Variações ontogenéticas nas enzimas pró-coagulantes do veneno de B. jararaca filhotes (vBjF) tornam este veneno mais coagulante que o de serpentes adultas (vBjA). Além disso, o vBjF não é tão eficientemente neutralizado pelo soro antibotrópico in vitro, como o vBjA. Neste trabalho comparamos as alterações hemostáticas induzidas pelos venenos vBjA e vBjF em ratos e avaliamos sua recuperação após o tratamento com soro antibotrópico (SAB), por meio de análises de tromboelastometria, dosagens de fatores de coagulação, e análise de plaquetas. Ratos Wistar machos foram inoculados com vBjA e vBjF (1,6 mg/kg , s.c.) ou solução salina (controle), e tratados com SAB ou solução salina (100 mL i.v.) 1 hora (h), após a inoculação dos venenos. Amostras de sangue de ratos tratados foram coletadas em 1, 3, 6 e 24 h após a injeção para avaliar os níveis de fibrinogênio plasmático, haptoglobina plasmática, hemoglobina plasmática, produtos de degradação de fibrinogênio e fibrina (PDF/f), complexo trombina- antitrombina III (TAT), fator de von Willebrand ( vWF), fatores de coagulação II e X , e também para contagem e análise funcional das plaquetas. Para as análises de tromboelastometria, foram coletadas amostras de sangue citratado (recalcificado) e de sangue nativo (sem anticoagulante) em 6 e 24 h após a inoculação e tratamento com solução salina ou SAB. Às amostras de sangue citratado foram adicionados reagentes específicos para analise das vias intrínseca e extrínseca da coagulação. Parâmetros como o tempo de coagulação (CT), o tempo de formação do coágulo (CFT) e ângulo alfa foram adquiridos durante 1 h. Em 3 h a contagem de plaquetas de ratos inoculados com vBjA e vBjF, e também o níveis de fibrinogênio, haptoglobina, FII, FX e vWF caíram abruptamente em relação aos controles, enquanto os de TAT e PDF/f aumentaram. Em 6 h os níveis de fibrinogênio ainda encontravam-se bastante baixos para ambos os venenos. Pela análise de tromboelastometria, notou-se que em 6 h os parâmetros CT, CFT, ângulo alfa permanecem muito alterados em ratos não tratados. Com o tratamento com SAB, todos os parâmetros foram significativamente restaurados, para ambos os grupos envenenados, principalmente em 3 e 6 horas após a inoculação venenos . Assim, apesar das diferenças entre vBjA e vBjF com relação a composição e potencial de neutralização in vitro, o tratamento com SAB foi igualmente eficiente na reversão dos distúrbios hemostáticos decorrentes do envenenamento por ambos os venenos / Ontogenetic variations in the pro-coagulant enzymes of the young B. jararaca venom (YBjv) makes it more coagulant than that from adult snakes (ABjv). Moreover, YBjv is not so efficiently neutralized by specific antivenin in vitro as ABjv. Herein we compared hemostatic disturbances induced by ABjv and YBjv in rats and assessed their recovery after treatment with botropic antivenin by thromboelastometry, dosages of coagulation factors, and platelet analysis. Male Wistar rats were inoculated with ABjv and YBjv (1.6 mg/kg, s.c), or saline (control), and treated with botropic antivenin (SAB) or saline (100 μL i.v.) 1 hour (h) after venom inoculation. Blood samples of treated rats were collected 1, 3, 6 and 24 h after injection to evaluate plasmatic fibrinogen, plasmatic haptoglobina, plasmatic hemoglobin, fibrin and fibrinogen degradation products (FfDP), thrombin-antithrombin III complex (TAT), von Willebrand factor (vWF), coagulation factors II and X, and also to count and functional analysis on platelets. Thromboelastometry was carried out on citrated (recalcified) and native (without anticoagulant) blood samples, collected 6 and 24 h after injection and treatment with SAB or saline. Citrated samples were mixed with specific reagents to analyze the intrinsic and extrinsic pathways. Parameters as clotting time (CT), clot formation time (CFT) and alpha angle were acquired for 1 h. At 3 h, platelet count of ABjv and YBjv rats and also fibrinogen, haptoglobin, FII, FX and vWF levels fell abruptly in regard to controls, while TAT and FfDP increased. At 6 h the fibrinogen levels still pretty low for both venoms. By thromboelastometry analysis, at 6 h, it was noticed that the CT, CFT, alpha angle remain greatly altered on non-treated rats. With the SAB treatment, all the parameters were significantly restored, for both envenomed groups, especially at 3 and 6 h after the venoms inoculation. Thus, despite differences in composition and in vitro neutralization potential among ABjv and YBjv, the treatment with SAB was equally efficient in reversing the hemostatic disturbances caused by both venoms

Orientador: Gilberto Di Nucci / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-08T17:30:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_Renata_D.pdf: 3731269 bytes, checksum: ef00e8c346cabde2a33e5eea29d6f2c1 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Desde 1986 acidentes causados pelo contato com lagartas de mariposas da espécie Lonomia obliqua vêm sendo notificados na Região Sul do Brasil. O envenenamento humano por esta espécie resulta em alterações do sistema de coagulação, caracterizando um quadro de coagulação intravascular disseminada, associado a uma síndrome fibrinolítica severa. Estudos demonstraram que o veneno da Lonomia obliqua contém um ativador de fator X e um ativador de protrombina. Uma proteína ativadora de protrombina, denominada LOPAP (¿Lonomia obliqua prothrombin activator protease¿) foi isolada e caracterizada bioquímica e fisiologicamente. Esta enzima é uma serino protease de 69 kDa. Quando testada in vivo, a LOPAP leva à formação de microcoágulos, hemorragia microvascular e pulmonar, sangue incoagulável e uma infiltração leucocitária pulmonar em ratos. Neste trabalho, através de cromatografia de exclusão, seguida por cromatografia de fase reversa (HPLC) isolou-se uma proteína de 20745.7 Da do extrato de cerdas de L. obliqua. Durante o processo, foi avaliada a atividade ativadora de fator X humano purificado in vitro, através de ensaio de cinética enzimática com o uso de substratos cromogênicos. A proteína ativa isolada apresentou imunorreatividade com o soro-antilonômico, produzido pelo Instituto Butantan. Com o uso de técnicas aplicadas a proteômica, determinou-se a seqüência de aminoácidos da proteína com atividade tipo fator Xa. Trata-se de uma proteína nova, ainda não seqüenciada, a qual apresenta grande identidade com proteínas da família das lipocalinas / Abstract: Since 1986 accidents caused by contact with caterpillars of butterflies of the Lonomia obliqua species comes being notified in the South Region of Brazil. The human envenoming for this species results in alterations of the coagulation system, characterizing a disseminated intravascular coagulation, associated to a severe fibrinolytic syndrome. Studies had demonstrated that the venom of the Lonomia obliqua contains a factor X and a prothrombin activator. An activator protein of prothrombin, called LOPAP (¿Lonomia obliqua prothrombin activator protease¿) was isolated and biochemist and physiologically characterized. This enzyme is a serine protease of 69 kDa. When tested in vivo, the LOPAP leads to thrombus formation, microvasculary and pulmonary hemorrhage, unclottable blood and leukocyte infiltration in the lungs at rats. In this work, through chromatography of exclusion, followed by phase reverse chromatography (HPLC), it was isolated a 20745.7 Da protein of the spicules extract of L. obliqua. During the process, it was evaluated the purified human factor X activator activity in vitro, through kinetic assay with the chromogenic substrate use. The isolated protein presented factor Xa like activity and presented immunorreactivity with the antilonomic serum, produced by Butantan Institute. Using techniques applied to the proteomic studies, it was determined the amino acid sequence of the protein with factor Xa like activity. It is a new protein, not yet sequenced, which has large identity with lipocalins family protein / Doutorado / Doutor em Farmacologia