Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A Bothrops leucurus (jararaca do rabo branco) à uma serpente peÃonhenta que habita a regiÃo Nordeste do Brasil. Os efeitos biolÃgicos devido ao envenenamento por B. leucurus tÃm perfil semelhante Ãqueles apresentados por outras serpentes do gÃnero Bothrops, tais como, importantes efeitos locais e sistÃmicos graves como a InsuficiÃncia Renal Aguda (IRA). O veneno de Bothrops leucurus induziu nefrotoxicidade em sistema de perfusÃo de rim isolado de rato, associado com citotoxicidade em cÃlulas tubulares epiteliais renais. Neste trabalho foi avaliado o efeito nefrotÃxico direto da enzima L-aminoÃcido oxidase isolada do veneno de Bothrops leucurus (LAAO-Bl) sobre cÃlulas epiteliais renais (MDCK e HK2) e o seu potencial nefrotÃxico em rim isolado de rato. O tratamento com LAAO-Bl, 1.56 â 100 Âg/mL induziu significativa morte celular de maneira concentraÃÃo dependente em ambas Ãs linhagens celulares apÃs 12 horas de tratamento. Nas cÃlulas MDCK nÃo foi observada liberaÃÃo de LDH apÃs 12 horas de exposiÃÃo à LAAO-Bl, enquanto nas cÃlulas HK2 LAAO-Bl induziu ruptura de membrana nas maiores concentraÃÃes estudadas quando comparado ao controle nÃo tratado. Nas cÃlulas MDCK o tratamento com LAAO-Bl aumentou significativamente a porcentagem de cÃlulas em apoptose (Anexina-V+, IP-), necrose (Anexina-V-, IP+) e necrose secundÃria (Anexina-V+, IP+). Nas cÃlulas HK2 LAAO-Bl induziu um aumento na porcentagem de cÃlulas em necrose (IP+) e necrose secundÃria (Anexina-V+, IP+) de maneira concentraÃÃo dependente. A induÃÃo de apoptose nas cÃlulas MDCK foi acompanhada de liberaÃÃo de Ca2+ do retÃculo endoplasmÃtico, aumento de espÃcies reativas de oxigÃnio, disfunÃÃo mitocondrial e aumento de expressÃo de Bax. O tratamento com LAAO-Bl induziu ativaÃÃo de caspase 3 e 7 em ambas as linhagens celulares. LAAO-Bl (10 Âg/mL) exerce efeitos significativos no rim isolado de rato aumentando a pressÃo de perfusÃo e o fluxo urinÃrio e diminuindo a taxa de filtraÃÃo glomerular e os transportes tubulares de sÃdio, potÃssio e cloreto. Os nossos resultados sugerem que LAAO-Bl contribui para nefrotoxicidade observada no envenenamento por Bothorps leucurus. AlÃm disso, os efeitos citotÃxicos de LAAO-Bl nas cÃlulas epiteliais renais podem ser responsÃveis, pelo menos em parte, pela nefrotoxicidade observada no rim isolado. / The pit viper Bothrops leucurus (White-tailed-jararaca) is a poisonous snake habituating area in the northeast of Brazil. The biological effects due envenomation have similar profile than those observed with other Bothrops, such as important severe local and systemic effects such as Acute Renal Failure (ARF). Bothrops leucurus venom induces nephrotoxicity in the isolated perfused kidney of rats associated with cytotoxicity against renal tubular epithelia cells. In this study, it was evaluated the direct nefrotoxicity of L-aminoacid oxidase isolated of B. leucurus venom (LAAO-Bl) on renal epithelial cells (MDCK and HK2) and their potential nephrotoxic in isolated rat kidney. In these cells treated with LAAO-Bl, 1.56 â 100 Âg/mL for 12 h, there was a decrease in their viability in a concentration-dependent manner after 12 hours of treatment. In MDCK cells LDH release was not observed after 12 h of LAAO-Bl exposure while LAAO-Bl induced membrane rupture in HK-2 cells at the highest concentrations studied when compared with untreated cells. In MDCK cells, LAAO-Bl significantly increased the percentage of early apoptotic (Annexin-V+, PI-), necrotic (Annexin-V-, PI+) and secondary necrotic cells (Annexin-V+, PI+) when compared with control untreated cells. In HK-2 cells LAAO-Bl induced an increase in necrotic (PI+ cells) and secondary necrotic cells (Annexin-V+, PI+) in a concentration-dependent manner. MDCK apoptosis induction was accompanied with Ca2+ release from the endoplasmic reticulum, reactive oxygen species (ROS) generation, mitochondria dysfunction with enhanced expression of Bax protein levels. LAAO-Bl induced caspase-3 and caspase-7 activation in both cell lines. LAAO-Bl (10 Âg/mL) exerts significant effects on the isolated kidney perfusion increasing perfusion pressure and urinary flow and decreasing the glomerular filtration rate and sodium, potassium and chloride tubular transport. Taken together our results suggest that LAAO-Bl contributes for the nephrotoxicity observed in the envenomation by Bothrops leucurus. Moreover, the cytotoxic of LAAO-Bl to renal epithelial cells might be responsible, least in part for the nephrotoxicity observed in isolated kidney.

Neste trabalho descrevemos o isolamento e a caracterização bioquímica, estrutural e funcional de uma L-aminoácido oxidase isolada do veneno da serpente Bothrops jararacussu, proteína esta denominada BjussuLAAO. O isolamento foi realizado pela combinação de três etapas cromatográficas, utilizando filtração molecular em Sephadex G-75, seguida de cromatografia de afinidade em Benzamidina-Sepharose, seguida pela última etapa cromatográfica, realizada com interação hidrofóbica em Fenil-Sepharose. A BjussuLAAO é uma proteína com massa molecular de 61 kDa e pI 5,8, e apresentou alta similaridade sequencial com as LAAOs já isoladas dos venenos de serpentes. A enzima BjussuLAAO induziu edema apenas na maior dose (100 ?g/animal), não apresentou atividade miotóxica, também não apresentou atividade hemorrágica, mesmo nas doses mais elevadas. A BjussuLAAO, demonstrou ter efeito coagulante e ação fibrinogenolítica e, mesmo utilizando inibidores de metaloproteases e serino proteases, continuou apresentando tal atividade, demonstrando assim não existir contaminantes destas classes de proteínas na amostra. As atividades mais interessantes do ponto de vista farmacológico, onde podemos visualizar a BjussuLAAO como um futuro fármaco, foram as atividades antitumoral, bactericida e antiparasitária. Esta apresentou, em baixas concentrações, citotoxicidade sobre células tumorais, ação leishmanicida e tripanocida, demonstrando assim ser uma substância candidata a fármaco multifuncional. / In this research we described the isolation and biochemical, structural and functional characterization of an L-amino acid oxidase from Bothrops jararacussu venom, named BjussuLAAO. The purification was carried out through three chromatography steps, using a molecular filtration on Sephadex G-75, followed by an affinity chromatography on Benzamidine-Sepharose, and finally a hydrophobic chromatography on Phenyl-Sepharose. BjussuLAAO is a protein with a molecular mass of 61 kDa and pI 5.8. This protein showed high sequencial similarity with other LAAOs from snake venoms. BjussuLAAO induced edema only in the highest dose (100 ?g/animal), did not show any myotoxic or hemorrhagic activity. BjussuLAAO, showed clotting and fibrinogenolitic activity, even in the presence of metalloproteases and serino-proteases inhibitors. The more interesting pharmacological activities, where from we can look a future application, were the anti-tumoral, bactericide, leishmanicidal and tripanocidal actions. The enzyme displayed a bactericide effect too, showing to be a multifunctional drug.

Neste trabalho descrevemos o isolamento e a caracterização bioquímica, estrutural e funcional de uma L-aminoácido oxidase isolada do veneno da serpente Bothrops jararacussu, proteína esta denominada BjussuLAAO. O isolamento foi realizado pela combinação de três etapas cromatográficas, utilizando filtração molecular em Sephadex G-75, seguida de cromatografia de afinidade em Benzamidina-Sepharose, seguida pela última etapa cromatográfica, realizada com interação hidrofóbica em Fenil-Sepharose. A BjussuLAAO é uma proteína com massa molecular de 61 kDa e pI 5,8, e apresentou alta similaridade sequencial com as LAAOs já isoladas dos venenos de serpentes. A enzima BjussuLAAO induziu edema apenas na maior dose (100 ?g/animal), não apresentou atividade miotóxica, também não apresentou atividade hemorrágica, mesmo nas doses mais elevadas. A BjussuLAAO, demonstrou ter efeito coagulante e ação fibrinogenolítica e, mesmo utilizando inibidores de metaloproteases e serino proteases, continuou apresentando tal atividade, demonstrando assim não existir contaminantes destas classes de proteínas na amostra. As atividades mais interessantes do ponto de vista farmacológico, onde podemos visualizar a BjussuLAAO como um futuro fármaco, foram as atividades antitumoral, bactericida e antiparasitária. Esta apresentou, em baixas concentrações, citotoxicidade sobre células tumorais, ação leishmanicida e tripanocida, demonstrando assim ser uma substância candidata a fármaco multifuncional. / In this research we described the isolation and biochemical, structural and functional characterization of an L-amino acid oxidase from Bothrops jararacussu venom, named BjussuLAAO. The purification was carried out through three chromatography steps, using a molecular filtration on Sephadex G-75, followed by an affinity chromatography on Benzamidine-Sepharose, and finally a hydrophobic chromatography on Phenyl-Sepharose. BjussuLAAO is a protein with a molecular mass of 61 kDa and pI 5.8. This protein showed high sequencial similarity with other LAAOs from snake venoms. BjussuLAAO induced edema only in the highest dose (100 ?g/animal), did not show any myotoxic or hemorrhagic activity. BjussuLAAO, showed clotting and fibrinogenolitic activity, even in the presence of metalloproteases and serino-proteases inhibitors. The more interesting pharmacological activities, where from we can look a future application, were the anti-tumoral, bactericide, leishmanicidal and tripanocidal actions. The enzyme displayed a bactericide effect too, showing to be a multifunctional drug.