Neste trabalho descrevemos o isolamento, a caracterização funcional e estrutural de uma metaloprotease hemorrágica, denominada BjussuMP-I. A proteína foi isolada da peçonha de Bothrops jararacussu por combinação de dois passos cromatográficos, utilizando filtração molecular em Sephacryl S-200, equilibrada em tampão Tris-HCl (0,01 M, pH 7,0) seguida de cromatografia de interação hidrofóbica em Phenyl-Sepharose CL-4B, equilibrada em tampão Tris-HCl (0,01 M, pH 7,6 mais NaCl 4 M) e eluída com gradiente de NaCl (4-0 M) a 25°C no mesmo tampão. BjussuMP-I é uma proteína com massa molecular de 60 kDa e pI 5,6, a qual induziu hemorragia após injeção intradérmica em camundongos, com uma dose hemorrágica mínima (DHM) de 4,5 g. A atividade hemorrágica da BjussuMP-I foi totalmente inibida após incubação com um agente quelante (EDTA), confirmando a dependência de metal da enzima para esse efeito. BjussuMP-I possui atividade proteolítica sobre a caseína e fibrinogênio e nenhum efeito sobre a gelatina. Por outro lado, demonstrou alta especificidade pela cadeia do fibrinogênio enquanto que a cadeia somente foi hidrolisada na presença de altas concentrações da metaloprotease. A protease foi ativa sobre o fibrinogênio em pH neutro e alcalino e inativada a 75 °C. A dependência de metal da enzima foi demonstrada pela inibição exercida por EDTA, EGTA e 1,10 fenantrolina. Verificou-se uma inibição parcial pelo ?-mercaptoetanol e PMSF, enquanto que leupeptina e aprotinina não afetaram a atividade fibrinogenolítica. A enzima foi ativada na presença de íons Ca++ e Mg++, sendo inibida por Mn++, Fe++, Zn++, Co++ e Ni++. Além disso, baixas concentrações da enzima produziram lise no coágulo de fibrina. BjussuMP-I também demonstrou inibição da agregação plaquetária induzida por colágeno e ADP e atividade bactericida sobre Escherichia coli e Staphylococcus aureus. Verificou-se que as atividades hemorrágica e proteolítica da BjussuMP-I foram neutralizadas pelo diterpenóide clerodane (Bt-CD) de Bacharis trimera. Também se observou uma inibição total do efeito hemorrágico, utilizando o extrato aquoso de Pentaclethra macroloba (EPema). A enzima foi reconhecida por anticorpos antineuwiedase, com uma reação de identidade imunológica parcial. A seqüência completa do cDNA da BjussuMP-I com 1540 pb codificou para uma proteína de 547 resíduos de aminoácidos, que conservou os domínios comuns a metaloproteases hemorrágicas de alto peso molecular da classe PIII: (i) pré-pró-peptideo, (ii) metaloprotease, (iii) disintegrina-símile e (iv) domínio rico em cisteína. / In this study the isolation, functional and structural characterization of a hemorrhagic metalloprotease, named BjussuMP-I is reported. The protein was isolated from Bothrops jararacussu snake venom by a combination of two chromatographic steps, using gel filtration on Sephacryl S-200 (0.01 M Tris-HCl, pH7.6 buffer) and Phenyl-Sepharose CL-4B chromatography (0.01 M Tris-HCl plus 4 M NaCl, pH7.6 buffer) followed by a concentration gradient from 4 to 0 M NaCl at 25°C in the same buffer. BjussuMP-I is a 60 kDa protein with a pI 5.6, which induced hemorrhage after intradermal injection in mice with a minimum hemorrhagic dose (MHD) of 4.5 g. The hemorrhagic activity of BjussuMP-I was totally abolished after incubation with a chelating agent (EDTA), corroborating the metal-dependence of this effect. BjussuMP-I shows proteolytic activity on casein, collagen and fibrinogen, although no effect on gelatin was observed. In addition, it presented a high specificity toward the -chain of fibrinogen, while the -chain was only hydrolyzed at high concentrations of the metalloprotease. The protease was active against fibrinogen in neutral and alkaline pH and was inactivated at 75°C. The metal dependence of the enzyme was confirmed through inhibition by EDTA, EGTA and 1,10 phenantroline. A partial inhibition was observed with -mercaptoetanol and PMSF, while leupeptin and aprotinin did not inhibit the fibrinogenolytic activity. The enzyme was active in the presence of Ca++ and Mg++ and it was inhibited by Mn++, Fe++, Zn++, Co++ and Ni++. In addition, low concentrations of the enzyme presented lyses in fibrin plate after 12 h of incubation. BjussuMP-I also displayed inhibitory effect on collagen- and ADP-stimulated platelet aggregation, as well as bactericidal activity against Escherichia coli and Staphylococcus aureus. It was reported that both hemorrhagic and proteolytic activities of BjussuMP-I were neutralized by the clerodane diterpenoide (Bt-CD) from Bacharis trimera. Full inhibition of hemorrhage was also observed by using aqueous extract from Pentaclethra macroloba (EPema). The enzyme was recognized by anti-neuwiedase antibodies in a reaction of partial immunologic identity. The complete cDNA sequence of BjussuMP-I with 1540 pb encoded open reading frames of 547 amino acid residues which conserved the common domains of P-III high molecular weight hemorrhagic metalloproteases: (i) pre-pro-peptide, (ii) metalloprotease, (iii) disintegrin-like and (iv) rich cysteine domain.

Orientadores: Sergio Marangoni, Luis Alberto Ponce-Soto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T18:20:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bonfim_VeraLucia_D.pdf: 7120787 bytes, checksum: 3839207f36a378b463b63406202ef7e4 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O envenenamento ofídico é um evento comum nos países pobres da área tropical e subtropical e as conseqüências deste, muito graves. Nestes países, pequena têm sido a valorização destas conseqüências, sendo pouco registradas estatisticamente como casos de saúde pública e muitas vezes tratados com procedimentos pouco efetivos ou ultrapassados. Neste trabalho foram utilizados metodologias refinadas e protocolos otimizados de purificação em HPLC com o intuito de se estudar mais detalhadamente a composição do veneno de duas serpentes de importância médica e epidemiológica, Bothrops jararacussu e Calloselasma rhodostoma, e analisar a relação estrutura função de PLA2 D49 (6-1, 6-2 e Cr-IV1) e PLA2 homólogas K49 (Bj-VII e Cr 5). A Bothrops jararacussu, é uma serpente encontrada nas Américas, desde o México até a Argentina sendo que no Brasil cerca de 90% dos acidentes ofídicos são causados pelo gênero Bothrops. A Calloselasma rhodostoma, é uma serpente amplamente distribuída no sudeste da Ásia e é a causa mais comum de acidentes ofídicos na Malásia e Tailândia. As novas toxinas foram obtidas com alto grau de pureza e homogeneidade molecular, como mostram os perfis cromatográficos, eletroforéticos e de espectrometria de massa por MALDi-TOF. A nova PLA2 D49 foi purificada do veneno de Calloselasma rhodostoma após dois passos cromatográficos: exclusão molecular em uma coluna Protein Pack SW 300 (0,78 cm x 3,30 cm), eluída com 0,25M de bicarbonato de amônio, pH 7,9, a um fluxo de 0,3 ml/min e, fase reversa em HPLC usando uma coluna µ-Bondapack C-18. Esta apresentou atividade fosfolipásica de 14,25±0,36 nmol/mg/min na presença de substrato sintético cromogênico (4-nitro-3-(octanoyloxy) benzoic acid), massa molecular de 14,029 Da determinada através de espectrometria de massa por MALDI-TOF, valor calculado de pI igual a 8.55, caráter básico e grande homologia seqüencial evidenciada pela estrutura primária quando esta é comparada com outras PLA2 D49 provenientes de veneno de serpente. A outra proteína, denominada Cr 5, uma PLA2 homóloga K49 foi isolada do veneno de Calloselasma rhodostoma em um único passo cromatográfico de fase reversa em HPLC (µ-Bondapack C-18). A massa molecular de 13,965 Da foi determinada através de espectrometria de massa por MALDI-TOF. A composição de aminoácido mostrou que a Cr 5 tem alto conteúdo de Lys, Tyr, Gly, Pro e 14 cisteínas, resíduos típicos de uma PLA2 básica. A completa seqüência de aminoácidos da Cr 5 contém 120 resíduos e mostra alta identidade quando comparada a outras PLA2 K49 isoladas de venenos de serpentes da família viperidae. Com relação à caracterização biológica, esta foi realizada também com as isoformas 6-1 e 6-2 (provenientes da fração BthTX-II de Botrhops jararacussu) e com a PLA2 K49 Bj-VII, estas purificadas e parcialmente caracterizadas em trabalho anterior. As PLA2 6-1, 6-2 e Cr-IV 1, exibiram miotoxicidade local e na dosagem de 40 µg/150 µl a 6-1 causou 83,06% de citotoxicidade em miotubos e 93,78% em mioblastos, já a 6-2 75,12 % em miotubos e 86,26% em mioblastos e a Cr-IV 1, 91,50% e 88,40% de citotoxicidade em miotubos e mioblastos, respectivamente. O efeito citotóxico também foi visto em fibroblastos mostrando na dosagem de 5 µM (linhagem 3T3) 85,63%, 86% e 91,34% de citotoxicidade na presença de 6-1, 6-2 e Cr-IV 1 respectivamente, e na linhagem COS7, 95,42%, 95,07% e 96,42% respectivamente, além de atividade inflamatória, sendo esta mais pronunciada na presença da Cr-IV 1. As PLA2s K49 homólogas, Bj-VII e Cr 5, evidenciaram miotoxicidade local e na dosagem de 40 ug/150 µl, a Bj-VII causou 87±50% de lise em mioblastos e 84±85% em miotubos e 91±25% de lise em mioblastos e 91±0.8 % em miotubos quando em contato com a Cr 5, além de atividade inflamatória evidenciada pela indução de edema. No caso destas proteínas, todos os efeitos biológicos induzidos por elas ocorreram na ausência de atividade fosfolipásica mensurável in vitro, suportando a idéia proposta pela literatura de mecanismos catalíticos e farmacológicos independentes. Apesar de todas apresentarem algumas diferenças biológicas, elas possuem um comportamento semelhante na estrutura-função, sugerindo uma ancestralidade comum embora sejam proteínas provenientes de venenos de serpentes separadas geograficamente / Abstract: Snake poisoning is a common event in poor countries of tropical and subtropical areas and the consequences of this is very serious. In these countries, there is the valorization of these consequences, due to few registers of published health cases and a lot of times treated with procedures a little effective or outdated. In this work we refined methodologies and optimized purification protocols used in HPLC with the intention to study the composition of the venom of two serpents of epidemic importance, Bothrops jararacussu and Calloselasma rhodostoma, and to analyze the relationship of structures function of PLA2 D49 (6-1, 6-2 and Cr-IV1) and homologous PLA2 K49 (Bj-VII and Cr 5). Bothrops jararacussu is a serpent found in America, from Mexico to Argentina being in Brazil, about 90% of the snake accidents caused by Bothrops genus. Calloselasma rhodostoma is a serpent thoroughly distributed at the Southwest of Asia and it is the most common cause of snake accidents in Malaysia and Thailand. The new toxins were obtained with high degree of purity and molecular homogeneity, like showed the chromatographics profiles, electrophoresis and MALDi-tof mass spectrometric (MS) analysis. A new D49 PLA2 was purified from the venom of Calloselasma rhodostoma after two chromatographic steps; molecular exclusion was loaded onto a Protein-Pack 300 SW column (0.78 cm 3 30 cm) and eluted with 0.25 M ammonium bicarbonate, pH 7.9, at a flow rate of 0.3 ml/min and reverse phase HPLC on µ-Bondapack C-18 and showed phospholipasic activity of 14.25±0.36 nmol/mg/min in the presence of a synthetic chromogenic substrate (4-nitro-3-(octanoyloxy) benzoic acid), a molecular mass of 14.029 Da was determined by MALDI-TOF mass spectrometry, calculated pI value 8.55, basic character and great sequential homology evidenced by the primary structure when this was compared with other PLA2 from D49 snake venom. The other protein, denominated Cr 5 PLA2 homologous (K49) was isolated from Calloselasma rhodostoma venom in one chromatographic step in reverse phase HPLC (RP-HPLC) (on l-Bondapack C-18). A molecular mass of 13.965 Da was determined by MALDI-TOF mass spectrometry. The amino acid composition showed that Cr 5 had a high content of Lys, Tyr, Gly, Pro, and 14 half-Cys residues, typical residues of a basic PLA2. The complete amino acid sequence of Cr 5 PLA2 contains 120 residues and this sequence shows high identity values when compared to other K49 PLA2s isolated from the venoms of viperid snakes. In relation with biological characterization, this was also done with the isoforms 6-1 and 6-2 (from fraction BthTX-II of Botrhops jararacussu) and with PLA2 K49 Bj-VII, these purified and partially characterized in The Masters. PLA2 6-1, 6-2 and Cr-IV 1 exhibited in mice local myonecrosis and edema upon intramuscular and intravenous injections, respectively. In dosage of 40 ug/150 ml, 6-1 showed 83.06% of citotoxicity in myotubes and 93.78% in myoblasts, 6-2 showed 75,12 % in myotubes and 86,26% in myoblasts, to Cr-IV 1 91.50% and 88.40% of citotoxicity in myoblasts and myotubes respectively. The citotoxic effect also in fibroblasts (cell line 3T3 and COS7) and in dosage de 5 µM (cell line 3T3) 85.63%, 85% and 91.34% of citotoxicity in the presence of 6-1, 6-2 and Cr-IV 1 respectively, and lineage COS7, 95.42%, 95.07 and 96.42% respectively, besides inflammatory activity, being this one more pronounced in the presence of the Cr-IV 1. PLA2 homologue K49, Bj-VII and Cr 5, evidenced local myotoxicity and in dosage of 40 ug/150 ml, showed 87±50 of lise in myoblasts and 84±85 in myotubes and 91±25% and 91±0.8 % when in contact with Bj-VII and Cr 5, respectivally besides of inflammatory activity evidenced by the edema induction. In the case of PLA2 K49 (Bj-VII and Cr 5), all of the biological effects induced by them happened in the absence of activity phospholipase measurable in vitro, supporting the idea proposed by the literature of catalytic and pharmacological mechanisms independent. Even though all show some kind of biologic differences all of them have a similar behave in function and structure which suggests a common ascendance of course we know they are proteins coming from different snakes geographic separated. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

As peçonhas de serpente do gênero Bothrops se caracterizam por induzir miotoxicidade, edema, coagulação e hemorragia. Por essa razão, alguns pesquisadores estão buscando por tratamentos alternativos contra os envenenamentos ofídicos com inibidores naturais e artificiais. O presente estudo tem como objetivo estudar as interações entre as PLA2s (Asp49 e Lys49) de veneno de serpente Bothrops jararacussu, denominadas BthTX-I e BthTX-II, respectivamente, e o inibidor vegetal isolado da espécie Cordia verbenacea. C. verbenacea apresenta diversas atividades farmacológicas já demonstradas, sendo utilizada também pela população como antiofídica. O extrato hidroalcoólico das folhas preparado à seco, foi submetido a técnicas cromatográficas como Sephadex LH-20 e CLAE, obtendo-se a purificação do princípio ativo antiofídico da planta, denominado ácido rosmarínico. A peçonha de B. jararacussu foi submetida à cromatografia de filtração em gel Sephadex G-75 e, à cromatografia de troca iônica. O ácido rosmarínico (AR) foi isolado do extrato metanólico de C. verbenacea e apresentou inibição da hemorragia provocada pela peçonha bruta de B. jararacussu. Em comparação, o ácido rosmarínico® também inibiu o efeito hemorrágico causado pela peçonha bruta de B. jararacussu. A atividade edematogênica provocada pelas toxinas BthTX-I e II foi avaliada e testada com os inibidores. Ambos AR e AR® não inibiram significativamente a induçào de edema. Resultados semelhantes foram obtidos com as atividades anticoagulante, e fosfolipásica. O ácido rosmarínico, AR e AR®, demonstrou alto efeito inibitório sobre a citotoxicidade e miotoxicidade induzida pela peçonha bruta e pela toxina BthTX-I. Ambos inibidores apresentou um menor efeito sobre a atividade miotóxica induzida pela toxina BthTX-II. Simulações de docking realizadas com três PLA2s e AR mostraram perfis de interações similares, reforçando as principais interações enzima-inibidor obtidas experimentalmente, relatadas na literatura. Os cálculos de derivação de farmacóforo baseados em diferentes inibidores relatados na literatura, assim como estudos de campos de interação molecular foram realizados, nos quais os resultados indicaram as principais modificações na estrutura do inibidor ácido rosmarínico necessárias para otimização. Nas simulações de screening virtual, novos potenciais inibidores de BthTX-I foram selecionados a partir de base de dados de compostos drug-like, direcionando os próximos passos aos testes biológicos, os quais serão realizados com esta fosfolipase e os novos candidatos a inibidores modelados. / Snake venoms from Bothrops genus are characterized by inducing myotoxicity, edema, thrombosis and hemorrhage. Thus, some researchers are searching for alternative treatments against ophidian poisoning with natural and artificial inhibitors. This work aimed study the interactions between PLA2s (Asp49 e Lys49) from Bothrops jararacussu snake venom, named BthTX-I and BthTX-II, respectively, and the inhibitor isolated from Cordia verbenacea plant. C. verbenacea presents several pharmacological activities already demonstrated, and it is also used by the population by its antiophidic activity. The hydroalcoholic extract prepared from the dried leaves, was submitted to chromatographic techniques as Sephadex LH-20 and HPLC, resulting in the purification of the antiophidian compound active from the plant, named rosmarinic acid. B. jararacussu snake venom was submitted to gel filtration chromatography on Sephadex G-75 and ion exchange chromatography. Rosmarinic acid (RA) was isolated from the C. verbenacea methanolic extract and it presented hemorrhage inhibition caused by crude venom from B. jararacussu. In comparison with this, Rosmaric acid® also inhibited the hemorrhagic effect caused by crude venom from B. jararacussu. Edematogenic activity caused by BthTX-I and II was evaluated and tested with the inhibitors. Both, RA e RA® did not inhibit the edema indution significantly. Similar results were obtained with the anticoagulant and phospholipasic activity. The rosmarinic acid, RA e RA®, presented high inhibitory effect for myotoxicity and cytotoxicity induced by crude venom and the toxin BthTX-I. Both inhibitors presented minor effect on myotoxicity activity induced by BthTX-II toxin. Docking simulations performed with three PLA2 and RA have shown similar interactions profiles, corroborating the main enzyme-inhibitor interactions experimentally obtained, reported in literature. Pharmacophore perception calculations based on different inhibitors reported in literature as well as molecular interaction fields studies were here carried out, whose results indicate the main changes in the structure of the rosmarinic acid inhibitor necessary to optimization. In the virtual screening simulations, novel potential BthTX-I inhibitors were selected from drug-like compounds databases, thus guiding next steps towards biological tests, which will must be performed with this phospholipase and the new inhibitor candidates modeled.

As peçonhas de serpentes são uma mistura complexa de enzimas e proteínas tóxicas. No Brasil, as serpentes dos gêneros Bothrops são responsáveis pela maioria dos acidentes ofídicos, os quais provocam dano tecidual local (como hemorragia, necrose e edema) e efeitos sistêmicos (como alterações na coagulação sanguínea). Envenenamentos por picadas de serpente são frequentemente tratados com a administração parenteral de soro antiofídico, visando a neutralização de toxinas. No entanto, apesar do sucesso da soroterapia, é importante a busca de inibidores capazes de neutralizar o dano tecidual local. Os extratos de plantas constituem uma fonte extremamente rica de compostos farmacologicamente ativos, e muitos extratos possuem atividade antiofídica. Neste estudo, o extrato metanólico das folhas de Serjania erecta, planta medicinal com propriedade anti-inflamatória foi submetido ao fracionamento cromatográfico, obtendo-se quatro frações principais que foram avaliadas por testes fitoquímicos, revelando a presença de saponinas, terpenos, flavonóides (SF3) e taninos (SF4). O isolamento e a caracterização de duas flavonas glicosiladas da fração rica em flavonóides (isovitexina e vitexina) também foram alcançados. Além disso, foi realizado o estabelecimento de culturas in vitro de S. erecta para assegurar, em um futuro próximo, a produção constante de metabólitos secundários, bem como a conservação desta espécie vegetal. Nos testes de inibição de atividade de peçonha de serpentes, a atividade fosfolipásica induzida pelas peçonhas de B. jararacussu e C. d. terrificus, e toxinas isoladas (BthTX-II e crotoxina) foi inibida pelas amostras testadas, sendo que as frações SF3 e SF4 inibiram completamente a ação da toxina BthTX-II, enquanto que a crotoxina foi inibida com sucesso pela ação da fração SF4. O extrato metanólico de S. erecta e a fração SF3 foram capazes de prevenir a ação fibrinogenolítica da peçonha de B. moojeni. Já os extratos metanólicos in natura e dos calos, as frações SF3 e SF4, e as flavonas promoveram proteção parcial das cadeias do fibrinogênio quando incubados juntos com a peçonha de B. jararacussu. Nos ensaios sobre atividade coagulante, a vitexina e as frações SF3 e SF4 atuaram como potentes inibidores desta atividade induzida pela peçonha de B. jararacussu. O mesmo foi observado no ensaio sobre a inibição do edema induzido por BthTX-I. A atividade hemorrágica das peçonhas de B. jararacussu e B. neuwiedi foi inibida pela ação do extrato metanólico das folhas de S. erecta e de suas frações. Sendo assim, as frações SF3 e SF4, ricas em flavonóides e taninos, respectivamente, apresentam compostos capazes de inibir a ação de toxinas presentes nas peçonhas. Os estudos sobre modelagem molecular feito entre a miotoxina BthTX-I e os compostos isolados demonstraram que o complexo toxinainibidor é estabilizado por pontes de hidrogênio com as cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos da região do sítio catalítico da toxina. Além disso, os espectros de ii dicroísmo circular não revelaram mudanças significativas nas estruturas secundárias das miotoxinas BthTX-I e II quando quando na presença das flavonas (vitexina e isovitexina). Entre as flavonas tanto a vitexina como a isovitexina mostraram resultados semelhantes em quase todas as atividades testadas, porém na atividade anticoagulante induzida pela peçonha de B. jararacussu, a vitexina impediu a coagulação do plasma testado, sugerindo que a posição do açúcar pode ter influenciado a inibição da atividade. Estes resultados sugerem que parte da ação antiofídica do extrato metanólico de S. erecta ocorre devido a ação dos compostos isolados em conjunto com outras classes de compostos presentes nesta planta medicinal. / Snake venoms are a complex mixture of enzymes and toxic proteins. In Brazil, Bothrops snakes are responsible for most accidents with venomous animals, which cause local tissue damage (hemorrhage, edema and necrosis) and systemic effects (blood clotting disorders). Snakebites are often treated with parenteral administration of antivenom, aimed at the neutralization of toxins. However, despite the success of serum therapy, it is important to search for inhibitors that can neutralize the local tissue damage. Plant extracts constitute a rich source of pharmacologically active compounds, and many extracts present antiophidian activity. In this study, the methanolic extract of leaves of Serjania erecta, a medicinal plant with antiinflammatory properties, was subjected to chromatographic fractionation, resulting in four main fractions that were evaluated by phytochemical tests, revealing the presence of saponins, terpenes, flavonoids (SF3) and tannins (SF4). The isolation and characterization of two flavone glycosides of the flavonoid-rich fraction (isovitexin and vitexin) were also achieved. Moreover, the in vitro cultures of Serjania erecta also established to allow, in the near future, the continuous production of secondary metabolites, as well as the conservation of this plant species. The aim of this study was to evaluate the effect of methanolic extract of aerial parts of S. erecta and its fractions, isolated compounds and methanolic extract of callus against the enzymatic and pharmacological effects induced by snake venoms and isolated toxins. The phospholipase A2 activity induced by snake venoms of B. jararacussu and C. d. terrificus, and isolated toxins (BthTX-II and crotoxin) was inhibited by the samples tested, and the fractions SF3 and SF4 completely inhibited the toxin BthTX-II, whereas crotoxin was inhibited successfully by the action of fraction SF4. The methanolic extract of S. erecta and fraction SF3 were able to prevent the fibrinogenolytic action of B. moojeni venom. The methanolic extracts of callus and aerial parts of S. erecta, fractions SF3 and SF4, and flavones promoted partial protection of fibrinogen chains when incubated together with the B. jararacussu venom. Vitexin, SF3 and SF4 were potent inhibitors of the coagulant activity induced by B. jararacussu venom. BthTX-I edema-inducing activity was inhibited by vitexin, SF3 and SF4. The hemorrhagic activity of B. jararacussu and B. neuwiedi venoms were inhibited by the action of methanolic extract of aerial parts of S. erecta and its fractions. This extract is a promising source of natural inhibitors, as flavonoids and tannins, which act forming complexes with metal ions and proteins, inhibiting the action of serine proteases, metalloproteases and phospholipases A2. The molecular modeling studies done between myotoxin BthTX-I and the compounds showed that the toxin-inhibitor complex is stabilized by hydrogen bonds with the side chains of amino acid residues in the region of the catalytic site of toxin. Moreover, the circular dichroism spectra revealed no significant changes in the secondary structures of iv BthTX-I and II in the presence of flavones (vitexin and isovitexin). Vitexin and isovitexin showed similar results in almost all tested activities, but in the anticoagulant activity induced by B. jararacussu snake venom the vitexin prevented plasma coagulation, suggesting that the position of the sugar may have influenced the inhibition of this activity. These results suggest that part of the action antiophidic the methanol extracts of S. erecta occurs due the action of the compounds isolated in conjunction with other compounds present in this medicinal plant.

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-13T17:28:10Z No. of bitstreams: 1 carlos-correa-netto.pdf: 1990428 bytes, checksum: 3a150480f1f6590c44a4c85210b6ccbb (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-13T17:28:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 carlos-correa-netto.pdf: 1990428 bytes, checksum: 3a150480f1f6590c44a4c85210b6ccbb (MD5) Previous issue date: 2007 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Os animais peçonhentos são aqueles capazes de produzir e inocular veneno (peçonha) em suas vítimas. No Brasil, foram catalogadas, até o momento, 326 espécies de serpentes, dentre as quais cerca de 50 são peçonhentas e de grande interesse para a Saúde Publica. A Bothrops jararacussu é a espécie brasileira que possui a capacidade de produzir e inocular a maior quantidade de veneno. Nos acidentes ofídicos causados por estaespécie, a ação do veneno não é totalmente neutralizada pelo soro específico, o antibotrópico, sendo importante nestes casos a adoção de uma conduta terapêutica diferenciada através da administração do soro poliespecífico, o antibotrópico-crotálico. No entanto, considerando-se apenas os sintomas clínicos do paciente, o médico não tem como discriminar se o acidente foi provocado por B. jararacussuou por outra espécie do gênero. Vale ainda ressaltar que para as demais espécies do gênero Bothrops, o soro antibotrópico é o mais indicado, fato que impossibilita o médico de adotarcomo estratégia geral, a utilização do soro antibotrópico-crotálico como umaterapêutica única no acidente botrópico. Esta tese teve como objetivo a caracterização, através de técnicas de imunoquímica, do veneno de B. jararacussu e a identificação de possíveis biomarcadores para este veneno. Para a triagem dos biomarcadores foram produzidos soros espécie-específicos para os venenos de B. jararacussu (soro anti-jararacussu) e para B. jararaca(soro anti-jararaca). Nas análises por “imunoblotting” a partir do fracionamento por 2D-PAGE foi visto um bom reconhecimento por ambos os soros, principalmente das frações de alto peso do veneno de B. jararacussu, mostrando que estas frações são as mais imunogênicas neste veneno. A partir destes dados, foram identificadas no mapa bidimensional, as principais proteínas de baixa imunogenicidade deste veneno. Uma proteína de 60kDa e pI ácido foi identificada como uma serino proteinase. Esta identificação foi obtida a partir da homologia com uma protease com domínio tripsina, denominada BOTIN, presente no banco de dados de ESTs de B. insularis. Esta proteína de pI ácido (denominada Bjssu-pI2,2) foi, pela primeira vez, descrita nesta espécie. Na região básica, foram identificadas duas outras proteínas, as quais demonstraram um baixo reconhecimento tanto pelo soro homólogo (soro anti-jararacussu) como pelo heterólogo (soro anti-jararaca). A proteína de 29kDa foi identificada como uma serino proteinase da família S1 e a de 16kDa foi identificada como Botropstoxina-I (BthTX-I), a principal miotoxina doveneno de B. jararacussu. Desta forma, a abordagem desta tese através de técnicas como eletroforese bidimensional somado a técnicas sensíveis como "imunoblotting” e espectrometria de massas, se mostrou muito interessante para o estudo imunoquímico das frações do veneno de B. jararacussu. As diferenças no reconhecimento dos soros espécie-específicos frenteao veneno de B. jararacussupermitiram a identificação de três proteínas com potencial para serem utilizadas como ferramenta para o desenvolvimento de diagnóstico diferencial para esta espécie. Além disso, os resultados deste trabalho reforçam a questão da ineficiência do soro antibotrópico para a neutralização do veneno no acidente causado por esta espécie, podendo se relacionar a importância da fração crotálica para a neutralização de toxinas pouco imunogênicas do veneno de B.jararacussu, como é o caso da BthTX-I. / Poisonous animals are characterized by the ability to produce and inject venom (poison) in their victims. Until nowadays there are326 different species of snakes catalogued in Brazil and, among them 50 species are venomous and important regarding public health. The Bothrops jararacussuis the Brazilian specie that has the ability to produce and inoculates higher amounts of venom. In the reported cases concerning this specie, the action of this venom can not be efficiently neutralized with specific antivenin,the antibotropic serum. In such cases, the attendant must adopt a differentiated therapeutic conduct that consists in the administration of the antibotropic – crotalic serum. However, in considering just the clinical symptoms of the patient, the doctor is not able to distinguish if the accident was caused by B. jararacussuor another specimen from Bothrops genus. It is important to emphasize the fact that for other specimens from Bothrops genus, the antibotropic serum is the most indicated treatment and for this reason, it is inadequate forthe doctor adopt antibotropic – crotalic serum as a single therapeutic strategy. Inthis study we aimed to characterize specific biomarkers present in the venom of B. jararacussutrough the use 2D-PAGE combined with immunoblotting. To achieve this goal, we produced sera anti-jararacussu and anti-jararaca and cross-reacted this sera against their specific venom as well against each other. 2D-gel analyses reveled that the high–molecular–weight fractions ofboth venoms were well recognized by each specific anti-sera as well as bythe non-specific one. This suggests that the proteins present in the high–molecular–weight fraction of each venom are the most immunogenic. Also, the 2D PAGE allowed us to identify the less immunogenic proteins in these venoms. Among them is a 60 kDa acid protein identified as a serine protease due to its high homology with a protease called BOTIN that possess a trypsin domain present in ESTs data bank from B. insularis. This acidic protein characterized in this work was called Bjssu-pI2,2 and was for the first time described in this specie. The other proteins displaying low immunogenic properties were a 29 kDa protein identified as a serine protease from S1-family and a 16 kDa protein identified as a Bothropstoxin-I (BthTX-I),the major myotoxin from B. jararacussuvenom. Thus, the approach used in this thesis, based on bidimensional electrophoresis in combination with sensitive techniques such as immunoblotting and mass spectrometry, showed to be interesting for the immunochemistry study of the B. jararacussuvenom proteins. The three proteins here identified in thevenom of B. jararacussu present a potential use as biomarkers. Moreover, this study also shed light into the reasons why the anti-bothropic serum is so ineffective against the B.jararacussuvenom reinforcing the role of the anti-crotalic serum in neutralizing low immunogenic proteins from the B. jararacussuvenom, such as the BthTX-I.

As peçonhas de serpentes são uma mistura complexa de enzimas e proteínas tóxicas. No Brasil, as serpentes dos gêneros Bothrops são responsáveis pela maioria dos acidentes ofídicos, os quais provocam dano tecidual local (como hemorragia, necrose e edema) e efeitos sistêmicos (como alterações na coagulação sanguínea). Envenenamentos por picadas de serpente são frequentemente tratados com a administração parenteral de soro antiofídico, visando a neutralização de toxinas. No entanto, apesar do sucesso da soroterapia, é importante a busca de inibidores capazes de neutralizar o dano tecidual local. Os extratos de plantas constituem uma fonte extremamente rica de compostos farmacologicamente ativos, e muitos extratos possuem atividade antiofídica. Neste estudo, o extrato metanólico das folhas de Serjania erecta, planta medicinal com propriedade anti-inflamatória foi submetido ao fracionamento cromatográfico, obtendo-se quatro frações principais que foram avaliadas por testes fitoquímicos, revelando a presença de saponinas, terpenos, flavonóides (SF3) e taninos (SF4). O isolamento e a caracterização de duas flavonas glicosiladas da fração rica em flavonóides (isovitexina e vitexina) também foram alcançados. Além disso, foi realizado o estabelecimento de culturas in vitro de S. erecta para assegurar, em um futuro próximo, a produção constante de metabólitos secundários, bem como a conservação desta espécie vegetal. Nos testes de inibição de atividade de peçonha de serpentes, a atividade fosfolipásica induzida pelas peçonhas de B. jararacussu e C. d. terrificus, e toxinas isoladas (BthTX-II e crotoxina) foi inibida pelas amostras testadas, sendo que as frações SF3 e SF4 inibiram completamente a ação da toxina BthTX-II, enquanto que a crotoxina foi inibida com sucesso pela ação da fração SF4. O extrato metanólico de S. erecta e a fração SF3 foram capazes de prevenir a ação fibrinogenolítica da peçonha de B. moojeni. Já os extratos metanólicos in natura e dos calos, as frações SF3 e SF4, e as flavonas promoveram proteção parcial das cadeias do fibrinogênio quando incubados juntos com a peçonha de B. jararacussu. Nos ensaios sobre atividade coagulante, a vitexina e as frações SF3 e SF4 atuaram como potentes inibidores desta atividade induzida pela peçonha de B. jararacussu. O mesmo foi observado no ensaio sobre a inibição do edema induzido por BthTX-I. A atividade hemorrágica das peçonhas de B. jararacussu e B. neuwiedi foi inibida pela ação do extrato metanólico das folhas de S. erecta e de suas frações. Sendo assim, as frações SF3 e SF4, ricas em flavonóides e taninos, respectivamente, apresentam compostos capazes de inibir a ação de toxinas presentes nas peçonhas. Os estudos sobre modelagem molecular feito entre a miotoxina BthTX-I e os compostos isolados demonstraram que o complexo toxinainibidor é estabilizado por pontes de hidrogênio com as cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos da região do sítio catalítico da toxina. Além disso, os espectros de ii dicroísmo circular não revelaram mudanças significativas nas estruturas secundárias das miotoxinas BthTX-I e II quando quando na presença das flavonas (vitexina e isovitexina). Entre as flavonas tanto a vitexina como a isovitexina mostraram resultados semelhantes em quase todas as atividades testadas, porém na atividade anticoagulante induzida pela peçonha de B. jararacussu, a vitexina impediu a coagulação do plasma testado, sugerindo que a posição do açúcar pode ter influenciado a inibição da atividade. Estes resultados sugerem que parte da ação antiofídica do extrato metanólico de S. erecta ocorre devido a ação dos compostos isolados em conjunto com outras classes de compostos presentes nesta planta medicinal. / Snake venoms are a complex mixture of enzymes and toxic proteins. In Brazil, Bothrops snakes are responsible for most accidents with venomous animals, which cause local tissue damage (hemorrhage, edema and necrosis) and systemic effects (blood clotting disorders). Snakebites are often treated with parenteral administration of antivenom, aimed at the neutralization of toxins. However, despite the success of serum therapy, it is important to search for inhibitors that can neutralize the local tissue damage. Plant extracts constitute a rich source of pharmacologically active compounds, and many extracts present antiophidian activity. In this study, the methanolic extract of leaves of Serjania erecta, a medicinal plant with antiinflammatory properties, was subjected to chromatographic fractionation, resulting in four main fractions that were evaluated by phytochemical tests, revealing the presence of saponins, terpenes, flavonoids (SF3) and tannins (SF4). The isolation and characterization of two flavone glycosides of the flavonoid-rich fraction (isovitexin and vitexin) were also achieved. Moreover, the in vitro cultures of Serjania erecta also established to allow, in the near future, the continuous production of secondary metabolites, as well as the conservation of this plant species. The aim of this study was to evaluate the effect of methanolic extract of aerial parts of S. erecta and its fractions, isolated compounds and methanolic extract of callus against the enzymatic and pharmacological effects induced by snake venoms and isolated toxins. The phospholipase A2 activity induced by snake venoms of B. jararacussu and C. d. terrificus, and isolated toxins (BthTX-II and crotoxin) was inhibited by the samples tested, and the fractions SF3 and SF4 completely inhibited the toxin BthTX-II, whereas crotoxin was inhibited successfully by the action of fraction SF4. The methanolic extract of S. erecta and fraction SF3 were able to prevent the fibrinogenolytic action of B. moojeni venom. The methanolic extracts of callus and aerial parts of S. erecta, fractions SF3 and SF4, and flavones promoted partial protection of fibrinogen chains when incubated together with the B. jararacussu venom. Vitexin, SF3 and SF4 were potent inhibitors of the coagulant activity induced by B. jararacussu venom. BthTX-I edema-inducing activity was inhibited by vitexin, SF3 and SF4. The hemorrhagic activity of B. jararacussu and B. neuwiedi venoms were inhibited by the action of methanolic extract of aerial parts of S. erecta and its fractions. This extract is a promising source of natural inhibitors, as flavonoids and tannins, which act forming complexes with metal ions and proteins, inhibiting the action of serine proteases, metalloproteases and phospholipases A2. The molecular modeling studies done between myotoxin BthTX-I and the compounds showed that the toxin-inhibitor complex is stabilized by hydrogen bonds with the side chains of amino acid residues in the region of the catalytic site of toxin. Moreover, the circular dichroism spectra revealed no significant changes in the secondary structures of iv BthTX-I and II in the presence of flavones (vitexin and isovitexin). Vitexin and isovitexin showed similar results in almost all tested activities, but in the anticoagulant activity induced by B. jararacussu snake venom the vitexin prevented plasma coagulation, suggesting that the position of the sugar may have influenced the inhibition of this activity. These results suggest that part of the action antiophidic the methanol extracts of S. erecta occurs due the action of the compounds isolated in conjunction with other compounds present in this medicinal plant.

As peçonhas de serpente do gênero Bothrops se caracterizam por induzir miotoxicidade, edema, coagulação e hemorragia. Por essa razão, alguns pesquisadores estão buscando por tratamentos alternativos contra os envenenamentos ofídicos com inibidores naturais e artificiais. O presente estudo tem como objetivo estudar as interações entre as PLA2s (Asp49 e Lys49) de veneno de serpente Bothrops jararacussu, denominadas BthTX-I e BthTX-II, respectivamente, e o inibidor vegetal isolado da espécie Cordia verbenacea. C. verbenacea apresenta diversas atividades farmacológicas já demonstradas, sendo utilizada também pela população como antiofídica. O extrato hidroalcoólico das folhas preparado à seco, foi submetido a técnicas cromatográficas como Sephadex LH-20 e CLAE, obtendo-se a purificação do princípio ativo antiofídico da planta, denominado ácido rosmarínico. A peçonha de B. jararacussu foi submetida à cromatografia de filtração em gel Sephadex G-75 e, à cromatografia de troca iônica. O ácido rosmarínico (AR) foi isolado do extrato metanólico de C. verbenacea e apresentou inibição da hemorragia provocada pela peçonha bruta de B. jararacussu. Em comparação, o ácido rosmarínico® também inibiu o efeito hemorrágico causado pela peçonha bruta de B. jararacussu. A atividade edematogênica provocada pelas toxinas BthTX-I e II foi avaliada e testada com os inibidores. Ambos AR e AR® não inibiram significativamente a induçào de edema. Resultados semelhantes foram obtidos com as atividades anticoagulante, e fosfolipásica. O ácido rosmarínico, AR e AR®, demonstrou alto efeito inibitório sobre a citotoxicidade e miotoxicidade induzida pela peçonha bruta e pela toxina BthTX-I. Ambos inibidores apresentou um menor efeito sobre a atividade miotóxica induzida pela toxina BthTX-II. Simulações de docking realizadas com três PLA2s e AR mostraram perfis de interações similares, reforçando as principais interações enzima-inibidor obtidas experimentalmente, relatadas na literatura. Os cálculos de derivação de farmacóforo baseados em diferentes inibidores relatados na literatura, assim como estudos de campos de interação molecular foram realizados, nos quais os resultados indicaram as principais modificações na estrutura do inibidor ácido rosmarínico necessárias para otimização. Nas simulações de screening virtual, novos potenciais inibidores de BthTX-I foram selecionados a partir de base de dados de compostos drug-like, direcionando os próximos passos aos testes biológicos, os quais serão realizados com esta fosfolipase e os novos candidatos a inibidores modelados. / Snake venoms from Bothrops genus are characterized by inducing myotoxicity, edema, thrombosis and hemorrhage. Thus, some researchers are searching for alternative treatments against ophidian poisoning with natural and artificial inhibitors. This work aimed study the interactions between PLA2s (Asp49 e Lys49) from Bothrops jararacussu snake venom, named BthTX-I and BthTX-II, respectively, and the inhibitor isolated from Cordia verbenacea plant. C. verbenacea presents several pharmacological activities already demonstrated, and it is also used by the population by its antiophidic activity. The hydroalcoholic extract prepared from the dried leaves, was submitted to chromatographic techniques as Sephadex LH-20 and HPLC, resulting in the purification of the antiophidian compound active from the plant, named rosmarinic acid. B. jararacussu snake venom was submitted to gel filtration chromatography on Sephadex G-75 and ion exchange chromatography. Rosmarinic acid (RA) was isolated from the C. verbenacea methanolic extract and it presented hemorrhage inhibition caused by crude venom from B. jararacussu. In comparison with this, Rosmaric acid® also inhibited the hemorrhagic effect caused by crude venom from B. jararacussu. Edematogenic activity caused by BthTX-I and II was evaluated and tested with the inhibitors. Both, RA e RA® did not inhibit the edema indution significantly. Similar results were obtained with the anticoagulant and phospholipasic activity. The rosmarinic acid, RA e RA®, presented high inhibitory effect for myotoxicity and cytotoxicity induced by crude venom and the toxin BthTX-I. Both inhibitors presented minor effect on myotoxicity activity induced by BthTX-II toxin. Docking simulations performed with three PLA2 and RA have shown similar interactions profiles, corroborating the main enzyme-inhibitor interactions experimentally obtained, reported in literature. Pharmacophore perception calculations based on different inhibitors reported in literature as well as molecular interaction fields studies were here carried out, whose results indicate the main changes in the structure of the rosmarinic acid inhibitor necessary to optimization. In the virtual screening simulations, novel potential BthTX-I inhibitors were selected from drug-like compounds databases, thus guiding next steps towards biological tests, which will must be performed with this phospholipase and the new inhibitor candidates modeled.

Serpentes do gênero Bothrops são responsáveis por 90% dos acidentes ofídicos no Brasil. Seus venenos provocam efeitos locais em humanos e animais, como hemorragia, edema, dor e necrose, caracterizando uma resposta inflamatória, cujo mecanismo não está bem definido. Esses efeitos estão relacionados com a ação combinada de proteases, substâncias que induzem hemorragia e fosfolipases, bem como a liberação de mediadores endógenos gerados pelos venenos. Considerando que a ativação do sistema complemento (SC) e de funções celulares, como quimiotaxia, ativação, proliferação e citotoxicidade podem desempenhar papel importante nos processos inflamatórios e de lesão tecidual subsequentes ao envenenamento, o estudo propõe: a) investigar a capacidade dos venenos brutos de serpentes Bothrops jararacussu e Bothrops pirajai e das toxinas purificadas, serinoprotease de B. jararacussu (SPBj) e L-aminoácido oxidase de B. pirajai (LAAOBp), em modular a atividade do SC; b) avaliar a contribuição do efeito sobre o SC no recrutamento de leucócitos polimorfonucleares humanos (PMN); c) avaliar o potencial citotóxico direto dos venenos e toxinas sobre células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC); d) analisar o efeito dos venenos sobre a modulação da expressão dos marcadores de ativação CD69, CD25 e HLA-DR em células T, B e natural killer (NK). Os resultados do ensaio de citotoxicidade mostraram que o veneno bruto de B. jararacussu foi citotóxico para PBMC apenas nas concentrações maiores, de 50 e 100g/mL, não apresentando citotoxicidade nas outras concentrações testadas. A serinoprotease apresentou baixa citotoxicidade para essas células, o que sugere a necessidade de maiores investigações quanto aos mecanismos que levam a essa morte celular. O aumento da viabilidade celular encontrado nas amostras incubadas com veneno bruto e LAAO de B. pirajai sugere possível indução de proliferação celular, que necessita de maiores estudos. Os resultados obtidos sugerem que os venenos brutos de B. jararacussu e B. pirajai são capazes de ativar o SC como observado nos ensaios cinéticos da VCVL e VA e de quimiotaxia de neutrófilos, onde ficou evidenciado que a migração celular foi devida a liberação dos fatores quimiotáticos do SC, C3a e C5a. e que suas respectivas toxinas, serinoprotease e LAAO apresentam efeitos moduladores sobre o SC humano, e estimulam investigações mais aprofundadas com a finalidade de se esclarecer os mecanismos de ação e identificar os componentes responsáveis pelos efeitos observados. Houve expressão aumentada de CD69, CD25 e HLA-DR nas células T CD4+ e CD8+, especialmente quando incubadas com veneno bruto de B. jararacussu e LAAO de B. pirajai, o que reflete ativação da resposta imune celular, e pode sugerir que este tipo de resposta desempenhe papel relevante na indução e/ou controle dos processos imunopatológicos decorrentes de envenenamentos por B. jararacussu e B. pirajai. Esta investigação visa fornecer subsídios para a possível utilização das toxinas para fins terapêuticos e como ferramentas para investigação dos mecanismos envolvidos nos processos fisiopatológicos que ocorrem em decorrência de picadas e também em outras doenças de caráter inflamatório. / Snakes of the genus Bothrops are responsible for 90% of snakebites in Brazil. Their venoms cause local effects in humans and animals, such as hemorrhage, edema, pain and necrosis, characteristic of an inflammatory response. The mechanism is not well defined. These effects are related to the combined action of proteases, substances that induce bleeding and phospholipases, as well as release of endogenous mediators generated by the venoms. Considering that activation of the complement system (CS) and cellular functions such as chemotaxis, activation, proliferation and cytotoxicity, may play a role in inflammatory processes and tissue injury following envenomation, the study proposes: a) to investigate the ability of crude venom of B. jararacussu and B. pirajai and the purified toxins, serineprotease of B. jararacussu and L-amino acid oxidase (LAAO) of B pirajai in modulating the activity of the CS, b) to assess the contribution of the effect on CS in the recruitment of human polymorphonuclear leukocytes (PMN), c) to assess the direct cytotoxic potential of venoms and toxins on human peripheral blood mononuclear cells (PBMC), d) to analyse the effect of venoms on the modulation of the expression of activation markers CD69, CD25 and HLA-DR on T, B and natural killer (NK) cells. The results of cytotoxicity assay showed that the crude venom of B. jararacussu was cytotoxic to PBMC only at higher concentrations, 50 and 100g/mL, showing no cytotoxicity in the other concentrations. The serineprotease showed low cytotoxicity to the cells, suggesting the need for further investigations about the mechanisms that lead to this cell death. The increase in cell viability found in samples incubated with crude venom of B. pirajai and LAAO suggests the possibility of induction of cell proliferation, which needs further study. The results suggest that the crude venom of B. jararacussu and B. pirajai are capable of activating the CS as observed in kinetic assays of classical pathwaylectin pathway and alternative pathway and neutrophil chemotaxis assay, where it was shown that cell migration was due to release of CS chemotactic factors, C3a and C5a, and that their respective toxins, serineprotease and LAAO have modulatory effects on human CS, and stimulate further research in order to clarify the mechanisms of action and identify the components responsible for the observed effects. There was increased expression of CD69, CD25 and HLA-DR on CD4+ and CD8+, especially when incubated with crude venom of B. jararacussu and LAAO of B. pirajai. It reflects activation of cellular immune response and may suggest that this type of response play an important role in the induction and/or control of immunopathological processes arising from envenomation by B. jararacussu and B. pirajai. This research aims to provide subsidies to the possible use of the toxin for therapeutic purposes and as tools for investigating mechanisms involved in pathophysiological processes that occur as a result of snakebites and also in other diseases of inflammatory nature.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:55:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JOSE VITELIO RUIZ RIVERO.pdf: 2033176 bytes, checksum: d4ea9284ff8bc2e6c776e40cb6b237fd (MD5) Previous issue date: 2010-12-20 / Snake venoms are biological resources of great pharmaceutical value. Besides presenting a small number of antiviral drugs, a large amount of pathogens develop mechanisms which escape from the action of the drugs, thus causing the growth of resistance. It was demonstrated that biomolecules contained in venoms have high therapeutic values which could be used as antimicrobial agents. The objective of this research is to evaluate the non cytotoxic activity which was isolated from the venom of Bothrops jararacussu in peripheral blood mononuclear cells. In this research, mononuclear cells were separated from healthy donors. After the activation of the cells with phytohemagglutinin and interleukin-2, different concentrations of the poison were added in order to evaluate its non cytotoxic activity. The concentration of the venom at 0.05 mg/mL showed no cytotoxicity, but at 5 and 0.5 mg/mL it was cytotoxic. Our study opens the way to further researches which aim to identify the antimicrobial activities of crude venoms and their fractions. / Os venenos ofídicos são recursos biológicos de importante valor farmacológico. Além do número pequeno de drogas antivirais, numerosos patógenos desenvolvem mecanismos de escape à ação das drogas, resultando no crescimento das taxas de resistência. Foi demonstrado que biomoléculas contidas nos venenos ofídicos apresentam alto valor terapêutico, que poderiam ser usadas como agentes antimicrobianos. O objetivo desta pesquisa é avaliar a atividade não citotóxica do veneno bruto isolado da Bothrops jararacussu em células mononucleares do sangue periférico. Nessa pesquisa foram separadas células mononucleares de doadores sadios. Após ativação das células com fitohemaglutinina e interleucina-2 foram adicionadas diferentes concentrações do veneno para avaliar sua atividade não citotóxica. O veneno na concentração de 0,05 μg/mL não apresentou citotoxicidade, entretanto foi citotóxico nas concentrações de 5 e 0,5 μg/mL. Nosso estudo abre caminho para novas pesquisas voltadas para a identificação das atividades antimicrobianas dos venenos brutos e suas frações.

Made available in DSpace on 2015-04-01T14:16:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2600688 bytes, checksum: 925d18dd7ebd669f58ba726884baa97c (MD5) Previous issue date: 2013-02-14 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Brazil is the country with the highest rate of reported snakebites. The venomous snakes that occur in the country belong to the Viperidae and Elapidae families. Snakebites cause the release of pharmacologically active substances with local effects such as hemorrhage, oedema, necrosis, myotoxicity, cardiotoxicity, neurotoxicity and cytotoxicity, as well as systemic effects such as blood coagulation, spontaneous bleeding, renal and respiratory failure. Snake venoms are rich sources of proteins, peptides, organic and inorganic compounds. The phospholipase A2 (PLA2s) are the most abundant proteins in the snake venom of different genera and exhibit toxic and pharmacology effects of strong medical and scientific interest. The aim of this study was to characterize physic-chemically B-linear epitopes of three phospholipases A2 (BhtTX-I, BthTX-II and BthA-I) isolated from Bothrops jararacussu snake venom recognized by the therapeutic horse anti-ophidic sera; in silico comparative analysis of the B-linear epitopes recognized by the sera that are present and / or absent in other PLA2s isolated from snake venoms; and describe molecules isolated from plant extracts that are able to inhibit the toxic and pharmacological effects of PLA2s. Parallel spot synthesis peptides experiments on cellulose membranes allowed identifying, by chemiluminescence, twelve PLA2s regions recognized by anti-ophidic sera (anti-bothropic and/or anti-crotalic). Comparative analyzes between PLA2s enabled to identify that some regions recognized by anti-ophidic sera are responsible for neurotoxic, anticoagulant and myotoxic activities performed by snakes. Therefore, this work enables interaction regions elucidate molecular serum-protein as well as assist in proposing new inhibitors. / O Brasil é o país com maior índice de acidentes ofídicos registrados. As serpentes peçonhentas que ocorrem no país pertencem às famílias Viperidae e Elapidae. Acidentes ofídicos causam a liberação de substâncias farmacologicamente ativas com efeitos locais como hemorragia, edema, necrose tecidual, miotoxicidade, cardiotoxicidade, neurotoxicidade e citotoxicidade, além de efeitos sistêmicos como coagulação sanguínea, sangramentos espontâneos, insuficiência renal e respiratória. Peçonha de serpentes são fontes ricas de proteínas, peptídeos, compostos orgânicos e inorgânicos. As fosfolipases A2 (PLA2s) são as proteínas mais abundantes nas peçonhas dos diferentes gêneros de serpentes e apresentam efeitos tóxicos e farmacológicos de grande interesse médico-científico. O presente estudo teve por objetivos caracterizar físico-quimicamente epitopos B-lineares de três PLA2s isoladas da peçonha de Bothrops jararacussu reconhecidos pelos soros antiofídicos; analisar comparativamente, in silico, os epitopos B-lineares reconhecidos pelos soros que estão presentes e/ou ausentes em demais PLA2s isoladas de peçonhas de serpentes; relatar moléculas isoladas de extratos vegetais que possibilitem inibir os efeitos tóxicos e farmacológicos das PLA2s. Experimentos de síntese paralela de peptídeos realizadas em membranas de celulose permitiram identificar, por quimiluminescência, doze regiões das PLA2s (BthTX-I, BthTX-II e BthA-I) presentes na peçonha de Bothrops jararacussu reconhecidas por soros antiofídicos (antibotrópico e/ou anticrotálico). Análises comparativas entre PLA2s possibilitaram identificar que algumas regiões específicas que foram reconhecidas pelos soros antiofídicos são responsáveis pelas atividades neurotóxica, miotóxica e anticoagulante desencadeadas pelo ofidismo. Portanto, o presente trabalho possibilita elucidar regiões de interação molecular soro-proteína bem como auxiliar na proposição de novos inibidores.