Venenos e outras secreções animais vêm sendo explorados como fonte de substâncias ativas na hemostasia em mamíferos. Esses princípios ativos, com funções primárias na alimentação e defesa, afetam elementos chave de quase todas as vias fisiológicas animais, tendo um enorme potencial como base para o desenvolvimento de novas drogas. No envenenamento ofídico, hemorragias locais e sistêmicas são causadas em grande parte pela ação de metaloproteinases hemorrágicas presentes nos venenos (SVMPs). Os estudos com metaloproteinases até então descritos baseiam-se principalmente em metodologias bioquímicas clássicas. Neste trabalho, as metaloproteinases e suas interações com outras proteínas são abordadas através de técnicas de dinâmica molecular, ressonância plasmônica de superfície e proteômica quantitativa. O perfil de inibição da atividade proteolítica de SVMPs por inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMPs) foi avaliado. Experimentos de modelagem e dinâmica molecular mostraram similaridades nas bases moleculares da interação das TIMPs tanto com SVMPs quanto com metaloproteinases endógenas (MMPs e ADAMs), seus alvos fisiológicos. O domínio rico-em-cisteínas das SVMPs da classe PIII está envolvido na interação com proteínas de matriz extracelular. Os sítios de interação do domínio rico-em-cisteínas de jararragina com fator de von Willebrand (vWF) foram identificados por ressonância plasmônica de superfície. Um modelo de interação entre os domínios das duas proteínas foi proposto. Considerando a presença de domínios A de vWF em diversas proteínas de matriz extracelular, o domínio de rico-em-cisteínas funcionaria direcionando as metaloproteinases para substratos específicos, promovendo hemorragia. Além disso, através de uma metodologia de proteômica quantitativa, foi verificada pela primeira vez a ação proteolítica de metaloproteinases em proteínas de matriz extracelular íntegra de células em cultura. Já no envenenamento lonômico, um quadro clínico hemorrágico é observado apesar da ausência de metaloproteinases no veneno. O estudo de proteínas tóxicas da lagarta Lonomia obliqua baseia-se no isolamento e caracterização bioquímica dos princípios ativos relacionados com aspectos da patologia do envenenamento. Nos últimos anos, esses estudos se focaram em uma única secreção da lagarta, identificando o seu potencial pró-coagulante, fibrin(ogen)olítico, hemolítico, edematogênico e nociceptivo. Neste trabalho, foram identificadas diferenças quali-quantitativas em quatro secreções venenosas de L. obliqua. A diferente participação de cada uma dessas secreções durante o contato com as lagartas pode levar a grande variabilidade de sintomas e gravidade do acidente. Utilizando a metodologia de microarranjos de DNA, analisamos o efeito do veneno da lagarta no padrão de expressão gênica de células em cultura e identificamos a expressão aumentada de genes possivelmente relacionados ao quadro clínico do envenenamento. Proteínas potencialmente tóxicas de L. obliqua descritas em um estudo de transcriptoma, juntamente com os dados de expressão gênica aqui demonstrados possibilitam uma maior compreensão dos efeitos do veneno na hemostasia e sintomas do lonomismo. / Animal venoms and other secretions have been explored as source of active substances on the mammal hemostasis. These active principles, which have primary function in feeding and defense, act on key elements of almost all physiologic pathways and have an enormous potential in the development of new therapeutic drugs. In ophidic envenomations, local and systemic hemorrhages are caused mainly by the action of hemorrhagic metalloproteinases from the venom (SVMPs). Previous studies with metalloproteinases were based mostly in classical biochemical methodologies. Here, the metalloproteinases and their interactions with other proteins were examined by molecular dynamics, surface plasmon resonance and quantitative proteomics methodologies. The inhibition profile of the SVMPs proteolytic activity by tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) was evaluated. Modeling and molecular dynamics procedures showed similarities in the molecular bases of the interaction of TIMPs both with SVMPS and endogenous metalloproteinases (MMPs and ADAMs). PIII SVMP cysteine-rich domain is involved in the interaction with extracellular matrix proteins. Using surface plasmon resonance, we identified the interaction sites between jararhagin cysteine-rich domain and von WIllebrand factor (vWF). An interaction model of these two proteins was proposed. Considering the presence of vWF A domains in several matrix proteins, the cysteine-rich domain probably works targeting the metalloproteinases to specific substrates, leading to hemorrhage. Moreover, using a quantitative proteomic approach, it was shown for the first time the metalloproteinases proteolytic action upon organized extracellular matrix proteins in culture cells. In lonomic envenomation, a hemorrhagic clinical profile is observed regardless the absence of metalloproteinases. The caterpillar's toxic proteins studies are based on isolation and biochemical characterization of active principles related to the patophisiology of the envenomation. In the last few years, these studies were focused on one caterpillar's secretion, containing pro-coagulant, fibrin(ogen)olytic, hemolytic, edematogenic and nociceptive activities. In this work, we identified quali-quantitative differences in four Lonomia obliqua venomous secretions. The different participation of each of these secretions during the accident could lead to the variability of symptoms and severity of the envenomation. Using a microarray methodology, we analyzed the effects of the caterpillar venom on the cultured cells gene expression profile and identified increased expression of genes possibly involved with the clinical manifestations. Potentially toxic proteins from L. obliqua identified in a transcriptome study, together with the gene expression data described here allow a better understanding of the venom effects in hemostasis during lonomism.

Acidentes com animais venenosos constituem um problema de saúde pública negligenciado em todo o mundo. Estimativas indicam que, considerando-se apenas acidentes com serpentes venenosas, ocorram mundialmente cerca de 2,5 milhões de casos, causando 85.000 óbitos anuais. O desenvolvimento do quadro patológico dos envenenamentos é o resultado conjunto de potentes atividades biológicas exercidas, principalmente, por proteínas e peptídeos que compõem os venenos animais. A proteômica aplicada à caracterização de componentes de venenos animais, denominada venômica, é uma metodologia essencial na identificação não apenas dos componentes tóxicos, mas também valiosa na investigação molecular dos mecanismos patológicos dos envenenamentos. Através de metodologias proteômicas, descrevemos a caracterização protéica dos venenos animais das serpentes Bothrops jararaca e Bothrops lanceolatus e da lagarta Lonomia obliqua. Ainda, avaliamos através da proteômica de tecido experimentalmente envenenado as ações tóxicas de um componente isolado do veneno de Bothrops jararaca. Através de análise comparativa e semi-quantitativa da composição protéica dos venenos de B. jararaca e B. lanceolatus, descrevemos uma diferença qualitativa na distribuição dos componentes tóxicos. Enfatizando o grupo protéico majoritário, metaloproteases (SVMP), descrevemos diferentes abundâncias relativas entre os subtipos destas enzimas. Esta diferença explicaria as repercussões clínicas opostas durante o envenenamento humano, sendo um veneno hemorrágico e o outro prótrombótico. Componentes tóxicos capazes de gerar um quadro hemorrágico também foram avaliados através da análise proteômica das secreções tóxicas de L. obliqua. O estudo comparativo entre hemolinfa e extrato de espículas demonstrou que, diferentemente dos venenos botrópicos, as secreções tóxicas são compostas majoritariamente de inibidores de proteases, predominantemente serpinas. Além disso, descrevemos pela primeira vez a presença de novos componentes potencialmente tóxicos, como metaloproteases. Por fim, a proteômica de tecidos foi aplicada à investigação dos efeitos locais da injeção da metaloprotease do veneno de B. jararaca, jararagina. O efeito direto da ação da metaloprotease foi observado através da identificação de proteínas presentes em maior ou menor abundância, denotando infiltração ou degradação, respectivamente. Hemorragia, edema e estresse oxidativo foram evidenciados por pronunciado aumento em proteínas envolvidas nesses processos, mas, acima de tudo, identificamos degradação de proteínas relacionadas à manutenção da integridade da matriz extracelular e estabilização de coágulos, sugerindo novos mecanismos relacionados à atividade tóxica a serem investigados. De uma maneira geral, o presente trabalho descreve componentes tóxicos de venenos animais causadores de síndromes hemorrágicas e gera novas hipóteses em relação a mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento da patofisiologia dos envenenamentos. / Accidents with venomous animals are a neglected health issue worldwide. Global estimates points to the occurrence of 2,500,000 envenomation cases, causing 85,000 deaths per year. The pathological envenomation condition is a result of strong biological activities caused mainly by the action of venom's proteins and peptides components. Proteomics applied to the characterization of animal venom active principles, so called venomics, is an essential tool to the identification of toxic molecules as well as to help understanding the molecular mechanisms underlying pathological envenomation conditions. Through a proteomic methodology, here we describe the characterization of venoms from the snakes Bothrops jararaca and Bothrops lanceolatus and the caterpillar Lonomia obliqua. Moreover, from a tissue proteomic perspective we were able to evaluate the toxic effects of a B. jararaca venom component upon experimentally envenomed skin. Using a comparative semi-quantitative proteomic analysis, we described a qualitative difference in toxic components distribution between B. jararaca and B. lanceolatus venoms. Focusing on snake venom metaloproteases (SVMPs) distribution, we observed different relative abundance of these enzymes subgroups. Those differences could explain the opposite clinical envenomation characteristics, since one venom is hemorrhagic and the other induces a prothrombotic profile. Pro-hemorrhagic venom toxins were also characterized through the proteome of L. obliqua venomous secretions. Hemolymph and bristle extract were analyzed showing that, different from bothropic venoms, the toxic secretions composition are mainly protease inhibitors, especially serpins. Moreover, we were able to demonstrate for the first time the presence of new putative toxins, such as metalloproteases. Finally, we applied tissue proteomics to the investigation of local snakebite pathology by jararhagin, a metalloprotease from B. jararaca venom. The metalloprotease direct effect was observed through the increase or decrease in protein identification, indicating infiltration or degradation respectively. Hemorrhage, edema and oxidative stress were characterized by enhance in correlated proteins but, most of all, we identified degradation in proteins important to extracellular matrix integrity and clot stabilization, indicating novel mechanism of toxicity to be further evaluated. In a general perspective, the present work describes toxic components from venomous animals that cause hemorrhagic syndromes and generates new testable hypothesis of the mechanisms of action involved in the development of envenomation pathophysiology.

Acidentes com animais venenosos constituem um problema de saúde pública negligenciado em todo o mundo. Estimativas indicam que, considerando-se apenas acidentes com serpentes venenosas, ocorram mundialmente cerca de 2,5 milhões de casos, causando 85.000 óbitos anuais. O desenvolvimento do quadro patológico dos envenenamentos é o resultado conjunto de potentes atividades biológicas exercidas, principalmente, por proteínas e peptídeos que compõem os venenos animais. A proteômica aplicada à caracterização de componentes de venenos animais, denominada venômica, é uma metodologia essencial na identificação não apenas dos componentes tóxicos, mas também valiosa na investigação molecular dos mecanismos patológicos dos envenenamentos. Através de metodologias proteômicas, descrevemos a caracterização protéica dos venenos animais das serpentes Bothrops jararaca e Bothrops lanceolatus e da lagarta Lonomia obliqua. Ainda, avaliamos através da proteômica de tecido experimentalmente envenenado as ações tóxicas de um componente isolado do veneno de Bothrops jararaca. Através de análise comparativa e semi-quantitativa da composição protéica dos venenos de B. jararaca e B. lanceolatus, descrevemos uma diferença qualitativa na distribuição dos componentes tóxicos. Enfatizando o grupo protéico majoritário, metaloproteases (SVMP), descrevemos diferentes abundâncias relativas entre os subtipos destas enzimas. Esta diferença explicaria as repercussões clínicas opostas durante o envenenamento humano, sendo um veneno hemorrágico e o outro prótrombótico. Componentes tóxicos capazes de gerar um quadro hemorrágico também foram avaliados através da análise proteômica das secreções tóxicas de L. obliqua. O estudo comparativo entre hemolinfa e extrato de espículas demonstrou que, diferentemente dos venenos botrópicos, as secreções tóxicas são compostas majoritariamente de inibidores de proteases, predominantemente serpinas. Além disso, descrevemos pela primeira vez a presença de novos componentes potencialmente tóxicos, como metaloproteases. Por fim, a proteômica de tecidos foi aplicada à investigação dos efeitos locais da injeção da metaloprotease do veneno de B. jararaca, jararagina. O efeito direto da ação da metaloprotease foi observado através da identificação de proteínas presentes em maior ou menor abundância, denotando infiltração ou degradação, respectivamente. Hemorragia, edema e estresse oxidativo foram evidenciados por pronunciado aumento em proteínas envolvidas nesses processos, mas, acima de tudo, identificamos degradação de proteínas relacionadas à manutenção da integridade da matriz extracelular e estabilização de coágulos, sugerindo novos mecanismos relacionados à atividade tóxica a serem investigados. De uma maneira geral, o presente trabalho descreve componentes tóxicos de venenos animais causadores de síndromes hemorrágicas e gera novas hipóteses em relação a mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento da patofisiologia dos envenenamentos. / Accidents with venomous animals are a neglected health issue worldwide. Global estimates points to the occurrence of 2,500,000 envenomation cases, causing 85,000 deaths per year. The pathological envenomation condition is a result of strong biological activities caused mainly by the action of venom's proteins and peptides components. Proteomics applied to the characterization of animal venom active principles, so called venomics, is an essential tool to the identification of toxic molecules as well as to help understanding the molecular mechanisms underlying pathological envenomation conditions. Through a proteomic methodology, here we describe the characterization of venoms from the snakes Bothrops jararaca and Bothrops lanceolatus and the caterpillar Lonomia obliqua. Moreover, from a tissue proteomic perspective we were able to evaluate the toxic effects of a B. jararaca venom component upon experimentally envenomed skin. Using a comparative semi-quantitative proteomic analysis, we described a qualitative difference in toxic components distribution between B. jararaca and B. lanceolatus venoms. Focusing on snake venom metaloproteases (SVMPs) distribution, we observed different relative abundance of these enzymes subgroups. Those differences could explain the opposite clinical envenomation characteristics, since one venom is hemorrhagic and the other induces a prothrombotic profile. Pro-hemorrhagic venom toxins were also characterized through the proteome of L. obliqua venomous secretions. Hemolymph and bristle extract were analyzed showing that, different from bothropic venoms, the toxic secretions composition are mainly protease inhibitors, especially serpins. Moreover, we were able to demonstrate for the first time the presence of new putative toxins, such as metalloproteases. Finally, we applied tissue proteomics to the investigation of local snakebite pathology by jararhagin, a metalloprotease from B. jararaca venom. The metalloprotease direct effect was observed through the increase or decrease in protein identification, indicating infiltration or degradation respectively. Hemorrhage, edema and oxidative stress were characterized by enhance in correlated proteins but, most of all, we identified degradation in proteins important to extracellular matrix integrity and clot stabilization, indicating novel mechanism of toxicity to be further evaluated. In a general perspective, the present work describes toxic components from venomous animals that cause hemorrhagic syndromes and generates new testable hypothesis of the mechanisms of action involved in the development of envenomation pathophysiology.

Acidentes com animais venenosos constituem um problema de saúde pública negligenciado em todo o mundo. Estimativas indicam que, considerando-se apenas acidentes com serpentes venenosas, ocorram mundialmente cerca de 2,5 milhões de casos, causando 85.000 óbitos anuais. O desenvolvimento do quadro patológico dos envenenamentos é o resultado conjunto de potentes atividades biológicas exercidas, principalmente, por proteínas e peptídeos que compõem os venenos animais. A proteômica aplicada à caracterização de componentes de venenos animais, denominada venômica, é uma metodologia essencial na identificação não apenas dos componentes tóxicos, mas também valiosa na investigação molecular dos mecanismos patológicos dos envenenamentos. Através de metodologias proteômicas, descrevemos a caracterização protéica dos venenos animais das serpentes Bothrops jararaca e Bothrops lanceolatus e da lagarta Lonomia obliqua. Ainda, avaliamos através da proteômica de tecido experimentalmente envenenado as ações tóxicas de um componente isolado do veneno de Bothrops jararaca. Através de análise comparativa e semi-quantitativa da composição protéica dos venenos de B. jararaca e B. lanceolatus, descrevemos uma diferença qualitativa na distribuição dos componentes tóxicos. Enfatizando o grupo protéico majoritário, metaloproteases (SVMP), descrevemos diferentes abundâncias relativas entre os subtipos destas enzimas. Esta diferença explicaria as repercussões clínicas opostas durante o envenenamento humano, sendo um veneno hemorrágico e o outro prótrombótico. Componentes tóxicos capazes de gerar um quadro hemorrágico também foram avaliados através da análise proteômica das secreções tóxicas de L. obliqua. O estudo comparativo entre hemolinfa e extrato de espículas demonstrou que, diferentemente dos venenos botrópicos, as secreções tóxicas são compostas majoritariamente de inibidores de proteases, predominantemente serpinas. Além disso, descrevemos pela primeira vez a presença de novos componentes potencialmente tóxicos, como metaloproteases. Por fim, a proteômica de tecidos foi aplicada à investigação dos efeitos locais da injeção da metaloprotease do veneno de B. jararaca, jararagina. O efeito direto da ação da metaloprotease foi observado através da identificação de proteínas presentes em maior ou menor abundância, denotando infiltração ou degradação, respectivamente. Hemorragia, edema e estresse oxidativo foram evidenciados por pronunciado aumento em proteínas envolvidas nesses processos, mas, acima de tudo, identificamos degradação de proteínas relacionadas à manutenção da integridade da matriz extracelular e estabilização de coágulos, sugerindo novos mecanismos relacionados à atividade tóxica a serem investigados. De uma maneira geral, o presente trabalho descreve componentes tóxicos de venenos animais causadores de síndromes hemorrágicas e gera novas hipóteses em relação a mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento da patofisiologia dos envenenamentos. / Accidents with venomous animals are a neglected health issue worldwide. Global estimates points to the occurrence of 2,500,000 envenomation cases, causing 85,000 deaths per year. The pathological envenomation condition is a result of strong biological activities caused mainly by the action of venom's proteins and peptides components. Proteomics applied to the characterization of animal venom active principles, so called venomics, is an essential tool to the identification of toxic molecules as well as to help understanding the molecular mechanisms underlying pathological envenomation conditions. Through a proteomic methodology, here we describe the characterization of venoms from the snakes Bothrops jararaca and Bothrops lanceolatus and the caterpillar Lonomia obliqua. Moreover, from a tissue proteomic perspective we were able to evaluate the toxic effects of a B. jararaca venom component upon experimentally envenomed skin. Using a comparative semi-quantitative proteomic analysis, we described a qualitative difference in toxic components distribution between B. jararaca and B. lanceolatus venoms. Focusing on snake venom metaloproteases (SVMPs) distribution, we observed different relative abundance of these enzymes subgroups. Those differences could explain the opposite clinical envenomation characteristics, since one venom is hemorrhagic and the other induces a prothrombotic profile. Pro-hemorrhagic venom toxins were also characterized through the proteome of L. obliqua venomous secretions. Hemolymph and bristle extract were analyzed showing that, different from bothropic venoms, the toxic secretions composition are mainly protease inhibitors, especially serpins. Moreover, we were able to demonstrate for the first time the presence of new putative toxins, such as metalloproteases. Finally, we applied tissue proteomics to the investigation of local snakebite pathology by jararhagin, a metalloprotease from B. jararaca venom. The metalloprotease direct effect was observed through the increase or decrease in protein identification, indicating infiltration or degradation respectively. Hemorrhage, edema and oxidative stress were characterized by enhance in correlated proteins but, most of all, we identified degradation in proteins important to extracellular matrix integrity and clot stabilization, indicating novel mechanism of toxicity to be further evaluated. In a general perspective, the present work describes toxic components from venomous animals that cause hemorrhagic syndromes and generates new testable hypothesis of the mechanisms of action involved in the development of envenomation pathophysiology.

Esse trabalho investigou as principais carboidrases já descritas em Lepidoptera e principalmente as enzimas relacionadas com hidrólise de sacarose presentes na hemolinfa e no intestino do sexto instar larval de Lonomia obliqua. Avaliou também o efeito das diferentes dietas Eriobotrya japonica, Psidium guajava, Mangifera indica e Alchornea ssp sobre as atividades das carboidrases presentes no sistema circulatório e no sistema digestório dessa lagarta. As pectinases e celulases foram identificadas somente no intestino, porém a amilase, a α-glucosidase, a β-glucosidase, a α-fucosidase e a β-fructosidase foram detectadas também na hemolinfa dessa lagarta. Os géis nativos e os pHs ótimos indicam que há distintas carboidrases na hemolinfa e no intestino de Lonomia obliqua. Alterações nas dietas afetam somente as carboidrases intestinais. A sacarose das folhas foi hidrolisada pela ação conjunta da α-glucosidase e da β-frucosidase. A investigação das carboidrases de Lonomia obliqua contribuirão para o desenvolvimento de medidas de controle desse inseto. / This work investigated the main carbohydrases already described in Lepidoptera and especially the enzymes present in the hemolymph and intestine of the 6th instar of Lonomia obliqua related to the hydrolysis of sucrose. It has also evaluated the effect of different diets Alchornea ssp, Eriobotrya japonica, Mangifera indica and Psidium guajava, on the activities of the carbohydrases present in the circulatory and digestive system of this caterpillar. Pectinases and cellulases were identified in the midgut only, but amylase, α-glucosidase, β-glucosidase, α-fucosidase and β-fructosidase were detected in both hemolymph and midgut of this caterpillar. Native gels and effect of pH indicated that there are distinct carboidrases in the hemolymph and the midgut of Lonomia obliqua. Diet change have affected the digestive carbohydrases only. The sucrose in the leaves was hydrolyzed by the combined action of α-glucosidase and β-frucosidase. The investigation of the carboidrases of Lonomia obliqua can contribute to the development of control strategies to this insect.

Em 2009, foi demonstrado um potente antiviral na hemolinfa de L. obliqua. Esta proteína purificada reduziu o título viral (TCID50 ml-1) do sarampo, pólio e H1N1 em 157, 61 e 64 vezes. Recentemente, expressamos a proteína antiviral em sistema baculovírus, que reduziu o título de vírus do herpes em 106 vezes, da rubéola e EMC em 105 vezes. No entanto, este sistema de expressão é muito caro e trabalhoso. Com isso, clonamos e expressamos esta proteína com atividade antiviral em sistema bacteriano. A sequência antiviral foi clonada em vetor de expressão pET28a. As construções resultantes foram expressas em E. coli Bl21 DE3 pLysS induzidas com IPTG 1,0 mM. Após expressão, o pellet bacteriano foi sonicado e o material foi purificado por afinidade e gel filtração. Testou-se contra o vírus EMC mostrando uma proteção de 104 vezes em relação ao controle. E utilizando qPCR para determinar os níveis de transcrição de RNA do vírus do herpes e da rubéola em células infectadas mostrou uma inibição respectivamente de 106 e 105 vezes, em relação ao controle. / In 2009, we demonstrated a potent antiviral in the hemolymph of L. obliqua. This purified protein has reduced the viral titer (TCID50 ml-1), measles and polio H1N1 157, 61 and 64 times. Recently, the antiviral protein expressed in baculovirus system, which reduced the title of the herpes virus in 106 times, rubella and EMC in 105 times. However, this expression system is very expensive and laborious. Thus, cloned and expressed this protein with antiviral activity in bacterial system. The antiviral sequence was cloned into pET28a expression vector. The resulting constructs were expressed in E. coli BL21 DE3 pLysS cells induced with 1.0 mM IPTG. Following expression, the bacterial pellet was sonicated and the material was purified by affinity and gel filtration. Was tested against EMC virus showing a protection of 104 times compared to the control. And using qPCR to determine the levels of viral RNA transcription of the herpes virus and rubella-infected cells showed an inhibition of respectively 106 and 105 times compared to the control.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-06-24. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:28Z : No. of bitstreams: 1 Publico-00275a.pdf: 1984852 bytes, checksum: b59b9eec047c1dde85258ab2627be073 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:28Z : No. of bitstreams: 2 Publico-00275a.pdf: 1984852 bytes, checksum: b59b9eec047c1dde85258ab2627be073 (MD5) Publico-00275b.pdf: 1888267 bytes, checksum: ec53e005babae0faeb59e5531e84717a (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:28Z : No. of bitstreams: 3 Publico-00275a.pdf: 1984852 bytes, checksum: b59b9eec047c1dde85258ab2627be073 (MD5) Publico-00275b.pdf: 1888267 bytes, checksum: ec53e005babae0faeb59e5531e84717a (MD5) Publico-00275c.pdf: 1700699 bytes, checksum: 0b64f1d6737aec3687de494ae30df256 (MD5) / O processo de reparação tecidual é um complexo de reações entre células e mediadores bioquímicos que são desencadeados a partir de uma lesão. Neste estudo avaliamos a ação do peptídeo 4 obtido a partir da sequência de aminoácidos do Lopap (Lonomia obliqua prothrombin activator protease) em cultura de fibroblastos para se avaliar a expressão de moléculas de matriz extracelular e receptores de membrana de interleucina-8 e em modelo experimental de lesão cutânea em ratos para se analisar o efeito da molécula em estudo no processo de reparação tecidual. Foram utilizados 40 ratos Wistar machos de 6 a 8 semanas, randomizados em 5 grupos experimentais. Após a anestesia, os ratos foram submetidos a procedimento cirúrgico, onde oito secções circulares de pele de 6 mm de diâmetro foram circunscritas na região dorsal e tratadas com solução salina ou com o peptídeo 4. Após diferentes períodos (3, 7, 14 e 21 dias) realizaram-se análises para se avaliar o processo de reparação tecidual entre os grupos. Concluímos que o peptídeo 4 é capaz de estimular fibroblastos em cultura, além de promover o aceleramento do processo de reparação tecidual em modelo in vivo, com maior deposição de colágeno, glicosaminoglicanos e melhor reorganização tecidual. / The process of tissue repair is a complex of reactions between cells and biochemical mediators that are triggered from an injury. This study evaluated the effect of peptide 4 derived from the amino acid sequence of Lopap (Lonomia obliqua prothrombin activator protease) in culture of fibroblasts to evaluate the expression of molecules of extracellular matrix and the membrane receptors of interleukin-8 and in experimental model of skin lesion in rats to examine the effect of the molecule in the process of tissue repair. We used 40 male Wistar rats with 6 to 8 weeks, randomized to 5 experimental groups. After anesthesia, the rats were submitted to surgery, where eight circular full-thickness of skin from 6 mm of diameter were surrounded in the back and treated with saline or with peptide 4. After different periods (days 3, 7, 14 and 21 days after wounding) were carried out tests to evaluate the process of tissue repair between the groups. We conclude that peptide 4 is able to stimulate fibroblasts in culture and promote the acceleration of the process of tissue repair in vivo model with greater deposition of collagen, glycosaminoglycans and better tissue reorganization. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Em 2009, foi demonstrado um potente antiviral na hemolinfa de L. obliqua. Esta proteína purificada reduziu o título viral (TCID50 ml-1) do sarampo, pólio e H1N1 em 157, 61 e 64 vezes. Recentemente, expressamos a proteína antiviral em sistema baculovírus, que reduziu o título de vírus do herpes em 106 vezes, da rubéola e EMC em 105 vezes. No entanto, este sistema de expressão é muito caro e trabalhoso. Com isso, clonamos e expressamos esta proteína com atividade antiviral em sistema bacteriano. A sequência antiviral foi clonada em vetor de expressão pET28a. As construções resultantes foram expressas em E. coli Bl21 DE3 pLysS induzidas com IPTG 1,0 mM. Após expressão, o pellet bacteriano foi sonicado e o material foi purificado por afinidade e gel filtração. Testou-se contra o vírus EMC mostrando uma proteção de 104 vezes em relação ao controle. E utilizando qPCR para determinar os níveis de transcrição de RNA do vírus do herpes e da rubéola em células infectadas mostrou uma inibição respectivamente de 106 e 105 vezes, em relação ao controle. / In 2009, we demonstrated a potent antiviral in the hemolymph of L. obliqua. This purified protein has reduced the viral titer (TCID50 ml-1), measles and polio H1N1 157, 61 and 64 times. Recently, the antiviral protein expressed in baculovirus system, which reduced the title of the herpes virus in 106 times, rubella and EMC in 105 times. However, this expression system is very expensive and laborious. Thus, cloned and expressed this protein with antiviral activity in bacterial system. The antiviral sequence was cloned into pET28a expression vector. The resulting constructs were expressed in E. coli BL21 DE3 pLysS cells induced with 1.0 mM IPTG. Following expression, the bacterial pellet was sonicated and the material was purified by affinity and gel filtration. Was tested against EMC virus showing a protection of 104 times compared to the control. And using qPCR to determine the levels of viral RNA transcription of the herpes virus and rubella-infected cells showed an inhibition of respectively 106 and 105 times compared to the control.

O envenenamento causado pela lagarta Lonomia obliqua é um problema de saúde pública nas regiões do Sul do Brasil. As vítimas envenenadas apresentam uma síndrome hemorrágica grave que pode evoluir para insuficiência renal aguda, hemorragia intracraniana e óbito. Com o objetivo de compreender os mecanismos que levam à hemorragia, neste trabalho foram avaliados a função plaquetária e os parâmetros de coagulação sangüínea em um modelo experimental de envenenamento em ratos e também foram investigados os efeitos diretos do veneno de L. obliqua sobre plaquetas isoladas in vitro. Os ratos envenenados apresentaram hipofibrinogenemia e hipoagregação plaquetária. A produção intravascular de óxido nítrico e a geração dos produtos de degradação de fibrinogênio/fibrina parecem estar envolvidos na hipoagregação plaquetária. Os animais envenenados também apresentaram incoagulabilidade sangüínea e um aumento significativo na atividade de trombina, plasmina e uroquinase no plasma. Apesar desta geração intravascular de trombina, somente uma pequena redução na contagem de plaquetas foi detectada. Quando testado in vitro, o veneno de L. obliqua foi capaz de induzir diretamente agregação e adesão de plaquetas isoladas. A agregação plaquetária induzida pelo veneno foi significativamente inibida por brometo de p-bromofenacila (p-BPB), um inibidor específico de fosfolipases A2. Experimentos com diferentes antagonistas farmacológicos indicaram que a agregação plaquetária disparada pelo veneno ocorre por um mecanismo dependente de cálcio envolvendo a via das ciclooxigenases e a ativação da fosfodiesterase 3A, uma enzima que leva ao consumo dos níveis intracelulares de AMPc. Se analisados em conjunto, os resultados aqui apresentados são importantes para a compreensão da síndrome hemorrágica resultante do contato acidental com a lagarta L. obliqua e podem auxiliar na descoberta de novas formas de tratamento para o quadro clínico. / The envenomation caused by the caterpillar Lonomia obliqua is a public health hazard in Southern Brazil regions. Envenomed victims present a severe hemorrhagic syndrome that can progress to acute renal failure, intracranial hemorrhage and death. To understand the mechanisms that lead to hemorrhage, we evaluated the platelet function and blood coagulation parameters in an experimental model of envenomation in rats and investigated the direct effects of L. obliqua venom on isolated platelets in vitro. Envenomed rats presented hypofibrinogenemia and platelet hypoaggregation. The intravascular production of nitric oxide and generation of fibrinogen/fibrin degradation products seems to be involved in platelet hypoaggregation. Animals also showed intense blood incoagulability and a significant increase in thrombin, plasmin and urokinase plasmatic activities. Despite this intravascular thrombin generation, only a slight decrease in platelet numbers was detected. When tested in vitro, L. obliqua venom was able to directly induce aggregation and adhesion of isolated platelets. The venom-induced platelet aggregation was significativly inhibited by p-bromophenacyl bromide (p-BPB), a specific inhibitor of phospholipases A2. Experiments with different pharmacological antagonists indicate that the aggregation response triggered by venom occurs through a calcium-dependent mechanism involving the cyclooxygenase pathway and activation of phosphodiesterase 3A, an enzyme that leads to the consumption of intracellular cAMP content. Altogether, these findings may be important to the understanding of the complex hemorrhagic syndrome resulting from accidental contact with L. obliqua caterpillars and may give new insights in the management of the clinical profile.

O envenenamento por animais peçonhentos é considerado uma doença ocupacional comum e grave, especialmente em áreas rurais de países tropicais em desenvolvimento. Sua importância para a saúde pública tem sido largamente ignorada pelas autoridades médicas em todo o mundo. Apesar dos soros antivenenos serem produzidos por vários laboratórios distribuídos em todos os continentes, o alto número de acidentes, a mortalidade e a morbidade associadas a eles continuam tendo um grande impacto sobre a população e os sistemas de saúde desses países. Especificamente nas regiões do sul do Brasil, os acidentes com lagartas venenosas da espécie Lonomia obliqua têm sido um problema crescente, não somente pelas altas taxas de incidência, mas também pela severidade das consequências clínicas observadas nos casos de envenenamento. Frequentemente, as vítimas envenenadas apresentam uma síndrome hemorrágica grave, que pode evoluir para insuficiência renal aguda (IRA), hemorragia intracraniana e morte. O presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de investigar os mecanismos fisiopatológicos induzidos pela toxicidade sistêmica do veneno de L. obliqua, dando atenção especial às alterações renais e vasculares que são descritas como as principais causas de morte neste tipo de envenenamento. Os resultados obtidos são aqui apresentados na forma de artigos científicos que abordam os seguintes aspectos: (i) o conhecimento atual sobre os componentes moleculares do veneno de L. obliqua e as características clínicas do envenenamento; (ii) a caracterização das principais alterações histopatológicas, hematológicas, bioquímicas e genotóxicas em diferentes órgãos e a capacidade da soroterapia antiveneno em neutralizar os efeitos tóxicos sistêmicos do veneno de L. obliqua em um modelo experimental in vivo em ratos; (iii) a epidemiologia, a fisiopatologia e o manejo terapêutico da IRA induzida por diferentes venenos nefrotóxicos; (iv) os mecanismos envolvidos na IRA induzida pelo envenenamento experimental com L. obliqua; e (v) a contribuição dos componentes do sistema calicreína-cininas (SCC) para a instabilidade hemodinâmica, a inflamação e o consequente comprometimento renal observado no envenenamento experimental com L. obliqua. Resumidamente, os dados obtidos permitiram-nos indicar que a injeção subcutânea do veneno de L. obliqua em ratos induz alterações hemostáticas severas e danos em múltiplos órgãos, principalmente nos pulmões, coração, rins e baço. Há também evidências de que o veneno possui atividade cardiotóxica, miotóxica e genotóxica. Além disso, o tratamento com soro só é eficaz em neutralizar os efeitos fisiopatológicos sistêmicos se for administrado durante a fase inicial de envenenamento. Em relação ao mecanismo da IRA induzida pelo veneno, este parece ser complexo e multifatorial envolvendo três aspectos principais: a citotoxicidade tubular derivada da ação do heme; as alterações vasculares, incluindo hipotensão sistêmica, aumento de permeabilidade vascular e deposição de fibrina nos capilares glomerulares; e a ativação do SCC renal. Em conjunto, estes mecanismos estão diretamente relacionados com as alterações funcionais observadas em ratos envenenados, como a hipoperfusão renal, inflamação, necrose tubular e a perda súbita das funções básicas do rim, incluindo perda da capacidade de filtração e excreção, concentração de urina e manutenção do equilíbrio hídrico. As ativações da calicreína renal e do receptor B1 de bradicinina (B1R) desempenham papel fundamental na IRA induzida por L. obliqua, pois tanto o bloqueio farmacológico do B1R quanto a inibição da calicreína são capazes de prevenir as alterações funcionais e histopatológicas renais observadas nos ratos envenenados. Os principais mecanismos envolvidos nesses efeitos benéficos estão associados com uma diminuição da resposta inflamatória renal (redução da migração de células proinflamatórias e dos níveis de citocinas proinflamatórias) e da degeneração tubular. Portanto, o conjunto de todos os resultados aqui mostrados permitiram fornecer evidências consistentes que relacionam a ativação do SCC e a IRA induzida por L. obliqua e também indicar que a inibição de componentes do SCC, principalmente a inibição de calicreína ou o antagonismo do B1R, podem ser alternativas terapêuticas para o controle da progressão da lesão renal nos casos de envenenamento. / The envenomation by venomous animals is considered a common and serious occupational disease, especially in rural areas of tropical developing countries. Its public health relevance has been largely ignored by medical authorities worldwide. Although antivenoms are produced by various laboratories in every continent, the burden of envenomation cases, causing both morbidity and mortality, still has a major impact on the population and on health-care systems. Specifically in regions of southern Brazil, accidents with the venomous caterpillar Lonomia obliqua have been an emergent problem, not only for their high incidence rates, but also by the severity of the clinical consequences observed in envenomation cases. Frequently, envenomed victims present a severe hemorrhagic syndrome that can progress to acute kidney injury (AKI), intracranial hemorrhage and death. Through this work we aimed to investigate the physiopathological mechanisms induced by the systemic toxicity of L. obliqua venom, with particular attention to renal and vascular disorders that are described as the leading cause of death in this type of envenomation. Results are presented here as scientific articles that address the following aspects: (i) the current knowledge about the molecular components of L. obliqua venom and the clinical features of envenomation; (ii) the characterization of the main histopathological, hematological, biochemical and genotoxic alterations in different organs and the ability of antivenom serotherapy to counteract the systemic toxic effects of L. obliqua venom using an in vivo experimental model in rats; (iii) some aspects of epidemiology, physiopathology and management of AKI induced by different nephrotoxic venoms; (Continue_ (iv) the mechanisms involved in experimental L. obliqua-induced AKI; and (v) the contribution of kallikrein-kinin system (KKS) components to the hemodynamic instability, inflammation and the consequent renal functional impairment during L. obliqua experimental envenomation. In summary, the data indicate that the subcutaneous injection of L. obliqua venom in rats induce severe hemostatic abnormalities and multi-organ damage, mainly in the lungs, heart, kidneys and spleen. There are also evidences of cardiotoxic, myotoxic and genotoxic activities in L. obliqua venom. Moreover, treatment with antivenom is only effective at counteracting the systemic physiopathological effects if it is administered during the initial phase of envenomation. Regarding the mechanism of venom-induced AKI, it seems to be complex and multifactorial involving three main issues: the hemederived tubular cytotoxicity; vascular alterations, including systemic hypotension, increase in vascular permeability and glomerular fibrin deposition; and the activation of renal KKS. Acting together these mechanisms are directly related to the functional alterations observed in envenomed rats such as renal hypoperfusion, inflammation, tubular necrosis and the sudden loss of basic renal functions, including filtration and excretion capacities, urinary concentration and maintenance of body fluid homeostasis. The activation of renal kallikrein and the bradykinin receptor B1 (B1R) play a crucial role in L. obliqua-induced AKI, because both the pharmacological blockade of B1R or kallikrein inhibition are able to prevent the renal functional and histopathological alterations observed in the kidneys of envenomed rats. The main mechanisms underlying these beneficial effects are associated with a decrease in renal inflammatory response (reduction of pro-inflammatory cell migration and pro-inflammatory cytokine levels) and tubular degeneration. Thus, the set of all findings allowed us to show a consistent evidence linking KKS activation with the L. obliqua-induced AKI and indicate that the inhibition of KKS components, mainly kallikrein inhibition or B1R antagonism, could be a therapeutic alternative to control the progression of renal injury in the cases of such envenomation.