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Efeito do óleo de peixe sobre a citoarquitetura hipotalâmica e parâmetros de obesidade em ratos Wistar submetidos à programação metabólica por redução de ninhada

Oliveira, Bruna Aparecida Comotti de January 2017 (has links)
Orientadora : Profª. Drª. Katya Naliwaiko / Coorientadora : Profª. Drª. Djanira Aparecida da Luz Veronez / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 28/03/2017 / Inclui referências : f. 50-61 / Resumo: A obesidade é uma doença de causa multifatorial determinada por fatores genéticos e ambientais. Após a industrialização dos alimentos, o perfil lipídico da dieta em humanos foi drasticamente alterado, provocando aumento do consumo de alimentos com gorduras saturadas e do tipo trans, o que causou em longo prazo sobrepeso da população. O período de lactação é um momento crucial no estabelecimento do comportamento alimentar e desta forma, superalimentação nesse período pode predispor o organismo ao desenvolvimento de comorbidades como a obesidade e diabetes. Neste trabalho, investigamos o efeito da programação metabólica por redução de ninhada sobre possíveis alterações morfológicas no hipotálamo, parâmetros de obesidade, além de investigar o efeito da suplementação com óleo de peixe rico em AGPI's n-3 sobre esses parâmetros. Para isso, foram utilizados ratos Wistar que, ao 3º dia pós-natal, tiveram suas ninhadas reduzidas para três animais caracterizando o grupo obeso, enquanto as ninhadas controle foram mantidas com 10 animais. Após o desmame, os animais foram divididos em 4 grupos experimentais: controle (CON), controle suplementado (CONS), obeso (OB) e obeso suplementado (OBS) e iniciou-se a suplementação diária com 1g/kg/dia de óleo de peixe. A massa corporal dos animais foi avaliada durante o período de em 7, 14 e 21 dias e, posteriormente, até o final do experimento. Para avaliação da obesidade foi calculado o índice de Lee aos 21 e 60 dias, e avaliados os panículos adiposos da cavidade abdominal (retroperitoneal, mesentérica e perigonadal). Parâmetros séricos como glicemia, lipidemia e perfil lipídico foram mensurados. Uma vez estabelecido o quadro de obesidade, os encéfalos dos animais foram processados histologicamente e submetidos à análise estereológica dos núcleos hipotalâmicos relacionados ao controle de ingestão e saciedade, núcleo arqueado (ARC), paraventricular (PV) e área hipotalâmica lateral (LHA). Os resultados demonstram que o modelo da programação metabólica foi hábil em estabelecer um padrão de obesidade nos animais de ninhada reduzida, entretanto essas alterações sistêmicas não foram acompanhadas de alterações da citoarquitetura dos núcleos hipotalâmicos. Esse quadro foi acompanhado de alterações em depósitos adiposos e em parâmetros séricos, que caracterizam o quadro. De forma interessante, a suplementação reverteu os parâmetros dos panículos adiposos, entretanto não provocou significativa melhora nos parâmetros séricos. Acreditamos que esses resultados devam-se ao curto tempo de suplementação. Desta forma, concluise que o modelo de programação metabólica produz alterações metabólicas que se relacionam com o quadro de obesidade, sem alterar a organização celular do hipotálamo. Palavras chave: Obesidade, programação metabólica, hipotálamo e óleo de peixe. / Abstract: Obesity is a multifactorial disease caused by genetic and environmental factors. After the industrialization of food, the lipid profile of the diet in humans was drastically altered, causing an increase in the consumption of foods with saturated fats and trans type, which caused in the long term overweight of the population. The lactation period is a crucial moment in the establishment of eating behavior and thus overfeeding in this period may predispose the body to the development of comorbidities such as obesity and diabetes. In this work, we investigated the effect of metabolic programming by litter reduction on possible morphological changes in the hypothalamus, obesity parameters, and investigated the effect of supplementation with fish oil rich in n-3 PUFAs on these parameters. For this, Wistar rats were used, which on the 3rd postnatal day had their litters reduced to three animals characterizing the obese group, while the control litters were maintained with 10 animals. After weaning, the animals were divided into 4 experimental groups: control (CON), supplemented control (CONS), obese (OB) and supplemented obese (OBS), and daily supplementation with 1g/kg/day of fish. The body mass of the animals was evaluated during the period of 7, 14 and 21 days, and thereafter until the end of the experiment. For the evaluation of obesity, the Lee index was calculated at 21 and 60 days, and the adipose tissue of the abdominal (retroperitoneal, mesenteric and perigonadal) cavity was evaluated. Serum parameters such as blood glucose, triglycerides and lipid profile were measured. Once the obesity was established, the animals' brains were processed histologically and submitted to stereological analysis of the hypothalamic nuclei related to the ingestion and satiety control, arcuate nucleus (ARC), paraventricular (PV) and lateral hypothalamic area (LHA). The results demonstrate that the model of metabolic programming was able to establish a pattern of obesity in the animals of reduced litter, however these systemic alterations are not accompanied by changes in the cytoarchitecture of hypothalamic nuclei. This situation was accompanied by alterations in fatty deposits and in serum parameters that characterize the condition. Interestingly, supplementation may reverse the parameters of adipose tissue, but it didn't cause a significant improvement in serum parameters. We believe that these results are due to the short time of supplementation. In this way, it is concluded that the metabolic programming model produces metabolic changes that are related to the obesity scenario, without altering the cellular organization of the hypothalamus. Key words: Obesity, metabolic programmed, hypothalamus and fish oil.
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Ocorrência e identificação de microplasmas hemotrópicos (Hemoplasma) em roedores (Rattus norvegicus) do Passeio Público e Zoológico de Curitiba

Conrado, Francisco de Oliveira January 2014 (has links)
Orientador : Prof. Dr. Alexander Welker Biondo / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 24/10/2014 / Inclui referências / Área de concentração : Biologia Celular e Molecular / Resumo: Micoplasmas hemotrópicos, também conhecidos como hemoplasmas, são bactérias pertencentes à classe Mollicutes, patógenos obrigatórios dos eritrócitos de uma diversidade de espécies animais. São responsáveis pelo desenvolvimento de quadro agudo caracterizado por anemia ou uma infecção crônica assintomática ou com variadas síndromes ainda pouco caracterizada podendo, inclusive, interferir em resultados de estudos experimentais em animais de pesquisa. Devido à incapacidade em cultivar estes organismos, técnicas moleculares tem sido utilizadas como padrão no seu diagnóstico e estudo, e novas espécies vem sendo descritas em todo o mundo, principalmente em animais silvestres e de vida livre. Mycoplasma coccoides e Mycoplasma haemomuris são os hemoplasmas mais comumente reconhecidos no sangue de roedores selvagens e de laboratório. Até o presente momento nenhum trabalho tratou de estudar a ocorrência, epidemiologia e caracterização clínica e molecular de hemoplasmas de roedores de vida livre no Brasil. Como a presença de animais selvagens em cativeiro em zoológicos inviabiliza a utilização de raticidas tóxicos ou anticoagulantes, a captura dos animais vivos tem sido utilizada como método de controle paliativo da infestação por roedores nestes locais. O objetivo deste estudo é investigar a ocorrência de micoplasmas hemotrópicos em ratazanas (Rattus norvegicus) de vida livre capturados no Passeio Público e Zoológico de Curitiba e comparar com variáveis hematológicas. Quarenta e três ratazanas foram capturadas entre o Passeio Público e o Zoológico de Curitiba, e 20 outras foram amostradas do criatório do Passeio Público, onde são mantidas para a alimentação dos animais carnívoros do acervo. Mais de sessenta e três porcento das ratazanas foram positivas em triagem universal para micoplasmas hemotrópicos por PCR quantitativa através de técnica de SYBR® Green. Uma amostra de ao menos 50% de cada TM obtida foi submetida a sequenciamento e determinadas como M. haemomuris com exceção de uma amostra, 94% similar ao hemoplasma felino 'Candidatus M. turicensis'. Análise filogenética de um fragmento de aproximadamente 1300 pb do gene 16S rRNA revelou que esta amostra é homóloga a um micoplasma hemotrópico descrito infectando um rato de colheita europeu da espécie Micromys minutus. A relevância da presença de uma nova espécie de micoplasma hemotrópico infectando essas duas espécies diferentes de roedores de vida livre em continentes tão distantes é incerta. Não foram detectadas alterações estatisticamente significativas nos parâmetros hematológicos entre as ratazanas infectadas e não infectadas, o que corrobora o caráter de baixa patogenicidade e/ou infecção silenciosa destes microrganismos. Estes achados sugerem que hemoplasmas possivelmente são endêmicos na região de Curitiba, e a epidemiologia destes microrganismos precisa ser investigada, assim como seu impacto na fauna local, nos animais selvagens e de cativeiro dos parques, com especial atenção ao seu potencial zoonótico. Palavras-chave: ratazana, anemia, hemoplasmose. / Abstract: Hemotropic mycoplasmas, also known as hemoplasmas, are bacteria belonging to the class Mollicutes, obligatory pathogens of the red blood cells of a variety of animal species. There organisms are responsible for the development of anemia and disease with acute or chronic course and may occur silently interfering with results of experimental studies in animal research. Due to the inability to cultivate these organisms, molecular techniques have been used as standard diagnosis and study, and new species are being described worldwide, mainly in wild and free living animals. Mycoplasma coccoides and Mycoplasma haemomuris are the most commonly recognized hemoplasmas in the blood of wild and laboratory rodents. To date no work attempted to study the incidence, epidemiology, and clinical and molecular characterization of hemoplasmas in free-ranging rodents in Brazil. As the presence of wild animals in captivity in zoos hinders the use of toxic rodenticides or anticoagulants, capturing live animals has been used as a method of palliative control of rodent infestation in these locations. The aim of this study is to investigate the occurrence of hemotropic mycoplasmas in free-ranging rats (Rattus norvegicus) captured in the Passeio Público and the Curitiba Zoo and compare with hematological parameters. Fourty three rats were captured and 20 others were sampled from the nursery, where they are kept for feeding the carnivorous animals of the parks. 63.5% of rats were positive in universal screening for hemotropic mycoplasmas by quantitative PCR using the SYBR® Green technique. A sample of at least 50% of each TM was subjected to sequencing and determined as M. haemomuris except for one sample, 94% similar to the feline hemoplasma 'C M. turicensis'. Phylogenetic analysis of a fragment of approximately 1300 bp of the 16S rRNA gene showed that this sample was homologous to a hemotropic mycoplasma described infecting a European harvest mouse (Micromys minutus). The relevance of the presence of a new species of hemoplasma infecting two different free-ranging rodent species in such distant continents is uncertain. No statistically significant changes in hematological parameters between infected and uninfected rats were found, which confirms the low pathogenicity and/or silent infection character of these microorganisms. These findings suggest that possibly hemoplasmas are endemic in the region, and the epidemiology of these organisms need to be investigated as well as its impact on local wildlife, captivity animals, with special attention to its zoonotic potential. Key-words: rats, anemia, mycoplasmal disease.
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Estudo comparativo do efeito do estresse térmico sobre a morfologia e o sistema de defesa antioxidante em eritrócitos dos peixes antárticos : Notothenia rossi (Richardson, 1844) e Notothenia coriceps (Richardson, 1844)

Pedreiro, Maria Rosa Dmengeon January 2014 (has links)
Orientadora : Drª. Lucélia Donatti / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 21/02/2014 / Inclui bibliografia / Área de concentração : Biologia celular e molecular / Resumo: Peixes antárticos são espécies adaptadas ao frio, consideradas estenotérmicas, sendo seu metabolismo eficiente em baixas temperaturas. Estudos recentes sobre alterações climáticas relatam que a Península Antártica apresenta aquecimento acelerado, é extremamente importante entender a plasticidade metabólica e os mecanismos bioquímicos envolvidos na aclimatação a altas temperaturas de peixes antárticos para a conservação destas espécies e do ecossistema Antártico. O presente trabalho teve o objetivo de analisar o efeito do estresse térmico sobre a morfologia e o sistema de defesa antioxidante em eritrócitos de Notothenia rossii e Notothenia coriiceps, expostos durante 1, 3 e 6 dias a 8+0.5°C e a 0+0.5°C. Variações morfológicas nos eritrócitos e nos níveis de atividade de alguns constituintes enzimáticos como a glutationa peroxidase (GPx); superóxido dismutase (SOD); glutationa S-transferase (GST); catalase (CAT); glutationa redutase (GR) e quantificação do constituinte não enzimático, glutationa reduzida (GSH) e lipoperoxidação lipídica (LPO), por dosagem de malonaldeído (MDA) foram analisados. Em N. coriiceps o aumento da temperatura a 8°C não modulou os níveis de SOD e GPx. Mas modulou negativamente os níveis de CAT em 1 (87% menor em 8°C quando comparado a 0°C) e 3 dias (90% menor em 8°C quando comparado a 0°C). A GST foi modulada positivamente em 3 dias (57,9% maior em 8°C quando comparado a 0°C) e negativamente em 6 dias (81,9% menor em 8°C quando comparados a 0°C). A GR foi modulada positivamente em 1 dia ( 69,9% maior em 8°C quando comparado a 0°C) e 3 dias (81% maior em 8°C quando comparado a 0°C). Em Notothenia rossii o aumento da temperatura não modulou os níveis de GPx e GR. Mas, a SOD foi modulada positivamente em 6 dias (68% maiores em 8°C quando comparados a 0°C) e a CAT foi modulada positivamente em 3 dias (97% maiores em 8°C quando comparados a 0°C) e negativamente em 6 dias (86% menores em 8°C quando comparados a 0°C). A GST também foi modulada negativamente em 6 dias (81,9% menor em 8°C quando comparados a 0°C). Os níveis de GSH não foram modulados pela temperatura em ambas as espécies. O níveis de MDA foram modulado negativamente em 3 dias a 8°C em ambas as espécies e houve modulação positiva em 1 dia para N. coriiceps pelo aumento da temperatura. Análises morfológicas dos eritrócitos indicaram que em N. coriiceps o aquecimento a 8°C determinou o aumento da frequência de alterações no formato celular, presença de vesículas na membrana plasmática, núcleo em Blebbed e fissura nuclear. Em N. rossii o estresse térmico influenciou o aumento da frequência de alterações no formato celular e a presença de núcleos em Blebbed. A proporção de eritrócitos maduros e imaturos, a frequência de micronúcleo, o deslocamento celular, volume celular e nuclear não foram influenciados pelo estresse térmico em ambas as espécies. Foi possível concluir que, nos nototenideos antárticos, N. rossii e N. coriiceps, espécies filogeneticamente muito próximas, os padrões de resposta frente ao aumento da temperatura ambiental foram diferentes. Palavras-chaves: eritrócitos, temperatura, estresse oxidativo, anormalidades celulares. / Abstract: Antarctic fish are cold-adapted species, considered stenothermal; the metabolism of this fishes is very efficient at low temperatures. Recent studies about climatic changes report accelerated warming in the Antartic Peninsula. For the conservation of Antartic ecosystem and species is extremely important to understand the metabolic plasticity and biochemical mechanisms involved in high temperatures acclimation of Antartic fishes. This study aimed to verify the effect of heat stress on the morphology and the antioxidant defense system in erythrocytes of Notothenia coriiceps and Notothenia rossii, exposed for 1, 3 and 6 days to 8 +0.5 +0.5 ° C and 0 ° C. Morphological changes in erythrocytes and activity levels of some enzymatic constituents like glutathione peroxidase ( GPx ), superoxide dismutase ( SOD ), glutathione S - transferase ( GST ), catalase ( CAT ), glutathione reductase ( GR ) and quantification of non-enzymatic constituent, reduced glutathione ( GSH ) and lipid peroxidation ( LPO ), by measurement of malondialdehyde (MDA) were analyzed. The temperature increase to 8ºC in N.coriiceps do not modulated levels of SOD and GPx, although, negatively modulates the levels of CAT 1 (87 % less than 8 ° C as compared to 0 ° C) and 3 days (90 % less than 8 ° C as compared to 0 ° C). GST was positively modulated in 3 days (57.9% 8 ° C higher in comparison to 0 ° C) and negatively within 6 days (81.9 % less than 8 ° C as compared to 0 ° C). The GR was positively modulated at 1 day ( 69.9% 8 ° C higher in comparison to 0 ° C) and 3 days (81 % increase at 8 ° C as compared to 0 ° C). The temperature increase in N. rossii do not modulate GPx levels of GR . However, SOD was positively modulated in 6 days (68 % higher when compared to 8C 0 ° C) and CAT was positively modulated in 3 days (97% at 8 ° C higher in comparison to 0 ° C) and negatively 6 days (86 % lower at 8 ° C as compared to 0 ° C). GST was also negatively modulated in 6 days (81.9 % less than 8 ° C as compared to 0 ° C). Morphological analysis of erythrocytes indicated that in N. coriiceps heating at 8 °C determined the increase frequency of changes in cell format, presence of vesicles in plasma membrane and Blebbed nucleus. Heat stress at 6 days in N. rossii influenced an increase frequency of changes in cell shape and presence of Blebbed nucleus. The proportion of mature and immature erythrocytes, frequency of micronucleus and cell displacement, cell and nuclear volume were not affected by heat stress in both species. In conclusion, N. rossii and N. coriiceps, phylogenetically close Antarctic nototenideos, have different patterns of response due to increased environmental temperature. Keywords: erythrocytes, temperature, oxidative stress, cellular abnormalities.
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Respostas de células de hepatocarcinoma humano (Hepg2) expostas à cilindrospermopsina

Liebel, Samuel January 2015 (has links)
Orientador : Prof. Dr. Francisco Filipak Neto / Co-orientador : Prof. Dr. Ciro Alberto de Oliveira Ribeiro / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 27/02/2015 / Inclui referências / Área de concentração : Biologia celular e molecular / Resumo: O aumento das atividades antropogênicas vem sendo causa de uma crescente eutrofização dos ambientes aquáticos, levando a floração de cianobactérias, dentre as quais algumas produtoras de cianotoxinas potencialmente tóxicas à vida animal e à saúde humana. Desta forma, fazem-se necessárias a avaliação dos principais danos causados pelas toxinas assim como a investigação os mecanismos de toxicidade da cilindrospermopsina (CYN) em células. Particularmente, modelos in vitro empregando a linhagem de hepatocarcinoma humano (HepG2) são importantes para a investigação dos mecanismos de toxicidade das cianotoxinas nas células. O objetivo do presente estudo foi investigar as respostas de células HepG2 frente à exposição a diferentes concentrações da cilindrospermopsina (CYN) através de ensaios de viabilidade celular; atividade das enzimas de biotransformação de fase II (Glutationa S-transferase - GST); sistema de resistência a multidrogas (MDR); ambiente redox celular, quantificação da produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio; danos oxidativos a biomoléculas; e alterações na morfologia das células. Além disso, determinou-se se a indução de isoformas do citocromo P450 aumenta a sensibilidade das células à CYN e avaliou-se a expressão diferencial de proteínas (proteoma). A CYN não se apresentou tóxica na concentração de 10 ?g l-1, levando a um aumento da viabilidade e toxicidade celular em células cultivadas com 10% de soro bovino fetal (SBF). A redução da concentração de SBF para 2% e a indução das isoformas do citocromo P450 (CYP) tornaram o metabolismo das células HepG2 mais próximas das células "normais". Após a indução, poucos parâmetros foram alterados, como a peroxidação lipídica. No entanto, baixas concentrações de CYN (inferior ou igual a 10 ?g l-1) induziram um aumento da proliferação e toxicidade celular. Analisando o proteoma das células expostas a CYN, identificaram-se 26 proteínas, as quais estão envolvidas em diferentes processos biológicos como enovelamento de proteínas, efluxo de xenobióticos, defesa antioxidante, metabolismo energético, anabolismo, sinalização, potencial tumorigênico e estrutura do citoesqueleto. Este perfil de proteínas indica que a exposição à CYN leva a um aumento da absorção e oxidação da glicose para proporcionar energia às células responder ao estresse químico. Aumento da proteína G (GPCRs), heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) e dos níveis das espécies reativas de oxigênio (EROs) podem estar provocando o aumento da proliferação celular, e aumento do potencial tumorigênico das células HepG2. O excesso de espécies reativas de oxigênio ativou mecanismos de proteção celular como a multidrug resistance protein (MRP3) e a glutationa peroxidase. As alterações provocadas pela CYN nas proteínas do citoesqueleto também podem estar associadas com a proliferação celular bem como a reposição das proteínas danificadas pelas EROs. Palavras-chave: cianotoxina, cilindrospermopsina, HepG2, CYPs, proteômica, imunofluorescência / Abstract: The increase of anthropogenic activities has been causing eutrophication of aquatic environments, leading to bloom of cyanotoxin-producer cyanobacteria that can thread wildlife and human health. The evaluation of the toxic effects and the mechanisms of toxicity of cyanotoxins such as cylindrospermopsin (CYN) are important issues in toxicology. For these purposes, cell lines such as human hepatocellular carcinoma (HepG2) are very useful in vitro models. The aim of the current study was to investigate the responses of HepG2 cells after exposure to different concentrations of CYN through assays of cell viability; activities of glutathione S-transferase (GST, a phase II biotransformation enzyme) and the efflux transporters involved in multidrug resistance phenotype (MDR); oxygen and nitrogen reactive species levels; oxidative damage to biomolecules; and alterations of cell morphology. In addition, the possibility of increased toxicity to CYN due to cytochrome P450 (CYP) induction and the differential expression of proteins (proteome) have been investigated. CYN at 10 ?g l-1 was not toxic to HepG2 cells, leading to increased cell viability and metabolism in cells cultured with 10% fetal bovine serum (FBS). Decrease of FBS concentration to 2% and induction of CYP isoforms have made HepG2 cells more sensitive to exposure to CYN. After induction, few parameters have changed, e.g., lipid peroxidation. However, CYN at low concentrations (bellow or equal 10 ?g l-1) has induced increases of cell proliferation and metabolism. A total of 26 proteins have been differentially expressed in CYN-exposed cells versus control. These proteins are involved in different biological processes like protein folding, xenobiotic efflux, antioxidant defense, energy metabolism, anabolism, cell signaling, tumorigenic potential and cytoskeleton structure. This protein profile indicates that the exposure to CYN leads to an increased absorption and breakdown of glucose as to provide energy for the cells to respond to chemical stress. Increased G protein (GPCRs), nuclear ribonucleoprotein heterogeneous (hnRNP) and the levels of reactive oxygen species (ROS) may be associated with increased cell proliferation, and increased tumorigenic potential of HepG2 cells. The excess ROS has activated cellular protection mechanisms such as MRP3 and glutathione peroxidase. The changes caused by CYN in cytoskeletal proteins may also be associated with cell proliferation as well as replacement of proteins damaged by ROS. Keywords: cyanotoxin, Cylindrospermopsin, HepG2, CYP, proteomics, immunofluorescence
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Avaliação dos efeitos cardiovasculares do aceturato de diminazeno (DIZE) em ratos submetidos à sobrecarga pressórica / Evaluation of the cardiovascular effects of diminazene aceturate (DIZE) in pressure-overloaded rat hearts

Macedo, Larissa Matuda 12 February 2014 (has links)
Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2014-09-08T17:59:46Z No. of bitstreams: 1 LARISSA MATUDA MACEDO.pdf: 1925394 bytes, checksum: f5aee8d90e490ce7d7b1a21ffa29993c (MD5) / Made available in DSpace on 2014-09-08T17:59:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LARISSA MATUDA MACEDO.pdf: 1925394 bytes, checksum: f5aee8d90e490ce7d7b1a21ffa29993c (MD5) Previous issue date: 2014-02-12 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / Activation of the Angiotensin Converting Enzyme 2 (ACE2)-Angiotensin-(1-7) [Ang(1-7)]-Mas Receptor axis results in protective effects in the cardiovascular system. ACE 2 is an important component of Renin-Angiotensin System, because it is able to convert Angiotensin II in Ang-(1-7). Recents studies have shown that diminazene aceturate (DIZE) act as an activator of ACE 2. The objective of this study was to evaluate the cardiovascular effects of chronic treatment with DIZE in pressureoverloaded rats and the possible mechanisms involved in these effects. Male Wistar rats (200-350 g) were divided in four groups: (1) Sham; (2) Coarcted (abdominal aortic banding, CAA); (3) CAA + DIZE (1 mg/kg, gavage); e (4) CAA + DIZE (1 mg/kg, gavage) + A-779 (120 µg/day, osmotic mini-pumps). Twenty one days after surgery procedure, the blood pressure was recorded, the hearts were isolated and perfused according to Langendorff method. Vascular reactivity was measured by isolated aortic ring preparation. In order to evaluate the cardiac hypertrophy, the left ventricular mass index (VMI) was calculated through the ratio of the left ventricular wet weight to tibia length. The cross-sectional area of cardiomyocytes (CSA) was also evaluated. The mRNA levels for ANP, BNP e TGF-β were also evaluated by qRT-PCR. The expression of ACE-2 and ERK1/2, AKT, mTOR, GATA-4, catalase and SOD proteins involved in hypertrophic pathways was analyzed by Western Blot technique. The results are presented as means ± SEM. One-way ANOVA followed by the Newman-Keuls post-test was used to analyze the blood pressure, cardiac morphometric parameters, isolated heart, qRT-PCR and Western Blot experiments. Two-way ANOVA followed by the Bonferroni post-test was used for aortic rings preparation protocols. All statistical analyses were considered significant at P<0.05. Isolated hearts from coarcted rats presented a significant decrease in the left ventricular end systolic pressure (128.1 ± 9.0 vs. 79.1 ± 12.8 mmHg in CAA, P<0.05), left ventricular developed pressure (118.1 ± 8.9 vs. 69.0 ± 12.7 mmHg in CAA, P<0.05), +dP/dt (2295.0 ± 161.8 vs. 1406.0 ± 246.5 mmHg/s in CAA, P<0.05) and dP/dt (1787.0 ± 166.0 vs. 1066.0 ± 181.9 mmHg/s in CAA, P<0.05). The DIZE treatment attenuated all of these effects induced by CAA. Moreover, DIZE treatment increased the coronary flow in hypertrophic hearts (CAA: 11.6 ± 0.8 vs. CAA+DIZE: 15.8 ± 0.6 mL/min, P<0.05). This effect was blocked by A-779. Pressure–overloaded hearts showed a significant increase in VMI (0.17 ± 0.01 vs. 0.21 ± 0.01 g/cm in CAA, P<0.05) and CSA (8.98 ± 0.54 vs. 10.72 ± 0.27 µm in CAA, P<0.05). The chronic treatment with DIZE prevented the heart hypertrophy (10.72 ± 0.27 in CAA vs. 9.25 ± 0.23 µm in CAA+DIZE, P<0.05). Indeed, treatment with A-779 attenuated the antihypertrophic effect induced by DIZE treatment. The coarcted rats presented a increase in mRNA expression of ANP, BNP and TGF-β and the DIZE treatment reverted this effect. The pressure overload decreased the acetylcholine-induced relaxation in aortic rings from coarcted rats and treatment with DIZE was not able to improve this effect. The coarctation decreased the phosphorylation of the AKT, which was not changed by DIZE treatment. The expression of ACE 2, total and phosphorylated ERK1/2, total AKT, mTOR, SOD and catalase was not changed by coarctation or by ACE 2 activation. These results show that the chronic treatment with DIZE was efficient in preventing the left ventricular hypertrophy and cardiac dysfunction induced by pressure overload. These effects were independent of changes in the expression of ACE 2, ERK1/2, AKT, mTOR, SOD and catalase. Thus, DIZE has important therapeutic potential for cardiovascular diseases. / A ativação do eixo Enzima Conversora de Angiotensina 2 (ECA2)-Angiotensina-(1-7) [Ang-(1-7)]-Receptor Mas resulta em importantes efeitos protetores no sistema cardiovascular..A ECA 2 é um importante componente do Sistema ReninaAngiotensina, pois hidrolisa a Angiotensina II em Ang-(1-7). Recentes estudos tem demonstrado que o aceturato de diminazeno (DIZE) apresenta capacidade de aumentar a atividade da ECA 2. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos cardiovasculares do DIZE nas mudanças induzidas por sobrecarga pressórica e possíveis mecanismos intracelulares envolvidos nestes efeitos. Foram utilizados ratos Wistar (200-350 g), divididos em quatro grupos: (1) Sham; (2) Coarctados (coarctação da aorta abdominal, CAA), (3) CAA + DIZE (1 mg/kg, gavagem); e (4) CAA + DIZE (1 mg/kg, gavagem) + A-779 (120 µg/dia, mini-bombas osmóticas). Decorridos 21 dias da coarctação, a pressão arterial dos animais foi registrada, os corações foram isolados e perfundidos pelo método de Langendorff com pressão constante. A reatividade vascular foi avaliada por preparação de anéis de aorta isolada. Para avaliar a hipertrofia cardíaca, o peso dos ventrículos esquerdos foi normalizado pelo comprimento das tíbias e expresso como índice de massa ventricular (IMV), além da área de secção transversa dos cardiomiócitos (AST) ser também medida. Os níveis de mRNA para ANP, BNP e TGF-β também foram avaliados por qRT-PCR. A expressão de ECA 2 e das proteínas ERK1/2, AKT, mTOR, GATA-4, SOD e catalase, envolvidas em vias pró-hipertróficas, foi analisada através da técnica de Western Blot. Os resultados foram apresentados como média ± erro padrão da média. Para as análises de pressão arterial média, coração isolado e parâmetros morfométricos, qRT-PCR e Western Blot, foi utilizado o teste ANOVA One Way seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls. Para a reparação de anéis de aorta isolada, foi usado ANOVA Two Way seguido pelo teste de Bonferroni. As diferenças foram consideradas significativas com P<0,05. Os corações isolados dos ratos coarctados apresentaram diminuição significativa da pressão ventricular esquerda ao final da sístole (128,1 ± 9,0 vs. 79,1 ± 12,8 mmHg em CAA, P<0,05), pressão desenvolvida pelo ventrículo esquerdo (118,1 ± 8,9 vs. 69,0 ± 12,7 mmHgem CAA, P<0,05), +dP/dt (2295,0 ± 161,8 vs. 1406,0 ± 246,5 mmHg/s em CAA, P<0,05) e -dP/dt (1787,0 ± 166,0 vs. 1066,0 ± 181,9 mmHg/s em CAA, P<0,05). A ativação da ECA 2 atenuou a disfunção ventricular esquerda induzida pela coarctação. O tratamento com DIZE aumentou o fluxo coronariano dos corações hipertrofiados (CAA: 11,6 ± 0,8 vs. CAA+DIZE: 15,8 ± 0,6 mL/min, P<0,05). Este efeito foi loqueado pelo A-779. Os corações submetidos a sobrecarga pressórica mostraram um umento significativo do IMV (0,17 ± 0,01 vs. 0,21 ± 0,01 g/cm em CAA, P<0,05) e AST (9,37 ± 0,55 vs. 10,72 ± 0,27 µm em CAA, P<0,05). A ativação da ECA 2 preveniu a hipertrofia cardíaca (AST: 10,72 ± 0,27 vs. 9,25 ± 0,23 µm em CAA + DIZE, P<0,05). O tratamento com A-779 atenuou o efeito anti-hipertrófico produzido pelo DIZE nos corações coarctados. A coarctação também promoveu aumento da expressão de mRNA de ANP, BNP e TGF-β e o tratamento com DIZE reverteu esse efeito. A sobrecarga pressórica diminuiu o relaxamento induzido por acetilcolina em anéis de aorta isolada e o tratamento com o ativador da ECA 2 não foi capaz de alterar esse efeito. A coarctação diminuiu a fosforilação da AKT e o tratamento com DIZE não foi capaz de alterá-la. Não foram encontradas alterações na expressão das proteínas ECA 2, ERK1/2 total e fosforilada, AKT total, mTOR, GATA-4, SOD e catalase. Tais resultados mostram que o tratamento crônico com DIZE apresenta efeitos cardioprotetores contra a disfunção cardíaca induzida pela sobrecarga pressórica através da diminuição da hipertrofia ventricular esquerda, sem mudanças na expressão de ECA 2, ERK1/2, AKT, mTOR, GATA-4, SOD e catalase. Portanto, o DIZE possui importante potencial terapêutico frente a doenças cardiovasculares.
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Aplicabilidade da PCR em tempo real ao diagnóstico da leptospirose humana e ao monitoramento da contaminação ambiental por espécies patogênicas de Leptospira

Riediger, Irina Nastassja January 2012 (has links)
Orientador : Prof. Dr. Alexander W. Biondo / Orientador : Prof. Albert Icksang Ko / Coorientador : Prof. Dr. Marco Aurélio Krieger / Coorientador : Dr. Alex Hoffmaster / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 27/02/2012 / Inclui referências : f. 150-169 / Resumo: cuja sintomatologia é inespecífica. Humanos desenvolvem formas graves de leptospirose e os métodos diagnósticos atuais não são eficazes para a detecção precoce da doença. O uso de um método de PCR em tempo real pode permitir o diagnóstico precoce e a quantificação das bactérias em amostras clínicas; além da quantificação do risco ambiental em amostras de água. Foi demonstrado que o método permite a detecção das leptospiras em amostras de sangue total coletadas nos primeiros seis dias de doença, após os quais a carga bacteriana decai de modo inversamente proporcional ao título de anticorpos. O limite mínimo de detecção foi estimado em 280 GEq/mL. O ponto de corte prognóstico foi estimado em 159 GEq/mL para o desenvolvimento de LPHS, com sensibilidade de 64,3% (IC 95% 35,1-87,2%), especificidade de 68,8% (IC 95% 62,8-74,3%) e acurácia 68,0%. Para óbito, o ponto de corte prognóstico foi definido em 1.181 GEq/mL, com sensibilidade de 76,5% (IC 95% 50,1-93,2%), especificidade de 89,3% (IC 95% 85,0-92,8%) e acurácia de 88,3%. A seleção do kit para extração do DNA e estabelecimento de parâmetros de concentração, volume inicial de amostra e limite mínimo de detecção permitiu a adaptação do método de qPCR para a quantificação das leptospiras em amostras ambientais. O método adaptado foi validado em estudo conduzido com amostras ambientais coletadas na comunidade de Pau da Lima, em Salvador (Bahia, Brasil). Os resultados apontaram maior positividade entre as amostras coletadas em baixa altitude (50% das amostras positivas), bem como entre as amostras coletadas pela manhã em comparação com a tarde (17,7% vs. 5,8%). A positividade foi maior entre amostras de esgoto do que entre amostras de água empoçada (17,7% vs. 5,6%). Também houve diferença de positividade entre as amostras coletadas nos períodos úmido e com umidade intermediária (16,0% vs. 9,7%). Assim, concluímos que o método de qPCR é uma ferramenta útil para o diagnóstico e avaliação prognóstica em pacientes com suspeita clínica de leptospirose. O método também foi eficaz na identificação de possíveis focos de infecção a partir da avaliação de amostras de água coletadas em área endêmica. Palavras-chave: Leptospira, leptospirose, PCR em tempo real, sangue total, carga bacteriana, prognóstico, amostra ambiental de água. / Abstract: are non-specific. Humans develop severe forms of leptospirosis and the current diagnostic methods are not suited for the early diagnosis of the disease. The use of a real-time PCR method allowed for an early diagnosis and bacterial quantification in clinical samples, as well as quantification of environmental burden in water samples. It has been shown that this method allows for the detection of leptospires in whole blood samples obtained during the first six days of illness, after which the bacterial load decrease is inversely proportional to the raise in antibody titer. The lower limit of detection was estimated to be 280 GEq/mL. The prognostic threshold was estimated at 159 GEq/mL for the development of LPHS, with sensitivity of 64.3% (95% CI 35.1- 87.2%), specificity of 68.8% (95% CI 62.8-74.3%) and accuracy of 68.0%. For death, the prognostic threshold was set at 1.181 GEq/mL, with sensitivity of 76.5% (95% CI 50.1-93.2%), specificity of 89.3% (95% CI 85.0-92.8%) and accuracy of 88.3%. Selection of the commercial kit for DNA extraction, and establishment of concentration parameters, initial sample volume and lower limit of detection led to the adaption of the qPCR method to allow for the quantification of leptospires in environmental samples. The adapted method was validated in a study conducted with environmental samples collected in the slum community of Pau da Lima, in Salvador (Bahia, Brazil). Results showed a higher positivity for samples collected at low altitudes (positivity of 50%), as well as for samples collected in the morning when compared to those collected in the afternoon (17.7% vs. 5.8%). Positivity was also higher for sewage than for puddle water (17.7% vs. 5.6%). There was also difference in positivity for samples collected during the wet season when compared to those collected during the period with intermediate humidity (16.0% vs. 9.7%). Therefore, we conclude that the qPCR method is a useful tool for the diagnosis and prognostic evaluation of patients with a clinical suspicion of leptospirosis. The method was also reliable in identifying possible infection sites through the evaluation of water samples collected from an endemic area. Keywords: Leptospira, leptospirosis, real time PCR, whole blood, bacterial load, prognosis, environmental water sample.
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Pesquisa de terapias para o melanoma em modelos de metástases pulmonares em camundongos

Andrade, Lucas Ferrari de January 2014 (has links)
Orientador : Prof. Dr. Edvaldo da Silva Trindade / Orientadora : Profª. Drª. Dorly de Freitas Buchi / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 28/08/2014 / Inclui referências / Resumo: Melanoma é um câncer de pele cujas metástases para órgãos distantes levam à óbito milhares de pessoas todos os anos. Até o presente momento, não existe uma forma de terapia que possua alta frequencia de respostas duradouras. Sendo assim, muitos pacientes com câncer utilizam homeopatia como uma terapia integrativa e complementar, e relatam terem vivenciado os benefícios do tratamento. Entretanto, existem poucas evidências científicas que comprovem sua real eficácia. Sendo assim, no presente estudo foi investigado o potencial anti-melanoma de um medicamento homeopático chamado M1, com base em sua ação imunoestimulante relatada anteriormente. Para tanto camundongos C57BL/6 foram injetados intravenosamente com células de melanoma B16F10 ou LWT1 para formação de metástases pulmonares e tratados com M1 ou seu veículo (água). Após 14 días de tratamento, os camundongos foram eutanasiados e os pulmões foram removidos para análises microscópicas e por citometria de fluxo. As análises histológicas revelaram que M1 reduziu a formação de metástases em ambos os modelos de melanoma. Adicionalmente, o tamanho dos nódulos, bem como a proliferação e angiogênese tumorais estavam todas reduzidas em metástases de melanoma B16F10 de camundongos tratados com M1. Interessantemente, a ação do M1 foi independente da imunidade inata e adaptativa mediada por linfócitos. Por outro lado, pulmões de camundongos com B16F10 e tratados com M1 posuíram menores frequencias de células mielóides imunossupressoras caracterizadas pela marcação CD11b+ Gr-1baixo AT1R+. A presença de AT1R nessas células sugere um papel na angiogênese tumoral, inibida pelo M1. Adicionalmente, as metástases de melanoma apresentaram um fenótipo de marcações para imunofluorescência associado à menor malignidade tumoral, como maior expressão de Beta-Catenina e menor expressão de Ácido Hialurônico. Esses dados revelaram que o tratamento com M1 resultou em menor carga tumoral de metástases de melanoma em camundongos e sugerem um possível mecanismo de ação celular: o controle da angiogênese pela inibição de células CD11b+ Gr-1baixo AT1R+ com consequente menor desenvolvimento tumoral e aumento de apoptose. Esses dados comprovam a eficiência do tratamento com M1 para o câncer de pele tipo melanoma. / Abstract: Melanoma is a skin cancer with increasing incidence and incurable metastases, which annually kills thousands of people worldwide. Until now, there is not a therapy with high efficacy rate and durable response. Therefore many cancer patients use integrative therapies such as Homeopathy and claim the benefits from these treatments. However, there are not enough scientific evidences to support efficacy of these homeopathic medicines. Therefore, in this study was investigated the antimelanoma potential of a homeopathic medicine termed M1, based on M1's immunestimulatory action that has been previously reported. C57BL/6 mice were injected intravenously with B16F10 or LWT1 mouse melanoma cells and treated with M1 or vehicle (water). Following 14 days of treatment, mice were euthanized, lungs removed and analysed by microscopy or flow cytometry. Microscopic analysis revealed the quantity of metastases was reduced by treatment with M1 for both melanoma cell lines. Furthermore, metastases' size, proliferation and angiogenesis were all reduced by M1 treatment for the B16F10 model. Surprisingly, these effects by M1 treatment were not associated but independent of innate and adoptive immune responses for B16F10 and LWT1 melanoma metastases. On the other hand, mice's lungs with B16F10 and treated with M1 had fewer frequency of CD11b+ Gr-1low AT1R+ myeloid-derived suppressor cells. The expression of AT1R on these cells suggests a possible role for tumour angiogenesis, inhibited by M1. Additionally, melanoma metastases had a phenotype determined by microscopy typical for decreased malignancy, such as increased Beta-Catenin and decreased Hyaluronic Acid expression. In summary, these data reveal M1 treatment reduces tumor burden of melanoma metastases in mice and suggest a possible mechanism of action: control of angiogenesis by inhibition of CD11b+ Gr-1low AT1R+ cells with consequent reduction of tumor development and increased tumour apoptosis. These data show the efficacy of treatment with M1 and provide insights in the importance of treatment with homeopathic medicines. Key words: Melanoma. Homeopathy. M1. Angiogenesis. CD11b+ Gr-1low AT1R+ cells.
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Avaliação do papel da proteína TCTP em melanoma murino (B16-F1 e B16-F10)

Ferreira, Marianna Boia January 2014 (has links)
Orientadora : Profª. Drª. Andrea Senff Ribeiro / Coorientador : Prof. Dr. Silvio Sanches Veiga / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 27/02/2017 / Inclui referências : f. 73-83 / Resumo: O tumor do tipo melanoma da pele apresenta baixa incidência contudo, sua letalidade é extremamente elevada. As linhagens B16 constituem um modelo de melanoma murino muito útil na oncologia experimental. A linhagem B16F10 apresenta alta capacidade de invasão e metastização enquanto que a linhagem B16-F1 apresenta menor motilidade in vitro e, portanto, baixo potencial metastático. A TCTP (Translationally Controlled Tumor Protein) é expressa em diversos organismos e tecidos, o que aponta um papel biológico fundamental. Diferentes estudos já estabeleceram seu envolvimento na regulação do ciclo e proliferação celular, bem como na malignidade e como fator protetor contra estresse e apoptose. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi avaliar o papel da TCTP em melanoma murino (B16F1 e B16F10). O perfil proteico bidimensional apresentado pelas linhagens foi diferente: a linhagem B16-F10 apresentou 201 spots e a linhagem B16-F1 126 spots. Essa diferença pode estar relacionada à complexidade celular da B16-F10, mais maligna e metastática. Em ambos os extratos foi identificada uma proteína com mobilidade eletroforética de 20 kDa e pI de 4,8 (valores esperados para TCTP). Além disso, a TCTP foi imunodetectada por western blotting. A linhagem B16- F1 apresentou um menor sinal de detecção quando comparada à B16-F10., Essa diferença poderia estar associada a uma maior expressão de TCTP em células tumorais mais metastáticas e invasivas e, consequentemente, a B16F10 apresentaria níveis superiores de TCTP. Esta hipótese foi confirmada por PCR em tempo real: B16-F10 apresentou níveis de RNAm para TCTP superiores aos encontrados para B16-F1. Esses dados corroboram com os resultados do western blotting e com dados da literatura que relacionam a TCTP à linhagens malignas, devido ao seu papel anti-apoptótico e seu antagonismo com a p53. A fim de avaliar o papel biológico da TCTP no melanoma, esta foi silenciada na linhagem B16-F10, utilizando a técnica de RNAi. O silenciamento diminuiu os níveis de TCTP em 50 a 70% quando utilizado 50 nM e 60 a 80% quando utilizado 100 nM do duplex após 24, 48 e 72 horas de transfecção. As linhagens transfectadas com RNAi para TCTP apresentaram menor proliferação, menor migração e maior adesão celular às moléculas da matriz extracelular quando comparadas às linhagens transfectadas com o controle negativo. Porém, não houve qualquer alteração significativa da viabilidade celular. O aumento da proliferação celular e do potencial migratório são dois eventos muito importantes para a tumorigênese, e estão intimamente relacionados à malignidade. Portanto, o silenciamento foi capaz de regredir o fenótipo de malignidade da linhagem B16-F10, deixando esse mais próximo da B16-F1. Dessa forma, nosso estudo caracterizou os perfis celulares das duas linhagens e demonstrou uma diferença no número de proteínas e parceiros moleculares entre ambas linhagens. Além disso, nossos dados sugerem que o silenciamento da TCTP tornou a linhagem B16-F10 menos metastática e maligna, com um fenótipo mais próximo ao de uma célula normal. Mais estudos são necessários com o intuito de identificar possíveis parceiros e melhor entender o papel dessa proteína multifuncional no melanoma murino. Palavras-chave: TCTP, melanoma, B16-10, B16-F1, câncer / Abstract: Skin melanoma tumor displays low incidence, however, its lethality is extremely high. B16 cell lines typify a murine melanoma model very useful on the experimental oncology field. B16-F10 cell line exhibits high invasion and metastization capacities while B16-F1 cell line depicts lower in vitro motility and, therefore, low metastasis potential. TCTP (translationally controlled tumor protein) is expressed in several organisms and tissues, which suggests a fundamental biological role. Different studies have already settled its participation in cell cycle regulation and cell proliferation, as well as in malignancy and as a protective factor against stress and apoptosis. Thus, this study aimed to assess the TCTP role in in murine melanoma (B16-F1 and B16- F10). Two-dimensional electrophoresis profiles of proteins from the two cell lines were different: B16-F10 cells presented 201 electrophoresis spots while B16-F1 originated 126 spots. This difference may be related to the B16-F10 cell complexity, since this cell line is more malignant and metastatic. In both cell extracts was identified a protein with electrophoretic mobility about 20 kDa and deduced pI of 4.8 (expected parameters for TCTP). Furthermore, TCTP was immunodetected by western blotting analysis. B16-F1 cells produced low detection signals when compared to the B16-F10 cells. This difference may be associated to the higher TCTP expression in more metastatic and invasive tumoral cells and, consequently, B16-F10 would present higher TCTP levels. This hypothesis was confirmed by Real-Time PCR, since B16-F10 revealed RNAm levels for TCTP higher than the B16-F1. These data corroborate with western blotting results and the specific literature, which connect TCTP and malignant cell lines due to the anti-apoptotic function and its p53 antagonism. In order to evaluate the biological role of TCTP in melanoma, it was performed the TCTP silencing in B16-F10 cell line by using RNA interference (RNAi) method. The gene silencing reduced TCTP levels in 50% to 70% when used 50 nM and 60% to 80% when used 100 nm of the duplex after 24, 48 and 72 hours of transfection. The transfected cell lines with RNAi for TCTP presented lower proliferation, lower migration and higher cell adhesion to extracellular matrix molecules when compared to the cell lines transfected with negative control. However, there was no significant change in cell viability. Increasing cell proliferation and migration potential are two events very important for the tumorigenesis process and they are closely related to the malignancy. Therefore, gene silencing was able to recede the malignant phenotype of B16- F10 cell line, resulting in a similar aspect to the B16-F1 cells. Thus, this study characterized the profile of two cell lines and it demonstrated differences in protein number and molecular partners between these two cell lines. Moreover, the generated data suggest that TCTP gene silencing became B16-F10 cells less metastatic and malignant, resembling the normal cell phenotype. Further studies are necessary in order to identify possible partners and to better understand the TCTP role in the murine melanoma. Key-words: TCTP, melanoma, B16-10, B16-F1, cancer.
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Caracterização de proteína TcZC3H31 de Trypanosoma cruzi, uma CCCH ZINC Finger essencial para metaciclogênese

Alcântara, Monica Visnieski January 2014 (has links)
Orientador : Dr. Stenio Perdigão Fragoso / Co-orientadora : Drª. Gisele Fernanda Assine Picci / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 10/06/2014 / Inclui referências / Área de concentração : Biologia Celular e Molecular / Resumo: O protozoário Trypanosoma cruzí, agente causador da Doença de Chagas, possui características incomuns em relação à organização e expressão gênicas, tais como genes arranjados em polícístrons, transcritos processados por uma reação de trans splícíng, ausência promotores clássicos da RNA Polimerase 11 e poucos fatores de transcrição codificados em seu genoma. Essas características sugerem que a regulação diferencial da expressão gênica, que permitem um ciclo de vida complexo, é controlada por mecanismos pós-transcricionais, principalmente através de elementos em eis presentes, em geral, nas regiões não traduzidas (UTRs) dos mRNAs e de proteínas ligadoras de RNA (fatores em trans). As proteínas CCCH zínc fínger, caracterizadas por possuírem três resíduos de cisteína e um de histidina que coordenam um íon zinco na sequência C-X7;8-C-X5-C-X3-H, estão entre as proteínas ligadoras de RNA que promovem o controle do processamento, estabilidade, distribuição e tradução dos mRNAs. O objetivo do presente trabalho foi estudar o papel que proteína TcZC3H31 (a qual possui três domínios CCCH zínc fínger) desempenha durante o ciclo de vida do T. cruzí, usando técnicas como nocaute gênico, superexpressão e ribonômica. Essa proteína é expressa quase que exclusivamente nas formas epimastigota e tripomastigota metacíclico. Durante a divisão celular (G2, mitose e citocinese) de epimastigotas foram observadas estruturas com alta concentração dessa proteína, as quais não são observadas nos parasitas em na fase G1 do ciclo celular. Foram obtidos parasitas nocautes para esse gene, os quais foram incapazes de se diferenciar de epimastigota para a forma tripomastigota metacíclico, enquanto parasitas superexpressando TcZC3H31 se diferenciam com maior eficiência do que os parasitas selvagens, sugerindo que essa proteína é essencial para a diferenciação do T. cruzí. Ensaios de imunoprecipitação de RNA seguida de sequenciamento (experimentos de ribonômica) permitiram a identificação de mRNAs alvos dessa proteína. A maioria dos genes identificados nessa análise codificam proteíno-quinases. O padrão de expressão de alguns RNAs alvos foi avaliado por PCR quantitativa ao longo do ciclo de vida e nos parasitas mutantes obtidos. Através dessas análises foi possível identificar um grupo de 5 genes para os quais padrão de expressão acompanha ao da proteína TcZC3H31, ou seja, seus mRNAs estão aumentados quando a proteína está superexpressa e diminuídos quando a proteína está ausente (nocaute gênico). Palavras-chave: Trypanosoma cruzí. CCCH zínc fíngers. Regulação da expressão gênica. Regulação pós-transcricional. Metaciclogênese. / Abstract: The protozoan parasite Trypanosoma cruzí is the causative agent of chagas disease and presents unusual gene expression and organization features. For example, genes are arranged in polícístrons, transcripts are processed through a trans splícíng reaction, and their genome lacks the classic RNA Polymerase li promoters and encodes only a few transcription factors. Those features suggest that the differential regulation of gene expression, required for the complexity of their life cycle, is controled at the posttranscriptional level, mainly through eis contrai elements, which are generally present in the untranslated regions (UTRs) of mRNAs and trans-acting factors, such as RNAbinding proteins (RBPs). The CCCH zínc fínger proteins are characterized by the presence of three cystein and one histidine residues that coordinate the zinc ion in the motif C-X718-C-X5-C-X3-H. They are RNA binding proteins that contrai mRNA processing, stability, distribution and translation. The aim of the present work was to to examine the role that the TcZC3H31 (a three CCCH zínc fínger motifs-containing protein) plays during the life cycle of T. cruzí. TcZC3H31 is almost exclusively expressed in the epimastigote and metacyclic trypomastigote forms. During cell division (G2, mytose and cytokinesis phases) TcZC3H31 was concentrated in structures, which were not observed in the G1 phase. T. cruzí null mutant for TcZC3H31 gene is not able to undergo differentiation to metacyclic trypomastigote forms, whereas TcZC3H31- superexpressing parasites differentiate more efficiently than wild type counterpart. These data suggest that TcZC3H31 protein is essential for T. cruzí differentiation. RNA immunoprecipitation followed by sequencing (ribonomic assays) identified the TcZC3H31 mRNA targets. Most of them encode for protein kinases. The expression pattern of some targets through the life cycle and in the mutant parasites was measured by quantitative PCR. This analysis enabled the identification of a 5 genes group wich showed an expression pattern similar to the expression of TcZC3H31 protein, with an increase of these mRNAs in response to the protein overexpression and a decrease in the protein absence (gene knockout). Key words: Trypanosoma cruzí. CCCH zínc fíngers. Gene expression regulation. Postranscriptional regulation. Metacyclogenesis.
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Efeito de fatores naturais e antrópicos sobre as respostas metabólicas do gastrópode antártico Nacella concinna (Strebel, 1908)

Oliveira, Mariana Feijó de January 2017 (has links)
Orientadora : Profª. Drª. Lucélia Donatti / Coorientador : Prof. Dr. Edson Rodrigues / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 20/02/2017 / Inclui referências : p. 139-169 / Resumo: O gastrópode antártico Nacella concinna habita a zona entremarés da Antártica, uma região naturalmente instável, que apresenta flutuações termo-salinas diárias, além de ser vulnerável à ação de contaminantes de origem antrópica, como o despejo de efluentes de esgoto de estações científicas e navios. Somado a isso, os organismos que habitam essa região precisam lidar com os níveis naturalmente elevados de metais pesados. Nesse contexto, o presente estudo teve como objetivo avaliar as respostas fisiológicas de N. concinna à variações termo-salinas de curto prazo, bem como verificar o efeito do esgoto da Estação Antártica Comandante Ferraz (EACF) sobre o metabolismo energético, nitrogenado e defesa antioxidante desse molusco. Também objetivamos avaliar o efeito direto de metais pesados sobre a atividade da arginase branquial e do pé muscular de N. concinna, bem como a distribuição tecidual e subcelular dessa enzima. Os bioensaios de temperatura e salinidade, ao longo do tempo, mostraram que o aquecimento e hipossalinidade modulam a defesa antioxidante, basicamente os níveis de SOD e G6PDH, de forma tecido-específica. No estresse hipossalino e térmico de curta duração, a defesa antioxidante glandular de N. concinna foi eficaz em prevenir lesões oxidativas em lipídeos e proteínas. O aquecimento é capaz de modular positivamente o metabolismo anaeróbio do pé muscular desse gastrópode. Contudo, nas brânquias, enquanto o aquecimento não modulou as enzimas do metabolismo energético, a hipossalinidade induziu resposta metabólica aeróbica. O estresse hipossalino elevou os níveis de AST e GDH no pé muscular, sugerindo a participação dessas enzimas na regulação osmótica desse tecido. Também foram observadas interações entre temperatura, salinidade e tempo, capazes de modular os níveis das enzimas analisadas nos três tecidos. Os níveis de ARG cerca de duas vezes superiores aos de ODH no pé muscular de N. concinna sugere a participação de ARG no catabolismo de L-arginina, durante a decomposição do "tampão energético" fosfo-Larginina. Apesar de ser considerado um bom biomonitor, a complexidade das respostas metabólicas de N. concinna, frente ao aquecimento e hipossalinidade, sugerem cautela na utilização dessas respostas como biomarcadores de mudanças naturais e antrópicas. Em relação ao efeito do esgoto, a indução de SOD, GST e CAT na glândula digestiva foi eficaz em prevenir danos oxidativos em lipídeos, mas não em proteínas na diluição de esgoto a 0,05% (v/v). A exposição ao esgoto foi capaz de elevar o potencial gerador de ATP aeróbio e anaeróbio das brânquias. Já no pé muscular o esgoto modulou positivamente a PFK, enzima reguladora da via glicolítica. Os estudos com metais pesados mostraram que as arginases branquial e do pé muscular de N. concinna apresentam características cinéticas distintas quanto ao KM e ação de cátions de metais pesados. Tanto a arginase branquial como a do pé muscular estão localizadas prioritariamente na fração citosólica dos tecidos. Também ficou evidente que as arginases das brânquias e do pé muscular são resistentes à inibição por cobre, o que sugere uma adaptação metabólica desse gastrópode, que pode ter contribuído para a ocupação de nichos naturalmente ricos em metais pesados. Palavras-chave: Nacella concinna. Antártica. Temperatura. Salinidade. Esgoto. Metais. / Abstract: The antarctic gastropod Nacella concinna inhabits the intertidal zone of Antarctica, a naturally unstable region that exhibits daily thermo-saline fluctuations, besides being vulnerable to the action of contaminants of anthropic origin, such as the discharge of sewage effluents from scientific stations and ships. In addition, organisms living in this region must deal with naturally high levels of heavy metals. In this context, the present study aimed to evaluate the physiological responses of N. concinna to shortterm thermo-saline variations, as well as to verify the effect of the Anarctic Station Comandante Ferraz (EACF) sewage on energy and nitrogen metabolism and antioxidant defense of this mollusk. We also aimed to evaluate the direct effect of heavy metals on the activity of the branchial and foot muscle arginase of N. concinna, as well as the tissue and subcellular distribution of this enzyme. Temperature and salinity bioassays, over time, have shown that heating and hyposalinity modulate the antioxidant defense, basically the levels of SOD and G6PDH, in a tissue-specific way. In short-term hyposaline and thermal stress, the antioxidant glandular defense of N. concinna was effective in preventing oxidative lesions in lipids and proteins. Heating is able to positively modulate the anaerobic metabolism of the foot muscle of this gastropod. However, in the gills, while heating did not modulate the enzymes of energy metabolism, hyposalinity induced an aerobic metabolic response. Hyposaline stress increased AST and GDH levels in the foot muscle, suggesting the participation of these enzymes in the osmotic regulation of this tissue. It was also observed interactions between temperature, salinity and time capable of modulating the levels of the enzymes analyzed in the three tissues. ARG levels about twice higher than that of ODH in the foot muscle of N. concinna suggest the participation of ARG in L-arginine catabolism during the decomposition of the phospho-L-arginine "energy buffer". In spite of being considered a good biomonitor, the complexity of N. concinna metabolic responses to heating and hyposalinity suggests caution in the use of these responses as biomarkers of natural and anthropogenic changes. Regarding the effect of the sewage, the induction of SOD, GST and CAT in the digestive gland was effective in preventing oxidative damage in lipids, but not in proteins in the dilution of 0.05% (v/v) of sewage. Exposure to the sewage was able to raise the aerobic and anaerobic ATP generating potential of the gills. In the foot muscle, the sewage positively modulated PFK, a glycolytic pathway regulating enzyme. Studies with heavy metals have shown that the branchial and foot muscle arginases of N. concinna have different kinetic characteristics regarding KM and action of heavy metal cations. Both the branchial and foot muscle arginases are located primarily in the cytosolic fraction of the tissues. It was also evident that the arginases of the gills and of the foot muscle are resistant to inhibition by copper, suggesting a metabolic adaptation of this gastropod, which may have contributed to the occupation of niches naturally rich in heavy metals. Keywords: Nacella concinna. Antarctica. Temperature. Salinity. Sewage. Metals.

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