Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica, área de especialización en Bioquímica de Proteínas y Biotecnología, y Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / La Enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad neurodegenerativa, de evolución lenta y que se caracteriza por ser la forma más común de demencia. En el transcurso de la EA, la proteína tau comienza a hiperfosforilarse irreversiblemente en múltiples sitios, y se autoensambla en estructuras anómalas filamentosas denominadas filamentos helicoidales pareados (PHFs), para dar lugar finalmente a los ovillos neurofibrilares (NFTs). Se ha demostrado que los oligómeros de tau son neurotóxicos y más interesante aún, correlacionan con el deterioro cognitivo. Se discute sobre la naturaleza precisa de las especies que causan dicho efecto. Por lo tanto, la inhibición de la agregación de tau en estructuras oligoméricas o filamentosas se muestra como un blanco terapéutico para el tratamiento de la EA. Se ha descrito previamente que moléculas de la familia de quinolinas y polifenoles afectarían la agregación de tau in vitro. En este contexto, la hipótesis de este trabajo se enmarca en que nuevos compuestos derivados de quinolinas y polifenoles como el ácido fúlvico, tendrían capacidad inhibitoria en la agregación de tau. El objetivo central es desarrollar una metodología para el estudio de moléculas con propiedades antiagregantes de tau y sus posibles mecanismos de la inhibición. Para ello se ha purificado htau recombinante y el fragmento 4RMBD desde E. coli y se indujo la polimerización in vitro con heparina. Se caracterizaron los agregados formados mediante técnicas de espectroscopia de fluorescencia, dynamic light scattering (DLS), microscopia electrónica y microscopia de fuerza atómica (AFM). A su vez, se estableció una metodología para el screening de moléculas con capacidad antiagregante de tau. Mediante estas técnicas, hemos determinado que solo el compuesto THQ-55 de las quinolinas ensayadas tendría un potencial efecto antiagregante de tau a altas concentraciones. A su vez, el ácido fúlvico presenta un efecto inhibitorio en la agregación de tau y desensamblaría los agregados preformados de ésta. Hacia el futuro se espera dilucidar el mecanismo mediante el cual el ácido fúlvico afecta los procesos de agregación proteica. / Alzheimer's Disease (AD) is a neurodegenerative disorder of slow progress that affects the brain. AD is the most common form of dementia. In the course of AD, tau protein begins to be irreversibly hyperphosphorylated at multiple sites, and selfassembles into pathological filamentous structures called paired helical filaments (PHFs), and these filaments assemble into neurofibrillary tangles (NFTs). It has been shown that tau oligomers are neurotoxic and correlate with cognitive decline, although the precise nature of the species that cause this effect is unknown. In this context, the inhibition of tau aggregation in oligomeric or filamentous structures appears as a promising therapeutic target for the treatment of AD. Previously, it has been described that the family of molecules of quinolines and polyphenols would affect the aggregation of tau in vitro. In this context, the hypothesis of this research is based on the activity of quinolines compounds and polyphenols such as fulvic acid, and their inhibitory action on tau aggregation. The central goal is the development of an approach for the study of molecules with anti-tau aggregation properties and its possible mechanisms of inhibition. Htau and the 4RMBD fragment have been purified from E. coli and the in vitro aggregation was induced with heparin. Aggregates formed were characterized by fluorescence spectroscopy techniques, dynamic light scattering (DLS), electron microscopy and atomic force microscopy (AFM). Moreover, a methodology for the screening of molecules with antiaggregation capacity of tau was established. Using these techniques, we determined that of the quinolines tested only the THQ-55 compound has an antiaggregation potential on tau at high concentrations. On the other hand, fulvic acid has a significant inhibitory effect on tau aggregation and disassembles tau preformed aggregates. Towards the future, we hope to elucidate the mechanism by which the fulvic acid affects protein aggregation processes.

Emaranhados neurofibrilares intraneuronais, juntamente com as placas beta-amilóide e astrogliose são importantes marcadores neuropatológicos da doença de Alzheimer (DA). Apesar dos mecanismos envolvidos na DA do tipo esporádica ainda não estarem bem esclarecidos, a hiperfosforilação da proteína tau é sugerida como grande fator para o desenvolvimento dos emaranhados neurofibrilares, que podem gerar disfunção neuronal e morte. A toxina ácido ocadáico (AO) é considerada um efetivo inibidor das fosfatases 1 e 2A, as quais podem gerar a hiperfosforilação da tau. Dessa forma, este trabalho tem como objetivo, avaliar alterações neurogliais em hipocampo e líquido cerebroespinhal (LCE) de ratos expostos ao AO intracerebroventricular após 3 e 12 semanas da infusão. E ainda, verificar alterações neurogliais de fatias hipocampais expostas de forma aguda ao AO (in vitro). Como resultados encontramos no modelo in vivo, declínio cognitivo, hiperfosforilação da tau (Ser 396) e alteração astroglial hipocampal principalmente devido a redução da captação de glicose e aumento da expressão da GFAP e ainda, redução da S100B no LCE, a qual pode atuar na sinalização neurônio-astrócito, em condições fisiológicas ou patológicas, como na DA. Ao observar as alterações neurogliais 12 semanas após a infusão, verificamos que o modelo é parcialmente reversível, uma vez que a fosforilação da proteína tau não mostrou alteração, mas foi observado declínio cognitivo em um dos comportamentos realizados e hipometabolismo da glicose. E ainda, in vitro, o AO foi capaz de hiperfosforilar a proteína tau (Ser 396), mas não alterou parâmetros astrogliais. Portanto, o modelo animal se mostra adequado para avaliação de alterações neuroquímicas. Mas nossos resultados também apontam para uma reversibilidade parcial do modelo a longo prazo, indicando a necessidade de cautela na avaliação de estratégias terapêuticas com este modelo. E ainda, nossos dados reforçam a importância de investigar alterações do metabolismo cerebral da glicose em indivíduos com déficit cognitivo. / Intraneuronal aggregates of neurofibrillary tangles (NFTs), together with beta-amyloid plaques and astrogliosis, are important markers of Alzheimer’s disease (AD). The underlying mechanism of sporadic AD remains poorly understood, but abnormal hyperphosphorylation of tau protein is suggested to have a role in NFTs genesis, which leads to neuronal dysfunction and death. The okadaic acid (OKA) toxin is a protein phosphatase 1 e 2A inhibitor and can lead to tau protein hyperphosphorylation. We have investigated the effects of intracerebroventricular (ICV) OKA on neuroglial alterations 3 and 12 weeks after OKA infusion. We have also researched the effects on neuroglial parameters on hippocampal slices treated with OKA in vivo. Our results have shown cognitive impairment, hippocampal astrogliosis, based on GFAP increment, decreased glucose uptake and increase on tau phosphorylation (at Ser396) in hipocamppus and decrease in S100B protein on cerebrospinal fluid 3 weeks after ICV OKA-infusion. Moreover, 12 weeks after ICV OKA infusion we also observed a cognitive impairment and decreased on glucose uptake. In vitro, exposure of hippocampal slices to OKA altered tau phosphorylation at Ser396 without any associated change in astroglial function. In conclusion, the OKA-animal model proved to be a suitable model for neurochemical parameters assessment. Our results also indicate a partial reversibility of long-term animal model, suggesting that therapeutics strategies evaluations must be caution on this model; and reinforce how important is to investigate on brain glucose metabolism alterations on cognitive impairment.

Emaranhados neurofibrilares intraneuronais, juntamente com as placas beta-amilóide e astrogliose são importantes marcadores neuropatológicos da doença de Alzheimer (DA). Apesar dos mecanismos envolvidos na DA do tipo esporádica ainda não estarem bem esclarecidos, a hiperfosforilação da proteína tau é sugerida como grande fator para o desenvolvimento dos emaranhados neurofibrilares, que podem gerar disfunção neuronal e morte. A toxina ácido ocadáico (AO) é considerada um efetivo inibidor das fosfatases 1 e 2A, as quais podem gerar a hiperfosforilação da tau. Dessa forma, este trabalho tem como objetivo, avaliar alterações neurogliais em hipocampo e líquido cerebroespinhal (LCE) de ratos expostos ao AO intracerebroventricular após 3 e 12 semanas da infusão. E ainda, verificar alterações neurogliais de fatias hipocampais expostas de forma aguda ao AO (in vitro). Como resultados encontramos no modelo in vivo, declínio cognitivo, hiperfosforilação da tau (Ser 396) e alteração astroglial hipocampal principalmente devido a redução da captação de glicose e aumento da expressão da GFAP e ainda, redução da S100B no LCE, a qual pode atuar na sinalização neurônio-astrócito, em condições fisiológicas ou patológicas, como na DA. Ao observar as alterações neurogliais 12 semanas após a infusão, verificamos que o modelo é parcialmente reversível, uma vez que a fosforilação da proteína tau não mostrou alteração, mas foi observado declínio cognitivo em um dos comportamentos realizados e hipometabolismo da glicose. E ainda, in vitro, o AO foi capaz de hiperfosforilar a proteína tau (Ser 396), mas não alterou parâmetros astrogliais. Portanto, o modelo animal se mostra adequado para avaliação de alterações neuroquímicas. Mas nossos resultados também apontam para uma reversibilidade parcial do modelo a longo prazo, indicando a necessidade de cautela na avaliação de estratégias terapêuticas com este modelo. E ainda, nossos dados reforçam a importância de investigar alterações do metabolismo cerebral da glicose em indivíduos com déficit cognitivo. / Intraneuronal aggregates of neurofibrillary tangles (NFTs), together with beta-amyloid plaques and astrogliosis, are important markers of Alzheimer’s disease (AD). The underlying mechanism of sporadic AD remains poorly understood, but abnormal hyperphosphorylation of tau protein is suggested to have a role in NFTs genesis, which leads to neuronal dysfunction and death. The okadaic acid (OKA) toxin is a protein phosphatase 1 e 2A inhibitor and can lead to tau protein hyperphosphorylation. We have investigated the effects of intracerebroventricular (ICV) OKA on neuroglial alterations 3 and 12 weeks after OKA infusion. We have also researched the effects on neuroglial parameters on hippocampal slices treated with OKA in vivo. Our results have shown cognitive impairment, hippocampal astrogliosis, based on GFAP increment, decreased glucose uptake and increase on tau phosphorylation (at Ser396) in hipocamppus and decrease in S100B protein on cerebrospinal fluid 3 weeks after ICV OKA-infusion. Moreover, 12 weeks after ICV OKA infusion we also observed a cognitive impairment and decreased on glucose uptake. In vitro, exposure of hippocampal slices to OKA altered tau phosphorylation at Ser396 without any associated change in astroglial function. In conclusion, the OKA-animal model proved to be a suitable model for neurochemical parameters assessment. Our results also indicate a partial reversibility of long-term animal model, suggesting that therapeutics strategies evaluations must be caution on this model; and reinforce how important is to investigate on brain glucose metabolism alterations on cognitive impairment.

Emaranhados neurofibrilares intraneuronais, juntamente com as placas beta-amilóide e astrogliose são importantes marcadores neuropatológicos da doença de Alzheimer (DA). Apesar dos mecanismos envolvidos na DA do tipo esporádica ainda não estarem bem esclarecidos, a hiperfosforilação da proteína tau é sugerida como grande fator para o desenvolvimento dos emaranhados neurofibrilares, que podem gerar disfunção neuronal e morte. A toxina ácido ocadáico (AO) é considerada um efetivo inibidor das fosfatases 1 e 2A, as quais podem gerar a hiperfosforilação da tau. Dessa forma, este trabalho tem como objetivo, avaliar alterações neurogliais em hipocampo e líquido cerebroespinhal (LCE) de ratos expostos ao AO intracerebroventricular após 3 e 12 semanas da infusão. E ainda, verificar alterações neurogliais de fatias hipocampais expostas de forma aguda ao AO (in vitro). Como resultados encontramos no modelo in vivo, declínio cognitivo, hiperfosforilação da tau (Ser 396) e alteração astroglial hipocampal principalmente devido a redução da captação de glicose e aumento da expressão da GFAP e ainda, redução da S100B no LCE, a qual pode atuar na sinalização neurônio-astrócito, em condições fisiológicas ou patológicas, como na DA. Ao observar as alterações neurogliais 12 semanas após a infusão, verificamos que o modelo é parcialmente reversível, uma vez que a fosforilação da proteína tau não mostrou alteração, mas foi observado declínio cognitivo em um dos comportamentos realizados e hipometabolismo da glicose. E ainda, in vitro, o AO foi capaz de hiperfosforilar a proteína tau (Ser 396), mas não alterou parâmetros astrogliais. Portanto, o modelo animal se mostra adequado para avaliação de alterações neuroquímicas. Mas nossos resultados também apontam para uma reversibilidade parcial do modelo a longo prazo, indicando a necessidade de cautela na avaliação de estratégias terapêuticas com este modelo. E ainda, nossos dados reforçam a importância de investigar alterações do metabolismo cerebral da glicose em indivíduos com déficit cognitivo. / Intraneuronal aggregates of neurofibrillary tangles (NFTs), together with beta-amyloid plaques and astrogliosis, are important markers of Alzheimer’s disease (AD). The underlying mechanism of sporadic AD remains poorly understood, but abnormal hyperphosphorylation of tau protein is suggested to have a role in NFTs genesis, which leads to neuronal dysfunction and death. The okadaic acid (OKA) toxin is a protein phosphatase 1 e 2A inhibitor and can lead to tau protein hyperphosphorylation. We have investigated the effects of intracerebroventricular (ICV) OKA on neuroglial alterations 3 and 12 weeks after OKA infusion. We have also researched the effects on neuroglial parameters on hippocampal slices treated with OKA in vivo. Our results have shown cognitive impairment, hippocampal astrogliosis, based on GFAP increment, decreased glucose uptake and increase on tau phosphorylation (at Ser396) in hipocamppus and decrease in S100B protein on cerebrospinal fluid 3 weeks after ICV OKA-infusion. Moreover, 12 weeks after ICV OKA infusion we also observed a cognitive impairment and decreased on glucose uptake. In vitro, exposure of hippocampal slices to OKA altered tau phosphorylation at Ser396 without any associated change in astroglial function. In conclusion, the OKA-animal model proved to be a suitable model for neurochemical parameters assessment. Our results also indicate a partial reversibility of long-term animal model, suggesting that therapeutics strategies evaluations must be caution on this model; and reinforce how important is to investigate on brain glucose metabolism alterations on cognitive impairment.

A proteína Tau é um importante componente do citoesqueleto neuronal, encontrada fundamentalmente nos axônios e sendo responsável pela estabilização dos microtúbulos. Agregados de proteína Tau em estado hiperfosforilado dão origem aos filamentos helicoidais pareados, que por sua vez integram os emaranhados neurofibrilares. Estes, ao lado das placas senis, representam os achados patológicos característicos da doença de Alzheimer (DA). A superfamília das fosfolipases A2 (PLA2) compreende diversas enzimas que participam de processos fisiológicos importantes, tais como a digestão de fosfolipídios, a remodelação da membrana celular e a geração de mensageiros para a sinalização intracelular. Existem evidências indiretas de que o estado de fosforilação da Tau é modificado pelos produtos metabólicos da PLA2, em processos de neuritogênese e plasticidade sináptica. O presente trabalho tem como objetivo investigar, em culturas primárias de neurônios, os efeitos da inibição da PLA2 sobre o estado de fosforilação da proteína Tau. Foram utilizados inibidores de diferentes subtipos de PLA2 para o tratamento das culturas, sendo os efeitos determinados pelo método de Western Blot, utilizando-se painel de anticorpos direcionados contra a proteína Tau sensíveis ao estado de fosforilação de seus diferentes fosfoepitopos. Nossos achados mostram que a inibição da PLA2 leva a um aumento dose-dependente e específico da fosforilação da Tau no resíduo de Serina 214. Isso sugere que a PLA2 participa da regulação do estado de fosforilação da Tau em neurônios hipocampais por uma via independente da ação da enzima glicogênio sintase quinase (GSK), que é a principal quinase da proteína Tau em neurônios. Essas evidências reforçam o papel da PLA2 na fisiopatologia da DA, na qual a redução da atividade enzimática correlaciona-se com parâmetros clínicos e neuropatológicos da demência. / Tau protein is an important cytoskeleton component, responsible for microtubules stabilization, found basically in axons of neurons. The abnormal aggregation of Tau protein in a hyperphosphorylated state could lead to paired helical filaments, which in turn integrate the neurofibrillary tangles present in many illnesses, such Alzheimer Disease (AD). Together with senile plaques, neurofibrillary tangles represent the histopathological findings of AD. Indirect evidences show that metabolic products of an important family of enzymes, phospholipase A2 (PLA2) are responsible for modifications in neuritogenesis processes, synaptic plasticity and in Tau phosphorylation state. The superfamily of PLA2 comprehends many enzymes important in physiological processes, such as phospholipids digestion, cellular membrane remodeling and messengers of intracellular signaling. This way, the objective of this research is to investigate, in primary neurons cultures, the effect of PLA2 inhibition on Tau phosphorylation state. Cultures were treated with PLA2 inhibitors and the effects were analyzed by western-blot method using specifics antibodies for some Tau phosphorylated residues. Our findings show that the PLA2 inhibition increases Tau phosphorylation in Serine 214 residue in dose-dependent and specific manner. These findings suggest that PLA2 participate in hippocampal neurons Tau phosphorylation regulation, in a glycogen sintase quinase (GSK) independent manner. These evidences strengthen the possible role of PLA2 in the physiopathology of AD and that the reduction of its enzymatic activity is correlated with clinical and neuropathology parameters of dementia.

A doença de Alzheimer é a principal e a mais comum desordem neurodegenerativa relacionada à idade. O número de pessoas afetadas pela doença de Alzheimer vem crescendo bastante nos últimos anos, principalmente devido ao aumento da expectativa de vida da população. As causas para o desenvolvimento da doença de Alzheimer são bastante complexas, envolvendo uma combinação de fatores genéticos, moleculares e ambientais. Os emaranhados neurofibrilares, constituídos pela proteína tau hiperfosforilada, e as placas senis, compostas pelo peptídeo β-amiloide, são as duas principais alterações fisiopatológicas encontradas nessa patologia. Existe uma ampla variedade de evidências genéticas, fisiológicas e bioquímicas que suportam a ideia que o peptídeo β-amiloide é ao menos uma das causas que originam a doença de Alzheimer. Na forma monomérica, o peptídeo β-amiloide parece não exercer efeitos tóxicos. Porém, conforme estas formas monoméricas se polimerizam formando intermediários solúveis denominados oligômeros, e por fim protofibrilas e fibrilas, exercem consideráveis efeitos neurotóxicos. Os oligômeros do peptídeo β-amiloide são capazes de se correlacionar de forma mais consistente com os distúrbios cognitivos observados na doença de Alzheimer. Além disso, diversos trabalhos atribuem às alterações sinápticas um dos principais mecanismos de toxicidade dos oligômeros do peptídeo β- amiloide. Para isso, diversas vias de sinalização sofrem alteração no seu funcionamento, como a via das MAPKs, destacando as proteínas JNK1/2 e ERK1/2, e a via Wnt/β-catenina. Neste trabalho nós procuramos avaliar os mecanismos moleculares de toxicidade dos oligômeros do peptídeo β-amiloide em culturas organotípicas de hipocampo de ratos. Para isso, as culturas foram expostas às concentrações de 0,5; 1 e 2 μM por um período de 48h. A morte celular foi avaliada a partir da incorporação do iodeto de propídeo, um marcador de morte celular de células principalmente em processo de necrose. A exposição das culturas a todas as concentrações testadas não foi capaz de causar um aumento significativo na morte celular. Entretanto, observamos um decréscimo nos níveis da proteína sinaptofisina por Western blotting em todas as concentrações utilizadas. Essas alterações nos níveis de sinaptofisina foram acompanhadas pela ativação da proteína JNK, ou seja, pelo aumento da sua fosforilação, e pela inibição da proteína ERK, que teve seus níveis de fosforilação diminuídos. Nós também observamos uma diminuição no imunoconteúdo da proteína β-catenina. A avaliação dos níveis de fosforilação da GSK-3β e β-catenina não apresentou resultado significativo. Embora mais estudos sejam necessários para avaliar os mecanismos de toxicidade dos oligômeros do peptídeo β-amiloide, nossos resultados sugerem uma perda sináptica nas culturas organotípicas, uma das primeiras características observadas na doença de Alzheimer. Acreditamos que esse modelo possa ser utilizado no estudo de fatores fisiológicos e compostos farmacológicos relacionados com a doença de Alzheimer. / Alzheimer’s disease is the principal and the most common neurodegenerative age-related disorder. The number of patients affected by Alzheimer’s disease has increased greatly in recent years, mainly due to increase in life expectancy of the population. The causes for the development of Alzheimer’s disease are quite complex, involving a combination of genetics, molecular, and environmental factors. Neurofibrillary tangles, formed by hyperphosphorylated tau protein, and senile plaques, composed of amyloid-β peptide, are the two major pathological changes found in Alzheimer’s disease. A wide variety of genetic, physiological, and biochemical evidences support the idea that amyloid-β peptide is at least one of the main causes of Alzheimer’s disease. In monomeric form the amyloid-β peptide appears did not exert toxic effects. However, as these monomers polymerize forming soluble intermediates called oligomers, and after protofibrils and fibrils, exert considerable neurotoxic effects. The amyloid-β oligomers peptide are more consistently correlated to cognitive disturbances observed in Alzheimer’s disease. In addition, several works have attributed to synaptic changes a major mechanism of amyloid-β oligomers toxicity. Several signaling pathways become altered in their work due to amyloid-β oligomers, such as MAPK pathway, highlighting JNK1/2 and ERK1/2 proteins, and Wnt/β-catenina. In this work, we evaluated the molecular mechanisms of amyloid-β oligomers toxicity in rat organotypic hippocampal slice cultures. For this purpose, cultures were exposed to concentrations of 0.5, 1, and 2 μM of amyloid-β oligomers for 48h. Cell death was assessed from the incorporation of propidium iodide, a marker of cell that are mainly in the necrosis process death. Exposure of all concentrations tested was not able to induce a significant increase in cell death in cultures. However, a decrease in synaptophysin protein levels by Western blotting occured in all concentrations. These changes in synaptophysin levels were accompanied by JNK activation and ERK inhibition. We also observed a decrease in β-catenin protein immunocontent. The evaluation of GSK-3β and β-catenin phosphorylation showed no significant alterations. Although further studies are necessary for understanding the mechanisms underlying amyloid-β oligomers toxicity, our data suggest synaptic loss in organotypic cultures, one of the earlier characteristics of AD, may be considered a good model to study physiologic factors and pharmacologic compounds AD-related.

A doença de Alzheimer é a principal e a mais comum desordem neurodegenerativa relacionada à idade. O número de pessoas afetadas pela doença de Alzheimer vem crescendo bastante nos últimos anos, principalmente devido ao aumento da expectativa de vida da população. As causas para o desenvolvimento da doença de Alzheimer são bastante complexas, envolvendo uma combinação de fatores genéticos, moleculares e ambientais. Os emaranhados neurofibrilares, constituídos pela proteína tau hiperfosforilada, e as placas senis, compostas pelo peptídeo β-amiloide, são as duas principais alterações fisiopatológicas encontradas nessa patologia. Existe uma ampla variedade de evidências genéticas, fisiológicas e bioquímicas que suportam a ideia que o peptídeo β-amiloide é ao menos uma das causas que originam a doença de Alzheimer. Na forma monomérica, o peptídeo β-amiloide parece não exercer efeitos tóxicos. Porém, conforme estas formas monoméricas se polimerizam formando intermediários solúveis denominados oligômeros, e por fim protofibrilas e fibrilas, exercem consideráveis efeitos neurotóxicos. Os oligômeros do peptídeo β-amiloide são capazes de se correlacionar de forma mais consistente com os distúrbios cognitivos observados na doença de Alzheimer. Além disso, diversos trabalhos atribuem às alterações sinápticas um dos principais mecanismos de toxicidade dos oligômeros do peptídeo β- amiloide. Para isso, diversas vias de sinalização sofrem alteração no seu funcionamento, como a via das MAPKs, destacando as proteínas JNK1/2 e ERK1/2, e a via Wnt/β-catenina. Neste trabalho nós procuramos avaliar os mecanismos moleculares de toxicidade dos oligômeros do peptídeo β-amiloide em culturas organotípicas de hipocampo de ratos. Para isso, as culturas foram expostas às concentrações de 0,5; 1 e 2 μM por um período de 48h. A morte celular foi avaliada a partir da incorporação do iodeto de propídeo, um marcador de morte celular de células principalmente em processo de necrose. A exposição das culturas a todas as concentrações testadas não foi capaz de causar um aumento significativo na morte celular. Entretanto, observamos um decréscimo nos níveis da proteína sinaptofisina por Western blotting em todas as concentrações utilizadas. Essas alterações nos níveis de sinaptofisina foram acompanhadas pela ativação da proteína JNK, ou seja, pelo aumento da sua fosforilação, e pela inibição da proteína ERK, que teve seus níveis de fosforilação diminuídos. Nós também observamos uma diminuição no imunoconteúdo da proteína β-catenina. A avaliação dos níveis de fosforilação da GSK-3β e β-catenina não apresentou resultado significativo. Embora mais estudos sejam necessários para avaliar os mecanismos de toxicidade dos oligômeros do peptídeo β-amiloide, nossos resultados sugerem uma perda sináptica nas culturas organotípicas, uma das primeiras características observadas na doença de Alzheimer. Acreditamos que esse modelo possa ser utilizado no estudo de fatores fisiológicos e compostos farmacológicos relacionados com a doença de Alzheimer. / Alzheimer’s disease is the principal and the most common neurodegenerative age-related disorder. The number of patients affected by Alzheimer’s disease has increased greatly in recent years, mainly due to increase in life expectancy of the population. The causes for the development of Alzheimer’s disease are quite complex, involving a combination of genetics, molecular, and environmental factors. Neurofibrillary tangles, formed by hyperphosphorylated tau protein, and senile plaques, composed of amyloid-β peptide, are the two major pathological changes found in Alzheimer’s disease. A wide variety of genetic, physiological, and biochemical evidences support the idea that amyloid-β peptide is at least one of the main causes of Alzheimer’s disease. In monomeric form the amyloid-β peptide appears did not exert toxic effects. However, as these monomers polymerize forming soluble intermediates called oligomers, and after protofibrils and fibrils, exert considerable neurotoxic effects. The amyloid-β oligomers peptide are more consistently correlated to cognitive disturbances observed in Alzheimer’s disease. In addition, several works have attributed to synaptic changes a major mechanism of amyloid-β oligomers toxicity. Several signaling pathways become altered in their work due to amyloid-β oligomers, such as MAPK pathway, highlighting JNK1/2 and ERK1/2 proteins, and Wnt/β-catenina. In this work, we evaluated the molecular mechanisms of amyloid-β oligomers toxicity in rat organotypic hippocampal slice cultures. For this purpose, cultures were exposed to concentrations of 0.5, 1, and 2 μM of amyloid-β oligomers for 48h. Cell death was assessed from the incorporation of propidium iodide, a marker of cell that are mainly in the necrosis process death. Exposure of all concentrations tested was not able to induce a significant increase in cell death in cultures. However, a decrease in synaptophysin protein levels by Western blotting occured in all concentrations. These changes in synaptophysin levels were accompanied by JNK activation and ERK inhibition. We also observed a decrease in β-catenin protein immunocontent. The evaluation of GSK-3β and β-catenin phosphorylation showed no significant alterations. Although further studies are necessary for understanding the mechanisms underlying amyloid-β oligomers toxicity, our data suggest synaptic loss in organotypic cultures, one of the earlier characteristics of AD, may be considered a good model to study physiologic factors and pharmacologic compounds AD-related.

A doença de Alzheimer é a principal e a mais comum desordem neurodegenerativa relacionada à idade. O número de pessoas afetadas pela doença de Alzheimer vem crescendo bastante nos últimos anos, principalmente devido ao aumento da expectativa de vida da população. As causas para o desenvolvimento da doença de Alzheimer são bastante complexas, envolvendo uma combinação de fatores genéticos, moleculares e ambientais. Os emaranhados neurofibrilares, constituídos pela proteína tau hiperfosforilada, e as placas senis, compostas pelo peptídeo β-amiloide, são as duas principais alterações fisiopatológicas encontradas nessa patologia. Existe uma ampla variedade de evidências genéticas, fisiológicas e bioquímicas que suportam a ideia que o peptídeo β-amiloide é ao menos uma das causas que originam a doença de Alzheimer. Na forma monomérica, o peptídeo β-amiloide parece não exercer efeitos tóxicos. Porém, conforme estas formas monoméricas se polimerizam formando intermediários solúveis denominados oligômeros, e por fim protofibrilas e fibrilas, exercem consideráveis efeitos neurotóxicos. Os oligômeros do peptídeo β-amiloide são capazes de se correlacionar de forma mais consistente com os distúrbios cognitivos observados na doença de Alzheimer. Além disso, diversos trabalhos atribuem às alterações sinápticas um dos principais mecanismos de toxicidade dos oligômeros do peptídeo β- amiloide. Para isso, diversas vias de sinalização sofrem alteração no seu funcionamento, como a via das MAPKs, destacando as proteínas JNK1/2 e ERK1/2, e a via Wnt/β-catenina. Neste trabalho nós procuramos avaliar os mecanismos moleculares de toxicidade dos oligômeros do peptídeo β-amiloide em culturas organotípicas de hipocampo de ratos. Para isso, as culturas foram expostas às concentrações de 0,5; 1 e 2 μM por um período de 48h. A morte celular foi avaliada a partir da incorporação do iodeto de propídeo, um marcador de morte celular de células principalmente em processo de necrose. A exposição das culturas a todas as concentrações testadas não foi capaz de causar um aumento significativo na morte celular. Entretanto, observamos um decréscimo nos níveis da proteína sinaptofisina por Western blotting em todas as concentrações utilizadas. Essas alterações nos níveis de sinaptofisina foram acompanhadas pela ativação da proteína JNK, ou seja, pelo aumento da sua fosforilação, e pela inibição da proteína ERK, que teve seus níveis de fosforilação diminuídos. Nós também observamos uma diminuição no imunoconteúdo da proteína β-catenina. A avaliação dos níveis de fosforilação da GSK-3β e β-catenina não apresentou resultado significativo. Embora mais estudos sejam necessários para avaliar os mecanismos de toxicidade dos oligômeros do peptídeo β-amiloide, nossos resultados sugerem uma perda sináptica nas culturas organotípicas, uma das primeiras características observadas na doença de Alzheimer. Acreditamos que esse modelo possa ser utilizado no estudo de fatores fisiológicos e compostos farmacológicos relacionados com a doença de Alzheimer. / Alzheimer’s disease is the principal and the most common neurodegenerative age-related disorder. The number of patients affected by Alzheimer’s disease has increased greatly in recent years, mainly due to increase in life expectancy of the population. The causes for the development of Alzheimer’s disease are quite complex, involving a combination of genetics, molecular, and environmental factors. Neurofibrillary tangles, formed by hyperphosphorylated tau protein, and senile plaques, composed of amyloid-β peptide, are the two major pathological changes found in Alzheimer’s disease. A wide variety of genetic, physiological, and biochemical evidences support the idea that amyloid-β peptide is at least one of the main causes of Alzheimer’s disease. In monomeric form the amyloid-β peptide appears did not exert toxic effects. However, as these monomers polymerize forming soluble intermediates called oligomers, and after protofibrils and fibrils, exert considerable neurotoxic effects. The amyloid-β oligomers peptide are more consistently correlated to cognitive disturbances observed in Alzheimer’s disease. In addition, several works have attributed to synaptic changes a major mechanism of amyloid-β oligomers toxicity. Several signaling pathways become altered in their work due to amyloid-β oligomers, such as MAPK pathway, highlighting JNK1/2 and ERK1/2 proteins, and Wnt/β-catenina. In this work, we evaluated the molecular mechanisms of amyloid-β oligomers toxicity in rat organotypic hippocampal slice cultures. For this purpose, cultures were exposed to concentrations of 0.5, 1, and 2 μM of amyloid-β oligomers for 48h. Cell death was assessed from the incorporation of propidium iodide, a marker of cell that are mainly in the necrosis process death. Exposure of all concentrations tested was not able to induce a significant increase in cell death in cultures. However, a decrease in synaptophysin protein levels by Western blotting occured in all concentrations. These changes in synaptophysin levels were accompanied by JNK activation and ERK inhibition. We also observed a decrease in β-catenin protein immunocontent. The evaluation of GSK-3β and β-catenin phosphorylation showed no significant alterations. Although further studies are necessary for understanding the mechanisms underlying amyloid-β oligomers toxicity, our data suggest synaptic loss in organotypic cultures, one of the earlier characteristics of AD, may be considered a good model to study physiologic factors and pharmacologic compounds AD-related.

A proteína Tau é um importante componente do citoesqueleto neuronal, encontrada fundamentalmente nos axônios e sendo responsável pela estabilização dos microtúbulos. Agregados de proteína Tau em estado hiperfosforilado dão origem aos filamentos helicoidais pareados, que por sua vez integram os emaranhados neurofibrilares. Estes, ao lado das placas senis, representam os achados patológicos característicos da doença de Alzheimer (DA). A superfamília das fosfolipases A2 (PLA2) compreende diversas enzimas que participam de processos fisiológicos importantes, tais como a digestão de fosfolipídios, a remodelação da membrana celular e a geração de mensageiros para a sinalização intracelular. Existem evidências indiretas de que o estado de fosforilação da Tau é modificado pelos produtos metabólicos da PLA2, em processos de neuritogênese e plasticidade sináptica. O presente trabalho tem como objetivo investigar, em culturas primárias de neurônios, os efeitos da inibição da PLA2 sobre o estado de fosforilação da proteína Tau. Foram utilizados inibidores de diferentes subtipos de PLA2 para o tratamento das culturas, sendo os efeitos determinados pelo método de Western Blot, utilizando-se painel de anticorpos direcionados contra a proteína Tau sensíveis ao estado de fosforilação de seus diferentes fosfoepitopos. Nossos achados mostram que a inibição da PLA2 leva a um aumento dose-dependente e específico da fosforilação da Tau no resíduo de Serina 214. Isso sugere que a PLA2 participa da regulação do estado de fosforilação da Tau em neurônios hipocampais por uma via independente da ação da enzima glicogênio sintase quinase (GSK), que é a principal quinase da proteína Tau em neurônios. Essas evidências reforçam o papel da PLA2 na fisiopatologia da DA, na qual a redução da atividade enzimática correlaciona-se com parâmetros clínicos e neuropatológicos da demência. / Tau protein is an important cytoskeleton component, responsible for microtubules stabilization, found basically in axons of neurons. The abnormal aggregation of Tau protein in a hyperphosphorylated state could lead to paired helical filaments, which in turn integrate the neurofibrillary tangles present in many illnesses, such Alzheimer Disease (AD). Together with senile plaques, neurofibrillary tangles represent the histopathological findings of AD. Indirect evidences show that metabolic products of an important family of enzymes, phospholipase A2 (PLA2) are responsible for modifications in neuritogenesis processes, synaptic plasticity and in Tau phosphorylation state. The superfamily of PLA2 comprehends many enzymes important in physiological processes, such as phospholipids digestion, cellular membrane remodeling and messengers of intracellular signaling. This way, the objective of this research is to investigate, in primary neurons cultures, the effect of PLA2 inhibition on Tau phosphorylation state. Cultures were treated with PLA2 inhibitors and the effects were analyzed by western-blot method using specifics antibodies for some Tau phosphorylated residues. Our findings show that the PLA2 inhibition increases Tau phosphorylation in Serine 214 residue in dose-dependent and specific manner. These findings suggest that PLA2 participate in hippocampal neurons Tau phosphorylation regulation, in a glycogen sintase quinase (GSK) independent manner. These evidences strengthen the possible role of PLA2 in the physiopathology of AD and that the reduction of its enzymatic activity is correlated with clinical and neuropathology parameters of dementia.

O presente estudo comparou o efeito do tratamento crônico com lítio em doses subterapêuticas (0,02mM e 0,2mM) e dose terapêutica (2mM) em cultura primária de neurônios corticais e hipocampais. As amostras foram analisadas e comparadas com o grupo controle (sem tratamento) tanto para os neurônios corticais, como para os neurônios hipocampais. O objetivo do estudo foi: 1) avaliar, nessas culturas celulares, a atividade de diferentes quinases (PKA, CaMKII, AKT e GSK3beta), diferentes sítio de fosforilação da Tau (Ser, 199, 205, 214, 396, C-terminal e seis isoformas), a partir da inibição da PLA2 pelo lítio; 2) Investigar as vias de sinalização envolvidas na modulação do estado de fosforilação da proteína tau a partir da inibição da PLA2 em culturas primárias de neurônios; 3) avaliar, simultaneamente, a expressão de fatores neurotróficos (BDNF) e citocinas (GM-CSF, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL6, IL-10, IL-12, IFN-y e TNF-alfa) mediante o tratamento de neurônios primários com lítio e 4) avaliar expressão gênica por microarray das culturas tratadas com diferentes doses, subterapêuticas e terapêutica, de cloreto de lítio. Nossos resultados sugerem uma dissociação de efeitos em neurônios corticais dos observados em neurônios hipocampais. O lítio aumentou a atividade enzimática da iPLA2 e da cPLA2, tanto em neurônios corticais como em neurônios hipocampais. A atividade da GSK3beta foi inibida pelo tratamento crônico com lítio em neurônios hipocampais e apresentou efeito contrário em neurônios corticais. Observamos comportamentos diferentes das diferentes proteínas analisadas em culturas de neurônios corticais e hipocampais, e não tivemos significância estatística para as alterações na proteína tau. O tratamento nas doses subterapêuticas aumentou a secreção de citocinas pró-inflamatórias tanto em neurônios corticais quanto em neurônios hipocampais / The present study compared the effect of lithium chronic treatment with subtherapeutic doses (0.02mM and 0.2mM) and therapeutic dose (2mM) in primary cortical and hippocampal neurons cell culture. This samples were analyzed and compared with the control group (no treatment). The study\'s goal was: 1) to evaluate in these Cell Culture a different activity kinases (PKA, CaMKII, AKT and GSK3beta), different phosphorylation site of the Tau (199, 205, 214, 396, C-terminal and Six isoforms) and PLA2 inhibition; 2) To investigate how signaling pathways involved in modulation of tau phosphorylation from the inhibition of PLA2 in primary cultures of neurons; 3) analyze an expression of neurotrophic factors (BDNF) and cytokines (GM-CSF, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IFNy TNFalfa 4) to evaluate gene expression via microarray with different doses of lithium treatment. Our results suggest a dissociation effects on cortical and hippocampal neurons cell culture. Lithium increased the enzyme activity of iPLA2 and cPLA2, in both cortical and hippocampal neurons. The GSK3beta the activity was inhibited by chronic treatment with lithium in hippocampal neurons and presented contrary effect on cortical neurons. We observe not statistics significance on tau protein. The treatment at subtherapeutic and therapeutic doses increased the secretion of pro and anti-inflammatory cytokines both in cortical and hippocampal neurons