A síndrome hemorrágica induzida por contato com as cerdas da lagarta do gênero Lonomia pode causar distúrbios hemostáticos, com consumo de alguns fatores de coagulação. Os primeiros acidentes com Lonomia foram descritos na Venezuela, em 1967; no Norte do Brasil, foram relatados alguns casos no início da década de 1980. A partir de 1989, na região Sul do Brasil, principalmente na zona rural de Passo Fundo (RS) e Chapecó (SC), surgiram vários casos de acidentes por contato com essas lagartas. Atualmente estes acidentes continuam ocorrendo com maior freqüência nesta região, com algumas notificações esporádicas em outras partes do Brasil, principalmente na região Central. Inicialmente os casos graves de acidentes com lagartas Lonomia foram tratados com antifibrinolíticos e infusão de glóbulos vermelhos, principalmente na Venezuela e no Brasil. Em 1994, um antiveneno específico que neutraliza os efeitos biológicos dos extratos das cerdas foi produzido no Instituto Butantan. Desde então, o tratamento para estes envenenamentos tem sido a soroterapia com antiveneno produzido com extrato das cerdas das lagartas originárias da região de maior ocorrência de acidentes. O objetivo deste estudo foi avaliar a estabilidade de algumas atividades do extrato preparado com as cerdas frescas, sem congelar (0) e com as cerdas congeladas e armazenadas por 2, 4 e 6 meses a -20ºC. Todas as cerdas utilizadas foram de lagartas no 5º e 6º instar. Assim, para esta finalidade, foram preparados três lotes (A, B e C) de extrato de cerdas de taturanas provenientes da região de Passo Fundo (RS). Para cada lote foram separadas 4 amostras de cerdas que foram processadas sem congelar (0), e congeladas por 2, 4 e 6 meses. Observamos que a atividade coagulante dos extratos dos lotes A e C foram reduzidas nas cerdas congeladas por 2 meses ou mais (p<0,05), mas a atividade do lote B reduziu apenas após 4 meses. Resultados semelhantes foram observados com a atividade fosfolipásica que reduziu nos extratos preparados com cerdas congeladas por 2 meses ou mais nos lotes A e C e após 4 meses ou mais no lote B (p<0,05). Entretanto, o armazenamento não afetou a atividade hemolítica indireta ou a imunogenicidade em nenhum dos lotes. Por outro lado, a atividade hemolítica direta e atividade fibrinolítica não foram observadas em nenhum dos três lotes preparados. O perfil eletroforético dos extratos em SDS-PAGE, após diferentes períodos de congelamento, não mostraram alterações evidentes, mas a análise densitométrica das amostras indicaram degradação proteica além da desnaturação associadas com a redução da atividade biológica. Os nossos resultados indicam que o congelamento das cerdas por 2 meses ou mais reduzem a atividade pro-coagulante e fosfolipásica do extrato. Entretanto, os extratos preparados com as cerdas congeladas podem ser usados para produção de antiveneno visto que o congelamento das cerdas não afeta a qualidade do anticorpo produzido. Futuramente serão realizados testes de soro neutralização para verificar a eficácia desses anticorpos in vivo. / Contact with Lonomia obliqua caterpillar bristles may cause a consumptive hemostatic disturbance. The first human accident caused by Lonomia was described in Venezuela, in 1967. Thirty six cases were reported in Northern Region of Brazil by a retrospective study between 1978 and 1982, but since 1989 a high incidence of hemorrhagic syndrome, caused by contact with L. obliqua caterpillars has also been reported in Southern Brazil, mainly in rural areas around Passo Fundo (RS) and Chapecó (SC). The occurrence of such accidents has spread to central regions of Brazil and some sporadic notifications have been reported in other regions of South America. Initially, severe human accidental contact with L. obliqua caterpillars was treated with antifibrinolytics drugs and infusion of packed red cells in Venezuela and Brazil. Since 1994, nonetheless, a specific antivenom that neutralizes the biological effects of the bristle extract has been produced by Butantan Institute, using bristles obtained from caterpillars collected in areas of large prevalence. Thereafter, antivenom therapy has been used successfully in Brazil. Taking into account that biological activities of extracts used for antivenom production may decrease during the storage period of bristles, the aim of this study was to compare their stability, using extracts prepared from fresh (without freezing) and frozen bristles stored for 2, 4 and 6 months at -20ºC. Bristles were from caterpillars in instars 5 and 6. Three batches of bristle extract (A, B and C) were prepared from caterpillars collected in Passo Fundo area (RS); each batch of bristles were pooled, and used immediately or stored for 2, 4 and 6 months at -20º C, before being used for extract production. Our results showed that the clotting activity of extracts of batches A and C were decreased in bristles frozen for 2 months or longer (p <0.05), while it was reduced in samples frozen for 4 months or longer in batch B. Similarly, phospholipase A2 activity was reduced in extracts prepared with bristles frozen for 2 months or longer in batches A and C, and for 4 months or longer in batch B (p <0.05). On the other hand, storage affected neither the hemolytic activity evaluated indirectly, nor immunogenicity in samples of different batches. Additionally, direct hemolytic activity and fibrinolytic activity were not detected in any sample of the three batches. Electrophoretic protein profile of extract batches on SDS-PAGE did not show evident alterations, but the densitometric analyses of samples indicated degradation and denaturation, which could be associated with the reduction of biological activities. Our results indicate that freezing bristles for two months or longer decrease both procoagulant and phospholipase A2 activities of the extract. However, extracts prepared from frozen bristles can be used for antivenom production, since freezing affected neither the quantity nor quality of produced antibodies. Experiments will be accomplished to verify the effectiveness of these antibodies in vivo.

A síndrome hemorrágica induzida por contato com as cerdas da lagarta do gênero Lonomia pode causar distúrbios hemostáticos, com consumo de alguns fatores de coagulação. Os primeiros acidentes com Lonomia foram descritos na Venezuela, em 1967; no Norte do Brasil, foram relatados alguns casos no início da década de 1980. A partir de 1989, na região Sul do Brasil, principalmente na zona rural de Passo Fundo (RS) e Chapecó (SC), surgiram vários casos de acidentes por contato com essas lagartas. Atualmente estes acidentes continuam ocorrendo com maior freqüência nesta região, com algumas notificações esporádicas em outras partes do Brasil, principalmente na região Central. Inicialmente os casos graves de acidentes com lagartas Lonomia foram tratados com antifibrinolíticos e infusão de glóbulos vermelhos, principalmente na Venezuela e no Brasil. Em 1994, um antiveneno específico que neutraliza os efeitos biológicos dos extratos das cerdas foi produzido no Instituto Butantan. Desde então, o tratamento para estes envenenamentos tem sido a soroterapia com antiveneno produzido com extrato das cerdas das lagartas originárias da região de maior ocorrência de acidentes. O objetivo deste estudo foi avaliar a estabilidade de algumas atividades do extrato preparado com as cerdas frescas, sem congelar (0) e com as cerdas congeladas e armazenadas por 2, 4 e 6 meses a -20ºC. Todas as cerdas utilizadas foram de lagartas no 5º e 6º instar. Assim, para esta finalidade, foram preparados três lotes (A, B e C) de extrato de cerdas de taturanas provenientes da região de Passo Fundo (RS). Para cada lote foram separadas 4 amostras de cerdas que foram processadas sem congelar (0), e congeladas por 2, 4 e 6 meses. Observamos que a atividade coagulante dos extratos dos lotes A e C foram reduzidas nas cerdas congeladas por 2 meses ou mais (p<0,05), mas a atividade do lote B reduziu apenas após 4 meses. Resultados semelhantes foram observados com a atividade fosfolipásica que reduziu nos extratos preparados com cerdas congeladas por 2 meses ou mais nos lotes A e C e após 4 meses ou mais no lote B (p<0,05). Entretanto, o armazenamento não afetou a atividade hemolítica indireta ou a imunogenicidade em nenhum dos lotes. Por outro lado, a atividade hemolítica direta e atividade fibrinolítica não foram observadas em nenhum dos três lotes preparados. O perfil eletroforético dos extratos em SDS-PAGE, após diferentes períodos de congelamento, não mostraram alterações evidentes, mas a análise densitométrica das amostras indicaram degradação proteica além da desnaturação associadas com a redução da atividade biológica. Os nossos resultados indicam que o congelamento das cerdas por 2 meses ou mais reduzem a atividade pro-coagulante e fosfolipásica do extrato. Entretanto, os extratos preparados com as cerdas congeladas podem ser usados para produção de antiveneno visto que o congelamento das cerdas não afeta a qualidade do anticorpo produzido. Futuramente serão realizados testes de soro neutralização para verificar a eficácia desses anticorpos in vivo. / Contact with Lonomia obliqua caterpillar bristles may cause a consumptive hemostatic disturbance. The first human accident caused by Lonomia was described in Venezuela, in 1967. Thirty six cases were reported in Northern Region of Brazil by a retrospective study between 1978 and 1982, but since 1989 a high incidence of hemorrhagic syndrome, caused by contact with L. obliqua caterpillars has also been reported in Southern Brazil, mainly in rural areas around Passo Fundo (RS) and Chapecó (SC). The occurrence of such accidents has spread to central regions of Brazil and some sporadic notifications have been reported in other regions of South America. Initially, severe human accidental contact with L. obliqua caterpillars was treated with antifibrinolytics drugs and infusion of packed red cells in Venezuela and Brazil. Since 1994, nonetheless, a specific antivenom that neutralizes the biological effects of the bristle extract has been produced by Butantan Institute, using bristles obtained from caterpillars collected in areas of large prevalence. Thereafter, antivenom therapy has been used successfully in Brazil. Taking into account that biological activities of extracts used for antivenom production may decrease during the storage period of bristles, the aim of this study was to compare their stability, using extracts prepared from fresh (without freezing) and frozen bristles stored for 2, 4 and 6 months at -20ºC. Bristles were from caterpillars in instars 5 and 6. Three batches of bristle extract (A, B and C) were prepared from caterpillars collected in Passo Fundo area (RS); each batch of bristles were pooled, and used immediately or stored for 2, 4 and 6 months at -20º C, before being used for extract production. Our results showed that the clotting activity of extracts of batches A and C were decreased in bristles frozen for 2 months or longer (p <0.05), while it was reduced in samples frozen for 4 months or longer in batch B. Similarly, phospholipase A2 activity was reduced in extracts prepared with bristles frozen for 2 months or longer in batches A and C, and for 4 months or longer in batch B (p <0.05). On the other hand, storage affected neither the hemolytic activity evaluated indirectly, nor immunogenicity in samples of different batches. Additionally, direct hemolytic activity and fibrinolytic activity were not detected in any sample of the three batches. Electrophoretic protein profile of extract batches on SDS-PAGE did not show evident alterations, but the densitometric analyses of samples indicated degradation and denaturation, which could be associated with the reduction of biological activities. Our results indicate that freezing bristles for two months or longer decrease both procoagulant and phospholipase A2 activities of the extract. However, extracts prepared from frozen bristles can be used for antivenom production, since freezing affected neither the quantity nor quality of produced antibodies. Experiments will be accomplished to verify the effectiveness of these antibodies in vivo.

A hemostasia é um processo multifuncional, complexo e finamente regulado que envolve diversos componentes celulares e moleculares, incluindo plaquetas, parede vascular, cascata da coagulação sangüínea e fibrinólise. O desequilíbrio desses componentes pode desencadear condições patológicas, tais como hemorragias, hipercoagulopatias e a conseqüente trombose vascular. O descobrimento de novos princípios ativos e o desenvolvimento de drogas como instrumentos de intervenção antitrombótica constituem estratégias de eleição para a prevenção e o tratamento do quadro trombo-embólico. Muitos desses princípios ativos são obtidos de fontes naturais, incluindo os conhecidos anti-hemostáticos presentes em venenos de serpentes e na saliva de artrópodos hematófagos. Por afetarem o sistema hemostático humano, essas moléculas são alvo de estudos para o desenvolvimento de anti-venenos, testes laboratoriais e novas drogas terapêuticas. As lagartas do gênero Lonomia são conhecidas por produzirem proteínas tóxicas que estão associadas a uma severa síndrome hemorrágica em humanos, cujo quadro clínico é caracterizado por distúrbios da coagulação, insuficiência renal aguda, hematúria, sangramentos, dentre outros sintomas. O veneno é constituído por diversos princípios ativos, incluindo atividades pró-coagulantes e fibrinolíticas Apesar da importância social e científica desses envenenamentos e do conhecimento sobre a natureza dessas toxinas, as informações sobre as características moleculares do veneno ainda são escassas, o que limita o melhor entendimento das bases moleculares da síndrome hemorrágica e o desenvolvimento de um diagnóstico e de um tratamento mais adequados para os pacientes. O presente trabalho teve por objetivo analisar as proteínas mais abundantes e os genes expressos em maior proporção na taturana L. obliqua durante a fase larval (fase em que ocorrem os acidentes), visando identificar moléculas potencialmente envolvidas no envenenamento. As etapas realizadas foram: análise dos princípios ativos presentes em tecidos utilizados para a construção de bibliotecas de cDNA, seqüenciamento em massa das bibliotecas e análise dos transcritos utilizando ferramentas de bioinformática. Mais de mil seqüências de cDNA foram obtidas e agrupadas gerando um catálogo com informações sobre os transcritos encontrados, incluindo seqüências completas de cDNAs que codificam para proteínas provavelmente envolvidas no envenenamento, além de novas seqüências de função biológica desconhecida O conteúdo protéico do veneno foi analisado por SDS-PAGE seguido por seqüenciamento da região N-terminal das proteínas mais abundantes, possibilitando a correlação entre o cDNA e a proteína por ele codificada. As seqüências completas de cDNA foram enviadas para o GenBank (NCBI/NIH, EUA) e os resultado estão disponíveis em um sítio eletrônico específico no NCBI: http://www.ncbi.nih.gov/projects/omes. O cDNA mais abundante da lagarta, que codifica para uma lipocalina, foi clonado e obteve-se a proteína recombinante. Demonstramos que essa lipocalina liga o grupamento heme e participa da oxidação acoplada desse ligante, levando à formação de biliverdina γ, sugerindo uma nova função para as proteínas ligadoras de bilina em insetos. Os resultados obtidos colaboram para o maior entendimento das bases moleculares do envenenamento por L. obliqua, além de apontarem moléculas candidatas para o desenvolvimento de kits de diagnóstico para o envenenamento com Lonomia e para a melhora na especificidade do soro anti-lonômico, bem como para estudos mais aprofundados dos processos hemostáticos.

O envenenamento causado pelo contato com a lagarta Lonomia obliqua apresenta uma alta taxa de letalidade, fazendo do lonomismo um dos mais graves causados por animais peçonhentos em todo o Brasil. O acidente é caracterizado por graves distúrbios hemostáticos que podem evoluir, em pacientes não tratados, ao óbito. O efeito paradoxal desse envenenamento (pró-coagulante e hemorrágico) é resultado da ação de diferentes princípios ativos presentes nas secreções venenosas da lagarta. Os efeitos clínicos paradoxais não são exclusivos do veneno desta lagarta. O envenenamento por serpentes do gênero Bothrops apresenta sintomatologia semelhante. Considerando a gravidade dos acidentes causados por L.onomia obliqua em toda a região Sul e seu difícil diagnóstico frente à similaridade com o acidente botrópico, este trabalho teve como objetivo estudar, utilizando modelos animais, os efeitos hemorrágicos e inflamatório desencadeados pelo veneno desta lagarta. Utilizando ensaios de westen-blot e de coagulação por tempo de recalcificação, verificamos que não há reação cruzada no reconhecimento das proteínas dos venenos de L. obliqua e B. jararaca pelos soros antilonômico e antibotrópico. Em modelos animais, estudamos o efeito hemorrágico através do acompanhamento do sangramento pós-incisão da cauda de ratos. Nesse ensaio, o extrato de espículas apresentou um efeito hemorrágico dose-dependente, sendo completamente revertido pelo soro antilonômico e EDTA. Os efeitos inflamatórios do veneno da taturana foram estudados através dos ensaios in vivo de extravasamento vascular e migração celular. O extrato de espículas foi capaz de induzir extravasamento vascular e o efeito foi reduzido através da utilização de inibidores (pomadas de heparina, benzamidina e EDTA). Da mesma forma, EDTA, benzamidina e heparina foram capazes de inibir o efeito dose-dependente sobre a migração celular induzido pelo extrato de espículas no ensaio de air pouch. Neste trabalho, estudamos o e inflamatório causado pelo extrato de espículas de L. obliqua. Os resultados aqui apresentados são essenciais para a melhor compreensão do quadro clínico conseqüente desse acidente. L. obliqua, assim como outros animais peçonhentos e/ou venenosos da fauna brasileira, representam importante fonte de recursos para a pesquisa, principalmente na área da saúde, como o desenvolvimento de novos medicamentos e de soros antivenenos mais específicos. / The envenomation caused by contact with Lonomia obliqua caterpillars presents a high lethality rate, being one of the most severe accidents with venomous animals in Brazil. The accident is characterized by a hemostatic disorder which can evolve, in untreated patients, to death. The paradoxical effect of the envenomation (pro-coagulant and hemorrhagic) results from the action of several active principles present in the caterpillar's venomous secretions. These paradoxical effects are not exclusive of caterpillar's venoms. Envenomation by Bothrops genus snakes has a similar symptomatology. Considering the severity of the accidents caused by L. obliqua in Southern Brazil and the difficult diagnostic due to the bothropic envenomation similarity, in this work we studied the hemorrhagic and inflammatory effects triggered by the caterpillar's venom using animal models. Using western-blot and coagulation (recalcification time) assays, we demonstrated that there is no cross reactivity of the L. obliqua and B. jararaca venoms by antilonomic and antibothropic sera. In animal models, the hemorrhagic effect using bleeding time assay was analyzed. In this assay, the caterpillar's bristle extract presented a dose-dependent hemorrhagic activity, which is completely inhibited by antilonomic serum and EDTA. The inflammatory effects of the lonomic venom were studied using vascular extravasation and cell migration assays. The bristle extract was capable of inducing vascular extravasation and this activity was inhibited by heparin, benzamidin and EDTA pomades. Also, heparin, benzamidin and EDTA inhibited the dose-dependent cell migration induced by bristle extract in the air pouch assay. In this wok, we studied hemorrhage and inflammation caused by Lonomia obliqua bristle extract. The results presented here are essential to the better comprehension of the clinical profile in the lonomic envenomation. Lonomia obliqua, as well as other venomous animals from the Brazilian fauna, represents an important source for research, specially in heath sciences, to the development of new drugs and specific antivenom sera.

O envenenamento causado pelo contato com a lagarta Lonomia obliqua apresenta uma alta taxa de letalidade, fazendo do lonomismo um dos mais graves causados por animais peçonhentos em todo o Brasil. O acidente é caracterizado por graves distúrbios hemostáticos que podem evoluir, em pacientes não tratados, ao óbito. O efeito paradoxal desse envenenamento (pró-coagulante e hemorrágico) é resultado da ação de diferentes princípios ativos presentes nas secreções venenosas da lagarta. Os efeitos clínicos paradoxais não são exclusivos do veneno desta lagarta. O envenenamento por serpentes do gênero Bothrops apresenta sintomatologia semelhante. Considerando a gravidade dos acidentes causados por L.onomia obliqua em toda a região Sul e seu difícil diagnóstico frente à similaridade com o acidente botrópico, este trabalho teve como objetivo estudar, utilizando modelos animais, os efeitos hemorrágicos e inflamatório desencadeados pelo veneno desta lagarta. Utilizando ensaios de westen-blot e de coagulação por tempo de recalcificação, verificamos que não há reação cruzada no reconhecimento das proteínas dos venenos de L. obliqua e B. jararaca pelos soros antilonômico e antibotrópico. Em modelos animais, estudamos o efeito hemorrágico através do acompanhamento do sangramento pós-incisão da cauda de ratos. Nesse ensaio, o extrato de espículas apresentou um efeito hemorrágico dose-dependente, sendo completamente revertido pelo soro antilonômico e EDTA. Os efeitos inflamatórios do veneno da taturana foram estudados através dos ensaios in vivo de extravasamento vascular e migração celular. O extrato de espículas foi capaz de induzir extravasamento vascular e o efeito foi reduzido através da utilização de inibidores (pomadas de heparina, benzamidina e EDTA). Da mesma forma, EDTA, benzamidina e heparina foram capazes de inibir o efeito dose-dependente sobre a migração celular induzido pelo extrato de espículas no ensaio de air pouch. Neste trabalho, estudamos o e inflamatório causado pelo extrato de espículas de L. obliqua. Os resultados aqui apresentados são essenciais para a melhor compreensão do quadro clínico conseqüente desse acidente. L. obliqua, assim como outros animais peçonhentos e/ou venenosos da fauna brasileira, representam importante fonte de recursos para a pesquisa, principalmente na área da saúde, como o desenvolvimento de novos medicamentos e de soros antivenenos mais específicos. / The envenomation caused by contact with Lonomia obliqua caterpillars presents a high lethality rate, being one of the most severe accidents with venomous animals in Brazil. The accident is characterized by a hemostatic disorder which can evolve, in untreated patients, to death. The paradoxical effect of the envenomation (pro-coagulant and hemorrhagic) results from the action of several active principles present in the caterpillar's venomous secretions. These paradoxical effects are not exclusive of caterpillar's venoms. Envenomation by Bothrops genus snakes has a similar symptomatology. Considering the severity of the accidents caused by L. obliqua in Southern Brazil and the difficult diagnostic due to the bothropic envenomation similarity, in this work we studied the hemorrhagic and inflammatory effects triggered by the caterpillar's venom using animal models. Using western-blot and coagulation (recalcification time) assays, we demonstrated that there is no cross reactivity of the L. obliqua and B. jararaca venoms by antilonomic and antibothropic sera. In animal models, the hemorrhagic effect using bleeding time assay was analyzed. In this assay, the caterpillar's bristle extract presented a dose-dependent hemorrhagic activity, which is completely inhibited by antilonomic serum and EDTA. The inflammatory effects of the lonomic venom were studied using vascular extravasation and cell migration assays. The bristle extract was capable of inducing vascular extravasation and this activity was inhibited by heparin, benzamidin and EDTA pomades. Also, heparin, benzamidin and EDTA inhibited the dose-dependent cell migration induced by bristle extract in the air pouch assay. In this wok, we studied hemorrhage and inflammation caused by Lonomia obliqua bristle extract. The results presented here are essential to the better comprehension of the clinical profile in the lonomic envenomation. Lonomia obliqua, as well as other venomous animals from the Brazilian fauna, represents an important source for research, specially in heath sciences, to the development of new drugs and specific antivenom sera.

A hemostasia é um processo multifuncional, complexo e finamente regulado que envolve diversos componentes celulares e moleculares, incluindo plaquetas, parede vascular, cascata da coagulação sangüínea e fibrinólise. O desequilíbrio desses componentes pode desencadear condições patológicas, tais como hemorragias, hipercoagulopatias e a conseqüente trombose vascular. O descobrimento de novos princípios ativos e o desenvolvimento de drogas como instrumentos de intervenção antitrombótica constituem estratégias de eleição para a prevenção e o tratamento do quadro trombo-embólico. Muitos desses princípios ativos são obtidos de fontes naturais, incluindo os conhecidos anti-hemostáticos presentes em venenos de serpentes e na saliva de artrópodos hematófagos. Por afetarem o sistema hemostático humano, essas moléculas são alvo de estudos para o desenvolvimento de anti-venenos, testes laboratoriais e novas drogas terapêuticas. As lagartas do gênero Lonomia são conhecidas por produzirem proteínas tóxicas que estão associadas a uma severa síndrome hemorrágica em humanos, cujo quadro clínico é caracterizado por distúrbios da coagulação, insuficiência renal aguda, hematúria, sangramentos, dentre outros sintomas. O veneno é constituído por diversos princípios ativos, incluindo atividades pró-coagulantes e fibrinolíticas Apesar da importância social e científica desses envenenamentos e do conhecimento sobre a natureza dessas toxinas, as informações sobre as características moleculares do veneno ainda são escassas, o que limita o melhor entendimento das bases moleculares da síndrome hemorrágica e o desenvolvimento de um diagnóstico e de um tratamento mais adequados para os pacientes. O presente trabalho teve por objetivo analisar as proteínas mais abundantes e os genes expressos em maior proporção na taturana L. obliqua durante a fase larval (fase em que ocorrem os acidentes), visando identificar moléculas potencialmente envolvidas no envenenamento. As etapas realizadas foram: análise dos princípios ativos presentes em tecidos utilizados para a construção de bibliotecas de cDNA, seqüenciamento em massa das bibliotecas e análise dos transcritos utilizando ferramentas de bioinformática. Mais de mil seqüências de cDNA foram obtidas e agrupadas gerando um catálogo com informações sobre os transcritos encontrados, incluindo seqüências completas de cDNAs que codificam para proteínas provavelmente envolvidas no envenenamento, além de novas seqüências de função biológica desconhecida O conteúdo protéico do veneno foi analisado por SDS-PAGE seguido por seqüenciamento da região N-terminal das proteínas mais abundantes, possibilitando a correlação entre o cDNA e a proteína por ele codificada. As seqüências completas de cDNA foram enviadas para o GenBank (NCBI/NIH, EUA) e os resultado estão disponíveis em um sítio eletrônico específico no NCBI: http://www.ncbi.nih.gov/projects/omes. O cDNA mais abundante da lagarta, que codifica para uma lipocalina, foi clonado e obteve-se a proteína recombinante. Demonstramos que essa lipocalina liga o grupamento heme e participa da oxidação acoplada desse ligante, levando à formação de biliverdina γ, sugerindo uma nova função para as proteínas ligadoras de bilina em insetos. Os resultados obtidos colaboram para o maior entendimento das bases moleculares do envenenamento por L. obliqua, além de apontarem moléculas candidatas para o desenvolvimento de kits de diagnóstico para o envenenamento com Lonomia e para a melhora na especificidade do soro anti-lonômico, bem como para estudos mais aprofundados dos processos hemostáticos.

A hemostasia é um processo multifuncional, complexo e finamente regulado que envolve diversos componentes celulares e moleculares, incluindo plaquetas, parede vascular, cascata da coagulação sangüínea e fibrinólise. O desequilíbrio desses componentes pode desencadear condições patológicas, tais como hemorragias, hipercoagulopatias e a conseqüente trombose vascular. O descobrimento de novos princípios ativos e o desenvolvimento de drogas como instrumentos de intervenção antitrombótica constituem estratégias de eleição para a prevenção e o tratamento do quadro trombo-embólico. Muitos desses princípios ativos são obtidos de fontes naturais, incluindo os conhecidos anti-hemostáticos presentes em venenos de serpentes e na saliva de artrópodos hematófagos. Por afetarem o sistema hemostático humano, essas moléculas são alvo de estudos para o desenvolvimento de anti-venenos, testes laboratoriais e novas drogas terapêuticas. As lagartas do gênero Lonomia são conhecidas por produzirem proteínas tóxicas que estão associadas a uma severa síndrome hemorrágica em humanos, cujo quadro clínico é caracterizado por distúrbios da coagulação, insuficiência renal aguda, hematúria, sangramentos, dentre outros sintomas. O veneno é constituído por diversos princípios ativos, incluindo atividades pró-coagulantes e fibrinolíticas Apesar da importância social e científica desses envenenamentos e do conhecimento sobre a natureza dessas toxinas, as informações sobre as características moleculares do veneno ainda são escassas, o que limita o melhor entendimento das bases moleculares da síndrome hemorrágica e o desenvolvimento de um diagnóstico e de um tratamento mais adequados para os pacientes. O presente trabalho teve por objetivo analisar as proteínas mais abundantes e os genes expressos em maior proporção na taturana L. obliqua durante a fase larval (fase em que ocorrem os acidentes), visando identificar moléculas potencialmente envolvidas no envenenamento. As etapas realizadas foram: análise dos princípios ativos presentes em tecidos utilizados para a construção de bibliotecas de cDNA, seqüenciamento em massa das bibliotecas e análise dos transcritos utilizando ferramentas de bioinformática. Mais de mil seqüências de cDNA foram obtidas e agrupadas gerando um catálogo com informações sobre os transcritos encontrados, incluindo seqüências completas de cDNAs que codificam para proteínas provavelmente envolvidas no envenenamento, além de novas seqüências de função biológica desconhecida O conteúdo protéico do veneno foi analisado por SDS-PAGE seguido por seqüenciamento da região N-terminal das proteínas mais abundantes, possibilitando a correlação entre o cDNA e a proteína por ele codificada. As seqüências completas de cDNA foram enviadas para o GenBank (NCBI/NIH, EUA) e os resultado estão disponíveis em um sítio eletrônico específico no NCBI: http://www.ncbi.nih.gov/projects/omes. O cDNA mais abundante da lagarta, que codifica para uma lipocalina, foi clonado e obteve-se a proteína recombinante. Demonstramos que essa lipocalina liga o grupamento heme e participa da oxidação acoplada desse ligante, levando à formação de biliverdina γ, sugerindo uma nova função para as proteínas ligadoras de bilina em insetos. Os resultados obtidos colaboram para o maior entendimento das bases moleculares do envenenamento por L. obliqua, além de apontarem moléculas candidatas para o desenvolvimento de kits de diagnóstico para o envenenamento com Lonomia e para a melhora na especificidade do soro anti-lonômico, bem como para estudos mais aprofundados dos processos hemostáticos.

O envenenamento causado pelo contato com a lagarta Lonomia obliqua apresenta uma alta taxa de letalidade, fazendo do lonomismo um dos mais graves causados por animais peçonhentos em todo o Brasil. O acidente é caracterizado por graves distúrbios hemostáticos que podem evoluir, em pacientes não tratados, ao óbito. O efeito paradoxal desse envenenamento (pró-coagulante e hemorrágico) é resultado da ação de diferentes princípios ativos presentes nas secreções venenosas da lagarta. Os efeitos clínicos paradoxais não são exclusivos do veneno desta lagarta. O envenenamento por serpentes do gênero Bothrops apresenta sintomatologia semelhante. Considerando a gravidade dos acidentes causados por L.onomia obliqua em toda a região Sul e seu difícil diagnóstico frente à similaridade com o acidente botrópico, este trabalho teve como objetivo estudar, utilizando modelos animais, os efeitos hemorrágicos e inflamatório desencadeados pelo veneno desta lagarta. Utilizando ensaios de westen-blot e de coagulação por tempo de recalcificação, verificamos que não há reação cruzada no reconhecimento das proteínas dos venenos de L. obliqua e B. jararaca pelos soros antilonômico e antibotrópico. Em modelos animais, estudamos o efeito hemorrágico através do acompanhamento do sangramento pós-incisão da cauda de ratos. Nesse ensaio, o extrato de espículas apresentou um efeito hemorrágico dose-dependente, sendo completamente revertido pelo soro antilonômico e EDTA. Os efeitos inflamatórios do veneno da taturana foram estudados através dos ensaios in vivo de extravasamento vascular e migração celular. O extrato de espículas foi capaz de induzir extravasamento vascular e o efeito foi reduzido através da utilização de inibidores (pomadas de heparina, benzamidina e EDTA). Da mesma forma, EDTA, benzamidina e heparina foram capazes de inibir o efeito dose-dependente sobre a migração celular induzido pelo extrato de espículas no ensaio de air pouch. Neste trabalho, estudamos o e inflamatório causado pelo extrato de espículas de L. obliqua. Os resultados aqui apresentados são essenciais para a melhor compreensão do quadro clínico conseqüente desse acidente. L. obliqua, assim como outros animais peçonhentos e/ou venenosos da fauna brasileira, representam importante fonte de recursos para a pesquisa, principalmente na área da saúde, como o desenvolvimento de novos medicamentos e de soros antivenenos mais específicos. / The envenomation caused by contact with Lonomia obliqua caterpillars presents a high lethality rate, being one of the most severe accidents with venomous animals in Brazil. The accident is characterized by a hemostatic disorder which can evolve, in untreated patients, to death. The paradoxical effect of the envenomation (pro-coagulant and hemorrhagic) results from the action of several active principles present in the caterpillar's venomous secretions. These paradoxical effects are not exclusive of caterpillar's venoms. Envenomation by Bothrops genus snakes has a similar symptomatology. Considering the severity of the accidents caused by L. obliqua in Southern Brazil and the difficult diagnostic due to the bothropic envenomation similarity, in this work we studied the hemorrhagic and inflammatory effects triggered by the caterpillar's venom using animal models. Using western-blot and coagulation (recalcification time) assays, we demonstrated that there is no cross reactivity of the L. obliqua and B. jararaca venoms by antilonomic and antibothropic sera. In animal models, the hemorrhagic effect using bleeding time assay was analyzed. In this assay, the caterpillar's bristle extract presented a dose-dependent hemorrhagic activity, which is completely inhibited by antilonomic serum and EDTA. The inflammatory effects of the lonomic venom were studied using vascular extravasation and cell migration assays. The bristle extract was capable of inducing vascular extravasation and this activity was inhibited by heparin, benzamidin and EDTA pomades. Also, heparin, benzamidin and EDTA inhibited the dose-dependent cell migration induced by bristle extract in the air pouch assay. In this wok, we studied hemorrhage and inflammation caused by Lonomia obliqua bristle extract. The results presented here are essential to the better comprehension of the clinical profile in the lonomic envenomation. Lonomia obliqua, as well as other venomous animals from the Brazilian fauna, represents an important source for research, specially in heath sciences, to the development of new drugs and specific antivenom sera.

Venenos e outras secreções animais vêm sendo explorados como fonte de substâncias ativas na hemostasia em mamíferos. Esses princípios ativos, com funções primárias na alimentação e defesa, afetam elementos chave de quase todas as vias fisiológicas animais, tendo um enorme potencial como base para o desenvolvimento de novas drogas. No envenenamento ofídico, hemorragias locais e sistêmicas são causadas em grande parte pela ação de metaloproteinases hemorrágicas presentes nos venenos (SVMPs). Os estudos com metaloproteinases até então descritos baseiam-se principalmente em metodologias bioquímicas clássicas. Neste trabalho, as metaloproteinases e suas interações com outras proteínas são abordadas através de técnicas de dinâmica molecular, ressonância plasmônica de superfície e proteômica quantitativa. O perfil de inibição da atividade proteolítica de SVMPs por inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMPs) foi avaliado. Experimentos de modelagem e dinâmica molecular mostraram similaridades nas bases moleculares da interação das TIMPs tanto com SVMPs quanto com metaloproteinases endógenas (MMPs e ADAMs), seus alvos fisiológicos. O domínio rico-em-cisteínas das SVMPs da classe PIII está envolvido na interação com proteínas de matriz extracelular. Os sítios de interação do domínio rico-em-cisteínas de jararragina com fator de von Willebrand (vWF) foram identificados por ressonância plasmônica de superfície. Um modelo de interação entre os domínios das duas proteínas foi proposto. Considerando a presença de domínios A de vWF em diversas proteínas de matriz extracelular, o domínio de rico-em-cisteínas funcionaria direcionando as metaloproteinases para substratos específicos, promovendo hemorragia. Além disso, através de uma metodologia de proteômica quantitativa, foi verificada pela primeira vez a ação proteolítica de metaloproteinases em proteínas de matriz extracelular íntegra de células em cultura. Já no envenenamento lonômico, um quadro clínico hemorrágico é observado apesar da ausência de metaloproteinases no veneno. O estudo de proteínas tóxicas da lagarta Lonomia obliqua baseia-se no isolamento e caracterização bioquímica dos princípios ativos relacionados com aspectos da patologia do envenenamento. Nos últimos anos, esses estudos se focaram em uma única secreção da lagarta, identificando o seu potencial pró-coagulante, fibrin(ogen)olítico, hemolítico, edematogênico e nociceptivo. Neste trabalho, foram identificadas diferenças quali-quantitativas em quatro secreções venenosas de L. obliqua. A diferente participação de cada uma dessas secreções durante o contato com as lagartas pode levar a grande variabilidade de sintomas e gravidade do acidente. Utilizando a metodologia de microarranjos de DNA, analisamos o efeito do veneno da lagarta no padrão de expressão gênica de células em cultura e identificamos a expressão aumentada de genes possivelmente relacionados ao quadro clínico do envenenamento. Proteínas potencialmente tóxicas de L. obliqua descritas em um estudo de transcriptoma, juntamente com os dados de expressão gênica aqui demonstrados possibilitam uma maior compreensão dos efeitos do veneno na hemostasia e sintomas do lonomismo. / Animal venoms and other secretions have been explored as source of active substances on the mammal hemostasis. These active principles, which have primary function in feeding and defense, act on key elements of almost all physiologic pathways and have an enormous potential in the development of new therapeutic drugs. In ophidic envenomations, local and systemic hemorrhages are caused mainly by the action of hemorrhagic metalloproteinases from the venom (SVMPs). Previous studies with metalloproteinases were based mostly in classical biochemical methodologies. Here, the metalloproteinases and their interactions with other proteins were examined by molecular dynamics, surface plasmon resonance and quantitative proteomics methodologies. The inhibition profile of the SVMPs proteolytic activity by tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) was evaluated. Modeling and molecular dynamics procedures showed similarities in the molecular bases of the interaction of TIMPs both with SVMPS and endogenous metalloproteinases (MMPs and ADAMs). PIII SVMP cysteine-rich domain is involved in the interaction with extracellular matrix proteins. Using surface plasmon resonance, we identified the interaction sites between jararhagin cysteine-rich domain and von WIllebrand factor (vWF). An interaction model of these two proteins was proposed. Considering the presence of vWF A domains in several matrix proteins, the cysteine-rich domain probably works targeting the metalloproteinases to specific substrates, leading to hemorrhage. Moreover, using a quantitative proteomic approach, it was shown for the first time the metalloproteinases proteolytic action upon organized extracellular matrix proteins in culture cells. In lonomic envenomation, a hemorrhagic clinical profile is observed regardless the absence of metalloproteinases. The caterpillar's toxic proteins studies are based on isolation and biochemical characterization of active principles related to the patophisiology of the envenomation. In the last few years, these studies were focused on one caterpillar's secretion, containing pro-coagulant, fibrin(ogen)olytic, hemolytic, edematogenic and nociceptive activities. In this work, we identified quali-quantitative differences in four Lonomia obliqua venomous secretions. The different participation of each of these secretions during the accident could lead to the variability of symptoms and severity of the envenomation. Using a microarray methodology, we analyzed the effects of the caterpillar venom on the cultured cells gene expression profile and identified increased expression of genes possibly involved with the clinical manifestations. Potentially toxic proteins from L. obliqua identified in a transcriptome study, together with the gene expression data described here allow a better understanding of the venom effects in hemostasis during lonomism.

Venenos e outras secreções animais vêm sendo explorados como fonte de substâncias ativas na hemostasia em mamíferos. Esses princípios ativos, com funções primárias na alimentação e defesa, afetam elementos chave de quase todas as vias fisiológicas animais, tendo um enorme potencial como base para o desenvolvimento de novas drogas. No envenenamento ofídico, hemorragias locais e sistêmicas são causadas em grande parte pela ação de metaloproteinases hemorrágicas presentes nos venenos (SVMPs). Os estudos com metaloproteinases até então descritos baseiam-se principalmente em metodologias bioquímicas clássicas. Neste trabalho, as metaloproteinases e suas interações com outras proteínas são abordadas através de técnicas de dinâmica molecular, ressonância plasmônica de superfície e proteômica quantitativa. O perfil de inibição da atividade proteolítica de SVMPs por inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMPs) foi avaliado. Experimentos de modelagem e dinâmica molecular mostraram similaridades nas bases moleculares da interação das TIMPs tanto com SVMPs quanto com metaloproteinases endógenas (MMPs e ADAMs), seus alvos fisiológicos. O domínio rico-em-cisteínas das SVMPs da classe PIII está envolvido na interação com proteínas de matriz extracelular. Os sítios de interação do domínio rico-em-cisteínas de jararragina com fator de von Willebrand (vWF) foram identificados por ressonância plasmônica de superfície. Um modelo de interação entre os domínios das duas proteínas foi proposto. Considerando a presença de domínios A de vWF em diversas proteínas de matriz extracelular, o domínio de rico-em-cisteínas funcionaria direcionando as metaloproteinases para substratos específicos, promovendo hemorragia. Além disso, através de uma metodologia de proteômica quantitativa, foi verificada pela primeira vez a ação proteolítica de metaloproteinases em proteínas de matriz extracelular íntegra de células em cultura. Já no envenenamento lonômico, um quadro clínico hemorrágico é observado apesar da ausência de metaloproteinases no veneno. O estudo de proteínas tóxicas da lagarta Lonomia obliqua baseia-se no isolamento e caracterização bioquímica dos princípios ativos relacionados com aspectos da patologia do envenenamento. Nos últimos anos, esses estudos se focaram em uma única secreção da lagarta, identificando o seu potencial pró-coagulante, fibrin(ogen)olítico, hemolítico, edematogênico e nociceptivo. Neste trabalho, foram identificadas diferenças quali-quantitativas em quatro secreções venenosas de L. obliqua. A diferente participação de cada uma dessas secreções durante o contato com as lagartas pode levar a grande variabilidade de sintomas e gravidade do acidente. Utilizando a metodologia de microarranjos de DNA, analisamos o efeito do veneno da lagarta no padrão de expressão gênica de células em cultura e identificamos a expressão aumentada de genes possivelmente relacionados ao quadro clínico do envenenamento. Proteínas potencialmente tóxicas de L. obliqua descritas em um estudo de transcriptoma, juntamente com os dados de expressão gênica aqui demonstrados possibilitam uma maior compreensão dos efeitos do veneno na hemostasia e sintomas do lonomismo. / Animal venoms and other secretions have been explored as source of active substances on the mammal hemostasis. These active principles, which have primary function in feeding and defense, act on key elements of almost all physiologic pathways and have an enormous potential in the development of new therapeutic drugs. In ophidic envenomations, local and systemic hemorrhages are caused mainly by the action of hemorrhagic metalloproteinases from the venom (SVMPs). Previous studies with metalloproteinases were based mostly in classical biochemical methodologies. Here, the metalloproteinases and their interactions with other proteins were examined by molecular dynamics, surface plasmon resonance and quantitative proteomics methodologies. The inhibition profile of the SVMPs proteolytic activity by tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) was evaluated. Modeling and molecular dynamics procedures showed similarities in the molecular bases of the interaction of TIMPs both with SVMPS and endogenous metalloproteinases (MMPs and ADAMs). PIII SVMP cysteine-rich domain is involved in the interaction with extracellular matrix proteins. Using surface plasmon resonance, we identified the interaction sites between jararhagin cysteine-rich domain and von WIllebrand factor (vWF). An interaction model of these two proteins was proposed. Considering the presence of vWF A domains in several matrix proteins, the cysteine-rich domain probably works targeting the metalloproteinases to specific substrates, leading to hemorrhage. Moreover, using a quantitative proteomic approach, it was shown for the first time the metalloproteinases proteolytic action upon organized extracellular matrix proteins in culture cells. In lonomic envenomation, a hemorrhagic clinical profile is observed regardless the absence of metalloproteinases. The caterpillar's toxic proteins studies are based on isolation and biochemical characterization of active principles related to the patophisiology of the envenomation. In the last few years, these studies were focused on one caterpillar's secretion, containing pro-coagulant, fibrin(ogen)olytic, hemolytic, edematogenic and nociceptive activities. In this work, we identified quali-quantitative differences in four Lonomia obliqua venomous secretions. The different participation of each of these secretions during the accident could lead to the variability of symptoms and severity of the envenomation. Using a microarray methodology, we analyzed the effects of the caterpillar venom on the cultured cells gene expression profile and identified increased expression of genes possibly involved with the clinical manifestations. Potentially toxic proteins from L. obliqua identified in a transcriptome study, together with the gene expression data described here allow a better understanding of the venom effects in hemostasis during lonomism.