Serpentes do gênero Bothrops são responsáveis por 90% dos acidentes ofídicos no Brasil. Seus venenos provocam efeitos locais em humanos e animais, como hemorragia, edema, dor e necrose, caracterizando uma resposta inflamatória, cujo mecanismo não está bem definido. Esses efeitos estão relacionados com a ação combinada de proteases, substâncias que induzem hemorragia e fosfolipases, bem como a liberação de mediadores endógenos gerados pelos venenos. Considerando que a ativação do sistema complemento (SC) e de funções celulares, como quimiotaxia, ativação, proliferação e citotoxicidade podem desempenhar papel importante nos processos inflamatórios e de lesão tecidual subsequentes ao envenenamento, o estudo propõe: a) investigar a capacidade dos venenos brutos de serpentes Bothrops jararacussu e Bothrops pirajai e das toxinas purificadas, serinoprotease de B. jararacussu (SPBj) e L-aminoácido oxidase de B. pirajai (LAAOBp), em modular a atividade do SC; b) avaliar a contribuição do efeito sobre o SC no recrutamento de leucócitos polimorfonucleares humanos (PMN); c) avaliar o potencial citotóxico direto dos venenos e toxinas sobre células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC); d) analisar o efeito dos venenos sobre a modulação da expressão dos marcadores de ativação CD69, CD25 e HLA-DR em células T, B e natural killer (NK). Os resultados do ensaio de citotoxicidade mostraram que o veneno bruto de B. jararacussu foi citotóxico para PBMC apenas nas concentrações maiores, de 50 e 100g/mL, não apresentando citotoxicidade nas outras concentrações testadas. A serinoprotease apresentou baixa citotoxicidade para essas células, o que sugere a necessidade de maiores investigações quanto aos mecanismos que levam a essa morte celular. O aumento da viabilidade celular encontrado nas amostras incubadas com veneno bruto e LAAO de B. pirajai sugere possível indução de proliferação celular, que necessita de maiores estudos. Os resultados obtidos sugerem que os venenos brutos de B. jararacussu e B. pirajai são capazes de ativar o SC como observado nos ensaios cinéticos da VCVL e VA e de quimiotaxia de neutrófilos, onde ficou evidenciado que a migração celular foi devida a liberação dos fatores quimiotáticos do SC, C3a e C5a. e que suas respectivas toxinas, serinoprotease e LAAO apresentam efeitos moduladores sobre o SC humano, e estimulam investigações mais aprofundadas com a finalidade de se esclarecer os mecanismos de ação e identificar os componentes responsáveis pelos efeitos observados. Houve expressão aumentada de CD69, CD25 e HLA-DR nas células T CD4+ e CD8+, especialmente quando incubadas com veneno bruto de B. jararacussu e LAAO de B. pirajai, o que reflete ativação da resposta imune celular, e pode sugerir que este tipo de resposta desempenhe papel relevante na indução e/ou controle dos processos imunopatológicos decorrentes de envenenamentos por B. jararacussu e B. pirajai. Esta investigação visa fornecer subsídios para a possível utilização das toxinas para fins terapêuticos e como ferramentas para investigação dos mecanismos envolvidos nos processos fisiopatológicos que ocorrem em decorrência de picadas e também em outras doenças de caráter inflamatório. / Snakes of the genus Bothrops are responsible for 90% of snakebites in Brazil. Their venoms cause local effects in humans and animals, such as hemorrhage, edema, pain and necrosis, characteristic of an inflammatory response. The mechanism is not well defined. These effects are related to the combined action of proteases, substances that induce bleeding and phospholipases, as well as release of endogenous mediators generated by the venoms. Considering that activation of the complement system (CS) and cellular functions such as chemotaxis, activation, proliferation and cytotoxicity, may play a role in inflammatory processes and tissue injury following envenomation, the study proposes: a) to investigate the ability of crude venom of B. jararacussu and B. pirajai and the purified toxins, serineprotease of B. jararacussu and L-amino acid oxidase (LAAO) of B pirajai in modulating the activity of the CS, b) to assess the contribution of the effect on CS in the recruitment of human polymorphonuclear leukocytes (PMN), c) to assess the direct cytotoxic potential of venoms and toxins on human peripheral blood mononuclear cells (PBMC), d) to analyse the effect of venoms on the modulation of the expression of activation markers CD69, CD25 and HLA-DR on T, B and natural killer (NK) cells. The results of cytotoxicity assay showed that the crude venom of B. jararacussu was cytotoxic to PBMC only at higher concentrations, 50 and 100g/mL, showing no cytotoxicity in the other concentrations. The serineprotease showed low cytotoxicity to the cells, suggesting the need for further investigations about the mechanisms that lead to this cell death. The increase in cell viability found in samples incubated with crude venom of B. pirajai and LAAO suggests the possibility of induction of cell proliferation, which needs further study. The results suggest that the crude venom of B. jararacussu and B. pirajai are capable of activating the CS as observed in kinetic assays of classical pathwaylectin pathway and alternative pathway and neutrophil chemotaxis assay, where it was shown that cell migration was due to release of CS chemotactic factors, C3a and C5a, and that their respective toxins, serineprotease and LAAO have modulatory effects on human CS, and stimulate further research in order to clarify the mechanisms of action and identify the components responsible for the observed effects. There was increased expression of CD69, CD25 and HLA-DR on CD4+ and CD8+, especially when incubated with crude venom of B. jararacussu and LAAO of B. pirajai. It reflects activation of cellular immune response and may suggest that this type of response play an important role in the induction and/or control of immunopathological processes arising from envenomation by B. jararacussu and B. pirajai. This research aims to provide subsidies to the possible use of the toxin for therapeutic purposes and as tools for investigating mechanisms involved in pathophysiological processes that occur as a result of snakebites and also in other diseases of inflammatory nature.

Orientador: Marcos Hikari Toyama / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T09:14:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fagundes_FabioHenriqueRamos_D.pdf: 9330688 bytes, checksum: 3849f7f19f623ba248060731c3752b2e (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Mionecrose e edema são dois dos efeitos de fosfolipases A2 secretórias (sPLA2s) de serpents do genero Bothrops, BjVIII é uma nova Lys49 PLA2 miotóxica isolada do veneno de Bothrops jararacussu que exibe efeitos atípicos na agregação plaquetária humana e aumenta a secreção de insulina. Nestes estudos, demonstramos que BjVIII aumenta a liberação de insulina das células beta do pâncreas e induz a agregação plaquetária. Utilizando degradação de Edman e seqüenciamento de aminoácidos de novo por massa, nós determinamos a seqüência primária completa de BjVIII. Esta análise revelou uma mudança do aminoácido G35K na BjVIII, que difere da seqüência de BthTX-I, PrTX-I e PrTX-II e podem estar relacionados com as diferenças observadas na atividade biológica entre BjVIII e outras Lys49 sPLA2. Estes resultados indicam que além da região C-terminal e B-wing de PLA2, o laço de ligação do cálcio na BjVIII deve ser considerada uma importante região envolvida nos efeitos farmacológicos das isoformas Lys49 sPLA2 do gênero Bothrops. Para entender melhor o modo de ação da BjVIII, estudos cristalográficos foram iniciados. Duas formas de cristais foram obtidos, ambos contendo duas moléculas na unidade assimétrica (ASU). Dados de difração de radiação síncrotron foram coletados a 2,0 °A e 1,9 °A de resolução para os cristais que pertencem ao grupo espacial P212121 (a = 48:4 ° A, b = 65:3 ° A, c = 84:3 ° A) e grupo espacial P3121 (a = b = 55:7 º A, c = 127:9 ° A), respectivamente. Nós apresentamos uma caracterização cristalográfica detalhada de BjVIII. A estrutura foi resolvida em dois grupos de espaço diferentes, onde uma densidade de elétrons inesperada foi supostamente modelada no sítio ativo como uma molécula de ácido lisofosfatidico ao qual foi atribuído o efeito atípico de agregação plaquetária. Além disso, os estudos de bioinformática e comparações moleculares com outras PLA2s mostraram a conservação evolutiva dos mecanismos catalíticos e possibilitou a identificação do mesmo sitio miotóxico recentemente propostos para Lys49-PLA2s. Estrutura cristalográfica de BjVIII e análises do modelo realizadas em nossos estudos têm contribuído para uma melhor compreensão da ação farmacológica de fosfolipases A2. As cumarinas, são compostos químicos encontrados em muitas plantas e sintetizados em laboratórios, tem valor clínico, como precursor de vários fármacos anticoagulantes e antiinflamatórios. Nós caracterizamos os efeitos de duas cumarinas sintéticas, etil 2-oxo-2Hcromeno- 3-carboxilato (EHCC) e ácido 7-hidroxi-2-oxo-2H-cromeno-3-carboxílico (HHCC), sobre a estrutura, e as propriedades biológica e farmacológicas de BjVIII. Os resultados de espectroscopia de fluorescência intrínseca e estudos de dicroísmo circular indicaram que ambos os compostos induzem uma desestruturação parcial da proteína. A análise de aminoácidos revelou que o tratamento com EHCC (BjVIII-EHCC) e HHCC (BjVIII- HHCC) induzem a modificação de aminoácidos da BjVIII. Além disso, observamos uma redução do edema, mionecrose, agregação plaquetária, estimulação da secreção de insulina e atividade antibacteriana induzida por BjVIII após o tratamento com essas cumarinas. Tomados em conjunto, nossos resultados indicam que EHCC e HHCC induzem uma modificação estrutural irreversível na BjVIII que leva a uma diminuição nas atividades farmacológicas e biológicas induzidas por BjVIII nativa. / Abstract: Myonecrosis and edema are two of the effects of the secretory phospholipases A2 (sPLA2s) of Bothrops jararacussu snake venom, BjVIII is a new myotoxic Lys49-PLA2 isolated from Bothrops jararacussu venom that exhibits atypical effects on human platelet aggregation and increases insulin secretion. In these studies, we demonstrate BjVIII also enhances insulin release from pancreatic beta cells and induces platelet aggregation. Using both Edman degradation and de novo amino acid sequencing by mass, we determined the complete primary sequence of BjVIII. This analysis showed a G35K amino acid change in BjVIII, which differs from the sequences of BthTx-I, PrTx-I, and Prtx-II and may relate to the observed differences in biological activities among BjVIII and other Lys49 sPLA2. These results indicate that besides the C-terminal region and B-wing of PLA2, the calcium binding loop in BjVIII should be considered an important region involved in the pharmacological effects of Lys49 sPLA2 isoforms from the Bothrops genus. To better understand the mode of action of BjVIII, crystallographic studies were initiated. Two crystal forms were obtained, both containing two molecules in the asymmetric unit (ASU). Synchrotron radiation diffraction data were collected to 2.0 °A resolution and 1.9 °A resolution for crystals belonging to the space group P212121 (a = 48:4 ° A, b = 65:3 ° A, c = 84:3 ° A) and space group P3121 (a = b = 55:7 ° A, c = 127:9 ° A), respectively. We present a detailed crystallographic characterization of BjVIII. Structure was solved in two different space groups where an unexpected electron density in the active site was putatively modeled as a lysophosphatidic acid molecule to which has been attributed the atypical platelet aggregation effect. In addition, bioinformatics studies and molecular comparisons with other PLA2s have shown the evolutionary conservation of the catalytic machinery and enabled the identification of the same myotoxic site recently proposed for Lys49-PLA2S. BjVIII crystallographic structures and model analyses performed in our studies have contributed to a better understanding of the pharmacological action of phospholipases A2. Coumarin, a chemical compound found in many plants and synthesized in chemical laboratories, has clinical value as the precursor for several experimental anticoagulants and anti-inflammatory drugs. We characterized the effects of two synthetic coumarins, ethyl 2-oxo- 2H-chromene-3-carboxylate (EHCC) and 7-hydroxy-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylic acid (HHCC), on the structural, biological, and pharmacological properties of BjVIII. The spectroscopic results from intrinsic fluorescence and circular dichroism studies indicated that both compounds induced partial protein unfolding. Amino acid analysis revealed that treatment with EHCC (BjVIII-EHCC) and HHCC (BjVIII-HHCC) induced amino acid modification of BjVIII. Furthermore, we observed a reduction of BjVIII-induced edema, myonecrosis, platelet aggregation, stimulation of insulin secretion, and antibacterial activity following treatment with these coumarins. Taken together, our results indicate that EHCC and HHCC induce an irreversible structural modification in the folding that leads to a decrease in pharmacological and biological activities induced by native BjVIII. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Humberto Santo Neto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T07:08:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vomero_VivianeUrbini_D.pdf: 26340150 bytes, checksum: c1d13ac627e9a92ccb192b6270f0d38b (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: As serpentes do gênero Bothrops são responsáveis por 90% dos acidentes ofídicos. Dentre elas se destaca a B. jararacussu pela capacidade de inoculação de grande quantidade de veneno. O veneno desta espécie se caracteriza pela ação miotóxica, e esta ação causam importantes alterações locais, como a necrose das fibras musculares e conseqüentemente perda da massa muscular. No presente trabalho, estudamos os efeitos do deflazacort (glicocorticóide derivado da predinizona) e da L-Arginina (precursor do óxido nítrico) na regeneração das fibras musculares frente aos efeitos mionecróticos do veneno. Para tanto, utilizamos camundongos Swiss adultos jovens do sexo masculino. O músculo tibial anterior foi injetado com 80 µg do veneno bruto de B. jararacussu diluídos em 0,1 ml de solução fisiológica. Após as injeções dos venenos iniciaram-se a administração das drogas, com injeções intraperitoneais diárias de deflazacort na dosagem de 1,2 mg/kg por 5 e 20 dias. O segundo grupo recebeu a L-arginina junto à água de beber na concentração de 3,75 mg/ml desde o momento da injeção do veneno por 2 meses. O grupo controle foi composto por animais injetados com o veneno sem a realização de tratamento. A regeneração muscular foi avaliada no período de 2 meses e 5 dias através de cortes transversos do terço médio dos músculos, sendo corados com H&E e Tricrômico de Masson, para contagem da população total das fibras musculares e de células com núcleos centrais para análise da regeneração muscular. Quantificações da área muscular e da fibrose tecidual também foram realizadas. Identificou-se que com a L-Arginina ocorreu um aumento na regeneração muscular com a presença de maior número de fibras musculares regeneradas (2.230 ± 478) em relação ao animal injetado não tratado (1.005 ± 134). E no grupo tratado com Deflazacort observou-se um aumento da fibrose tecidual (1.077.051 ± 466.658,2; versus 777.107,3 ± 356.804,8 pixels quadrado) com número menor de fibras musculares (783,5 ± 134) em relação ao grupo não tratado. Desta forma, identificou-se o estímulo da regeneração muscular promovida pela L-arginina e o aumento da fibrose tecidual e diminuição da área muscular causado pela administração do antiinflamatório Deflazacort após o envenenamento pelo veneno bruto de B. jararacussu. / Abstract: The study evaluates the effect of deflazacort (DFZ), an anti-inflammatory oxalazine derivative of prednisone, on muscle regeneration following myonecrosis experimentally induced by B. jararacussu venom. Mice (n=15) right tibialis anterioris muscle was injected with 80 µg of venom. Two groups of animals (n=10) was treated during 5 and 20 days with a daily intraperitoneal injection of deflazacort, an anti-inflammatory oxalazine derivative of prednisone (1,2 mg/kg). The third group was injected with crude venom and did not receive any pharmacological treatment. The animals were killed 5 and 60 days after envenoming and muscle regeneration was evaluated by counting the number of muscle fibers and measuring the fibrosis area. We found that in deflazacort-treated group the area of fibrosis was higher (p< 0.05) than in injected muscles without treatment (1.077.051 ± 466.658,2; versus 777.107,3 ± 356.804,8 pixels square), and the number of muscle fiber was significant different too (755 ± 84; versus 1.221 ± 102). Although it does not reach the level of muscle fiber population of uninjured tibialis anterioris muscle (3.257 ± 478). We conclude that deflazacort treatment is detrimental to muscle fiber regeneration aggravating the loss of muscle mass after B. jararacussu envenoming. / Doutorado / Anatomia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-04-11T13:11:41Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Neuza B. Barros.pdf: 2710465 bytes, checksum: 4f522332291442b7edb66a372b6259ce (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-04-11T13:11:55Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Neuza B. Barros.pdf: 2710465 bytes, checksum: 4f522332291442b7edb66a372b6259ce (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-11T13:11:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Neuza B. Barros.pdf: 2710465 bytes, checksum: 4f522332291442b7edb66a372b6259ce (MD5) Previous issue date: 2017-12-04 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Cutaneous leishmaniasis (CL) is endemic in several regions of the world. In Brazil, despite the wide variety of clinical manifestations, 75% of patients with CL display a typical clinical picture, characterized by one or more ulcers and high round edges with a central necrosis, usually in the lower extremities. Leishmania amazonensis is a major etiologic agent of a wide spectrum of clinical forms of leishmaniasis. The objective of this study was to investigate the in vitro and in vivo antileishmania amazonensis activity of phospholipase A2 (Asp49) isolated from Bothrops jararacussu venom encapsulated in liposomal system. The cytotoxicity of PLA2-Asp49-liposomal was determined by MTT method in J774 macrophages after 48h of incubation. Macrophages treated with PLA2-Asp49-liposomes had cell viability around 82% at the highest concentration (100 μg/mL), while promastigotes treated with the same concentration resulted 78% of inhibition. On the other hand, peritoneal macrophages from Balb/c mice infected and treated with PLA2-Asp49-liposomes showed a 28% reduction in phagocytic index and a 55% reduction (p <0.05) in the number of intracellular amastigotes after 48h of treatment compared to the control group. After the treatments, the supernatants of peritoneal macrophages were collected, and the production of TNF-α, IL-10 and nitric oxide was evaluated. It was observed that there was no IL-10 production by macrophages treated with PLA2-Asp49-liposomes when compared to the untreated control. However, this group presented significant levels of TNF-α and nitric oxide. After the physicochemical characterization of the liposomes it was observed that the size of the vesicles remained close to the diameter of the membrane used in the extrusion, with an average diameter of 205.2 nm for PLA2-Asp49-liposomes and 241.9 nm for the control liposomes. PLA2-Asp49 were also efficiently encapsulated in liposomes (69.6%). The molecular docking showed that lipids strongly interact with the active site of the enzyme PLA2-Asp49. The activity of the toxin-containing liposomes was evaluated in BALB/c mice, previously infected with 1x105 of the parasite's promastigotes. After six weeks of infection, treatments in different groups of animals were initiated and observed for 21 days. The size of the paw lesion in PLA2-Asp49-liposomal treated animals was observed as decreasing by approximately 18% relative to the untreated control group and the Glucantime®-treated animals, which was used as a reference drug. At the end of the treatment, the animals were sacrificed and the paw and lymph node tissues were collected. Part of the collection was used to recover amastigotes and another to quantify cytokines and nitrites. In the group treated with PLA2-Asp49-liposomes the parasitic load was observed to be reduced by 73.5% in the macerated lymph node, compared to the control group. Comparatively, in the paw tissue was observed a reduction of 57.12%. The infected groups treated with PLA2-Asp49-liposomes showed significant production in TNF-α (45 and 80 pg/mL) and nitrite levels (32 and 36 μM), respectively, in lymph node and paw tissues, compared to infected untreated groups. The results indicate that the liposomal system containing PLA2-Asp49 is a promising biotechnological tool to confer an antileishmania activity in infected macrophages. / A leishmaniose cutânea é uma doença endêmica em várias regiões do mundo. No Brasil, 75% dos pacientes com a doença exibem uma forma clínica típica, caracterizada por uma ou mais úlceras de bordas redondas e elevadas com um centro necrótico. Leishmania amazonensis é um dos principais agentes etiológicos de formas clínicas da leishmaniose. O objetivo do presente trabalho foi o de investigar os efeitos in vitro e in vivo da potencial atividade antileishmania amazonensis da Fosfolipase A2 (PLA2) da peçonha de Bothrops jararacussu encapsulada em sistema lipossomal. O método de MTT foi utilizado para avaliação da citotoxicidade da PLA2-Asp49-lipossomal em macrófagos J774 após 48h de incubação. Os macrófagos tratados com a PLA2-Asp49-lipossomal apresentaram viabilidade celular em cerca de 82% na maior concentração utilizada (100 μg/mL). No ensaio com as formas promastigotas tratadas com a mesma concentração da PLA2-Asp49-lipossomal ocorreu uma inibição de 78% dos parasitos. Para o teste de infecção macrófagos peritoneais de camundongos Balb/c, infectados e incubados com PLA2-Asp49-lipossomal apresentaram redução de 28% no índice fagocítico e de 55% (p < 0.05) na quantidade de amastigotas intracelulares, após 48h de tratamento, comparado ao grupo controle. Os sobrenadantes de cultura dos macrófagos peritoneais foram coletados para a avaliação da produção de citocinas (TNF-α e IL-10) e de óxido nítrico. Não houve produção de IL-10 pelos macrófagos tratados com o PLA2-Asp49-lipossomal in vitro. Entretanto, o grupo tratado com PLA2-Asp49-liposomal produziu níveis significativos de TNF-α e óxido nítrico. Após a caracterização físico-química dos lipossomas foi observado que o tamanho das vesículas permaneceu próximo ao tamanho da membrana utilizada na extrusão, com diâmetro médio entre 205,2 nm para PLA2-Asp49-liposomal e 241,9 nm para os lipossomas controle. A PLA2-Asp49 foi eficientemente encapsulada nos lipossomas (69,6%). A atividade dos lipossomas contendo a toxina foi avaliada em camundongos BALB/c, previamente infectados com 1x105 promastigotas do parasito. Após seis semanas foi iniciado o tratamento com as preparações dos diferentes grupos de animais, acompanhados por 21 dias. Foi observado nos animais tratados com PLA2-Asp49-lipossomal diminuição de aproximadamente 18% do tamanho da lesão das patas, em relação ao grupo controle sem tratamento e aos animais tratados com o fármaco referência (Glucantime®). Ao término do tratamento, os animais foram mortos, os tecidos das patas e linfonodos foram coletados para recuperação de amastigotas e quantificação de citocinas e nitritos nos sobrenadantes destes tecidos. No macerado do linfonodo, no grupo tratado com PLA2-asp49-liposomal observou-se redução da carga parasitária de 73,5%, comparado com o grupo controle. Ainda nessa comparação, no macerado do tecido da pata houve redução de 57,12% dos números de amatigotas transfomadas para promastigotas. Os grupos infectados e tratados com PLA2-Asp49-lipossomal apresentaram aumentos significativos, respectivamente, nos tecidos dos linfonodos e patas, nos níveis de IL-12 (1.200 e 400 pg/mL), fator de necrose tumoral (TNF-α) (50 e 100 pg/mL), e de nitritos (32 e 36 μM), quando comparados aos grupos infectados e sem tratamento. Os resultados sugerem que o sistema lipossomal contendo PLA2-Asp-49 é uma ferramenta biotecnológica promissora para conferir atividade antileishmania a macrófagos infectados, aumentando seus mecanismos celulares microbicidas e auxiliando para o estabelecimento de uma resposta imunológica mais eficiente.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-01-20T11:00:33Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1691022 bytes, checksum: 36423c35cadbb1f2c911606adbed948b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-20T11:00:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1691022 bytes, checksum: 36423c35cadbb1f2c911606adbed948b (MD5) Previous issue date: 2016-07-29 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A grande diversidade de estirpes de Staphylococcus aureus em circulação nos rebanhos leiteiros reforça a necessidade de uma melhor caracterização dessas bactérias a fim de gerar informações que possam ser usadas no controle da mastite bovina. Neste trabalho, hipotetizou-se que estirpes de S. aureus geneticamente relacionadas causam diferentes formas de mastite. As bactérias S. aureus 302 e S. aureus 322, foram isoladas de vacas com mastite persistente e não-persistente, respectivamente, e apresentaram os mesmos genes de virulência e perfis de bandas idênticos quando genotipadas por análise em multilocus de repetições em tandem de número variável (MLVA). Por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE), utilizado como um método genotípico adicional, comprovou-se que as bactérias são geneticamente relacionadas. Apesar dessa proximidade, ensaios in vitro de produção de biofilme, hemólise, invasão e persistência em células mamárias bovinas MAC-T e virulência in vivo em modelo Galleria mellonella comprovaram diferenças significativas entre as estirpes. Os resultados sugerem que apenas a caracterização molecular é insuficiente para correlacionar sintomas da doença à uma determinada estirpe. S. aureus 302 e S. aureus 322, além de S. aureus 469 (mastite persistente) e S. aureus 366 (mastite não-persistente) foram contrastadas por uma abordagem proteômica. Extratos de proteínas totais foram preparados a partir de bactérias crescidas até a fase exponencial e separados por eletroforese bidimensional. Um total de 35 spots com abundância diferencial foi detectado, dos quais três foram exclusivos de S. aureus 302 quando comparada a S. aureus 322 e S. aureus 366 e podem representar marcadores que indicam a persistência da bactéria no animal. Este trabalho também avaliou a dispersão de biofilmes de S. aureus NRS 155 e S. epidermidis NRS 101 pela lectina BjcuL, isolada de Bothrops jararacussu. Essa lectina não impediu a adesão inicial das células e foi capaz de inibir a formação de biofilmes quando pré-aderida a superfícies abióticas. Houve uma melhor atividade sobre biofilme pré-formado de S. aureus NRS 155 em comparação S. epidermidis NRS 101. Por qRT-PCR, detectou-se uma alteração na expressão de genes envolvidos no controle do operon ica, responsável pela produção do polissacarídeo de adesão intercelular. Finalmente, BjcuL foi capaz de restaurar a susceptibilidade de bactérias em biofilme pré-formado a antibióticos como gentamicina e ampicilina, revelando o potencial da estratégia antibiofilme no controle de infecções de S. aureus. / The great diversity of Staphylococcus aureus strains isolated from milk- producing cattle reinforces the need of bacterial characterization to raise information that can be used in the control of bovine mastitis. In this work, we hypothesized that genetically related S. aureus strains can cause different forms of mastitis. The strains S. aureus 302 and S. aureus 322 were isolated from cows with persistent and non-persistent mastitis, respectively, and harbored the same virulence genes and identical banding profiles when genotyped by multilocus variable-number tandem repeats analysis (MLVA). Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) was used as an additional genotyping method and confirmed that the bacteria were genetically related. Despite close proximity, in vitro assays like biofilm production, hemolysis, invasion, and persistence in the bovine mammary epithelial cells (MAC-T) and also in vivo assessment of virulence in the Galleria mellonella model revealed significant differences between the strains. These results suggest that molecular analysis alone is insufficient to establish a link between a bacterial strain and the clinical symptoms of mastitis. Also in this work, S. aureus 302 and S. aureus 322 besides the strains S. aureus 469 (persistent mastitis) and S. aureus 366 (non- persistent mastitis) were analyzed using a proteomic approach. Extracts of intracellular proteins were prepared from bacteria grown until exponential phase and separated by two-dimensional electrophoresis. A total of 35 spots differentially expressed was detected while three of them were exclusive of S. aureus 302 when compared to S. aureus 322 and S. aureus 366, and may represent markers of bacterial persistence in animals. Finally, this study studied the dispersion of S. aureus NRS 155 and S. epidermidis NRS 101 biofilms by the lectin BjcuL isolated from Bothrops jararacussu. The lectin did not prevent the initial adherence of bacterial cells and inhibited biofilm formation when abiotic surfaces were pre-coated with the protein. Anti-biofilm activity was higher on S. aureus NRS 155 preformed biofilms in comparison to S. epidermidis NRS 101. Change in the expression of genes involved in the control of the ica operon, responsible for the production of polysaccharide intercellular adhesin, was detected by qRT-PCR. BjcuL restored susceptibility of preformed biofilms to gentamicin and ampicillin, revealing the potential of antibiofilm strategy to control S. aureus infections.

As fosfolipases A2 (PLA2s) de peçonhas de serpentes compreendem um grupo de enzimas de massas moleculares variáveis entre 14.000 e 18.000, e são responsáveis por vários efeitos tóxicos induzidos pela peçonha destes animais, tornando-se necessária a busca por inibidores naturais de PLA2¬s. O presente trabalho propôs a caracterização bioquímica, farmacológica e estrutural de duas proteínas inibitórias isoladas do plasma da serpente Bothrops jararacussu (BjussuMIPs), que neutralizam as atividades enzimáticas, tóxicas e farmacológicas de diferentes PLA2s. Estes inibidores foram isolados por cromatografia de afinidade em miotoxina-Sepharose, demonstrando que ambos são glicoproteínas com massas moleculares de 24.000 (BjussuMIP) e 23.500 (BjussuMIP) para os monômeros e de 120.000 (BjussuMIP) e 160.000 (BjussuMIP) para os oligômeros. O tratamento dos BjussuMIPs com a N-glicosidase F reduziram os seus pesos moleculares para aproximadamente 18.000, mas não afetaram suas atividades inibitórias sobre PLA2s, sugerindo que os carboidratos tem pouco ou nenhum papel na associação dos BjussuMIPs com estas enzimas. A análise do BjussuMIP por dicroísmo circular mostrou 44% de -hélice, 18% de folhas , 10% de voltas e 28% de estruturas aleatórias. O cDNA obtido por PCR a partir do fígado desta serpente revelou 432 pb (BjussuMIP) e 543 pb (BjussuMIP) que codificam para 144 e 181 resíduos de aminoácidos, respectivamente. O alinhamento da sequência de BjussuMIP com a de outros inibidores do tipo , denominados de PLIs, apresentou 73-92% de similaridade e o BjussuMIP mostrou 89-94% com inibidores do tipo PLIs. Os BjussuMIPs demonstraram ser relativamente estável a variações de pH (6-12) e temperatura, entretanto, perderam atividade inibitória quando submetido a altas temperaturas. A caracterização funcional indica que os BjussuMIPs apresentaram propriedades inibitórias sobre diferentes PLA2s isoladas de peçonhas de serpentes dos gêneros Bothrops e Crotalus. Ambos BjussuMIPs revelaram propriedades farmacológicas como a inibição das atividades fosfolipásica, anticoagulante, miotóxica, indução de edema, citotóxica, bactericida e letal. Os resultados obtidos demonstram que o BjussuMIP mostra maior afinidade sobre as PLA2s homólogas Lys49 como BthTX-I e PrTX-I, enquanto que o BjussuMIP apresenta-se mais específico para PLA2s Asp49, sugerindo uma especificidade entre os BjussuMIPs e tipos de PLA2s. Além disso, ambos os inibidores mostraram ser eficazes na suplementação do antiveneno botrópico em diferentes concentrações, resultando no aumento da capacidade do soro em neutralizar toxinas de serpentes. Os aspectos abordados neste trabalho poderão trazer informações complementares sobre possíveis mecanismos de ação, podendo resultar no melhor entendimento dos efeitos inibitórios exercidos pelos BjussuMIPs, assim como auxiliar o tratamento do envenenamento ofídico pela suplementação da soroterapia tradicional. / Phospholipases A2 (PLA2s) from snake venoms comprise a group of enzymes with molecular weights varying from 14,000 to 18,000, and are responsible for several toxic effects induced by the venom of these animals, making important the search for natural inhibitors of PLA2s. The present work proposed the biochemical, pharmacological and structural characterization of two protein inhibitors isolated from the plasma of Bothrops jararacussu snake (BjussuMIPs), which neutralize the enzymatic, toxic and pharmacological activities of different PLA2s. These inhibitors were isolated by an affinity chromatography on myotoxin-Sepharose, showing that both are glycoproteins with molecular weights of 24,000 (BjussuMIP) and 23,500 (BjussuMIP) for the monomers and 120,000 (BjussuMIP) and 160,000 (BjussuMIP) for the oligomers. The treatment of BjussuMIPs with N-glucosidase F reduced their molecular weights to about 18,000, but did not affect their inhibitory activity on PLA2s, suggesting that the carbohydrates have little or no role in the association of these BjussuMIPs with these enzymes. The analysis of BjussuMIP by circular dichroism showed 44% of -helix, 18% of sheets, 10% of turns and 28% of random structures. The cDNA obtained by PCR from the snake liver showed 432 bp for BjussuMIP and 543 bp for BjussuMIP, which encode for 144 and 181 amino acid residues, respectively. The alignment of the sequence of BjussuMIP with those from other -inhibitors (PLIs) showed 73-92% of similarity and 89-94% for the BjussuMIP compared to other PLIs. The BjussuMIPs showed to be relatively stable to changes in pH (6-12) and temperature, however lost of its activity when submitted to high temperatures. The functional characterization indicates that both BjussuMIPs presented inhibitory properties on different snake venom PLA2s from the genera Bothrops and Crotalus. Both BjussuMIPs showed pharmacological properties such as inhibition of phospholipase, anticoagulant, myotoxic, cytotoxic, bactericidal, edema-inducing and lethal activities. The results show that BjussuMIP presents higher affinity to Lys49-PLA2 homologous, such as BthTX-I and PrTX-I, while BjussuMIP is more specific to Asp49-PLA2s, suggesting specificity between BjussuMIPs and types of PLA2s. Moreover, both inhibitors proved effective in the supplementation of Bothrops antivenom at different concentrations, resulting in an increased capacity of serum in neutralizing snake toxins. The issues reported in this work could bring additional information on possible mechanisms of action and may result in better understanding of the inhibitory effects exerted by these BjussuMIPs, as well as assist the treatment of ophidian envenomations by supplementation of the traditional serum therapy.

As fosfolipases A2 (PLA2s) de peçonhas de serpentes compreendem um grupo de enzimas de massas moleculares variáveis entre 14.000 e 18.000, e são responsáveis por vários efeitos tóxicos induzidos pela peçonha destes animais, tornando-se necessária a busca por inibidores naturais de PLA2¬s. O presente trabalho propôs a caracterização bioquímica, farmacológica e estrutural de duas proteínas inibitórias isoladas do plasma da serpente Bothrops jararacussu (BjussuMIPs), que neutralizam as atividades enzimáticas, tóxicas e farmacológicas de diferentes PLA2s. Estes inibidores foram isolados por cromatografia de afinidade em miotoxina-Sepharose, demonstrando que ambos são glicoproteínas com massas moleculares de 24.000 (BjussuMIP) e 23.500 (BjussuMIP) para os monômeros e de 120.000 (BjussuMIP) e 160.000 (BjussuMIP) para os oligômeros. O tratamento dos BjussuMIPs com a N-glicosidase F reduziram os seus pesos moleculares para aproximadamente 18.000, mas não afetaram suas atividades inibitórias sobre PLA2s, sugerindo que os carboidratos tem pouco ou nenhum papel na associação dos BjussuMIPs com estas enzimas. A análise do BjussuMIP por dicroísmo circular mostrou 44% de -hélice, 18% de folhas , 10% de voltas e 28% de estruturas aleatórias. O cDNA obtido por PCR a partir do fígado desta serpente revelou 432 pb (BjussuMIP) e 543 pb (BjussuMIP) que codificam para 144 e 181 resíduos de aminoácidos, respectivamente. O alinhamento da sequência de BjussuMIP com a de outros inibidores do tipo , denominados de PLIs, apresentou 73-92% de similaridade e o BjussuMIP mostrou 89-94% com inibidores do tipo PLIs. Os BjussuMIPs demonstraram ser relativamente estável a variações de pH (6-12) e temperatura, entretanto, perderam atividade inibitória quando submetido a altas temperaturas. A caracterização funcional indica que os BjussuMIPs apresentaram propriedades inibitórias sobre diferentes PLA2s isoladas de peçonhas de serpentes dos gêneros Bothrops e Crotalus. Ambos BjussuMIPs revelaram propriedades farmacológicas como a inibição das atividades fosfolipásica, anticoagulante, miotóxica, indução de edema, citotóxica, bactericida e letal. Os resultados obtidos demonstram que o BjussuMIP mostra maior afinidade sobre as PLA2s homólogas Lys49 como BthTX-I e PrTX-I, enquanto que o BjussuMIP apresenta-se mais específico para PLA2s Asp49, sugerindo uma especificidade entre os BjussuMIPs e tipos de PLA2s. Além disso, ambos os inibidores mostraram ser eficazes na suplementação do antiveneno botrópico em diferentes concentrações, resultando no aumento da capacidade do soro em neutralizar toxinas de serpentes. Os aspectos abordados neste trabalho poderão trazer informações complementares sobre possíveis mecanismos de ação, podendo resultar no melhor entendimento dos efeitos inibitórios exercidos pelos BjussuMIPs, assim como auxiliar o tratamento do envenenamento ofídico pela suplementação da soroterapia tradicional. / Phospholipases A2 (PLA2s) from snake venoms comprise a group of enzymes with molecular weights varying from 14,000 to 18,000, and are responsible for several toxic effects induced by the venom of these animals, making important the search for natural inhibitors of PLA2s. The present work proposed the biochemical, pharmacological and structural characterization of two protein inhibitors isolated from the plasma of Bothrops jararacussu snake (BjussuMIPs), which neutralize the enzymatic, toxic and pharmacological activities of different PLA2s. These inhibitors were isolated by an affinity chromatography on myotoxin-Sepharose, showing that both are glycoproteins with molecular weights of 24,000 (BjussuMIP) and 23,500 (BjussuMIP) for the monomers and 120,000 (BjussuMIP) and 160,000 (BjussuMIP) for the oligomers. The treatment of BjussuMIPs with N-glucosidase F reduced their molecular weights to about 18,000, but did not affect their inhibitory activity on PLA2s, suggesting that the carbohydrates have little or no role in the association of these BjussuMIPs with these enzymes. The analysis of BjussuMIP by circular dichroism showed 44% of -helix, 18% of sheets, 10% of turns and 28% of random structures. The cDNA obtained by PCR from the snake liver showed 432 bp for BjussuMIP and 543 bp for BjussuMIP, which encode for 144 and 181 amino acid residues, respectively. The alignment of the sequence of BjussuMIP with those from other -inhibitors (PLIs) showed 73-92% of similarity and 89-94% for the BjussuMIP compared to other PLIs. The BjussuMIPs showed to be relatively stable to changes in pH (6-12) and temperature, however lost of its activity when submitted to high temperatures. The functional characterization indicates that both BjussuMIPs presented inhibitory properties on different snake venom PLA2s from the genera Bothrops and Crotalus. Both BjussuMIPs showed pharmacological properties such as inhibition of phospholipase, anticoagulant, myotoxic, cytotoxic, bactericidal, edema-inducing and lethal activities. The results show that BjussuMIP presents higher affinity to Lys49-PLA2 homologous, such as BthTX-I and PrTX-I, while BjussuMIP is more specific to Asp49-PLA2s, suggesting specificity between BjussuMIPs and types of PLA2s. Moreover, both inhibitors proved effective in the supplementation of Bothrops antivenom at different concentrations, resulting in an increased capacity of serum in neutralizing snake toxins. The issues reported in this work could bring additional information on possible mechanisms of action and may result in better understanding of the inhibitory effects exerted by these BjussuMIPs, as well as assist the treatment of ophidian envenomations by supplementation of the traditional serum therapy.

Submitted by Biblioteca da Faculdade de Farmácia (bff@ndc.uff.br) on 2018-01-11T12:57:40Z No. of bitstreams: 1 Arthur Luiz Corrêa tese doutorado.pdf: 5155463 bytes, checksum: 7138f9498d120338ec38e96e1f595180 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-11T12:57:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Arthur Luiz Corrêa tese doutorado.pdf: 5155463 bytes, checksum: 7138f9498d120338ec38e96e1f595180 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Acidentes envolvendo serpentes do gênero Bothrops são uma das principais causas de envenenamento no Brasil, e constituem importante problema de saúde pública devido as elevadas taxas de mortalidade e morbidade. A peçonha de Bothrops provoca danos teciduais locais e o processo inflamatório é uma das suas principais complicações. O tratamento preconizado pela Organização Mundial de Saúde para os acidentes ofídicos constitui na administração de soro hiperimune que neutraliza efeitos sistêmicos, mas não inibe o desenvolvimento de efeitos locais. Desta forma, a busca de tratamentos alternativos/complementares torna-se necessário. Este estudo tem como objetivo caracterizar os constituintes químicos dos extratos de Myrsine parvifolia e avaliar sua ação inibitória sobre os efeitos locais induzidos pela peçonha de B. jararaca e B. jararacussu. No presente estudo, foi determinada a composição química do óleo essencial de frutos e folhas de M. parvifolia e o perfil químico dos extratos bruto hidroetanólico, fração em hexano, fração em diclorometano, fração em acetato de etila, fração em butanol e extrato bruto aquoso de suas folhas. O teor de polifenóis, taninos e de flavonoides totais foi determinado por técnicas espectrofotométricas. As substâncias foram identificadas por técnicas cromatográficas e espectrométricas. A atividade antioxidante foi determinada usando os ensaios de sequestro do radical 1-difenil-2- picrilhidrazila (DPPH). Avaliou-se a capacidade dos extratos em inibir atividade proteolítica e coagulante induzida pela peçonha de B. jararacussu em modelo in vitro e a capacidade de proteção contra letalidade e redução do processo inflamatório (aumento da permeabilidade vascular, edema de pata e migração de leucócitos) induzido pela peçonha de B. jararaca em modelo in vivo. Inibição da proteólise e coagulação induzida pela peçonha de B. jararacussu foi verificada após pré-incubação da peçonha com os extratos (10:1). Camundongos suíços foram pré-tratados com extrato (100 mg/kg) uma hora antes da administração da peçonha de B. jararaca e submetidos ao ensaio de indução de letalidade, edema de pata, aumento da permeabilidade vascular intraperitoneal e pleurisia. Os principais constituintes químicos identificados no óleo essencial de folhas de M. parvifolia foram óxido de cariofileno (14,4%), β-cariofileno (12,6%) e γ-muuroleno (7,9%) e nos frutos β-cariofileno (11,7%) e δ-cadineno (7,1%). Os flavonoides miricetina, miricetina-3-O-β-arabinopiranosideo, quercetina e kaempferol foram isolados da fração acetato de etila. Terpenos, vitaminas liposolúveis e ácidos graxos foram identificados na fração em hexano e diclorometano. Todos os extratos inibiram atividade proteolítica (81-100%) enquanto que a coagulação induzida por B. jararacussu foi prolongada pelo extrato bruto hidroetanólico e fração em butanol. Verificou-se aumento da taxa de sobrevida entre os animais tratados com fração em acetato de etila (40%). Nos animais tratados com extrato bruto hidroetanólico e fração em diclorometano observaram-se redução do edema total (40 e 52%, respectivamente), redução do aumento da permeabilidade vascular (32,2 e 32,4%, respectivamente) e redução do influxo de leucócitos na cavidade pleural (42 e 39%, respectivamente). No grupo tratado com a fração em hexano observou-se apenas redução do edema (37%). A inibição de enzimas proteoliticas e prócoagulantes da peçonha de B. jararacussu e redução da inflamação induzida pelo envenenamento por B. jararaca, demonstram o potencial antiofidico de folhas de M. parvifolia, principalmente no controle da morbidade observada dos acidentes por serpentes do gênero Bothrops / Accidents involving snakes of the genus Bothrops are one of the main causes of poisoning in Brazil, and represent a significant problem of public health due to its high rates of mortality and morbidity. The Bothrops venom causes local tissue damage and the inflammatory process is one of its major complications. The recommended treatment for snakebites by the World Health Organization is the administration of hyperimmune serum which neutralizes systemic effects, but does not inhibit the development of local effects. Therefore, the search for alternative/complementary treatments becomes necessary. This study aims to characterize the chemical constituents and evaluate the inhibitory effects of Myrsine parvifolia extracts against local effects induced by the Bothrops jararaca and B. jararcussu venom. In the present study, it has been estabilished the chemical composition of the essential oil from the M. parvifolia leaves and fruits and the chemical profile of the hydroethanolic crude, hexane, dichloromethane, ethyl acetate, butanol and aqueous crude extracts. The concentration of total phenols, tannins and flavonoids was established using spectrophotometric techniques. Compounds were identified by chromatographic and spectrometric techniques. The antioxidant activity was determined by 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radicals (DPPH) radical scavenging assay. The extracts ability to inhibit proteolytic and coagulant activity induced by the B. jararacussu venom was determined in vitro and their ability of protection against lethality and reduction of the inflammatory process (increase in vascular permeability, paw edema and leukocyte migration) induced by the B. jararaca venom was determined in vivo. Inhibition of proteolysis and coagulation induced by the B. jararacussu venom was verified after preincubation of the venom with extracts (10: 1). Swiss mice were pretreated with extract (100 mg/kg) one hour before the administration of the B. jararaca venom and then submitted to the assays of lethality, paw edema, increased intraperitoneal vascular permeability and pleurisy. The main substances identified in the essential oil of leaf of M. parvifolia were caryophyllene (14.4%), β-caryophyllene (12.6%) and γ-muurolene (7.9%) and in the fruits β-caryophyllene (11.7%) and δ-cadinene (7.1 %) were identified. The flavonoids myricetin, myricetin-3-O-β-arabinopyranoside, quercetin and kaempferol were isolated from the ethyl acetate extract. Terpenes, fat-soluble vitamins and fatty acids were identified in the hexane and dichloromethane extracts. All extracts inhibited proteolytic activity (81-100%), while coagulant activity induced by the B. jararacussu was inhibited only by hydroethanolic crude and buthanol extracts. There was an increase in survival rates in the animals treated with ethyl acetate extract (40%). In the animals treated with the hydroethanolic crude and dichloromethane extract it was noted total edema reduction (40 and 52 %, respectively), reduction in vascular permeability increase (32.2 and 32.4 %, respectively) and reduction of leukocytes in the pleural cavity (42 and 39 %, respectively). Inhibition of proteolytic and procoagulant enzymes from B. jararacussu venom and the reduction of inflammation induced by B. jararaca poisoning demonstrate the antiofidic potential of M. parvifolia leaves, mainly in the control of morbidity observed in accidents coused by Bothrops snakes