Thesis (Ph.D.)--Virginia Commonwealth University, 2008. / Title from title-page of electronic thesis. Prepared for: Dept. of Biochemistry and Molecular Biology. Bibliography: leaves 168-205.

Thesis (Ph.D.)--Virginia Commonwealth University, 2008. / Prepared for: Dept. of Biochemistry and Molecular Biology. Bibliography: leaves 168-205. Also available online via the Internet.

Alteração da fosfolipase A2 tem sido descrita em diversas doenças neuropsiquiátricas. Esta enzima é responsável pelo metabolismo dos fosfolípides de membrana e parece estar envolvida na fisiopatologia do transtorno bipolar. Neste estudo, foram analisados os três principais subtipos da PLA2 (sPLA2, cPLA2 e iPLA2) em plaquetas de pacientes e indivíduos controles. A atividade de subtipos de PLA2 foi determinada em 20 pacientes TB sem tratamento com estabilizadores de humor e após seis semanas de tratamento com lítio; 72 pacientes medicados e 65 controles (16 pareados com os pacientes sem tratamento e 49 com os pacientes previamente medicados), pelo método radioenzimático. Os pacientes foram diagnosticados e classificados de acordo com os critérios estabelecidos no DSM-IV-TR. Foi verificado que Os pacientes no estágio inicial da doença apresentaram menor atividade de iPLA2, sPLA2 e cPLA2 quando comparadas ao grupo controle. Seis semanas de tratamento com o lítio não foram suficientes para observar alterações nos resultados obtidos. No entanto, o lítio diminuiu a sintomatologia maníaca e a depressiva, avaliadas pelas escalas de Hamilton e Young, respectivamente (p < 0,01 para as duas comparações). Os pacientes medicados não diferiram do grupo controle para os três subtipos de PLA2 avaliados. Estes resultados sugerem que no estágio inicial do TB há uma diminuição da atividade das PLA2, e que a ação de um ou mais medicamentos que são incluídos na terapêutica para este transtorno podem reverter essa diminuição. Sugere-se ainda que a diminuição da atividade da iPLA2 no estágio inicial do transtorno bipolar, além de alterar o remodelamento da membrana, possa ser um fator de risco para o desenvolvimento de demência nestes pacientes. / Changes in phospholipase A2 have been reported in several psychiatric disorders. This enzyme is responsible for the metabolism of membrane phospholipids and has been suggested to play a role in bipolar disorder physiopathology. In this study, the activity of the three main subtypes of phospholipase A2 (PLA2) were analyzed (sPLA2, cPLA2 and iPLA2) in platelets of BD patients and health subjects. Subjects enrolled were: 20 drug-naïve and drug free BD patients, who were treated with lithium for six weeks; 72 BD long-term treatment patients and 65 controls (16 for the drug-naïve and drug free and 49 for the long term group). PLA2 subtype activities were determined by the radio enzymatic method. Patients\' diagnostic and classification were made according to DSM-IV-TR criteria. Patients at the early stage of the disease presented lower iPLA2, sPLA2 and cPLA2 activity than the control group. Six weeks treatment with lithium did not change these activities. However, lithium reduced the maniac and depressive symptoms, evaluated with Hamilton and Young scales, respectively (p < 0.01, for both comparisons). Long-term treated patients presented similar PLA2 activities to control group. The results suggest that at the early stage of BD iPLA2 activity is decreased and that the adequate treatment of BD could reverse this reduction. We suggest that a reduction of iPLA2 activity at the early stage of BD can modify the membrane metabolism, and could be a risk for the development of dementia in BD patients.

Multiple Sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) that is characterized by widespread focal areas of inflammation and demyelination. Although the exact cause of the disease is still not known, myelin-reactive T cells that enter the CNS trigger the disease and lead to the recruitment and activation of macrophages and other immune cells. One set of candidates that could serve to mediate these CNS changes is the family of phospholipase A2 (PLA2) enzymes, which consist of secreted (sPLA2) and cytosolic (cPLA2) forms. These enzymes hydrolyze membrane phospholipids to release free fatty acids (arachidonic acid) that can stimulate complex inflammatory cascades, and lysophospholipids that can induce myelin breakdown and demyelination, the two pathological hallmarks of MS. / For my Ph.D. research I studied the expression and role of different members of the PLA2 family in 'experimental autoimmune encephalomyelitis' (EAE), a widely used animal model of MS. I first generated a relapsing-remitting form of EAE in the C57BL/6 mouse strain that lacks a major form of sPLA2. I showed that cPLA2 is expressed by immune cells in the EAE lesions in the CNS. Furthermore blocking the activity of cPLA2 with a broad-spectrum chemical inhibitor starting at the time of EAE induction reduced the incidence and severity of disease, reduced lesion burden as well as reduced the expression of a number of chemokines and cytokines. Treating mice in the remission phase also prevented further clinical episodes. This showed that some or all members of the cPLA2 family play an important role in the onset and progression of EAE in a strain of mice lacking sPLA2. / I next carried out studies to assess the expression of all 14 members of the sPLA2 and cPLA2 families at the onset, peak and remission stages of EAE in the SJL/J mouse strain that expresses all forms of PLA2. The mRNA expression of only 4 of these PLA2s was increased. These include sPLA2 (groups IIA and V) and cPLA 2 (groups IVA and VIA). The expression of these PLA2s in the CNS was also characterized by double-immunofluorescence. The role of these PLA2s was assessed using selective inhibitors and analysed by monitoring the clinical disability scores, chemokine/cytokine protein arrays, lipomics lipid profiling, and histological analysis. Surprisingly, the sPLA2 inhibitor prevented disease remission and worsened the clinical outcome. This was accompanied by an increase in several pro-inflammatory chemokines. Selective inhibitors of cPLA2 group IVA and the calcium independent foam group VIA (iPLA2) reduced severity of EAE when given starting before onset of disease. The cPLA2 inhibitor treatment was effective only while administered, while iPLA2 inhibitor treatment was effective even after treatment was stopped. Furthermore, only delayed treatment with the iPLA2 inhibitor was effective, suggesting that cPLA2 group IVA only plays a role in the initiation of disease, while iPLA 2 plays a role in both disease onset and progression. These effects were also associated with concomitant reduction in chemokine/cytokine expression, reduction of inflammatory lipid mediators, and increase in protective lipids e.g., omega 3 fatty acids. / This work has allowed us to dissect out the expression and role of different members of the PLA2 family and has revealed the importance of selectively inhibiting some but not others in EAE. These findings may therefore have important implications for the treatment of MS.

Orientadores: Sergio Marangoni, Luis Alberto Ponce-Soto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T18:20:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bonfim_VeraLucia_D.pdf: 7120787 bytes, checksum: 3839207f36a378b463b63406202ef7e4 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O envenenamento ofídico é um evento comum nos países pobres da área tropical e subtropical e as conseqüências deste, muito graves. Nestes países, pequena têm sido a valorização destas conseqüências, sendo pouco registradas estatisticamente como casos de saúde pública e muitas vezes tratados com procedimentos pouco efetivos ou ultrapassados. Neste trabalho foram utilizados metodologias refinadas e protocolos otimizados de purificação em HPLC com o intuito de se estudar mais detalhadamente a composição do veneno de duas serpentes de importância médica e epidemiológica, Bothrops jararacussu e Calloselasma rhodostoma, e analisar a relação estrutura função de PLA2 D49 (6-1, 6-2 e Cr-IV1) e PLA2 homólogas K49 (Bj-VII e Cr 5). A Bothrops jararacussu, é uma serpente encontrada nas Américas, desde o México até a Argentina sendo que no Brasil cerca de 90% dos acidentes ofídicos são causados pelo gênero Bothrops. A Calloselasma rhodostoma, é uma serpente amplamente distribuída no sudeste da Ásia e é a causa mais comum de acidentes ofídicos na Malásia e Tailândia. As novas toxinas foram obtidas com alto grau de pureza e homogeneidade molecular, como mostram os perfis cromatográficos, eletroforéticos e de espectrometria de massa por MALDi-TOF. A nova PLA2 D49 foi purificada do veneno de Calloselasma rhodostoma após dois passos cromatográficos: exclusão molecular em uma coluna Protein Pack SW 300 (0,78 cm x 3,30 cm), eluída com 0,25M de bicarbonato de amônio, pH 7,9, a um fluxo de 0,3 ml/min e, fase reversa em HPLC usando uma coluna µ-Bondapack C-18. Esta apresentou atividade fosfolipásica de 14,25±0,36 nmol/mg/min na presença de substrato sintético cromogênico (4-nitro-3-(octanoyloxy) benzoic acid), massa molecular de 14,029 Da determinada através de espectrometria de massa por MALDI-TOF, valor calculado de pI igual a 8.55, caráter básico e grande homologia seqüencial evidenciada pela estrutura primária quando esta é comparada com outras PLA2 D49 provenientes de veneno de serpente. A outra proteína, denominada Cr 5, uma PLA2 homóloga K49 foi isolada do veneno de Calloselasma rhodostoma em um único passo cromatográfico de fase reversa em HPLC (µ-Bondapack C-18). A massa molecular de 13,965 Da foi determinada através de espectrometria de massa por MALDI-TOF. A composição de aminoácido mostrou que a Cr 5 tem alto conteúdo de Lys, Tyr, Gly, Pro e 14 cisteínas, resíduos típicos de uma PLA2 básica. A completa seqüência de aminoácidos da Cr 5 contém 120 resíduos e mostra alta identidade quando comparada a outras PLA2 K49 isoladas de venenos de serpentes da família viperidae. Com relação à caracterização biológica, esta foi realizada também com as isoformas 6-1 e 6-2 (provenientes da fração BthTX-II de Botrhops jararacussu) e com a PLA2 K49 Bj-VII, estas purificadas e parcialmente caracterizadas em trabalho anterior. As PLA2 6-1, 6-2 e Cr-IV 1, exibiram miotoxicidade local e na dosagem de 40 µg/150 µl a 6-1 causou 83,06% de citotoxicidade em miotubos e 93,78% em mioblastos, já a 6-2 75,12 % em miotubos e 86,26% em mioblastos e a Cr-IV 1, 91,50% e 88,40% de citotoxicidade em miotubos e mioblastos, respectivamente. O efeito citotóxico também foi visto em fibroblastos mostrando na dosagem de 5 µM (linhagem 3T3) 85,63%, 86% e 91,34% de citotoxicidade na presença de 6-1, 6-2 e Cr-IV 1 respectivamente, e na linhagem COS7, 95,42%, 95,07% e 96,42% respectivamente, além de atividade inflamatória, sendo esta mais pronunciada na presença da Cr-IV 1. As PLA2s K49 homólogas, Bj-VII e Cr 5, evidenciaram miotoxicidade local e na dosagem de 40 ug/150 µl, a Bj-VII causou 87±50% de lise em mioblastos e 84±85% em miotubos e 91±25% de lise em mioblastos e 91±0.8 % em miotubos quando em contato com a Cr 5, além de atividade inflamatória evidenciada pela indução de edema. No caso destas proteínas, todos os efeitos biológicos induzidos por elas ocorreram na ausência de atividade fosfolipásica mensurável in vitro, suportando a idéia proposta pela literatura de mecanismos catalíticos e farmacológicos independentes. Apesar de todas apresentarem algumas diferenças biológicas, elas possuem um comportamento semelhante na estrutura-função, sugerindo uma ancestralidade comum embora sejam proteínas provenientes de venenos de serpentes separadas geograficamente / Abstract: Snake poisoning is a common event in poor countries of tropical and subtropical areas and the consequences of this is very serious. In these countries, there is the valorization of these consequences, due to few registers of published health cases and a lot of times treated with procedures a little effective or outdated. In this work we refined methodologies and optimized purification protocols used in HPLC with the intention to study the composition of the venom of two serpents of epidemic importance, Bothrops jararacussu and Calloselasma rhodostoma, and to analyze the relationship of structures function of PLA2 D49 (6-1, 6-2 and Cr-IV1) and homologous PLA2 K49 (Bj-VII and Cr 5). Bothrops jararacussu is a serpent found in America, from Mexico to Argentina being in Brazil, about 90% of the snake accidents caused by Bothrops genus. Calloselasma rhodostoma is a serpent thoroughly distributed at the Southwest of Asia and it is the most common cause of snake accidents in Malaysia and Thailand. The new toxins were obtained with high degree of purity and molecular homogeneity, like showed the chromatographics profiles, electrophoresis and MALDi-tof mass spectrometric (MS) analysis. A new D49 PLA2 was purified from the venom of Calloselasma rhodostoma after two chromatographic steps; molecular exclusion was loaded onto a Protein-Pack 300 SW column (0.78 cm 3 30 cm) and eluted with 0.25 M ammonium bicarbonate, pH 7.9, at a flow rate of 0.3 ml/min and reverse phase HPLC on µ-Bondapack C-18 and showed phospholipasic activity of 14.25±0.36 nmol/mg/min in the presence of a synthetic chromogenic substrate (4-nitro-3-(octanoyloxy) benzoic acid), a molecular mass of 14.029 Da was determined by MALDI-TOF mass spectrometry, calculated pI value 8.55, basic character and great sequential homology evidenced by the primary structure when this was compared with other PLA2 from D49 snake venom. The other protein, denominated Cr 5 PLA2 homologous (K49) was isolated from Calloselasma rhodostoma venom in one chromatographic step in reverse phase HPLC (RP-HPLC) (on l-Bondapack C-18). A molecular mass of 13.965 Da was determined by MALDI-TOF mass spectrometry. The amino acid composition showed that Cr 5 had a high content of Lys, Tyr, Gly, Pro, and 14 half-Cys residues, typical residues of a basic PLA2. The complete amino acid sequence of Cr 5 PLA2 contains 120 residues and this sequence shows high identity values when compared to other K49 PLA2s isolated from the venoms of viperid snakes. In relation with biological characterization, this was also done with the isoforms 6-1 and 6-2 (from fraction BthTX-II of Botrhops jararacussu) and with PLA2 K49 Bj-VII, these purified and partially characterized in The Masters. PLA2 6-1, 6-2 and Cr-IV 1 exhibited in mice local myonecrosis and edema upon intramuscular and intravenous injections, respectively. In dosage of 40 ug/150 ml, 6-1 showed 83.06% of citotoxicity in myotubes and 93.78% in myoblasts, 6-2 showed 75,12 % in myotubes and 86,26% in myoblasts, to Cr-IV 1 91.50% and 88.40% of citotoxicity in myoblasts and myotubes respectively. The citotoxic effect also in fibroblasts (cell line 3T3 and COS7) and in dosage de 5 µM (cell line 3T3) 85.63%, 85% and 91.34% of citotoxicity in the presence of 6-1, 6-2 and Cr-IV 1 respectively, and lineage COS7, 95.42%, 95.07 and 96.42% respectively, besides inflammatory activity, being this one more pronounced in the presence of the Cr-IV 1. PLA2 homologue K49, Bj-VII and Cr 5, evidenced local myotoxicity and in dosage of 40 ug/150 ml, showed 87±50 of lise in myoblasts and 84±85 in myotubes and 91±25% and 91±0.8 % when in contact with Bj-VII and Cr 5, respectivally besides of inflammatory activity evidenced by the edema induction. In the case of PLA2 K49 (Bj-VII and Cr 5), all of the biological effects induced by them happened in the absence of activity phospholipase measurable in vitro, supporting the idea proposed by the literature of catalytic and pharmacological mechanisms independent. Even though all show some kind of biologic differences all of them have a similar behave in function and structure which suggests a common ascendance of course we know they are proteins coming from different snakes geographic separated. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Alteração da fosfolipase A2 tem sido descrita em diversas doenças neuropsiquiátricas. Esta enzima é responsável pelo metabolismo dos fosfolípides de membrana e parece estar envolvida na fisiopatologia do transtorno bipolar. Neste estudo, foram analisados os três principais subtipos da PLA2 (sPLA2, cPLA2 e iPLA2) em plaquetas de pacientes e indivíduos controles. A atividade de subtipos de PLA2 foi determinada em 20 pacientes TB sem tratamento com estabilizadores de humor e após seis semanas de tratamento com lítio; 72 pacientes medicados e 65 controles (16 pareados com os pacientes sem tratamento e 49 com os pacientes previamente medicados), pelo método radioenzimático. Os pacientes foram diagnosticados e classificados de acordo com os critérios estabelecidos no DSM-IV-TR. Foi verificado que Os pacientes no estágio inicial da doença apresentaram menor atividade de iPLA2, sPLA2 e cPLA2 quando comparadas ao grupo controle. Seis semanas de tratamento com o lítio não foram suficientes para observar alterações nos resultados obtidos. No entanto, o lítio diminuiu a sintomatologia maníaca e a depressiva, avaliadas pelas escalas de Hamilton e Young, respectivamente (p < 0,01 para as duas comparações). Os pacientes medicados não diferiram do grupo controle para os três subtipos de PLA2 avaliados. Estes resultados sugerem que no estágio inicial do TB há uma diminuição da atividade das PLA2, e que a ação de um ou mais medicamentos que são incluídos na terapêutica para este transtorno podem reverter essa diminuição. Sugere-se ainda que a diminuição da atividade da iPLA2 no estágio inicial do transtorno bipolar, além de alterar o remodelamento da membrana, possa ser um fator de risco para o desenvolvimento de demência nestes pacientes. / Changes in phospholipase A2 have been reported in several psychiatric disorders. This enzyme is responsible for the metabolism of membrane phospholipids and has been suggested to play a role in bipolar disorder physiopathology. In this study, the activity of the three main subtypes of phospholipase A2 (PLA2) were analyzed (sPLA2, cPLA2 and iPLA2) in platelets of BD patients and health subjects. Subjects enrolled were: 20 drug-naïve and drug free BD patients, who were treated with lithium for six weeks; 72 BD long-term treatment patients and 65 controls (16 for the drug-naïve and drug free and 49 for the long term group). PLA2 subtype activities were determined by the radio enzymatic method. Patients\' diagnostic and classification were made according to DSM-IV-TR criteria. Patients at the early stage of the disease presented lower iPLA2, sPLA2 and cPLA2 activity than the control group. Six weeks treatment with lithium did not change these activities. However, lithium reduced the maniac and depressive symptoms, evaluated with Hamilton and Young scales, respectively (p < 0.01, for both comparisons). Long-term treated patients presented similar PLA2 activities to control group. The results suggest that at the early stage of BD iPLA2 activity is decreased and that the adequate treatment of BD could reverse this reduction. We suggest that a reduction of iPLA2 activity at the early stage of BD can modify the membrane metabolism, and could be a risk for the development of dementia in BD patients.

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Made available in DSpace on 2015-04-01T14:16:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2600688 bytes, checksum: 925d18dd7ebd669f58ba726884baa97c (MD5) Previous issue date: 2013-02-14 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Brazil is the country with the highest rate of reported snakebites. The venomous snakes that occur in the country belong to the Viperidae and Elapidae families. Snakebites cause the release of pharmacologically active substances with local effects such as hemorrhage, oedema, necrosis, myotoxicity, cardiotoxicity, neurotoxicity and cytotoxicity, as well as systemic effects such as blood coagulation, spontaneous bleeding, renal and respiratory failure. Snake venoms are rich sources of proteins, peptides, organic and inorganic compounds. The phospholipase A2 (PLA2s) are the most abundant proteins in the snake venom of different genera and exhibit toxic and pharmacology effects of strong medical and scientific interest. The aim of this study was to characterize physic-chemically B-linear epitopes of three phospholipases A2 (BhtTX-I, BthTX-II and BthA-I) isolated from Bothrops jararacussu snake venom recognized by the therapeutic horse anti-ophidic sera; in silico comparative analysis of the B-linear epitopes recognized by the sera that are present and / or absent in other PLA2s isolated from snake venoms; and describe molecules isolated from plant extracts that are able to inhibit the toxic and pharmacological effects of PLA2s. Parallel spot synthesis peptides experiments on cellulose membranes allowed identifying, by chemiluminescence, twelve PLA2s regions recognized by anti-ophidic sera (anti-bothropic and/or anti-crotalic). Comparative analyzes between PLA2s enabled to identify that some regions recognized by anti-ophidic sera are responsible for neurotoxic, anticoagulant and myotoxic activities performed by snakes. Therefore, this work enables interaction regions elucidate molecular serum-protein as well as assist in proposing new inhibitors. / O Brasil é o país com maior índice de acidentes ofídicos registrados. As serpentes peçonhentas que ocorrem no país pertencem às famílias Viperidae e Elapidae. Acidentes ofídicos causam a liberação de substâncias farmacologicamente ativas com efeitos locais como hemorragia, edema, necrose tecidual, miotoxicidade, cardiotoxicidade, neurotoxicidade e citotoxicidade, além de efeitos sistêmicos como coagulação sanguínea, sangramentos espontâneos, insuficiência renal e respiratória. Peçonha de serpentes são fontes ricas de proteínas, peptídeos, compostos orgânicos e inorgânicos. As fosfolipases A2 (PLA2s) são as proteínas mais abundantes nas peçonhas dos diferentes gêneros de serpentes e apresentam efeitos tóxicos e farmacológicos de grande interesse médico-científico. O presente estudo teve por objetivos caracterizar físico-quimicamente epitopos B-lineares de três PLA2s isoladas da peçonha de Bothrops jararacussu reconhecidos pelos soros antiofídicos; analisar comparativamente, in silico, os epitopos B-lineares reconhecidos pelos soros que estão presentes e/ou ausentes em demais PLA2s isoladas de peçonhas de serpentes; relatar moléculas isoladas de extratos vegetais que possibilitem inibir os efeitos tóxicos e farmacológicos das PLA2s. Experimentos de síntese paralela de peptídeos realizadas em membranas de celulose permitiram identificar, por quimiluminescência, doze regiões das PLA2s (BthTX-I, BthTX-II e BthA-I) presentes na peçonha de Bothrops jararacussu reconhecidas por soros antiofídicos (antibotrópico e/ou anticrotálico). Análises comparativas entre PLA2s possibilitaram identificar que algumas regiões específicas que foram reconhecidas pelos soros antiofídicos são responsáveis pelas atividades neurotóxica, miotóxica e anticoagulante desencadeadas pelo ofidismo. Portanto, o presente trabalho possibilita elucidar regiões de interação molecular soro-proteína bem como auxiliar na proposição de novos inibidores.

As serpentes contêm em sua peçonha inúmeras substâncias que vão desde componentes inorgânicos até proteínas complexas com diferentes atividades sobre diversos sistemas fisiológicos. As serpentes do gênero Lachesis estão distribuídas na floresta tropical da América Central e do Sul, incluindo o Brasil. Entre as substâncias encontradas na peçonha dessas serpentes estão as fosfolipases A2 (PLA2), que constituem uma família de enzimas que catalisam a hidrólise da ligação éster sn-2 em glicerofosfolipídeos e exibem uma variedade de atividades fisiológicas e patológicas, incluindo neurotoxicidade pré e pós-sináptica. Elas induzem a formação de edema, afetam a agregação plaquetária, além de serem potentes promotores de inflamação. Os objetivos desse trabalho foram o isolamento, a caracterização estrutural e bioquímica de uma nova PLA2 presente na peçonha de Lachesis muta. A peçonha foi submetida a uma filtração em gel em coluna HiPrep Sephacryl S200, obtendo-se as frações LmS-A a LmS-K. As frações LmS-G, LmS-H e Lms-I apresentaram elevada atividade fosfolipásica, com destaque para a fração LmS-G, que foi então submetida a uma cromatografia de fase reversa, obtendo-se um pico majoritário denominado Lmr-PLA2. A sequência de aminoácidos da Lmr-PLA2 apresentou alta identidade com PLA2s já descritas na literatura, porém, com alguns resíduos distintos, caracterizando-a como uma nova PLA2. Além disso, a enzima possui o resíduo D49 na sua sequência de aminoácidos, sugerindo ser uma PLA2 cataliticamente ativa, confirmado pelo ensaio de atividade hemolítica indireta. A massa molar determinada por espectrometria de massas foi de 13,9 kDa. Através de eletroforese bidimensional, foi determinado o ponto isoelétrico de 5,49, indicando ser uma PLA2 ácida. Os parâmetros cinéticos obtidos foram velocidade máxima (Vmax) e a constante de Michaelis (Km) de 1,147 nmol/min/mL e 0,404 mM além de Kcat = 0,41 min-1, ou número de turnover, e a eficiência catalítica Kcat/Km= 1,02 mM-1min-1 sobre o substrato NOB (3-(octanoyloxy)benzoic acid). A Lmr-PLA2 inibe a agregação plaquetária, é edematogênica, mas não é miotóxica. Os níveis plasmáticos de creatina cinase, proteínas, ureia e ?-glutamiltranspeptidase de camundongos que receberam injeção de Lmr-PLA2 não foram alterados. Estes dados juntamente com as análises de miotoxicidade demonstraram que a enzima tem baixa toxicidade in vivo. A elevada atividade catalítica e baixa toxicidade da Lmr-PLA2 tornam esta molécula promissora para o desenvolvimento de fármacos. / Snakes contain numerous substances in their venom ranging from inorganic to complex proteins with different activities on various physiological systems. Snakes of the genus Lachesis are distributed in the rainforest of Central and South America, including Brazil. Among the substances found in the venom of these snakes are phospholipases A2 (PLA2), which constitute a family of enzymes that catalyze the hydrolysis of the sn-2 ester bond in glycerophospholipids and exhibit a variety of physiological and pathological activities, including neurotoxicity pre- and post-synaptic. They induce the formation of edema, affect platelet aggregation and are potent promoters of inflammation. The objectives of this work are the isolation, structural and biochemical characterization of a new PLA2 present in the venom of Lachesis muta rhombeata. The role venom was subjected to gel filtration in Sephacryl S200, obtaining fractions LMS-A to LMS-K. The fractions LMS-G, LMS-H and LMS-I exhibited phospholipase activity, particularly the fraction LMS-G, which was then subjected to reversed phase chromatography, yielding a majority peak called Lmr-PLA2. The amino acid sequence of Lmr-PLA2 showed high identity with PLA2s already described in the literature, but with some distinct residues, characterizing it as a new PLA2. Additionally, this enzyme possesses the residue D49 in its amino acid sequence, indicating that one catalytically active PLA2 confirmed by indirect hemolytic activity. The molar mass determined by mass spectrometry was 13.9 kDa and its isoelectric point 5.49, indicating that Lm-PLA2 is an acid phospholipase. The kinetic parameters were Vmax = 1.147 nmol/min/mL and Km = 0.404 mM; Kcat = 0.41 min-1, or turnover number, e a catalytic efficiency, Kcat/Km = 1.02 mM-1min-1 with NOB (3-(octanoyloxy)benzoic acid) substrate. Lmr-PLA2 inhibits platelet aggregation, causes edema, but it is not myotoxic. Plasma levels of creatine kinase, protein, urea and ?-glutamyltranspeptidase of mice injected with Lmr-PLA2 have not changed. These data together with myotoxicity analysis showed that the enzyme has low toxicity in vivo. The high catalytic activity and low toxicity of Lmr-PLA2 make this molecule promising for drug development.

A proteína Tau é um importante componente do citoesqueleto neuronal, encontrada fundamentalmente nos axônios e sendo responsável pela estabilização dos microtúbulos. Agregados de proteína Tau em estado hiperfosforilado dão origem aos filamentos helicoidais pareados, que por sua vez integram os emaranhados neurofibrilares. Estes, ao lado das placas senis, representam os achados patológicos característicos da doença de Alzheimer (DA). A superfamília das fosfolipases A2 (PLA2) compreende diversas enzimas que participam de processos fisiológicos importantes, tais como a digestão de fosfolipídios, a remodelação da membrana celular e a geração de mensageiros para a sinalização intracelular. Existem evidências indiretas de que o estado de fosforilação da Tau é modificado pelos produtos metabólicos da PLA2, em processos de neuritogênese e plasticidade sináptica. O presente trabalho tem como objetivo investigar, em culturas primárias de neurônios, os efeitos da inibição da PLA2 sobre o estado de fosforilação da proteína Tau. Foram utilizados inibidores de diferentes subtipos de PLA2 para o tratamento das culturas, sendo os efeitos determinados pelo método de Western Blot, utilizando-se painel de anticorpos direcionados contra a proteína Tau sensíveis ao estado de fosforilação de seus diferentes fosfoepitopos. Nossos achados mostram que a inibição da PLA2 leva a um aumento dose-dependente e específico da fosforilação da Tau no resíduo de Serina 214. Isso sugere que a PLA2 participa da regulação do estado de fosforilação da Tau em neurônios hipocampais por uma via independente da ação da enzima glicogênio sintase quinase (GSK), que é a principal quinase da proteína Tau em neurônios. Essas evidências reforçam o papel da PLA2 na fisiopatologia da DA, na qual a redução da atividade enzimática correlaciona-se com parâmetros clínicos e neuropatológicos da demência. / Tau protein is an important cytoskeleton component, responsible for microtubules stabilization, found basically in axons of neurons. The abnormal aggregation of Tau protein in a hyperphosphorylated state could lead to paired helical filaments, which in turn integrate the neurofibrillary tangles present in many illnesses, such Alzheimer Disease (AD). Together with senile plaques, neurofibrillary tangles represent the histopathological findings of AD. Indirect evidences show that metabolic products of an important family of enzymes, phospholipase A2 (PLA2) are responsible for modifications in neuritogenesis processes, synaptic plasticity and in Tau phosphorylation state. The superfamily of PLA2 comprehends many enzymes important in physiological processes, such as phospholipids digestion, cellular membrane remodeling and messengers of intracellular signaling. This way, the objective of this research is to investigate, in primary neurons cultures, the effect of PLA2 inhibition on Tau phosphorylation state. Cultures were treated with PLA2 inhibitors and the effects were analyzed by western-blot method using specifics antibodies for some Tau phosphorylated residues. Our findings show that the PLA2 inhibition increases Tau phosphorylation in Serine 214 residue in dose-dependent and specific manner. These findings suggest that PLA2 participate in hippocampal neurons Tau phosphorylation regulation, in a glycogen sintase quinase (GSK) independent manner. These evidences strengthen the possible role of PLA2 in the physiopathology of AD and that the reduction of its enzymatic activity is correlated with clinical and neuropathology parameters of dementia.