatus é uma serpente de grande importância médica na região Centro Oeste do Brasil. Desta forma justifica-se o interesse em isolar e caracterizar compostos como a crotoxina que representa a principal fração do veneno bruto, com importantes atividades farmacológicas. Aproximadamente 20 mg de veneno total foram aplicados em uma coluna Protein Pack SW 300 (0,78X30cm Waters) acoplada a um sistema HPLC (Waters) resultando no isolamento da crotoxina. Nessa fase o perfil cromatográfico não mostrou a fração correspondente á crotamina o que reforça a importância do estudo da crotoxina desse veneno. O isolamento das frações crotapotina e fosfolipase A2 a partir da crotoxina purificada foi realizado em uma coluna de fase reversa, C-18 J.l-Boundapak em HPLC. Quatro isoformas de crotapotina, sendo as isoformas F3 e F4 majoritariamente recuperadas e apenas uma de fosfolipase A2, (F6) foram purificadas com um alto grau de pureza segundo a caracterização bioquímica e estudos eletroforéticos como SDS-PAGE revelando a massa mo/ecular a crotoxina de 24 kDa e da PLA2 de 15 kDa e das crotapotinas F3 e F4 com 9 kDa. O estudo em forma cruzada do efeito inibitório das crotapotinas sobre as PLA2 provenientes de Cdcoll, Cdt e Cdcas, sugere que as diferenças estruturais são responsveis pelas diferenças no mecanismo de inibição. A caracterização cinética da fosfolipase A2 de Cdcoll evidencia um comportamento de enzima alostérica em nossas condições experimentais, dado não relatado ainda na literatura especializada. Este fato reforçou nosso interesse em estabelecer comparações entre outras fosfolipases dependentes de calcio provenientes de veneno de serpentes que possuam um comportamento michaeliano. O efeito neurotóxico do veneno total, crotoxina, isoformas de crotapotina (F3 e F4); assim como a fração, PLA2 (F6) isolados, suas reassociações com a PLA2 (F6) de Cdcoll, foi estudada em registros miográficos, em preparações nervo frênico-diafragma isolado de camundongo e biventer cervicis de pintainho. Evidenciou-se ainda que a reassociação das isoformas da crotapotina de Cdcoll (F3 e F4) e a PLA2 (F6) restabelece o efeito bloqueador neuromuscular característico da crotoxina nativa. Foram realizadas abordagens bioquímica e farmacológica comparando as duas isoformas de crotapotina (F3 e F4) e reassociação de ambas com a fosofolipase isolada da mesma crotoxina de Cdcoll, são resultados ainda não registrados na bibliografía. Portanto este trabalho é importante para comprender a integridade ou pureza dos componentes isolados, assim como para identificar o efeito neurotóxico. É importante ressaltar que a reassociação entre as isoformas de crotapotina e fosfolipase (PLA2) não implicou em perda do efeito biológico, o que mostra que a metodologia utilizada foi satisfatória para a purificação das proteínas, preservando a integridade estrutural e funcional das isoformas estudadas / Abstract: Crotalus durissus collilineatus is a serpent of great medical importance in the region Center West of Brazil. af this form the interest in isolating is justified and characterizing composites as the crotoxina like that they present the main fraction of the raw poison, with important pharmacology activities. Approximately 20 mg of total poison had been applied in a column Protein Pack SW 300 (0,78X30cm Waters) coupled to a system HPLC (Waters) resulting in the isolation of the crotoxina. In this phase the chromatographic profile did not show crotamina to the corresponding fraction a what it strengthens the importance of the study of the crotoxina of this poison. The isolation of the fractions crotapotina and fosfolipase A2 from the crotoxina purificaty was carried through in a phase column reversa, C-18 I-l-Boundapak in HPLC. Four. isoformas of crotapotina (F3 and F4) to greater recover, and only one of phospholipase A2, (F6) they had been purificatory with one high degree of pureness according to characterization electrophoretics biochemist and studies as SDS-PAGE disclosing relative the molecular mass of the 24 kDa crotoxina of 15 kDa PLA2 kDa and the crotapotinas F3 and F4 with 9 kDa respectively. The inibitory effect of the crotapotins on the PLA2 in crossed form proceeding from CdcolI, Cdt and Cdcas discloses to differences structured in the inhibition mechanism. The kinetic characterization of phospholipase A2 de Cdcoll evidences a alosteritic enzyme behavior in our experimental conditions, still dates not told in specialized literature. This fact strengthened our interest in establishing matchings among others fosfolipases dependents of calcio proceeding from poison of serpents that possess a michaeliano behavior. The neurotoxicity effect of the total poison, as well as of the crotoxina, beyond the components of the crotoxina; isoforms of crotapotina (F3 and F4); as well as the fraction, PLA2 (F6) isolated, as of of these reasociations with PLA2 (F6) of Cdcoll, was studied in miographics registers, red tapes isolated nerve frenic-diaphragm of mouse and to biventer cervicis of chick. It was still proven that the to reconstruct of isoformas of the crotapotina of Cdcoll (F3 and F4) and PLA2 (F6) commit the effect choke to neuromuscular characteristic of the native crotoxina. Boardíngs the two biochemist and pharmacology comparing isoformas of crotapotina (F3 and F4) and to reconstruct of both with phospholipase isolated of the same crotoxina of Cdcoll, still not registered in the bibliography, for in such a way this whork were important to comprender the integrity or purity of the isolatedcomponents, as well as identifying the neurotoxocity effect. It is important to resaltar that the to reconstruct enters isoformas of crotapotina and phospholipase (PLA2) did not imply in loss of the biological effect, what sample that the used methodology was satisfactory for the purification of proteins, preserving studied the structural and functional integrity of isoformas / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Everardo Magalhães Carneiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-02T14:12:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nogueira_TatianeCristinadeAraujo_M.pdf: 6446233 bytes, checksum: b7dca032457cdd61b13fb51d4cca6714 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: As fosfolipases A2 (PLA2) desempenham importante papel no metabolismo de lipídios de membrana e estão intimamente relacionadas com a liberação de ácido araquidônico (AA), derivado dos lisofosfolípideos e estão presentes em diversos venenos extraídos de animais peçonhentos. A crotoxina é um composto extraído de venenos de cascavel e é constituída pela crotapotina e pela PLA2. A homologia das PLA2 de venenos com as dos mamíferos têm sido de grande utilidade no estudo de identificação de proteínas alvo, classificação de receptores de PLA2 endógenas e estudos funcionais de diferentes tecidos. Assim, o objetivo deste trabalho foi investigar o papel da crotoxina-like, extraída do veneno da cascavel Crotalus durissus collilineatus, e suas subunidades sobre a secreção de insulina por ilhotas de Langerhans, visando elucidar os mecanismos que estariam envolvidos na modulação da secreção de insulina em presença de diferentes agentes. Em experimentos realizados em ilhotas de Langerhans de ratos Wistar verificou-se que a crotoxina potencializa a secreção de insulina estimulada por 16.7 mM de glicose e este efeito é devido à subunidade PLA2 presente nesta toxina,uma vez que a crotapotina não afetou a secreção de insulina estimulada por glicose. Além disso, a PLA2 do veneno induziu aumento da secreção de insulina de maneira dose-dependente. A adição de glicose marcada na ausência de PLA2 induziu um aumento de liberação de 14CO2 de 30 ± 0.6 pmol/ilhota/90 min que foi similar aos valores obtidos na presença de PLA2 (32 ±1. 7 pmol/ilhota/min) Nifedipina (10 mM), um bloqueador de canais de cálcio, reduziu a secreção de insulina estimulada por potássio, mas não afetou a potencialização da secreção de insulina pela PLA2. O bloqueador de canais de sódio, tetrodotoxina (TTX) na concentração de 10 mM não alterou o aumento da secreção de insulina induzido pela PLA2. A quelação de cálcio extracelular por EGT A (0,5 mM) também não afetou a potencialização da secreção de insulina nas ilhotas de Langerhans de ratos estimulada pela PLA2. Estes resultados mostram que os mecanismos pelos quais a PLA2 eleva a secreção de insulina em ilhotas de Langerhans de ratos não envolvem o metabolismo da glicose, a ativação de canais de cálcio e sódio e a participação direta dos íons cálcio do meio extracelular. No entanto, a secreção de insulina potencializada pela PLA2 foi significativamente atenuada tanto pela incubação prévia das ilhotas de Langerhans com heparina (5 UI/m1) quanto pela adição de dexametasona (5 e 10 mM). Paralelo a potencialização da secreção de insulina, um aumento significativo do efluxo de ácido araquidônico foi observado em ilhotas de Langerhans de ratos em presença de PLA2. Assim, estes achados sugerem que a potencialização da secreção de insulina induzida pela PLA2 em baixa concentração ou concentração supralimiar de glicose está possivelmente relacionada com a mobilização de ácido araquidônico / Abstract: The crotoxin results from phospholipase A2 (PLA2) and crotapotin interaction. The PLA: acts in the membrane phospholipids generating arachidonic acid (AA). Venom PLA2 has been used as a pharmacological tool to identify target protein, mammalian receptor, and physiological cellular function. Therefore, the aim of this work was to study the role of crotoxin-like from Crotalus durissus colfjfjneatus and its subunits on the insulin secretion of the isolated rat Langerhans islets. Also, we investigated the underlying mechanisms by which the venom PLA2 would evoke insulin secretion in the presence of insulinotropic agents. Our experiments demonstrated that insulin secretion was potentialized by crotoxin in a dose-dependent manner in presence of low and high glucose concentration and this effect is related to PLA2. Neither glucose metabolism nor ionic channels (Ca+2 and Na+ channels) are involved in the enhancement of insulin secretion induced by PLA2 in isolated Langerhans islets since label glucose, nifedipine (10 mM) and tetrodotoxin (10 mM) did not affect this response. EGT A also did not interfere with the potentiation of insulin secretion induced PLA2 showing that extracellular calcium is not directly involved in this phenomenon. However, heparin and dexametasone significantly attenuated the increase of insulin secretion in response to PLA2.Moreover, the efflux of AA was markedly increased in parallel to enhancement of insulin secretion in isolated rat Langerhans islets. In conclusion, these findings show that the potentiation of insulin secretion induced by PLA2 in presence of glucose may be related to AA mobilization of Langerhans islets from rats / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-08-30Bitstream added on 2014-06-13T19:45:11Z : No. of bitstreams: 1 villaverde_aisb_dr_botfmvz.pdf: 3478993 bytes, checksum: d5ea0090ec4786ded2155ff7802d56fe (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O estudo da proteína fosfolipase C zeta (PLCζ), considerada o fator espermático ativador do oócito em mamíferos, pode beneficiar algumas técnicas de reprodução assistida, como a injeção espermática intracitoplasmática e transferência nuclear, por propiciar conhecimento a respeito do processo de fertilização e a possibilidade de utilização da PLCζ presente nos extratos espermáticos. Portanto, o objetivo deste estudo foi localizar a PLCζ em extratos provenientes do citosol e matriz perinuclear de espermatozóides de gatos domésticos normospérmicos e teratospérmicos. Amostras de sêmen foram colhidas de seis gatos adultos: normospérmicos (n=3), teratospérmicos (n=2) e de qualidade seminal intermediária (n=1). As proteínas do citosol foram extraídas utilizando os procedimentos de sonicação, ultracentrifugação, ultrafiltração e precipitação em sulfato de amônio. Por sua vez, as proteínas da matriz perinuclear foram extraídas após incubação em Na2CO3, sonicação, ultracentrifugação, ultrafiltração e precipitação em sulfato de amônio. Com base na avaliação ultraestrutural dos espermatozóides e dosagem de proteína total, foi confirmada a eficiência de ambos os protocolos de extração. As amostras da matriz perinuclear apresentaram 3,3 vezes menos proteína total e diferente perfil protéico na eletroforese unidimensional e bidimensional quando comparadas as amostras obtidas do citosol. Após análise das proteínas encontradas, foi concluído que nos extratos espermáticos do citosol e matriz perinuclear de gatos domésticos normospérmicos e teratospérmicos estão presentes proteínas de peso molecular semelhante ao previamente descrito para a proteína PLCζ em outras espécies de mamíferos / The study of phospholipase C zeta protein (PLCζ), considered as the oocyte activating sperm factor in mammals, could benefit some assisted reproductive techniques, such as intracytoplasmic sperm injection and nuclear transfer, by providing knowledge about the process of fertilization and the possibility of using the PLCζ contained in the sperm extracts. Thus, the aim of this study was to localize the phospholipase C zeta (PLCζ) protein in extracts from the spermatozoa cytosol and perinuclear matrix of normospermic and teratospermic domestic cat. Sperm samples were collected from six adult male cats: normospermic (n=3), teratospermic (n=2) and with intermediate sperm quality (n=1). Proteins from the cytosol were extracted using the procedures of sonication, ultracentrifugation, ultrafiltration and precipitation in ammonium sulfate. On the other hand, proteins from perinuclear matrix were extracted after incubation in Na2CO3, sonication, ultracentrifugation, ultrafiltration and precipitation in ammonium sulfate. Based on the ultrastructural analysis of the spermatozoa and total protein determination, the efficiency of both extraction protocols was confirmed. Samples from perinuclear matrix showed 3.3 times less total recovered protein and different protein profile in the uni- and bidimensional electrophoresis when compared to the samples obtained from the cytosol. After protein profile analysis, it can be concluded that several proteins showing similar molecular weight to that previously described for PLCζ protein in other mammalian species are presented in both sperm extracts from cytosol and perinuclear matrix of normospermic and teratospermic domestic cats

Resumo: As fosfolipases são uma família de enzimas encontradas em várias fontes biológicas incluindo os organismos procarióticos e eucarióticos. As aranhas do gênero Loxosceles, conhecidas popularmente como aranhas marrons, são eficazes em produzir em seus venenos uma grande proporção de fosfolipases-D. No veneno destas aranhas, estas enzimas estão relacionadas à dermonecrose, desregulação da resposta inflamatória, hemólise, nefrotoxicidade e agregação plaquetária. As fosfolipases-D catalizam a hidrólise de diferentes fosfolipídios gerando ácido fosfatídico, ou ácido lisofosfatídico, ou ceramida-1-fosfato, importantes mediadores nos eventos de sinalizações celulares. Alterações no padrão de expressão, atividade destas moléculas ou receptores para seus produtos tem sido relacionados com o desenvolvimento de muitos tumores. Desta forma, neste trabalho foi observado o efeito de uma fosfolipase-D exógena recombinante da glândula de veneno da aranha marrom Loxosceles intermedia (LiRecDT1) sobre as células das linhagens de melanoma murino B16-F10 e B16-F1. Por meio de experimentos de imunoblotting em duas dimensões com anticorpo contra a fosfolipase-D recombinante LiRecDT1 foi observada reatividade imunológica cruzada para pelo menos 25 spots no veneno bruto de L. intermedia, indicando alto nível de expressão para diferentes isoformas de fosfolipase-D. Experimentos de cinética de degradação de lipídios mostraram que esta toxina degrada de maneira tempo dependente tanto esfingomileina, gerando ceramida-1-fosfato e colina, quanto lisofosfatidilcolina, gerando ácido lisofosfatídico e colina e mostram menor atividade contra fosfatidilcolina. Através de experimentos de imunofluorescência com anticorpos contra LiRecDT1 e usando a toxina recombinante de fusão LiRecDT1-GFP foi observado a ligação direta de LiRecDT1 na membrana de células B16-F10. Também foi observado que a toxina recombinante LiRecDT1 tem acesso e degrada fosfolipídios das membranas das células B16-F10, observado em experimentos com extratos de membranas obtidos com detergente ou Ghosts de membrana pela geração de colina. Usando o Fluo-4 AM, um fluoróforo permeante sensível ao cálcio, foi possível observar que o tratamento das células B16-F10 e B16-F1 com a toxina LiRecDT1 induziu um aumento da concentração de cálcio no citoplasma. Em células B16-F10 também foram avaliadas a viabilidade e a morfologia após o tratamento com a fosfolipase-D recombinante e os resultados mostraram que não houve alterações sugerindo que a entrada de cálcio não foi decorrente a danos causados à membrana das células. Baseado no que é conhecido sobre a atividade de fosfolipases-D endógenas como indutores da proliferação celular e no fato de que LiRecDT1 se liga a superfície de células B16-F10 hidrolisando fosfolipídios e gerando lipídios bioativos, foi utilizada a toxina LiRecDT1 como uma fonte exógena de fosfolipase-D em células B16-F10. O tratamento destas células com a fosfolipase-D recombinante de aranha marrom foi efetivo no aumento da sua proliferação e de maneira tempo e concentração dependentes, especialmente na presença de esfingomielina sintética no meio. Estes resultados sugerem que a fosfolipase-D de aranha marrom pode ser usada como uma ferramenta bioativa para protocolos experimentais em biologia celular.