Orientador: Stephen Hyslop / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-15T04:49:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Smaal_Adriana_M.pdf: 6478282 bytes, checksum: 2107d35eeaa596500136ca0dd4e07119 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O envenenamento por serpentes do gênero Bothrops resulta em alterações sistêmicas que incluem coagulopatia, hemorragia sistêmica, choque hipovolêmico e insuficiência renal aguda. Neste estudo investigamos a ação de da peçonha de B. jararacussu e suas frações cromatográficas sobre alguns parâmetros cardiovasculares (pressão arterial, freqüências cardíaca e respiratória, e eletrocardiograma) em ratos anestesiados com uretana. Ratos Wistar (300-400 g) foram canulados na arteria carótida esquerda para monitoramento contínuo da pressão arterial sistêmica e na veia femoral para administração das peçonhas e frações cromatográficas. A freqüência cardíaca e o ECG foram monitorados por um eletrocardiógrafo. No final do experimento, coração, rins, fígado e pulmão foram processados para avaliação histológica. Os ratos foram monitorados durante 120 min. Para análise histológica, foram coletados amostras de coração, pulmão, rim e fígado. A peçonha (0.25, 0.5 and 0.75 mg/kg, i.v.) casou queda acentuada da pressão arterial nos até os 5 minutos após administração das peçonhas, tendo recuperação para valores de níveis basais nas doses menores, e a dose maior não houve recuperação. As doses menores não causaram alterações nas freqüências cardíacas e respiratórias, porem a dose maior causou queda irreversivel destes parâmetros. Alterações transitórias vistas no ECG foram extra sístole, taquicardia ventricular e alteração na amplitude do complexo QRS. Ratos injetados com a menor dose sobreviveram durante os 120 minutos monitorados no experimento, já os injetados com a maior dose morreram com aproximadamente 15 minutos após a administração da peçonha. A gel filtração resultou em 5 picos (PI-PV), sendo que a administração dos 2 primeiros picos mostraram alterações semelhantes a peçonha bruta. O fracionamento do pico I por troca iônica, não resultou em alterações cardiovasculares,pois provavelmente eles agem em sinergismo. Similarmente, a Bothropstoxina isolada do pico III não causou alterações. Analise histológica mostraram alterações em órgãos, principalmente em pulmões. Adicionalmente,foi visualizado mionecrose, edema e infiltrado inflamatório no coração, perda da arquitetura tecidual no fígado, e microaneurismas capilares, presença de proteína na luz tubular, e infiltrado inflamatório nos rins. Os picos I, II e III mostraram alterações similares a peçonha bruta. Estes resultados mostram que as peçonhas botrópicas produzem alterações cardiovasculares importantes, alem de alterações morfológicas em diversos órgãos. A predominância de hemorragia e presença de atividade hemorrágica nos picos I, II e III indicam a presença de diversas proteínas hemorrágicas nesta peçonha. / Abstract: Envenoming by Bothrops snakes results in systemic alterations that include coagulopathy, internal hemorrhage, hypovolemic shock and acute renal failure. In this work, we investigated the action of Bothrops jararacussu snake venom and its chromatographic fractions on arterial blood pressure, heart and respiratory rates, and electrocardiogram in urethane-anesthetized male Wistar rats. The rats were cannulated for blood pressure measurements (carotid artery) and the injection of venom or fraction (femoral vein). The heart rate and electrocardiogram (ECG) were measured with an ECG recorder. At the end of the experiments, samples of heart, liver, lung and kidney were processed for histological analysis. Venom (0.25, 0.5 and 0.75 mg/kg, i.v.) caused immediate hypotension that lasted for 5 min followed by a gradual recovery to pre-venom levels with the two lowest doses, whereas there was no recovery with the highest dose. The two lowest doses did not significantly affect the heart rate or respiratory rate, but these parameters were depressed with the highest dose. Transient changes in the ECG seen during the first 5 min included ventricular extrasystoles, ventricular tachycardia and alterations in the QRS complex amplitude. Rats injected with the two lowest doses survived for 120 min post-venom, whereas with the highest dose the survival time was 15 min at the most. Gel filtration (Sephacryl 75) of venom resulted in five peaks (PI - PIV), the first two of which produced cardiovascular alterations similar to those of the venom. Fractionation of PI resulted in two major peaks, neither of which produced significant cardiovascular alterations, perhaps because they normally act in synergy. Similarly, a PLA2 (bothropstoxin) isolated from peak PIII did not alter the parameters investigated. Histological analysis revealed hemorrhage in the organs examined, particularly the lungs. In addition, there were focal lesions in hepatic and renal tissue, as well as renal epithelial desquamation, glomerular microaneurysms, an increase in the capsular space and the presence of protein-like material in the lumen of proximal and distal tubules. Peaks PI, PII and PIII produced histological alterations similar to those of the venom. These results show that B. jararacussu venom causes important cardiovascular changes in anesthetized rats, in addition to morphological alterations in a variety of organs. The predominance of hemorrhage and the presence of hemorrhagic activity in peaks PI - PIII indicate the presence of a variety of hemorrhagic proteins in this venom. / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Farmacologia

A radiação ionizante tem sido empregada com sucesso na modificação das propriedades imunológicas das biomoléculas e tem se mostrado uma potente ferramenta para destoxicar venenos de serpentes sem afetar e, muitas vezes, melhorando suas propriedades imunogênicas. Resultados promissores foram obtidos com o tratamento, tanto de veneno total quanto de frações isoladas, com a radiação gama de 60Co. No presente trabalho, foram avaliados os efeitos da Bothropstoxina-1 (Bthx-1) e do veneno total de Bothrops jararacussu sobre o sistema imune de camundongos B10.PL e BALB/c, visando caracterizar a resposta imune contra proteínas irradiadas. Modificações estruturais foram observadas por meio de técnicas eletroforéticas - SDS-PAGE. Para os ensaios imunológicos, camundongos de diferentes linhagens foram imunizados com ambas as formas da Bthx-1 e os anticorpos circulantes foram isotipados e titulados pelo método de ELISA. Os resultados mostraram que tanto o veneno total como a toxina isolada, mesmo após o processo de irradiação, se mostraram imunogênicos e os anticorpos produzidos reconheciam as formas nativas. Para a caracterização antigênica a técnica de Western Blot permitiu demonstrar que a Bthx-1 irradiada induziu à produção de anticorpos responsivos para ambas as formas da toxina isolada e do veneno total. Os resultados do ensaio de citotoxicidade mostram que a viabilidade dos macrófagos ensaiados com a Bthx-1 ou com o veneno total irradiados foi maior quando comparada com os resultados obtidos para as formas nativas. Analisando-se o resultado do ensaio de LDH, observou-se que a Bthx-1 irradiada promoveu menor dano muscular que a toxina nativa. Conclui-se que a irradiação de proteínas promove modificações estruturais significativas, mantendo, contudo, suas propriedades imunológicas originais, representando uma potencial ferramenta na melhoria do processo de imunização. / Ionizing radiation has been successfully employed to modify the immunological properties of biomolecules and has been proven to be a powerful tool to attenuate snake venoms toxicity without affecting and even increasing their immunogenic properties. Very promising results were obtained when crude animal venoms, as well as isolated toxins, were treated with 60Co gamma rays, yielding toxoids with good immunogenicity, however, little is known about the modifications that irradiated molecules undergo and even less about the immunological response that such antigens elicit. At the present work, we have evaluated the effects on immune system of B10.PL and BALB/c mice of Bothrops jararacussu crude venom and isolated bothropstoxin-1 (Bthx-1), before and after gamma radiation exposition. According to our data, irradiation process promoted structural modifications on both isolated toxin and crude venom, characterized by higher molecular weight protein (aggregates and oligomers) formation. Irradiated samples were immunogenic and the antibodies elicited by them were able to recognize the native toxin in ELISA. These results indicate that irradiation of toxic proteins can promote significant modifications in their structures, but still retain many of the original antigenic and immunological properties. Also, our data indicate that the irradiated protein induced higher titers of IgG2b, suggesting that Th1 cells were predominantly involved. Results from Western blot assay showed that antibodies raised against irradiated bothropstoxin-1 recognize both native isolated toxin or crude venom. Citotoxicity assay showed that irradiated toxin and crude venom were less toxic than their native counterpart. Thus, the viability of the macrophages cultured in the presence of irradiated Bthx-1 or crude venom was higher if compared with their native forms. LDH Assay showed that irradiated Bthx-1 promotes less muscular damage than the native form. Our data confirm a potential use of ionizing radiation for immunization process improvement.

Neste trabalho descrevemos o isolamento e a caracterização bioquímica, estrutural e funcional de uma L-aminoácido oxidase isolada do veneno da serpente Bothrops jararacussu, proteína esta denominada BjussuLAAO. O isolamento foi realizado pela combinação de três etapas cromatográficas, utilizando filtração molecular em Sephadex G-75, seguida de cromatografia de afinidade em Benzamidina-Sepharose, seguida pela última etapa cromatográfica, realizada com interação hidrofóbica em Fenil-Sepharose. A BjussuLAAO é uma proteína com massa molecular de 61 kDa e pI 5,8, e apresentou alta similaridade sequencial com as LAAOs já isoladas dos venenos de serpentes. A enzima BjussuLAAO induziu edema apenas na maior dose (100 ?g/animal), não apresentou atividade miotóxica, também não apresentou atividade hemorrágica, mesmo nas doses mais elevadas. A BjussuLAAO, demonstrou ter efeito coagulante e ação fibrinogenolítica e, mesmo utilizando inibidores de metaloproteases e serino proteases, continuou apresentando tal atividade, demonstrando assim não existir contaminantes destas classes de proteínas na amostra. As atividades mais interessantes do ponto de vista farmacológico, onde podemos visualizar a BjussuLAAO como um futuro fármaco, foram as atividades antitumoral, bactericida e antiparasitária. Esta apresentou, em baixas concentrações, citotoxicidade sobre células tumorais, ação leishmanicida e tripanocida, demonstrando assim ser uma substância candidata a fármaco multifuncional. / In this research we described the isolation and biochemical, structural and functional characterization of an L-amino acid oxidase from Bothrops jararacussu venom, named BjussuLAAO. The purification was carried out through three chromatography steps, using a molecular filtration on Sephadex G-75, followed by an affinity chromatography on Benzamidine-Sepharose, and finally a hydrophobic chromatography on Phenyl-Sepharose. BjussuLAAO is a protein with a molecular mass of 61 kDa and pI 5.8. This protein showed high sequencial similarity with other LAAOs from snake venoms. BjussuLAAO induced edema only in the highest dose (100 ?g/animal), did not show any myotoxic or hemorrhagic activity. BjussuLAAO, showed clotting and fibrinogenolitic activity, even in the presence of metalloproteases and serino-proteases inhibitors. The more interesting pharmacological activities, where from we can look a future application, were the anti-tumoral, bactericide, leishmanicidal and tripanocidal actions. The enzyme displayed a bactericide effect too, showing to be a multifunctional drug.

A saúde bucal, na maioria dos municípios brasileiros, constitui ainda um grande desafio aos princípios do Sistema Único de Saúde, principalmente no que se refere à universalização, à eqüidade do atendimento e alto custo envolvido na terapia restauradora. A procura pela descoberta de novos compostos metabólicos com atividade antibacteriana para a prevenção de doenças bucais e talvez com menores impactos a saúde e financeiros, seria muito importante para obtenção de um meio efetivo de controle da formação de um biofilme patogênico e da cárie dental. O objetivo deste trabalho é estudar a viabilidade biotecnológica do uso de venenos nativos de diferentes serpentes quanto à capacidade de inibir o crescimento de Streptococcus mutans, principal agente envolvido na cárie dental. Nossos resultados mostraram que os venenos das serpentes Bothrops moojeni e Bothrops jararacussu inibiram o crescimento de Streptococcus mutans e o componente responsável pela inibição parece ser a peróxido de hidrogênio. Apesar de ainda não totalmente conclusivos, os ensaios já realizados, permitem afirmar que venenos de serpentes são ferramentas importantes na inibição do crescimento de patógenos, especificamente daqueles envolvidos nas doenças cariogênicas. / The oral health at the most of Brazilian municipalities is still a big challenge to the principles of the Brazilian Health Unique System (SUS), particularly with regard to the globalization, the equity of care and high cost involved in restorative therapy. The demand for discovery of new natural products with antibacterial activity in order to prevent dental diseases and perhaps with fewer health and financial impacts, would be very important to achieve an effective means to control the formation of a pathogenic biofilm and dental caries. The objective of this work is to study the feasibility of the use of different snakes crude venom in inhibiting the growth of Streptococcus mutans, the principal agent involved in dental caries. Our results showed that Bothrops moojeni and Bothrops jararacussu venoms were able to inhibit the growth of Streptococcus mutans and the component responsible for that inhibition appears to be the hydrogen peroxide. Though still not fully conclusive, the tests already carried out, show that snake venoms are important tools to inhibit the growth of pathogens, specifically those involved in caries diseases. MOSCA, R.C., 2008 7 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO................................................................................................

A saúde bucal, na maioria dos municípios brasileiros, constitui ainda um grande desafio aos princípios do Sistema Único de Saúde, principalmente no que se refere à universalização, à eqüidade do atendimento e alto custo envolvido na terapia restauradora. A procura pela descoberta de novos compostos metabólicos com atividade antibacteriana para a prevenção de doenças bucais e talvez com menores impactos a saúde e financeiros, seria muito importante para obtenção de um meio efetivo de controle da formação de um biofilme patogênico e da cárie dental. O objetivo deste trabalho é estudar a viabilidade biotecnológica do uso de venenos nativos de diferentes serpentes quanto à capacidade de inibir o crescimento de Streptococcus mutans, principal agente envolvido na cárie dental. Nossos resultados mostraram que os venenos das serpentes Bothrops moojeni e Bothrops jararacussu inibiram o crescimento de Streptococcus mutans e o componente responsável pela inibição parece ser a peróxido de hidrogênio. Apesar de ainda não totalmente conclusivos, os ensaios já realizados, permitem afirmar que venenos de serpentes são ferramentas importantes na inibição do crescimento de patógenos, especificamente daqueles envolvidos nas doenças cariogênicas. / The oral health at the most of Brazilian municipalities is still a big challenge to the principles of the Brazilian Health Unique System (SUS), particularly with regard to the globalization, the equity of care and high cost involved in restorative therapy. The demand for discovery of new natural products with antibacterial activity in order to prevent dental diseases and perhaps with fewer health and financial impacts, would be very important to achieve an effective means to control the formation of a pathogenic biofilm and dental caries. The objective of this work is to study the feasibility of the use of different snakes crude venom in inhibiting the growth of Streptococcus mutans, the principal agent involved in dental caries. Our results showed that Bothrops moojeni and Bothrops jararacussu venoms were able to inhibit the growth of Streptococcus mutans and the component responsible for that inhibition appears to be the hydrogen peroxide. Though still not fully conclusive, the tests already carried out, show that snake venoms are important tools to inhibit the growth of pathogens, specifically those involved in caries diseases. MOSCA, R.C., 2008 7 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO................................................................................................

A radiação ionizante tem sido empregada com sucesso na modificação das propriedades imunológicas das biomoléculas e tem se mostrado uma potente ferramenta para destoxicar venenos de serpentes sem afetar e, muitas vezes, melhorando suas propriedades imunogênicas. Resultados promissores foram obtidos com o tratamento, tanto de veneno total quanto de frações isoladas, com a radiação gama de 60Co. No presente trabalho, foram avaliados os efeitos da Bothropstoxina-1 (Bthx-1) e do veneno total de Bothrops jararacussu sobre o sistema imune de camundongos B10.PL e BALB/c, visando caracterizar a resposta imune contra proteínas irradiadas. Modificações estruturais foram observadas por meio de técnicas eletroforéticas - SDS-PAGE. Para os ensaios imunológicos, camundongos de diferentes linhagens foram imunizados com ambas as formas da Bthx-1 e os anticorpos circulantes foram isotipados e titulados pelo método de ELISA. Os resultados mostraram que tanto o veneno total como a toxina isolada, mesmo após o processo de irradiação, se mostraram imunogênicos e os anticorpos produzidos reconheciam as formas nativas. Para a caracterização antigênica a técnica de Western Blot permitiu demonstrar que a Bthx-1 irradiada induziu à produção de anticorpos responsivos para ambas as formas da toxina isolada e do veneno total. Os resultados do ensaio de citotoxicidade mostram que a viabilidade dos macrófagos ensaiados com a Bthx-1 ou com o veneno total irradiados foi maior quando comparada com os resultados obtidos para as formas nativas. Analisando-se o resultado do ensaio de LDH, observou-se que a Bthx-1 irradiada promoveu menor dano muscular que a toxina nativa. Conclui-se que a irradiação de proteínas promove modificações estruturais significativas, mantendo, contudo, suas propriedades imunológicas originais, representando uma potencial ferramenta na melhoria do processo de imunização. / Ionizing radiation has been successfully employed to modify the immunological properties of biomolecules and has been proven to be a powerful tool to attenuate snake venoms toxicity without affecting and even increasing their immunogenic properties. Very promising results were obtained when crude animal venoms, as well as isolated toxins, were treated with 60Co gamma rays, yielding toxoids with good immunogenicity, however, little is known about the modifications that irradiated molecules undergo and even less about the immunological response that such antigens elicit. At the present work, we have evaluated the effects on immune system of B10.PL and BALB/c mice of Bothrops jararacussu crude venom and isolated bothropstoxin-1 (Bthx-1), before and after gamma radiation exposition. According to our data, irradiation process promoted structural modifications on both isolated toxin and crude venom, characterized by higher molecular weight protein (aggregates and oligomers) formation. Irradiated samples were immunogenic and the antibodies elicited by them were able to recognize the native toxin in ELISA. These results indicate that irradiation of toxic proteins can promote significant modifications in their structures, but still retain many of the original antigenic and immunological properties. Also, our data indicate that the irradiated protein induced higher titers of IgG2b, suggesting that Th1 cells were predominantly involved. Results from Western blot assay showed that antibodies raised against irradiated bothropstoxin-1 recognize both native isolated toxin or crude venom. Citotoxicity assay showed that irradiated toxin and crude venom were less toxic than their native counterpart. Thus, the viability of the macrophages cultured in the presence of irradiated Bthx-1 or crude venom was higher if compared with their native forms. LDH Assay showed that irradiated Bthx-1 promotes less muscular damage than the native form. Our data confirm a potential use of ionizing radiation for immunization process improvement.

Neste trabalho descrevemos o isolamento, a caracterização funcional e estrutural de uma metaloprotease hemorrágica, denominada BjussuMP-I. A proteína foi isolada da peçonha de Bothrops jararacussu por combinação de dois passos cromatográficos, utilizando filtração molecular em Sephacryl S-200, equilibrada em tampão Tris-HCl (0,01 M, pH 7,0) seguida de cromatografia de interação hidrofóbica em Phenyl-Sepharose CL-4B, equilibrada em tampão Tris-HCl (0,01 M, pH 7,6 mais NaCl 4 M) e eluída com gradiente de NaCl (4-0 M) a 25°C no mesmo tampão. BjussuMP-I é uma proteína com massa molecular de 60 kDa e pI 5,6, a qual induziu hemorragia após injeção intradérmica em camundongos, com uma dose hemorrágica mínima (DHM) de 4,5 g. A atividade hemorrágica da BjussuMP-I foi totalmente inibida após incubação com um agente quelante (EDTA), confirmando a dependência de metal da enzima para esse efeito. BjussuMP-I possui atividade proteolítica sobre a caseína e fibrinogênio e nenhum efeito sobre a gelatina. Por outro lado, demonstrou alta especificidade pela cadeia do fibrinogênio enquanto que a cadeia somente foi hidrolisada na presença de altas concentrações da metaloprotease. A protease foi ativa sobre o fibrinogênio em pH neutro e alcalino e inativada a 75 °C. A dependência de metal da enzima foi demonstrada pela inibição exercida por EDTA, EGTA e 1,10 fenantrolina. Verificou-se uma inibição parcial pelo ?-mercaptoetanol e PMSF, enquanto que leupeptina e aprotinina não afetaram a atividade fibrinogenolítica. A enzima foi ativada na presença de íons Ca++ e Mg++, sendo inibida por Mn++, Fe++, Zn++, Co++ e Ni++. Além disso, baixas concentrações da enzima produziram lise no coágulo de fibrina. BjussuMP-I também demonstrou inibição da agregação plaquetária induzida por colágeno e ADP e atividade bactericida sobre Escherichia coli e Staphylococcus aureus. Verificou-se que as atividades hemorrágica e proteolítica da BjussuMP-I foram neutralizadas pelo diterpenóide clerodane (Bt-CD) de Bacharis trimera. Também se observou uma inibição total do efeito hemorrágico, utilizando o extrato aquoso de Pentaclethra macroloba (EPema). A enzima foi reconhecida por anticorpos antineuwiedase, com uma reação de identidade imunológica parcial. A seqüência completa do cDNA da BjussuMP-I com 1540 pb codificou para uma proteína de 547 resíduos de aminoácidos, que conservou os domínios comuns a metaloproteases hemorrágicas de alto peso molecular da classe PIII: (i) pré-pró-peptideo, (ii) metaloprotease, (iii) disintegrina-símile e (iv) domínio rico em cisteína. / In this study the isolation, functional and structural characterization of a hemorrhagic metalloprotease, named BjussuMP-I is reported. The protein was isolated from Bothrops jararacussu snake venom by a combination of two chromatographic steps, using gel filtration on Sephacryl S-200 (0.01 M Tris-HCl, pH7.6 buffer) and Phenyl-Sepharose CL-4B chromatography (0.01 M Tris-HCl plus 4 M NaCl, pH7.6 buffer) followed by a concentration gradient from 4 to 0 M NaCl at 25°C in the same buffer. BjussuMP-I is a 60 kDa protein with a pI 5.6, which induced hemorrhage after intradermal injection in mice with a minimum hemorrhagic dose (MHD) of 4.5 g. The hemorrhagic activity of BjussuMP-I was totally abolished after incubation with a chelating agent (EDTA), corroborating the metal-dependence of this effect. BjussuMP-I shows proteolytic activity on casein, collagen and fibrinogen, although no effect on gelatin was observed. In addition, it presented a high specificity toward the -chain of fibrinogen, while the -chain was only hydrolyzed at high concentrations of the metalloprotease. The protease was active against fibrinogen in neutral and alkaline pH and was inactivated at 75°C. The metal dependence of the enzyme was confirmed through inhibition by EDTA, EGTA and 1,10 phenantroline. A partial inhibition was observed with -mercaptoetanol and PMSF, while leupeptin and aprotinin did not inhibit the fibrinogenolytic activity. The enzyme was active in the presence of Ca++ and Mg++ and it was inhibited by Mn++, Fe++, Zn++, Co++ and Ni++. In addition, low concentrations of the enzyme presented lyses in fibrin plate after 12 h of incubation. BjussuMP-I also displayed inhibitory effect on collagen- and ADP-stimulated platelet aggregation, as well as bactericidal activity against Escherichia coli and Staphylococcus aureus. It was reported that both hemorrhagic and proteolytic activities of BjussuMP-I were neutralized by the clerodane diterpenoide (Bt-CD) from Bacharis trimera. Full inhibition of hemorrhage was also observed by using aqueous extract from Pentaclethra macroloba (EPema). The enzyme was recognized by anti-neuwiedase antibodies in a reaction of partial immunologic identity. The complete cDNA sequence of BjussuMP-I with 1540 pb encoded open reading frames of 547 amino acid residues which conserved the common domains of P-III high molecular weight hemorrhagic metalloproteases: (i) pre-pro-peptide, (ii) metalloprotease, (iii) disintegrin-like and (iv) rich cysteine domain.

Orientador: Stephen Hyslop / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-15T05:11:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rodrigues_MarianaAcedoPitocco_M.pdf: 2686415 bytes, checksum: 93b2ceba582a84158f4ce0d23348a829 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Serpentes do gênero Bothrops são a principal causa de acidentes ofídicos no Brasil. Acidentes envolvendo a Bothrops jararacussu (jararacuçu) resultam em envenenamento moderado e grave, devido principalmente à grande quantidade de peçonha injetada por esta espécie. Entre os efeitos observados, o quadro de hipotensão e de choque são fatores importantes a serem considerados. Neste trabalho, avaliamos as alterações cardíacas causadas pela peçonha de B. jararacussu em átrio direito isolado de rato. A incubação das preparações com peçonha (0,025, 0,050, 0,1 e 0,2 mg/ml) resultou em uma marcada contratura atrial em altas concentrações que levou a uma redução progressiva da força contrátil e a freqüência atrial, especialmente na maior concentração utilizada (0,2 mg/ml). A maior concentração da peçonha também causou uma marcada liberação de CK-BM e desorganização das fibras musculares atriais. A peçonha aquecida (100°C, 20 min) aboliu esta atividade enquanto a diálise não alterou significativamente essas respostas. O fracionamento da peçonha de B. jararacussu em cromatografia por gel filtração e troca iônica nos forneceu a fração (III3) que reproduziu todas as alterações funcionais e morfológicas vistas com a peçonha bruta. SDS-PAGE da fração III3, na presença e ausência de ditiotreitol e ß-mecaptoetanol revelaram uma massa molecular de ~28 KDa e 14 KDa, respectivamente, semelhantes às bothropstoxinas, as principais PLA2 miotóxicas desta peçonha. Os antivenenos comerciais utilizados (botrópico e botrópico/crotálico) se mostraram eficientes em neutralizar os efeitos produzidos pela peçonha bruta tanto na força e freqüência atriais como na liberação de CK-MB e nas alterações histológicas. A pré-incubação com antagonistas farmacológicos (bloqueadores de receptores adrenérgicos, histaminérgicos, muscarínicos, e inibidores da ciclooxigenase e óxido nítrico sintase) não afetou significativamente as alterações induzidas pela peçonha. Estes resultados indicam que as alterações induzidas pela peçonha de B. jararacussu estão envolvidas diretamente com o dano a fibra muscular atrial mediada provavelmente através da atividade das PLA2 miotóxicas. / Abstract: The genus Bothrops is the principal cause of snakebite in Brazil. Bites by Bothrops jararacussu (jararacuçu) result in moderate to severe envenoming partly because of the large amount of venom injected by this species. Hypotension and circulatory shock are important systemic manifestations associated with bites by this species. In this work, we examined the cardiac alterations caused by B. jararacussu venom in rat isolated right atria. Incubation of atria with venom (0.025, 0.050, 0.1 and 0.2 mg/ml) resulted in marked muscle contracture at high concentrations that led to a progressive decrease in contractile force and beating rate, especially at the highest concentration (0.2 mg/ml). The highest venom concentrations also caused a marked release of CK-MB and disorganization of atrial muscle fibers. Heating the venom (100ºC, 20 min) abolished this activity whereas dialysis did not significantly alter the responses. Fractionation of B. jararacussu venom by gel filtration and ion exchange chromatographies yielded a peak (III-3) that reproduced all of the morphological and functional changes seen with the venom. SDS-PAGE of the peak III-3 protein in the absence and presence - mercaptoethanol revealed a molecular mass of ~28 KDa and 14 KDa, respectively, similar to bothropstoxins, the main myotoxic PLA2 of this venom. Bothropic and bothropic/crotalic antivenoms prevented the venom (0.2 mg/ml)-induced decrease in contractile force and atrial rate, as well as the tissue damage (CK-MB release and histological alterations). Pre-incubation with adrenergic, histaminergic and muscarinic receptor antagonists, or with cyclooxygenase and nitric oxide synthase inhibitors, did not significantly affect the venom-induced changes. These results indicate that the B. jararacussu venom-induced alterations probably involve direct to atrial muscle fibers mediated by venom myotoxic PLA2. / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O uso de plantas medicinais no tratamento de picadas de serpentes à amplamente difundido nas culturas populares ao redor do mundo. Esta prÃtica pode ser Ãtil no tratamento primÃrio de vÃtimas de acidentes ofÃdicos, principalmente em Ãreas onde o soro antiveneno nÃo està prontamente disponÃvel. Os pterocarpanos, especialmente as cabenegrinas A-I e A-II, tiveram sua atividade antiofÃdica comprovada em diversos modelos experimentais. Esta dissertaÃÃo objetivou estabelecer uma metodologia para estudos das alteraÃÃes bioquÃmicas e hematolÃgicas induzidas pelo veneno de B. jararacussu em ratos e verificar o efeito da cabenegrina A-II nestas alteraÃÃes, alÃm de verificar o efeito da cabenegrina A-II nas alteraÃÃes pressÃricas induzidas pelo veneno. Foram analisados parÃmetros indicativos da funÃÃo renal (creatinina, urÃia e Ãcido Ãrico), da funÃÃo hepÃtica (AST e ALT), de dano muscular (CK), alÃm de glicose, eletrÃlitos e hemograma. As alteraÃÃes bioquÃmicas e hematolÃgicas induzidas pelo veneno variaram conforme a via de administraÃÃo, variaÃÃes estas relacionadas à amplitude de absorÃÃo do veneno. Neste estudo, a via intramuscular foi escolhida para os estudos com a cabenegrina A-II. Neste modelo experimental, a cabenegrina A-II foi capaz de reverter à maioria dos efeitos bioquÃmicos e hematolÃgicos produzidos pela administraÃÃo do veneno de B. jararacussu, apontando para uma melhora considerÃvel da funÃÃo renal e hepÃtica dos animais, bem como um dano muscular menos pronunciado. Nas alteraÃÃes pressÃricas causadas pelo veneno de B. jararacussu, a cabenegrina A-II bloqueou o efeito hipotensor do veneno, um indicativo de inibiÃÃo enzimÃtica promovida por este pterocarpano prenilado. Estes dados, acrescentados a estudos prÃvios realizados com essas substÃncias, as colocam como uma alternativa de protÃtipos na busca de novos agentes antiveneno. / Medicinal plants against snakebite are widespread used in folk medicine in the world. This practice may be useful as a first treatment of snakebite victims, mainly in places where antivenom immunotherapy is not promptly available. Pterocarpans, especially the cabenegrins A-I and A-II, had their antiophidic activity proved by several experimental models. This work aimed to fix one efficient methodology to study biochemical and hematological alterations induced by Bothrops jararacussu venom in rats and verify the effects of cabenegrin A-II in these alterations, besides studying the effects of cabenegrin A-II in pressure changes induced by this venom. Indicatives parameters for renal function (creatinin, urea and uric acid), hepatic function (AST and ALT) and muscle injury (CK), besides glucose, electrolytes and hemogram were analyzed. Biochemical and hematological changes varied according the way of administration of the venom, variations related to the rate of absorption of the venom. In this case, intramuscular way was chosen to study the effects of cabenegrin A-II, where cabenegrin A-II was able to block the major part of biochemical and hematological effects induced by B. jararacussu venom, showing an improve in renal and hepatic function and less muscle injury than control group. On pressure changes induced by B. jararacussu venom, cabenegrin A-II blocked the hypotensive effect of the venom, indicating enzymatic inhibition promoted by this prenylated pterocarpan. These data, added to previous studies with this class, indicate prenylated pterocarpans as lead compounds in research of new antivenom drugs.

Neste trabalho descrevemos o isolamento e a caracterização bioquímica, estrutural e funcional de uma L-aminoácido oxidase isolada do veneno da serpente Bothrops jararacussu, proteína esta denominada BjussuLAAO. O isolamento foi realizado pela combinação de três etapas cromatográficas, utilizando filtração molecular em Sephadex G-75, seguida de cromatografia de afinidade em Benzamidina-Sepharose, seguida pela última etapa cromatográfica, realizada com interação hidrofóbica em Fenil-Sepharose. A BjussuLAAO é uma proteína com massa molecular de 61 kDa e pI 5,8, e apresentou alta similaridade sequencial com as LAAOs já isoladas dos venenos de serpentes. A enzima BjussuLAAO induziu edema apenas na maior dose (100 ?g/animal), não apresentou atividade miotóxica, também não apresentou atividade hemorrágica, mesmo nas doses mais elevadas. A BjussuLAAO, demonstrou ter efeito coagulante e ação fibrinogenolítica e, mesmo utilizando inibidores de metaloproteases e serino proteases, continuou apresentando tal atividade, demonstrando assim não existir contaminantes destas classes de proteínas na amostra. As atividades mais interessantes do ponto de vista farmacológico, onde podemos visualizar a BjussuLAAO como um futuro fármaco, foram as atividades antitumoral, bactericida e antiparasitária. Esta apresentou, em baixas concentrações, citotoxicidade sobre células tumorais, ação leishmanicida e tripanocida, demonstrando assim ser uma substância candidata a fármaco multifuncional. / In this research we described the isolation and biochemical, structural and functional characterization of an L-amino acid oxidase from Bothrops jararacussu venom, named BjussuLAAO. The purification was carried out through three chromatography steps, using a molecular filtration on Sephadex G-75, followed by an affinity chromatography on Benzamidine-Sepharose, and finally a hydrophobic chromatography on Phenyl-Sepharose. BjussuLAAO is a protein with a molecular mass of 61 kDa and pI 5.8. This protein showed high sequencial similarity with other LAAOs from snake venoms. BjussuLAAO induced edema only in the highest dose (100 ?g/animal), did not show any myotoxic or hemorrhagic activity. BjussuLAAO, showed clotting and fibrinogenolitic activity, even in the presence of metalloproteases and serino-proteases inhibitors. The more interesting pharmacological activities, where from we can look a future application, were the anti-tumoral, bactericide, leishmanicidal and tripanocidal actions. The enzyme displayed a bactericide effect too, showing to be a multifunctional drug.