Orientadora : Profª Drª Olga Meiri Chaim / Coorientador : Prof. Dr. Silvio Sanches Veiga / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 01/02/2017 / Inclui referências : f. 110-130 / Resumo: As fosfolipases de aranhas do gênero Loxosceles, também conhecidas como toxinas dermonecróticas, são as toxinas do veneno melhor caracterizadas do ponto de vista bioquímica e biológica e estão relacionadas a diversos eventos, como hemólise, coagulação intravascular disseminada, edema e indução de resposta inflamatória. Os principais substratos lipídicos para estas toxinas são a esfingomielina e lisofosfatidilcolina que, após sua hidrólise, geram como produtos a ceramida-1-fosfato e o ácido lisofosfatídico, respectivamente, lipídeos bioativos que estão envolvidos em diversos processos celulares, incluindo a modulação da resposta inflamatória. A toxina LiRecDT1, a primeira isoforma de fosfolipase recombinante de L. intermedia caracterizada, além de promover o recrutamento de neutrófilos em pele de coelho, se liga à membrana de células endoteliais de aorta de coelho, promovem alterações morfológicas e induzem a reorganização de microdomínios de membrana caracterizados por lipid rafts, porém, os mecanismos envolvidos neste processo ainda permanecem desconhecidos. Desta forma, os objetivos deste trabalho compreenderam a análise dos mecanismos moleculares da ação do veneno e da LiRecDT1 após a interação com a membrana de células endoteliais, visando determinar as alterações morfológicas das células, alterações bioquímicas da membrana plasmática, e a possível internalização da toxina recombinante. Primeiramente, as toxinas LiRecDT1 e LiRecDT1/H12A (isoforma mutada com atividade residual) foram expressas em cepa de E. coli e então avaliadas em relação à sua atividade esfingomielinásica, de modo que as toxinas foram obtidas com alto grau de pureza e tanto o veneno como a LiRecDT1 apresentaram atividade esfingomielinásica, sendo que a LiRecDT1/H12A apresentou atividade residual. Em seguida, foi verificado que o veneno promove a desadesão de células endoteliais de aorta de coelho (RAEC) e que a LiRecDT1 promove a vacuolização citoplasmática e alteração na morfologia celular após 2 horas de incubação com a toxina, sendo que este evento é observado até 24 horas. Ainda, a interação da LiRecDT1 com a membrana plasmática destas células foi avaliada por microscopia de fluorescência confocal, TIRF, e de super-resolução, onde foi possível visualizar que a LiRecDT1 se liga à membrana das células e promove a reorganização de lipid rafts após 1 hora, e se liga à caveolina-1 presente nestes domínios de maneira tempo-dependente. Ainda, os dados da microscopia de super-resolução sugeriram a possível endocitose da LiRecDT1, o que foi comprovado pela co-localização com proteínas do sistema endossomo/lisossomo após 1 e 4 horas, por microscopia confocal. Sendo assim, fica evidente que a toxina interage com a membrana plasmática de células endoteliais, especificamente com microdomínios de lipid rafts, e é internalizada e endereçada para compartimentos do sistema endossomo/lisossomo. Contudo, novos estudos devem ser realizados a fim de caracterizar possíveis parceiros moleculares para a LiRecDT1, assim como investigar vias de sinalização ativadas/inativadas decorrentes da reorganização dos microdomínios de membrana. Além disso, é discutida a possibilidade de a LiRecDT1 estar sendo enviada para a membrana ou até mesmo ser exocitada após a sua internalização, de modo que outros destinos intracelulares para a toxina recombinante podem ser exploradas. Palavras-chace: Fosfolipases-D, L. intermedia, lipid rafts, endocitose / Abstract: Phospholipases from Loxosceles spiders, also known as dermonecrotic toxins, are the best-characterized toxins in the venom regarding their biochemical and biological activities, and they are related to several events such as hemolysis, disseminated intravascular coagulation, edema, and induction of inflammatory responses. Their main lipid substrates are sphingomyelin and lysophosphatidylcholine, that, agter hydrolysis, generate ceramide-1-phosphate and lysophosphatidic acid as subproducts, respectively, which are bioactive lipids involved in cellular processes including the modulation of inflammatory responses. The toxin LiRecDT1, the first characterized recombinant phospholipase isoform from L. intermedia, besides recruiting neutrophils in rabbit skin, binds rabbit aorta endothelial cells membrane, and induce lipid raft reorganization, however, the mechanisms that drive such process remain unknown. Thus, the objectives os this work regarded the analysis of the molecular mechanisms of action of the venom and LiRecDT1 after interaction with endothelial cell membrane, aiming to determine the cell morphological alterations, plasma membrane biochemical alterations, and the possible internalization of the recombinant toxin. First, the toxins LiRecDT1 and LiRecDT1/H12A (mutated isoform with residual activity) were expressed in an E. coli strain and then evaluated in relation to their sphingomyelinase activity. The toxins were obtained with high putiry levels and the venom and LiRecDT1 showed sphingomyelinase activity, and LiRecDT1/H12A showed only residual activity. After, it was shown that the venom promotes rabbit aorta endothelial cell (RAEC) detachment, and that LiRecDT1 induces cell vacuolization and cell morphology alteration after two hours incubation with the toxin, event still observed after 24 hours. Moreover, the interaction of LiRecDT1 with the plasma membrane of these cells was evaluated by confocal fluorescence microscopy, TIRF, and superresolution microscopy, where it was observed that LiRecDT1 binds the cell membrane and promote lipid raft reorganization after 1 hour, and binds caveolin- 1 present in these domains in a time-dependent manner. Data from the superresolution microscopy suggested the possible LiRecDT1 endocytosis, which was proved to be true after the co-localization with proteins present in endosome/lysosome compartments after 1 and 4 hours, by confocal microscopy. Thus, its evident that the toxin interacts with endothelial cell plasma membrane , especifically with lipid rafts, and is internalized and sent to endosomal/lysosomal compartments. However, more studies must be taken in order to characterize possible molecular partners for LiRecDT1, as well as investigate signaling pathways modulated by the reorganization of lipid rafts. Besides, the possibility of LiRecDT1 being sent to the membrane or even being exocytosed after its internalization is discussed, as other intracellular targets for the recombinant toxin may be explored. Key words: Phospholipases-D, L. intermedia, lipid rafts, endocytosis.

Made available in DSpace on 2015-09-17T15:25:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-03-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:46:30Z : No. of bitstreams: 1 000846264.pdf: 4110745 bytes, checksum: 9413f0f4aa0915b943ec1e5d62692439 (MD5) / O objetivo do presente estudo in vitro foi avaliar a interação entre os microorganismos C. albicans, S. aureus sensível (MSSA) e resistente (MRSA) à meticilina com relação a alguns dos seus principais fatores de virulência. Estes fatores foram analisados considerando os micro-organismos isoladamente e em culturas mistas. Foi verificada a interação entre esses micro-organismos através da contagem do número de colônias viáveis (UFC/mL), análise da atividade metabólica por meio do ensaio XTT e quantificação da biomassa total por meio do corante cristal violeta nos tempos de 90 minutos, 12, 24 e 48 horas. Para análise da produção de proteinase (SAP) e fosfolipase (PL-C), kits fluorimétricos foram utilizados. A estrutura dos biofilmes foi avaliada por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Culturas simples e mistas dos micro-organismos também foram utilizadas para infectar um epitélio oral humano reconstituído (EOHR). A capacidade de colonização e invasão foi avaliada após 24 horas utilizando a técnica de hibridização in situ (PNA-FISH). A avaliação do dano causado pelos micro-organismos ao tecido foi realizada por quantificação da liberação da enzima lactato desidrogenase (LDH). Técnicas moleculares (RT-qPCR) foram empregadas para quantificação do número de micro-organismos colonizando o epitélio e também para avaliação da expressão de genes de virulência. A expressão gênica foi avaliada em superfície biótica (EOHR) e abiótica (placa de poliestireno de 24 poços) para culturas simples e mistas dos micro-organismos. Os resultados dos ensaios de quantificação foram analisados utilizando ANOVA a dois critérios com teste post-hoc de Tukey (α = 0,05), enquanto os dados de atividade enzimática foram analisados por ANOVA a um critério com correção de Welch seguido pelo teste de Games-Howell. Os resultados da expressão gênica foram... (Resumo completo clicar acesso eletrônico) / The aim of this study was to evaluate, in vitro, the interaction between C. albicans and methicillinsusceptible (MSSA) and resistant (MRSA) S. aureus in relation to some of their major virulence factors. These factors were analyzed considering the three microorganisms in single and dual cultures. The interaction between these microorganisms was evaluated by counting colony-forming units (CFU/mL), analysis of metabolic activity by the XTT assay and quantification of the total biomass by crystal violet dye at 90 minutes, 12, 24, and 48 hours. To analyze the production of proteinase (SAP) and phospholipase (PL-C), fluorometric kits were used. The structure of the biofilms was acessed by scanning electron microscopy (SEM). Further, single and dual cultures of microorganisms were used to infect a reconstituted human oral epithelium (RHOE). The pattern of colonization and invasion of the RHOE was evaluated after 24 hours using the in situ hybridization technique (PNA-FISH). The damage caused by microorganisms in the tissue was evaluated by quantification of the lactate dehydrogenase enzyme (LDH) released. Molecular techniques (RT-qPCR) were also used to quantify the number of microorganisms colonizing the epithelium and to evaluate the expression of virulence genes. Gene expression was evaluated in biotic (RHOE) and abiotic (24-well polystyrene microplate) surfaces for single and dual cultures. The results from quantification assays were compared using two-way ANOVA with Tukey post-hoc test, while data from enzymatic activities were analyzed by one-way Welch-ANOVA followed by Games-Howell post hoc test. The results of gene expression were analyzed by one-way ANOVA with Tukey for data satisfying the assumptions of normality and homoscedasticity or one-way Welch-ANOVA followed by Games-Howell for heteroscedastic data. LDH results were also...(Complete abstract electronic access below)

Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Coorientador: Débora Colombi / Banca: Consuelo L. Fortes-Dias / Banca: Marcelo Fossey / Banca: Paulo Eduardo M. Ribolla / Banca: João Renato Carvalho Muniz / Resumo: Ainda nos dias de hoje, o envenenamento ofídico é um problema de saúde pública, afetando sobretudo, regiões de clima tropical, subtropical e áreas rurais de países da África, Ásia, Oceania e América Latina. No Brasil, os gêneros de serpentes Bothrops e Crotalus são responsáveis por quase 90% dos acidentes ofídicos, sendo que os acidentes provocados por este último apresentam relativa alta taxa de mortalidade. O veneno das serpentes do gênero Bothrops possuem uma classe de fosfolipases A2, as Lys49-PLA2s, que não possuem atividade catalítica, mas são capazes de induzir a mionecrose por uma mecanismo não catalítico que não é totalmente conhecido. Com relação às fosfolipases A2 veneno das serpentes do gênero Crotalus, o complexo crotoxina, formado pela crotoxina A (não catalítica) e a crotoxina B (catalítica) pode constituir até cerca de 60% do veneno desses animais, como no caso da subespécie Crotalus durissus terrificus, e é uma potente neurotoxina que provoca um grande bloqueio da transmissão neuromuscular. Neste trabalho, utilizando diversas técnicas teóricas e experimentais, sobretudo cristalografia de raios X, são apresentados diversos resultados que visam aprofundar o conhecimento acerca do funcionamento destas proteínas. Com relação à crotoxina, é apresentado a estrutura cristalográfica da crotoxina B de Crotalus durissus colillineatus, a expressão heteróloga da isoforma CBa2 da crotoxina B de Crotalus durissus terrificus para a posterior produção de formas mutantes sítio-dirigidas e resultados da análise do espalhamento de raios X a baixo ângulo da crotoxina e de suas subunidades isoladas, gerando informações relevantes e inéditas acerca da oligomerização destas proteínas. No caso das Lys49-PLA2s isoladas do veneno botrópico, são apresentadas duas novas estruturas cristalográficas dessa classe de proteínas isolada da serpente amazônica B. brazili. A análise ... / Abstract: Snakebite is a very serious public health problem still today, affecting tropical and subtropical countries, especially the rural areas of Africa, Asia, Oceania and Latin America. In Brazil, Bothrops and Crotalus snake genus are responsible of almost 90% of snakebites. The venoms of Bothrops snakes have a class of phospholipases A2, known as Lys49-PLA2s, which do not have catalytic activity. However, they are able to induce myonecrosis by a non-catalytic mechanism that is not fully understood. In the venom of Crotalus snakes, a phospholipase A2, known as crotoxin constitutes about 60% of the venom from these animals. This protein is a potent neurotoxin that causes a large block of neuromuscular transmission formed by complexation of crotoxin A (non-catalytic) and crotoxin B (catalytic). In this work, it was used several theoretical and experimental techniques, in particular X-ray protein crystallography, to generate information to extend the knowledge of the action of these proteins. Regarding to crotoxin, the crystal structure of crotoxin B isolated from Crotalus durissus colillinetaus was solved and the heterologous expression of isoform CBa2 of crotoxin B from Crotalus durissus terrificus was performed, in order to, subsequently, produce site-directed mutants. Furthermore, it is presented small angle X-ray scattering experiments with the crotoxin and its isolated subunits that provided intriguing and novel information about the oligomerization of these proteins. Regarding to Lys49-PLA2s from Bothrops snakes, it is presented two new crystal structures of this class isolated from Amazonian snake B. brazili. The analysis of these structures and the structural comparison to other Lys49-PLA2s crystallographic structures generated new information about the position of hydrophobic residues in C-terminal portion of these proteins. This information led us to a new proposition of the mechanism of action of these proteins. It is also presented ... / Doutor

Orientador: Marcos Hikari Toyama / Banca: Selma Dzimidas Rodrigues / Banca: Luciana Reitz de Carvalho / Resumo: Os estudos na área de biotecnologia marinha vêm crescendo nas ultimas décadas e os trabalhos recentes têm revelado inúmeros compostos com potencial farmacológico. O Brasil apresenta um extenso litoral, bastante diversificado em espécies e recursos abundantes para uma pesquisa tecnológica dos organismos marinhos. Os polissacarídeos sulfatados de algas já vêm sendo utilizados em diversas aplicações, principalmente inibindo a atividade de determinadas enzimas, como aquelas relacionadas à cascata de coagulação. Este estudo teve como objetivo mostrar a relevância destas moléculas na modulação das atividades enzimática e inflamatórias das Fosfolipases A2 secretórias extraídas do veneno da Crotalus durissus terrificus. O estudo mostrou que os efeitos biológicos e farmacológicos estão relacionados com a fonte dos polissacarídeos sulfatados, ou seja, a macroalga de origem, mas também com sua estrutura química, a composição dos açucares e a massa molecular. Através da cromatografia por exclusão molecular foi possível identificar as massas moleculares aproximadas dos açucares e também pode revelar a interação existente entre a Fosfolipase A2 e os polissacarídeos sulfatados. Os testes enzimáticos revelaram que a ação fosfolipásica é dose dependente do açúcar, ou seja, em baixas doses de polissacarídeos sulfatados das macroalgas Botryocladia occidentalis e Codium isthmocladum, a atividade da Fosfolipase A2 diminuiu e aumentou, respectivamente. Porém, em altas doses, a atividade enzimática aumentava e diminuía, respectivamente, para as mesmas algas. A atividade enzimática diminuiu ao longo do tempo para o polissacarídeo sulfatado da Caulerpa racemosa. Para esta clorófita, a atividade edematogênica aumentou enquanto para as outras diminuíam, bem como para o teste de miotoxicidade / Abstract: Studies in the field of marine biotechnology have been growing in recent decades, and recent studies have revealed numerous compounds with pharmacological potential. Brazil has an extensive coastline, quite diverse in species and abundant resources for technological research of marine organisms. The sulfated polysaccharides of algae have already been used in several applications, mainly by inhibiting the activity of certain enzymes, such as those related to the coagulation cascade. This study aimed to show the relevance of these molecules in the modulation of inflammatory and enzymatic activities of Phospholipase A2 secretory extracted from the venom of Crotalus durissus terrificus. The study showed that the biological and pharmacological effects are related to the source of sulfated polysaccharides, or origin of the seaweed, but also their chemical structure, composition and molecular weight of sugars. Through molecular exclusion chromatography was possible to identify approximate molecular masses of sugars and can also reveal the interaction between the phospholipase A2 and sulfated polysaccharides. The tests revealed that the enzyme phospholipase action is dose-dependent sugar, or low doses of sulfated polysaccharides of macroalgae and Codium isthmocladum, Botryocladia occidentalis, the phospholipase A2 activity decreased and increased, respectively. However, at high doses, the enzyme activity increased and decreased, respectively, for the same algae. The enzyme activity decreased over time for the sulfated polysaccharide the Caulerpa racemosa. For this seaweed, the enzymatic activity increased while the edema decreased / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-09-04Bitstream added on 2014-06-13T20:29:44Z : No. of bitstreams: 1 000736000.pdf: 1119345 bytes, checksum: 15a1cf62b53cf447a235fce25ed7705b (MD5) / Os estudos na área de biotecnologia marinha vêm crescendo nas ultimas décadas e os trabalhos recentes têm revelado inúmeros compostos com potencial farmacológico. O Brasil apresenta um extenso litoral, bastante diversificado em espécies e recursos abundantes para uma pesquisa tecnológica dos organismos marinhos. Os polissacarídeos sulfatados de algas já vêm sendo utilizados em diversas aplicações, principalmente inibindo a atividade de determinadas enzimas, como aquelas relacionadas à cascata de coagulação. Este estudo teve como objetivo mostrar a relevância destas moléculas na modulação das atividades enzimática e inflamatórias das Fosfolipases A2 secretórias extraídas do veneno da Crotalus durissus terrificus. O estudo mostrou que os efeitos biológicos e farmacológicos estão relacionados com a fonte dos polissacarídeos sulfatados, ou seja, a macroalga de origem, mas também com sua estrutura química, a composição dos açucares e a massa molecular. Através da cromatografia por exclusão molecular foi possível identificar as massas moleculares aproximadas dos açucares e também pode revelar a interação existente entre a Fosfolipase A2 e os polissacarídeos sulfatados. Os testes enzimáticos revelaram que a ação fosfolipásica é dose dependente do açúcar, ou seja, em baixas doses de polissacarídeos sulfatados das macroalgas Botryocladia occidentalis e Codium isthmocladum, a atividade da Fosfolipase A2 diminuiu e aumentou, respectivamente. Porém, em altas doses, a atividade enzimática aumentava e diminuía, respectivamente, para as mesmas algas. A atividade enzimática diminuiu ao longo do tempo para o polissacarídeo sulfatado da Caulerpa racemosa. Para esta clorófita, a atividade edematogênica aumentou enquanto para as outras diminuíam, bem como para o teste de miotoxicidade / Studies in the field of marine biotechnology have been growing in recent decades, and recent studies have revealed numerous compounds with pharmacological potential. Brazil has an extensive coastline, quite diverse in species and abundant resources for technological research of marine organisms. The sulfated polysaccharides of algae have already been used in several applications, mainly by inhibiting the activity of certain enzymes, such as those related to the coagulation cascade. This study aimed to show the relevance of these molecules in the modulation of inflammatory and enzymatic activities of Phospholipase A2 secretory extracted from the venom of Crotalus durissus terrificus. The study showed that the biological and pharmacological effects are related to the source of sulfated polysaccharides, or origin of the seaweed, but also their chemical structure, composition and molecular weight of sugars. Through molecular exclusion chromatography was possible to identify approximate molecular masses of sugars and can also reveal the interaction between the phospholipase A2 and sulfated polysaccharides. The tests revealed that the enzyme phospholipase action is dose-dependent sugar, or low doses of sulfated polysaccharides of macroalgae and Codium isthmocladum, Botryocladia occidentalis, the phospholipase A2 activity decreased and increased, respectively. However, at high doses, the enzyme activity increased and decreased, respectively, for the same algae. The enzyme activity decreased over time for the sulfated polysaccharide the Caulerpa racemosa. For this seaweed, the enzymatic activity increased while the edema decreased

Made available in DSpace on 2016-06-07T17:12:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-09-29. Added 1 bitstream(s) on 2016-06-07T17:17:05Z : No. of bitstreams: 1 000864119_20161015.pdf: 820535 bytes, checksum: 8cfc04e894aa886137e9ca9b9cd3aae0 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-10-17T11:54:15Z: 000864119_20161015.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-10-17T11:54:54Z : No. of bitstreams: 1 000864119.pdf: 2517185 bytes, checksum: f66c5ecaac1008f20a8256cf9a4604ed (MD5) / Esfingomielinase D (SMase D) é uma enzima conhecida por catalisar a clivagem de esfingomielina em ceramida-1-fosfato e colina, atividade presente apenas em aranhas do gênero Loxosceles (aranhas marrom) e em bactérias patogênicas do tipo Corynebacterium. A SMase D, também encontrada na literatura como fosfolipase D, é o principal componente do veneno de aranhas do gênero Loxosceles, capaz de induzir sozinha as lesões dermonecróticas características do loxoscelismo. Apesar da importância clínica, poucos detalhes sobre o mecanismo de ação destas enzimas são conhecidos. Neste trabalho, o mecanismo catalítico das SMases D de aranhas do gênero Loxosceles é estudado através de métodos computacionais como docking, dinâmica molecular clássica, simulações a pH constante e métodos híbridos QM/MM. Primeiramente são avaliadas as interações da SMase D com o íon sulfato, mio-inositol-1-fosfato, o substrato esfingomielina e o inibidor suramina, assim como os prováveis estados de protonação das histidinas 12 e 47 na presença e ausência de ligantes. A seguir, a barreira de energia livre experimental para liberação da colina é estimada em 21 kcal/mol através da teoria do estado de transição e da constante catalítica (kcat) da SMase D de Loxosceles laeta. Este valor é comparado às energias de ativação calculadas em simulações QM/MM para as vias de catálise covalente (entre 18 e 24 kcal/mol) e não covalente (25 kcal/mol), os quais correlacionam bem com o valor de 21 Kcal/mol, estimado experimentalmente. Adicionalmente, é sugerido um papel crucial para o grupo hidroxila da esfingomielina no processo de catálise. Dependendo do modo de ligação da hidroxila, a catálise pode ser covalente ou não covalente, com produtos distintos nos dois tipos de catálise. Interessante notar que os dois processos possuem energias de ativação comparáveis, em torno de 25 Kcal/mol, o que poderia supor que os dois processos são... / Sphingomyelinases D (SMase D) are enzymes that catalyze sphingomyelin in ceramida-1-fosfate and choline. This activity is only found in Loxosceles brown spiders and Corynebacterium pathogenic bacterias. SMase D, or phospholipase D, is the main component of spider venoms of the genus Loxosceles, being able to induce the characteristic dermonecrotic features of the whole venom. Despite of the clinical importance o these enzymes, their action mechanism is not completely described. In this work, the catalytic mechanism of SMases D against sphingomyelin is studied through computational methods like docking, classical molecular dynamics, constant pH simulations and hybrid methods QM/MM. First, molecular interactions of SMases D with sulfate ion, myo-inositol-1-phosphate, sphingomyelin (the substrate) and suramin inhibitor are evaluated, as well as the protonation states of the catalytic histidines, 12 and 47, in presence or absence of ligands in the active site. Then, the free energy barrier of 21 kcal/mol for choline release is estimated using the transition state theory and the catalytic constant of Loxosceles laeta activity (kcat). This value is compared to the activation energies obtained through QM/MM simulations for covalent (between 18 and 24 kcal/mol) and non-covalent (25 kcal/mol) pathways. Additionally, the hydroxyl group of sphingomyelin is proposed to play a crucial role in the catalytic mechanism. Depending on the binding way of the hydroxyl group, the catalysis may be covalent or non-covalent, with different reaction products in each case. Interestingly, the two processes showed similar activation energies, suggesting that they may be equally probable, as discussed in some experimental studies for different phospholipase D. Finally, the affinity of SMases for mimetic membranes is discussed

Orientador: Jorge Chahine / Banca: Ronaldo Júnio De Oliveira / Banca: José Fernando Ruggiero Bachega / Banca: Gabriel Gouvêa Slade / Banca: Fábio Rogério de Moraes / Resumo: Esfingomielinase D (SMase D) é uma enzima conhecida por catalisar a clivagem de esfingomielina em ceramida-1-fosfato e colina, atividade presente apenas em aranhas do gênero Loxosceles (aranhas marrom) e em bactérias patogênicas do tipo Corynebacterium. A SMase D, também encontrada na literatura como fosfolipase D, é o principal componente do veneno de aranhas do gênero Loxosceles, capaz de induzir sozinha as lesões dermonecróticas características do loxoscelismo. Apesar da importância clínica, poucos detalhes sobre o mecanismo de ação destas enzimas são conhecidos. Neste trabalho, o mecanismo catalítico das SMases D de aranhas do gênero Loxosceles é estudado através de métodos computacionais como docking, dinâmica molecular clássica, simulações a pH constante e métodos híbridos QM/MM. Primeiramente são avaliadas as interações da SMase D com o íon sulfato, mio-inositol-1-fosfato, o substrato esfingomielina e o inibidor suramina, assim como os prováveis estados de protonação das histidinas 12 e 47 na presença e ausência de ligantes. A seguir, a barreira de energia livre experimental para liberação da colina é estimada em 21 kcal/mol através da teoria do estado de transição e da constante catalítica (kcat) da SMase D de Loxosceles laeta. Este valor é comparado às energias de ativação calculadas em simulações QM/MM para as vias de catálise covalente (entre 18 e 24 kcal/mol) e não covalente (25 kcal/mol), os quais correlacionam bem com o valor de 21 Kcal/mol, estimado experimentalmente. Adicionalmente, é sugerido um papel crucial para o grupo hidroxila da esfingomielina no processo de catálise. Dependendo do modo de ligação da hidroxila, a catálise pode ser covalente ou não covalente, com produtos distintos nos dois tipos de catálise. Interessante notar que os dois processos possuem energias de ativação comparáveis, em torno de 25 Kcal/mol, o que poderia supor que os dois processos são... / Abstract: Sphingomyelinases D (SMase D) are enzymes that catalyze sphingomyelin in ceramida-1-fosfate and choline. This activity is only found in Loxosceles brown spiders and Corynebacterium pathogenic bacterias. SMase D, or phospholipase D, is the main component of spider venoms of the genus Loxosceles, being able to induce the characteristic dermonecrotic features of the whole venom. Despite of the clinical importance o these enzymes, their action mechanism is not completely described. In this work, the catalytic mechanism of SMases D against sphingomyelin is studied through computational methods like docking, classical molecular dynamics, constant pH simulations and hybrid methods QM/MM. First, molecular interactions of SMases D with sulfate ion, myo-inositol-1-phosphate, sphingomyelin (the substrate) and suramin inhibitor are evaluated, as well as the protonation states of the catalytic histidines, 12 and 47, in presence or absence of ligands in the active site. Then, the free energy barrier of 21 kcal/mol for choline release is estimated using the transition state theory and the catalytic constant of Loxosceles laeta activity (kcat). This value is compared to the activation energies obtained through QM/MM simulations for covalent (between 18 and 24 kcal/mol) and non-covalent (25 kcal/mol) pathways. Additionally, the hydroxyl group of sphingomyelin is proposed to play a crucial role in the catalytic mechanism. Depending on the binding way of the hydroxyl group, the catalysis may be covalent or non-covalent, with different reaction products in each case. Interestingly, the two processes showed similar activation energies, suggesting that they may be equally probable, as discussed in some experimental studies for different phospholipase D. Finally, the affinity of SMases for mimetic membranes is discussed / Doutor

Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Banca: Richard John Ward / Banca: Roberto Morato Fernandez / Banca: João Alexandre Ribeiro Gonçalves Barbosa / Resumo: Neste trabalho foram realizados estudos estruturais experimentais e teóricos com a BthA-I e a BjussuMP-I, duas proteínas isoladas do veneno de Bothrops jararacussu. A proteína BthA-I é uma fosfolipase A2 (PLA2) ácida com elevada atividade catalítica e que possui a capacidade de inibir a agregação de plaquetas e reduzir a pressão arterial. Cristais da BthA-I nativa e de sua forma quimicamente modificada pelo pBPB (brometo de p-bromofenacila), um conhecido inibidor de a PLA2s que também é capaz de suprimir os mecanismos farmacológicos próprios desta proteína, foram obtidos e submetidos a experimentos de difração de raios-X. A estrutura cristalina da BthA-I foi elucidada a 1,9 Å de resolução e o processamento dos dados experimentais revelou a presença de dois monômeros na unidade assimétrica. A análise estrutural destes monômeros revelou que a BthA-I dimérica possui uma conformação oligomérica distinta das demais PLA2s, onde os sítios catalíticos da molécula encontram-se expostos ao solvente. Apesar das condições de cristalização da BthA-I nativa, é possível sugerir que a forma dimérica desta proteína seja aquela encontrada predominantemente in vivo. A determinação estrutural da BthA-I quimicamente modificada pelo pBPB a 1,85 Å de resolução revelou a presença inequívoca de moléculas de inibidor covalentemente ligadas aos resíduos His48, localizados nos sítios de ligação de substrato dos dois monômeros do complexo. Três regiões do complexo BthA-I/pBPB são estruturalmente alteradas pela ligação do inibidor: os loops de ligação de Ca++ e as regiões de β-wing C-terminais. Estas mudanças estruturais são provavelmente derivadas da conformação oligomérica apresentada pelo complexo, cuja disposição pode explicar a supressão das atividades farmacológicas da BthA-I... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In this work were performed experimental and theoretical structural studies with BthA-I and BjussuMP-I, two proteins from the venom of Bothrops jararacussu. BthA-I, a high catalytic acidic phospholipase A2 (PLA2) with platelet aggregation inhibition, anticoagulant and hypotensive properties, was crystallized in its native form and complexed to pBPB (p-bromophenacyl bromide), a well-known inhibitor of PLA2s which also abolishes the biochemical activities of this protein. The crystal structure of BthA-I native was solved at 1.9 Å and the data processing showed two monomers in the unit cell. A novel dimeric conformation of this native protein with the active sites of the monomers exposed to the solvent was observed. Despite of the conditions used in the crystallization experiments, it is possible to suggest that the dimeric form must be predominantly found in vivo. The structural determination of BthA-I chemically modified by pBPB at 1.85 Å revealed the unambiguous identification of inhibitor molecules covalently bound to residues His48 in the substrate-binding clefts of both monomers of the complex. Three regions of BthA-I/pBPB complex are structurally altered by the binding of the inhibitor: the Ca++ -binding loops, the β-wings and the C-terminal regions. These structural changes are probably derived from the oligomeric state presented by the complex, which could explain the abolition of pharmacological activities of the pBPB-chemically modified BthA-I. A residue present in the "pancreatic" loops (Lys69), which is usually related to the anticoagulant effect of the BthA-I, is in the dimeric interface of the complex, supporting this hypothesis regarding the abolition of this and other activities caused by pBPB. The theoretical BjussuMP-I catalytic domain, a P-III metalloprotease, was built through folding recognition... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Igor Polikarpov / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-27T11:02:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lee_WenHwa_D.pdf: 8676479 bytes, checksum: fe860bf2f06ea88d21a3e1f9f4aa09de (MD5) Previous issue date: 2001 / Doutorado

Alteração da fosfolipase A2 tem sido descrita em diversas doenças neuropsiquiátricas. Esta enzima é responsável pelo metabolismo dos fosfolípides de membrana e parece estar envolvida na fisiopatologia do transtorno bipolar. Neste estudo, foram analisados os três principais subtipos da PLA2 (sPLA2, cPLA2 e iPLA2) em plaquetas de pacientes e indivíduos controles. A atividade de subtipos de PLA2 foi determinada em 20 pacientes TB sem tratamento com estabilizadores de humor e após seis semanas de tratamento com lítio; 72 pacientes medicados e 65 controles (16 pareados com os pacientes sem tratamento e 49 com os pacientes previamente medicados), pelo método radioenzimático. Os pacientes foram diagnosticados e classificados de acordo com os critérios estabelecidos no DSM-IV-TR. Foi verificado que Os pacientes no estágio inicial da doença apresentaram menor atividade de iPLA2, sPLA2 e cPLA2 quando comparadas ao grupo controle. Seis semanas de tratamento com o lítio não foram suficientes para observar alterações nos resultados obtidos. No entanto, o lítio diminuiu a sintomatologia maníaca e a depressiva, avaliadas pelas escalas de Hamilton e Young, respectivamente (p < 0,01 para as duas comparações). Os pacientes medicados não diferiram do grupo controle para os três subtipos de PLA2 avaliados. Estes resultados sugerem que no estágio inicial do TB há uma diminuição da atividade das PLA2, e que a ação de um ou mais medicamentos que são incluídos na terapêutica para este transtorno podem reverter essa diminuição. Sugere-se ainda que a diminuição da atividade da iPLA2 no estágio inicial do transtorno bipolar, além de alterar o remodelamento da membrana, possa ser um fator de risco para o desenvolvimento de demência nestes pacientes. / Changes in phospholipase A2 have been reported in several psychiatric disorders. This enzyme is responsible for the metabolism of membrane phospholipids and has been suggested to play a role in bipolar disorder physiopathology. In this study, the activity of the three main subtypes of phospholipase A2 (PLA2) were analyzed (sPLA2, cPLA2 and iPLA2) in platelets of BD patients and health subjects. Subjects enrolled were: 20 drug-naïve and drug free BD patients, who were treated with lithium for six weeks; 72 BD long-term treatment patients and 65 controls (16 for the drug-naïve and drug free and 49 for the long term group). PLA2 subtype activities were determined by the radio enzymatic method. Patients\' diagnostic and classification were made according to DSM-IV-TR criteria. Patients at the early stage of the disease presented lower iPLA2, sPLA2 and cPLA2 activity than the control group. Six weeks treatment with lithium did not change these activities. However, lithium reduced the maniac and depressive symptoms, evaluated with Hamilton and Young scales, respectively (p < 0.01, for both comparisons). Long-term treated patients presented similar PLA2 activities to control group. The results suggest that at the early stage of BD iPLA2 activity is decreased and that the adequate treatment of BD could reverse this reduction. We suggest that a reduction of iPLA2 activity at the early stage of BD can modify the membrane metabolism, and could be a risk for the development of dementia in BD patients.