A Bothrops jararaca é a serpente de maior importância médica no Brasil. Vários estudos foram realizados com o objetivo de caracterizar os componentes do veneno de serpentes, entretanto, a base molecular dos genomas das serpentes é pouco conhecida. Assim, foi realizado o sequenciamento e montagem do genoma da serpente Bothrops jararaca. Foram construídas bibliotecas tipo shotgun e mate-pair para realização de corridas de sequenciamento usando a tecnologia Illumina e sequências complementares foram obtidas em equipamento PACBIO RS II. Uma biblioteca de BACs também foi construída e 768 pools de 12 BACs foram sequenciados. Um grande conjunto de segmentos genômicos foi obtido e foi possível identificar genes de várias toxinas, entre elas SVMPs, SVSPs, BPPs, CRISPs e VEGF. Ainda foi possível depreender o contexto genômico de muitos destes genes e identificamos os principais elementos repetitivos genômicos. Estes achados são relevantes para o entendimento da função e evolução do sistema venenífero e podem servir de base para outros estudos futuramente. / The pit viper Bothrops jararaca is the most medically important snake in Brazil. Several studies were conducted in order to characterize the components of snake venom. However, the molecular basis of snake genomes is poorly known. Hence, it was carried out the sequencing and assembly of the Bothrops jararaca snake genome. Shotgun and mate-pair libraries were constructed to perform sequencing runs using Illumina technology and complementary sequences were obtained in PACBIO RS II equipment. A BAC library was also constructed and 768 pools of 12 BACs were sequenced. A large number of genomic segments was obtained. It was possible to identify genes of several toxins, including SVMPs, SVSPs, BPPs, CRISPs and VEGF. In addition, it was possible to infer the genomic context related to most of these genes and identify the main genomic repetitive elements. These findings are relevant for understanding the function and evolution of the venom system and it provides the basis for further studies.

Variações ontogenéticas nas enzimas pró-coagulantes do veneno de B. jararaca filhotes (vBjF) tornam este veneno mais coagulante que o de serpentes adultas (vBjA). Além disso, o vBjF não é tão eficientemente neutralizado pelo soro antibotrópico in vitro, como o vBjA. Neste trabalho comparamos as alterações hemostáticas induzidas pelos venenos vBjA e vBjF em ratos e avaliamos sua recuperação após o tratamento com soro antibotrópico (SAB), por meio de análises de tromboelastometria, dosagens de fatores de coagulação, e análise de plaquetas. Ratos Wistar machos foram inoculados com vBjA e vBjF (1,6 mg/kg , s.c.) ou solução salina (controle), e tratados com SAB ou solução salina (100 mL i.v.) 1 hora (h), após a inoculação dos venenos. Amostras de sangue de ratos tratados foram coletadas em 1, 3, 6 e 24 h após a injeção para avaliar os níveis de fibrinogênio plasmático, haptoglobina plasmática, hemoglobina plasmática, produtos de degradação de fibrinogênio e fibrina (PDF/f), complexo trombina- antitrombina III (TAT), fator de von Willebrand ( vWF), fatores de coagulação II e X , e também para contagem e análise funcional das plaquetas. Para as análises de tromboelastometria, foram coletadas amostras de sangue citratado (recalcificado) e de sangue nativo (sem anticoagulante) em 6 e 24 h após a inoculação e tratamento com solução salina ou SAB. Às amostras de sangue citratado foram adicionados reagentes específicos para analise das vias intrínseca e extrínseca da coagulação. Parâmetros como o tempo de coagulação (CT), o tempo de formação do coágulo (CFT) e ângulo alfa foram adquiridos durante 1 h. Em 3 h a contagem de plaquetas de ratos inoculados com vBjA e vBjF, e também o níveis de fibrinogênio, haptoglobina, FII, FX e vWF caíram abruptamente em relação aos controles, enquanto os de TAT e PDF/f aumentaram. Em 6 h os níveis de fibrinogênio ainda encontravam-se bastante baixos para ambos os venenos. Pela análise de tromboelastometria, notou-se que em 6 h os parâmetros CT, CFT, ângulo alfa permanecem muito alterados em ratos não tratados. Com o tratamento com SAB, todos os parâmetros foram significativamente restaurados, para ambos os grupos envenenados, principalmente em 3 e 6 horas após a inoculação venenos . Assim, apesar das diferenças entre vBjA e vBjF com relação a composição e potencial de neutralização in vitro, o tratamento com SAB foi igualmente eficiente na reversão dos distúrbios hemostáticos decorrentes do envenenamento por ambos os venenos / Ontogenetic variations in the pro-coagulant enzymes of the young B. jararaca venom (YBjv) makes it more coagulant than that from adult snakes (ABjv). Moreover, YBjv is not so efficiently neutralized by specific antivenin in vitro as ABjv. Herein we compared hemostatic disturbances induced by ABjv and YBjv in rats and assessed their recovery after treatment with botropic antivenin by thromboelastometry, dosages of coagulation factors, and platelet analysis. Male Wistar rats were inoculated with ABjv and YBjv (1.6 mg/kg, s.c), or saline (control), and treated with botropic antivenin (SAB) or saline (100 μL i.v.) 1 hour (h) after venom inoculation. Blood samples of treated rats were collected 1, 3, 6 and 24 h after injection to evaluate plasmatic fibrinogen, plasmatic haptoglobina, plasmatic hemoglobin, fibrin and fibrinogen degradation products (FfDP), thrombin-antithrombin III complex (TAT), von Willebrand factor (vWF), coagulation factors II and X, and also to count and functional analysis on platelets. Thromboelastometry was carried out on citrated (recalcified) and native (without anticoagulant) blood samples, collected 6 and 24 h after injection and treatment with SAB or saline. Citrated samples were mixed with specific reagents to analyze the intrinsic and extrinsic pathways. Parameters as clotting time (CT), clot formation time (CFT) and alpha angle were acquired for 1 h. At 3 h, platelet count of ABjv and YBjv rats and also fibrinogen, haptoglobin, FII, FX and vWF levels fell abruptly in regard to controls, while TAT and FfDP increased. At 6 h the fibrinogen levels still pretty low for both venoms. By thromboelastometry analysis, at 6 h, it was noticed that the CT, CFT, alpha angle remain greatly altered on non-treated rats. With the SAB treatment, all the parameters were significantly restored, for both envenomed groups, especially at 3 and 6 h after the venoms inoculation. Thus, despite differences in composition and in vitro neutralization potential among ABjv and YBjv, the treatment with SAB was equally efficient in reversing the hemostatic disturbances caused by both venoms

O presente trabalho teve como objetivo caracterizar o desenvolvimento da semente de Araucaria angustifolia através da proteômica comparativa, buscando compreender as alterações fisiológicas e metabólicas que ocorrem durante esse processo. Inicialmente, foram avaliados três diferentes metodologias de extração de proteínas. A metodologia composta por solução de extração contendo 7 M de uréia, 2 M de tiouréia, 1% de ditiotreitol, 2% de Triton-100, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonil e 5 µM de pepstatina, seguido de precipitação em 20% de ácido tricloroacético apresentou géis de maior resolução e reprodutibilidade, tendo sido escolhida como metodologia de extração protéica para o estudo das alterações no proteoma da semente de A. angustifolia. Uma dificuldade associada ao estudo do proteoma de espécies não sequenciadas é a baixa representatividade nos bancos de dados protéicos, resultando em identificações baseadas em homologia. Estratégias proteômicas baseadas em fracionamento em gel resultam em grandes contaminações por fragmentos de queratina. Sendo assim, foi desenvolvido um programa de remoção de espectros de baixa qualidade para utilização em proteômica baseada em homologia. As análises mostraram que o programa reduz o tempo de busca, melhora a qualidade dos alinhamentos e não resulta em perda de identificações positivas. Finalmente, utilizando as metodologias descritas, foram estudadas as alterações no proteoma durante o desenvolvimento da semente de A. angustifolia. Noventa e seis proteínas foram identificadas e agrupadas de acordo com sua função biológica e padrão de detecção. Os resultados obtidos permitiram o estabelecimento de marcadores protéicos no início e final do desenvolvimento embrionário. A análise das proteínas abundantes no início da embriogênese indica um maior controle no metabolismo oxidativo em relação aos estádios finais. Contrariamente, o final da embriogênese é caracterizado por um alto metabolismo de assimilação de carbono e acúmulo de proteínas de reserva. As implicações dos resultados obtidos no controle e melhoramento de sistemas de embriogênese somática na espécie também foram discutidas / The aim of the present work was to characterize the seed development of Araucaria angustifolia through proteomics in order to understand the physiological and biochemical changes during this process. For that, initially, three different protein extraction methods were evaluated. The extraction based on protein solubilization in 7 M urea, 2 M thiourea, 1% dithiothreitol, 2% Triton-100, 1 mM phenylmethylsulphonyl fluoride, 5 µM pepstatin, followed by 20% trichloroacetic acid precipitation showed the highest gel resolution and reprodutivity and, thus, was chosen to be used in the analysis of the proteome of A. angustifolia seeds. One aspect that hampers the proteome study of unsequenced species is the low protein representativity in databases. So, protein identification is usually carried out through homology. Strategies based on 2-DE result in high keratin contamination. In the present work a spectra filtering software was developed and evaluated for use in homology driven proteomics. The software reduced the time of search, improved alignment quality and did not result in lost of positive identifications. Finally, using the described strategies, the changes in the proteome of A. angustifolia seeds were studied. Ninety six proteins were identified and classified according to their biological functions and expression profiles during seed development. The identified proteins may be used as protein markers of early and late embryogenesis. Proteins involved in the control of oxidative metabolism were highly expressed during the early stages of seed development; while, carbon metabolism and storage proteins were highly expressed in late stages. Considerations on the improvement and control of somatic embryogenesis through medium manipulation and protein markers screening using data generated are also discussed.

O presente trabalho teve como objetivo caracterizar o desenvolvimento da semente de Araucaria angustifolia através da proteômica comparativa, buscando compreender as alterações fisiológicas e metabólicas que ocorrem durante esse processo. Inicialmente, foram avaliados três diferentes metodologias de extração de proteínas. A metodologia composta por solução de extração contendo 7 M de uréia, 2 M de tiouréia, 1% de ditiotreitol, 2% de Triton-100, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonil e 5 µM de pepstatina, seguido de precipitação em 20% de ácido tricloroacético apresentou géis de maior resolução e reprodutibilidade, tendo sido escolhida como metodologia de extração protéica para o estudo das alterações no proteoma da semente de A. angustifolia. Uma dificuldade associada ao estudo do proteoma de espécies não sequenciadas é a baixa representatividade nos bancos de dados protéicos, resultando em identificações baseadas em homologia. Estratégias proteômicas baseadas em fracionamento em gel resultam em grandes contaminações por fragmentos de queratina. Sendo assim, foi desenvolvido um programa de remoção de espectros de baixa qualidade para utilização em proteômica baseada em homologia. As análises mostraram que o programa reduz o tempo de busca, melhora a qualidade dos alinhamentos e não resulta em perda de identificações positivas. Finalmente, utilizando as metodologias descritas, foram estudadas as alterações no proteoma durante o desenvolvimento da semente de A. angustifolia. Noventa e seis proteínas foram identificadas e agrupadas de acordo com sua função biológica e padrão de detecção. Os resultados obtidos permitiram o estabelecimento de marcadores protéicos no início e final do desenvolvimento embrionário. A análise das proteínas abundantes no início da embriogênese indica um maior controle no metabolismo oxidativo em relação aos estádios finais. Contrariamente, o final da embriogênese é caracterizado por um alto metabolismo de assimilação de carbono e acúmulo de proteínas de reserva. As implicações dos resultados obtidos no controle e melhoramento de sistemas de embriogênese somática na espécie também foram discutidas / The aim of the present work was to characterize the seed development of Araucaria angustifolia through proteomics in order to understand the physiological and biochemical changes during this process. For that, initially, three different protein extraction methods were evaluated. The extraction based on protein solubilization in 7 M urea, 2 M thiourea, 1% dithiothreitol, 2% Triton-100, 1 mM phenylmethylsulphonyl fluoride, 5 µM pepstatin, followed by 20% trichloroacetic acid precipitation showed the highest gel resolution and reprodutivity and, thus, was chosen to be used in the analysis of the proteome of A. angustifolia seeds. One aspect that hampers the proteome study of unsequenced species is the low protein representativity in databases. So, protein identification is usually carried out through homology. Strategies based on 2-DE result in high keratin contamination. In the present work a spectra filtering software was developed and evaluated for use in homology driven proteomics. The software reduced the time of search, improved alignment quality and did not result in lost of positive identifications. Finally, using the described strategies, the changes in the proteome of A. angustifolia seeds were studied. Ninety six proteins were identified and classified according to their biological functions and expression profiles during seed development. The identified proteins may be used as protein markers of early and late embryogenesis. Proteins involved in the control of oxidative metabolism were highly expressed during the early stages of seed development; while, carbon metabolism and storage proteins were highly expressed in late stages. Considerations on the improvement and control of somatic embryogenesis through medium manipulation and protein markers screening using data generated are also discussed.

Orientador: Stephen Hyslop / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-25T14:01:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_IgorRappFerreirada_M.pdf: 2311174 bytes, checksum: c1f5a65bf448cb7a06bd5d1b0764ad1e (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O envenenamento causado por Bothrops jararaca pode resultar em dor local, edema, hemorragia e mionecrose, parcialmente causados por SVMPs. Neste trabalho, descrevemos a caracterização da BJ-PI2, uma metaloprotease da classe P-I da peçonha de B. jararaca e suas ações em tecidos locais. BJ-PI2 foi purificada por uma combinação cromatográfica de gel-filtração, troca aniônica e fase reversa em HPLC, e identificada por espectrometria de massas. As atividades coagulante e fibrin(ogen)olítica foram medidas por métodos convencionais. A atividade hemorrágica e as alterações na permeabilidade vascular foram examinadas em pele dorsal de ratos. A mionecrose e a atividade inflamatória foram avaliadas em músculo gastrocnêmio de camundongos. BJ-PI2, uma proteína de cadeia única com massa molecular de 23,08 kDa. Fragmentos trípticos da BJ-PI2 mostraram alta homologia com a SVMP insularinase A oriunda de Bothrops insularis, mas também com a bothrojaractivase, uma SVMP oriunda de B. jararaca; foi observada similaridade menor com a BJ-PI e jararafibrases II e IV isoladas de B. jararaca. A BJ-PI2 não coagula fibrinogênio nem plasma citratado de rato porém teve atividade ?- e ?-fibrinogenase (inibidas por EDTA e 1,10- fenantrolina mas não por PMSF) e atenuou a coagulação de plasma induzida pela recalcificação. BJ-PI2 tem atividade fibrinolítica. BJ-PI2 aumentou a permeabilidade vascular em pele dorsal de rato (atividade inibida por 1,10-fenantrolina). BJ-PI2 não provocou hemorragia ou mionecrose, contudo causou migração de células inflamatórias. Em contrapartida, a peçonha foi fortemente hemorrágica e mionecrótica porém causou pouca infiltração de células inflamatórias. Estes resultados indicam que a BJ-PI2 é uma SVMP não hemorrágica, não mionecrótica e não coagulante da classe PI que pode aumentar a permeabilidade vascular e a migração de células inflamatórias in vivo, mas não contribui com a hemorragia e a necrose induzidas pela peçonha / Abstract: Envenoming by Bothrops jararaca can result in local pain, edema, hemorrhage and necrosis, partially mediated by snake venom metalloproteinases (SVMPs). In this work, we describe the characterization of BJ-PI2, a P-I class SVMP from B. jararaca venom, and its local tissue actions. BJ-PI2 was purified by a combination of gel filtration, anion-exchange chromatography and reverse phase HPLC, and identified by mass spectrometry. Clotting and fibrin(ogen)olytic activities were assayed using conventional methods. Hemorrhagic activity and changes in vascular permeability were examined in rat dorsal skin. Myonecrosis and inflammatory activity were examined in mouse gastrocnemius muscle. BJ-PI2 was a 23.08 kDa single-chain polypeptide. Tryptic fragments showed highest homology with SVMP insularinase A from Bothrops insularis, but also with B. jararaca SVMP bothrojaractivase; less similarity was observed with B. jararaca SVMPs BJ-PI and jararafibrases II and IV. BJ-PI2 did not clot fibrinogen or rat citrated plasma but had ?- and ?-fibrinogenolytic activity (inhibited by EDTA and 1,10-phenanthroline but not by PMSF) and attenuated coagulation after plasma recalcification. BJ-PI2 had fibrinolytic activity. BJ-PI2 increased the vascular permeability of rat dorsal skin (inhibited by 1,10-phenanthroline). BJ-PI2 was not hemorrhagic or myonecrotic but caused migration of inflammatory cells. In contrast, venom was strongly hemorrhagic and myonecrotic but caused less infiltration of inflammatory cells. These results indicate that BJ-PI2 is a non-hemorrhagic, non-myonecrotic, non-coagulant P-I class SVMP that may enhance vascular permeability and inflammatory cell migration in vivo, but is not a major contributor to venom-induced hemorrhage and necrosis / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Farmacologia

A Bothrops jararaca é a serpente de maior importância médica no Brasil. Vários estudos foram realizados com o objetivo de caracterizar os componentes do veneno de serpentes, entretanto, a base molecular dos genomas das serpentes é pouco conhecida. Assim, foi realizado o sequenciamento e montagem do genoma da serpente Bothrops jararaca. Foram construídas bibliotecas tipo shotgun e mate-pair para realização de corridas de sequenciamento usando a tecnologia Illumina e sequências complementares foram obtidas em equipamento PACBIO RS II. Uma biblioteca de BACs também foi construída e 768 pools de 12 BACs foram sequenciados. Um grande conjunto de segmentos genômicos foi obtido e foi possível identificar genes de várias toxinas, entre elas SVMPs, SVSPs, BPPs, CRISPs e VEGF. Ainda foi possível depreender o contexto genômico de muitos destes genes e identificamos os principais elementos repetitivos genômicos. Estes achados são relevantes para o entendimento da função e evolução do sistema venenífero e podem servir de base para outros estudos futuramente. / The pit viper Bothrops jararaca is the most medically important snake in Brazil. Several studies were conducted in order to characterize the components of snake venom. However, the molecular basis of snake genomes is poorly known. Hence, it was carried out the sequencing and assembly of the Bothrops jararaca snake genome. Shotgun and mate-pair libraries were constructed to perform sequencing runs using Illumina technology and complementary sequences were obtained in PACBIO RS II equipment. A BAC library was also constructed and 768 pools of 12 BACs were sequenced. A large number of genomic segments was obtained. It was possible to identify genes of several toxins, including SVMPs, SVSPs, BPPs, CRISPs and VEGF. In addition, it was possible to infer the genomic context related to most of these genes and identify the main genomic repetitive elements. These findings are relevant for understanding the function and evolution of the venom system and it provides the basis for further studies.

Acidentes com animais venenosos constituem um problema de saúde pública negligenciado em todo o mundo. Estimativas indicam que, considerando-se apenas acidentes com serpentes venenosas, ocorram mundialmente cerca de 2,5 milhões de casos, causando 85.000 óbitos anuais. O desenvolvimento do quadro patológico dos envenenamentos é o resultado conjunto de potentes atividades biológicas exercidas, principalmente, por proteínas e peptídeos que compõem os venenos animais. A proteômica aplicada à caracterização de componentes de venenos animais, denominada venômica, é uma metodologia essencial na identificação não apenas dos componentes tóxicos, mas também valiosa na investigação molecular dos mecanismos patológicos dos envenenamentos. Através de metodologias proteômicas, descrevemos a caracterização protéica dos venenos animais das serpentes Bothrops jararaca e Bothrops lanceolatus e da lagarta Lonomia obliqua. Ainda, avaliamos através da proteômica de tecido experimentalmente envenenado as ações tóxicas de um componente isolado do veneno de Bothrops jararaca. Através de análise comparativa e semi-quantitativa da composição protéica dos venenos de B. jararaca e B. lanceolatus, descrevemos uma diferença qualitativa na distribuição dos componentes tóxicos. Enfatizando o grupo protéico majoritário, metaloproteases (SVMP), descrevemos diferentes abundâncias relativas entre os subtipos destas enzimas. Esta diferença explicaria as repercussões clínicas opostas durante o envenenamento humano, sendo um veneno hemorrágico e o outro prótrombótico. Componentes tóxicos capazes de gerar um quadro hemorrágico também foram avaliados através da análise proteômica das secreções tóxicas de L. obliqua. O estudo comparativo entre hemolinfa e extrato de espículas demonstrou que, diferentemente dos venenos botrópicos, as secreções tóxicas são compostas majoritariamente de inibidores de proteases, predominantemente serpinas. Além disso, descrevemos pela primeira vez a presença de novos componentes potencialmente tóxicos, como metaloproteases. Por fim, a proteômica de tecidos foi aplicada à investigação dos efeitos locais da injeção da metaloprotease do veneno de B. jararaca, jararagina. O efeito direto da ação da metaloprotease foi observado através da identificação de proteínas presentes em maior ou menor abundância, denotando infiltração ou degradação, respectivamente. Hemorragia, edema e estresse oxidativo foram evidenciados por pronunciado aumento em proteínas envolvidas nesses processos, mas, acima de tudo, identificamos degradação de proteínas relacionadas à manutenção da integridade da matriz extracelular e estabilização de coágulos, sugerindo novos mecanismos relacionados à atividade tóxica a serem investigados. De uma maneira geral, o presente trabalho descreve componentes tóxicos de venenos animais causadores de síndromes hemorrágicas e gera novas hipóteses em relação a mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento da patofisiologia dos envenenamentos. / Accidents with venomous animals are a neglected health issue worldwide. Global estimates points to the occurrence of 2,500,000 envenomation cases, causing 85,000 deaths per year. The pathological envenomation condition is a result of strong biological activities caused mainly by the action of venom's proteins and peptides components. Proteomics applied to the characterization of animal venom active principles, so called venomics, is an essential tool to the identification of toxic molecules as well as to help understanding the molecular mechanisms underlying pathological envenomation conditions. Through a proteomic methodology, here we describe the characterization of venoms from the snakes Bothrops jararaca and Bothrops lanceolatus and the caterpillar Lonomia obliqua. Moreover, from a tissue proteomic perspective we were able to evaluate the toxic effects of a B. jararaca venom component upon experimentally envenomed skin. Using a comparative semi-quantitative proteomic analysis, we described a qualitative difference in toxic components distribution between B. jararaca and B. lanceolatus venoms. Focusing on snake venom metaloproteases (SVMPs) distribution, we observed different relative abundance of these enzymes subgroups. Those differences could explain the opposite clinical envenomation characteristics, since one venom is hemorrhagic and the other induces a prothrombotic profile. Pro-hemorrhagic venom toxins were also characterized through the proteome of L. obliqua venomous secretions. Hemolymph and bristle extract were analyzed showing that, different from bothropic venoms, the toxic secretions composition are mainly protease inhibitors, especially serpins. Moreover, we were able to demonstrate for the first time the presence of new putative toxins, such as metalloproteases. Finally, we applied tissue proteomics to the investigation of local snakebite pathology by jararhagin, a metalloprotease from B. jararaca venom. The metalloprotease direct effect was observed through the increase or decrease in protein identification, indicating infiltration or degradation respectively. Hemorrhage, edema and oxidative stress were characterized by enhance in correlated proteins but, most of all, we identified degradation in proteins important to extracellular matrix integrity and clot stabilization, indicating novel mechanism of toxicity to be further evaluated. In a general perspective, the present work describes toxic components from venomous animals that cause hemorrhagic syndromes and generates new testable hypothesis of the mechanisms of action involved in the development of envenomation pathophysiology.

Acidentes com animais venenosos constituem um problema de saúde pública negligenciado em todo o mundo. Estimativas indicam que, considerando-se apenas acidentes com serpentes venenosas, ocorram mundialmente cerca de 2,5 milhões de casos, causando 85.000 óbitos anuais. O desenvolvimento do quadro patológico dos envenenamentos é o resultado conjunto de potentes atividades biológicas exercidas, principalmente, por proteínas e peptídeos que compõem os venenos animais. A proteômica aplicada à caracterização de componentes de venenos animais, denominada venômica, é uma metodologia essencial na identificação não apenas dos componentes tóxicos, mas também valiosa na investigação molecular dos mecanismos patológicos dos envenenamentos. Através de metodologias proteômicas, descrevemos a caracterização protéica dos venenos animais das serpentes Bothrops jararaca e Bothrops lanceolatus e da lagarta Lonomia obliqua. Ainda, avaliamos através da proteômica de tecido experimentalmente envenenado as ações tóxicas de um componente isolado do veneno de Bothrops jararaca. Através de análise comparativa e semi-quantitativa da composição protéica dos venenos de B. jararaca e B. lanceolatus, descrevemos uma diferença qualitativa na distribuição dos componentes tóxicos. Enfatizando o grupo protéico majoritário, metaloproteases (SVMP), descrevemos diferentes abundâncias relativas entre os subtipos destas enzimas. Esta diferença explicaria as repercussões clínicas opostas durante o envenenamento humano, sendo um veneno hemorrágico e o outro prótrombótico. Componentes tóxicos capazes de gerar um quadro hemorrágico também foram avaliados através da análise proteômica das secreções tóxicas de L. obliqua. O estudo comparativo entre hemolinfa e extrato de espículas demonstrou que, diferentemente dos venenos botrópicos, as secreções tóxicas são compostas majoritariamente de inibidores de proteases, predominantemente serpinas. Além disso, descrevemos pela primeira vez a presença de novos componentes potencialmente tóxicos, como metaloproteases. Por fim, a proteômica de tecidos foi aplicada à investigação dos efeitos locais da injeção da metaloprotease do veneno de B. jararaca, jararagina. O efeito direto da ação da metaloprotease foi observado através da identificação de proteínas presentes em maior ou menor abundância, denotando infiltração ou degradação, respectivamente. Hemorragia, edema e estresse oxidativo foram evidenciados por pronunciado aumento em proteínas envolvidas nesses processos, mas, acima de tudo, identificamos degradação de proteínas relacionadas à manutenção da integridade da matriz extracelular e estabilização de coágulos, sugerindo novos mecanismos relacionados à atividade tóxica a serem investigados. De uma maneira geral, o presente trabalho descreve componentes tóxicos de venenos animais causadores de síndromes hemorrágicas e gera novas hipóteses em relação a mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento da patofisiologia dos envenenamentos. / Accidents with venomous animals are a neglected health issue worldwide. Global estimates points to the occurrence of 2,500,000 envenomation cases, causing 85,000 deaths per year. The pathological envenomation condition is a result of strong biological activities caused mainly by the action of venom's proteins and peptides components. Proteomics applied to the characterization of animal venom active principles, so called venomics, is an essential tool to the identification of toxic molecules as well as to help understanding the molecular mechanisms underlying pathological envenomation conditions. Through a proteomic methodology, here we describe the characterization of venoms from the snakes Bothrops jararaca and Bothrops lanceolatus and the caterpillar Lonomia obliqua. Moreover, from a tissue proteomic perspective we were able to evaluate the toxic effects of a B. jararaca venom component upon experimentally envenomed skin. Using a comparative semi-quantitative proteomic analysis, we described a qualitative difference in toxic components distribution between B. jararaca and B. lanceolatus venoms. Focusing on snake venom metaloproteases (SVMPs) distribution, we observed different relative abundance of these enzymes subgroups. Those differences could explain the opposite clinical envenomation characteristics, since one venom is hemorrhagic and the other induces a prothrombotic profile. Pro-hemorrhagic venom toxins were also characterized through the proteome of L. obliqua venomous secretions. Hemolymph and bristle extract were analyzed showing that, different from bothropic venoms, the toxic secretions composition are mainly protease inhibitors, especially serpins. Moreover, we were able to demonstrate for the first time the presence of new putative toxins, such as metalloproteases. Finally, we applied tissue proteomics to the investigation of local snakebite pathology by jararhagin, a metalloprotease from B. jararaca venom. The metalloprotease direct effect was observed through the increase or decrease in protein identification, indicating infiltration or degradation respectively. Hemorrhage, edema and oxidative stress were characterized by enhance in correlated proteins but, most of all, we identified degradation in proteins important to extracellular matrix integrity and clot stabilization, indicating novel mechanism of toxicity to be further evaluated. In a general perspective, the present work describes toxic components from venomous animals that cause hemorrhagic syndromes and generates new testable hypothesis of the mechanisms of action involved in the development of envenomation pathophysiology.

Acidentes com animais venenosos constituem um problema de saúde pública negligenciado em todo o mundo. Estimativas indicam que, considerando-se apenas acidentes com serpentes venenosas, ocorram mundialmente cerca de 2,5 milhões de casos, causando 85.000 óbitos anuais. O desenvolvimento do quadro patológico dos envenenamentos é o resultado conjunto de potentes atividades biológicas exercidas, principalmente, por proteínas e peptídeos que compõem os venenos animais. A proteômica aplicada à caracterização de componentes de venenos animais, denominada venômica, é uma metodologia essencial na identificação não apenas dos componentes tóxicos, mas também valiosa na investigação molecular dos mecanismos patológicos dos envenenamentos. Através de metodologias proteômicas, descrevemos a caracterização protéica dos venenos animais das serpentes Bothrops jararaca e Bothrops lanceolatus e da lagarta Lonomia obliqua. Ainda, avaliamos através da proteômica de tecido experimentalmente envenenado as ações tóxicas de um componente isolado do veneno de Bothrops jararaca. Através de análise comparativa e semi-quantitativa da composição protéica dos venenos de B. jararaca e B. lanceolatus, descrevemos uma diferença qualitativa na distribuição dos componentes tóxicos. Enfatizando o grupo protéico majoritário, metaloproteases (SVMP), descrevemos diferentes abundâncias relativas entre os subtipos destas enzimas. Esta diferença explicaria as repercussões clínicas opostas durante o envenenamento humano, sendo um veneno hemorrágico e o outro prótrombótico. Componentes tóxicos capazes de gerar um quadro hemorrágico também foram avaliados através da análise proteômica das secreções tóxicas de L. obliqua. O estudo comparativo entre hemolinfa e extrato de espículas demonstrou que, diferentemente dos venenos botrópicos, as secreções tóxicas são compostas majoritariamente de inibidores de proteases, predominantemente serpinas. Além disso, descrevemos pela primeira vez a presença de novos componentes potencialmente tóxicos, como metaloproteases. Por fim, a proteômica de tecidos foi aplicada à investigação dos efeitos locais da injeção da metaloprotease do veneno de B. jararaca, jararagina. O efeito direto da ação da metaloprotease foi observado através da identificação de proteínas presentes em maior ou menor abundância, denotando infiltração ou degradação, respectivamente. Hemorragia, edema e estresse oxidativo foram evidenciados por pronunciado aumento em proteínas envolvidas nesses processos, mas, acima de tudo, identificamos degradação de proteínas relacionadas à manutenção da integridade da matriz extracelular e estabilização de coágulos, sugerindo novos mecanismos relacionados à atividade tóxica a serem investigados. De uma maneira geral, o presente trabalho descreve componentes tóxicos de venenos animais causadores de síndromes hemorrágicas e gera novas hipóteses em relação a mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento da patofisiologia dos envenenamentos. / Accidents with venomous animals are a neglected health issue worldwide. Global estimates points to the occurrence of 2,500,000 envenomation cases, causing 85,000 deaths per year. The pathological envenomation condition is a result of strong biological activities caused mainly by the action of venom's proteins and peptides components. Proteomics applied to the characterization of animal venom active principles, so called venomics, is an essential tool to the identification of toxic molecules as well as to help understanding the molecular mechanisms underlying pathological envenomation conditions. Through a proteomic methodology, here we describe the characterization of venoms from the snakes Bothrops jararaca and Bothrops lanceolatus and the caterpillar Lonomia obliqua. Moreover, from a tissue proteomic perspective we were able to evaluate the toxic effects of a B. jararaca venom component upon experimentally envenomed skin. Using a comparative semi-quantitative proteomic analysis, we described a qualitative difference in toxic components distribution between B. jararaca and B. lanceolatus venoms. Focusing on snake venom metaloproteases (SVMPs) distribution, we observed different relative abundance of these enzymes subgroups. Those differences could explain the opposite clinical envenomation characteristics, since one venom is hemorrhagic and the other induces a prothrombotic profile. Pro-hemorrhagic venom toxins were also characterized through the proteome of L. obliqua venomous secretions. Hemolymph and bristle extract were analyzed showing that, different from bothropic venoms, the toxic secretions composition are mainly protease inhibitors, especially serpins. Moreover, we were able to demonstrate for the first time the presence of new putative toxins, such as metalloproteases. Finally, we applied tissue proteomics to the investigation of local snakebite pathology by jararhagin, a metalloprotease from B. jararaca venom. The metalloprotease direct effect was observed through the increase or decrease in protein identification, indicating infiltration or degradation respectively. Hemorrhage, edema and oxidative stress were characterized by enhance in correlated proteins but, most of all, we identified degradation in proteins important to extracellular matrix integrity and clot stabilization, indicating novel mechanism of toxicity to be further evaluated. In a general perspective, the present work describes toxic components from venomous animals that cause hemorrhagic syndromes and generates new testable hypothesis of the mechanisms of action involved in the development of envenomation pathophysiology.

As Fosfolipases A2 (PLA2) são enzimas que atuam desconstruindo membranas celulares, resultando em ácidos graxos e lisofosfolipidios, causando inflamação tecidual. Evidências indicam que serpentes possuem uma resistência natural devido a propriedades presentes no sangue, que inibem ações de proteínas presentes no veneno. Portanto, no presente trabalho foi isolado e caracterizado bioquimicamente e biologicamente o primeiro inibidor de PLA2 do tipo gama (γPLI) do soro da serpente B. jararaca, denominado PLI_BJ. O inibidor de PLA2 foi isolado utilizando dois passos cromatográficos. O PLI_BJ mostrou, por SDS-PAGE, uma massa molecular aparente de 25 000 e 20 000 em condições redutoras e não redutoras, respectivamente. A sequência de aminoácidos parcial de PLI_BJ foi determinada por espectrometria de massa e corresponde a 72% e 68% de cobertura da sequência de aminoácidos de duas proteínas já descritas como PLI. O PLI_BJ mostrou também atividade inibitória satisfatória nos três testes realizados sugerindo um papel deste inibidor nos efeitos de envenenamento da serpente. / Phospholipases A2 (PLA2) are enzymes that act on cell membrane phospholipids resulting in fatty acids and lysophospholipids, deconstructing the cell wall causing tissue inflammation. Evidence indicates that snakes have natural resistance due to protective properties of blood that inhibits the action of proteins present in the venom. This study aimed to purify and characterize PLA2 inhibitors (PLI) from serum of the Bothrops jararaca snakes. PLA2 inhibitor was isolated using two chromatographic steps, and was named PLI_BJ. The purity of the PLI_BJ was confirmed by HPLC and SEC. The PLI_BJ showed, by SDS-PAGE, an molecular mass of 25,000 and 20,000 under reducing and non-reducing conditions, respectively. The partial amino acid sequence of PLI_BJ was determined by mass spectrometry and it corresponds to 72% and 68% of coverage of the amino acid sequence of two proteins already described as PLI. The PLI_BJ also showed satisfactory inhibitory activity in the three tests performed suggesting a role of this inhibitor in snake envenomation effects.