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Análise proteômica comparativa entre neutrófilos quiescentes e neutrófilos ativo por n-formil-metionil-leucil-fenilalanina (fMLP)

Neves, Anne Caroline Dias 16 April 2010 (has links)
Dissertação (mestrado)-Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2010. / Submitted by Jadiana Paiva Dantas (jadi@bce.unb.br) on 2011-06-29T22:31:15Z No. of bitstreams: 1 2010_AnneCarolineDiasNeves.pdf: 2909388 bytes, checksum: 0e35b081fa1d4e2d81290e6b8c897464 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-07-14T22:36:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_AnneCarolineDiasNeves.pdf: 2909388 bytes, checksum: 0e35b081fa1d4e2d81290e6b8c897464 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-07-14T22:36:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_AnneCarolineDiasNeves.pdf: 2909388 bytes, checksum: 0e35b081fa1d4e2d81290e6b8c897464 (MD5) / Os neutrófilos são células do sistema imune responsáveis pelo combate inicial contra microrganismos, tais como bactérias e fungos. Possuem uma vida curta, em torno de 6 a 10h na circulação periférica sendo os primeiros a chegarem ao local injuriado. Os neutrófilos podem ser ativados por várias substâncias, entre elas o fMLP (N-formil Metionil-Leucil-Fenilalanina), um peptídeo presente em bactérias Gram-positivas responsável pela ativação dos neutrófilos principalmente em pacientes acometidos por sepse. Essa ativação envolve proteínas centrais na produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) como ERK, p38MAPK e PKC, envolvidas não só na montagem da NADPH oxidase, mas também na reorganização do citoesqueleto favorecendo os processos de desgranulação, transmigração e diapedese. Além da produção de ROS, também são produzidas inúmeras citocinas e quimiocinas, assim como mediadores da inflamação como prostaglandinas e leucotrienos. O presente estudo tem como objetivo comparar o mapa proteômico ácido de neutrófilos quiescentes com o mapa proteômico ácido de neutrófilos ativados com fMLP, evidenciando proteínas com expressão diferencial significativa. A comparação revelou 157 spots exclusivos da condição quiescente, sendo sete identificadas [CLIC1 (canal de cloreto), Dimethylglycine Dehydrogenase (desmetila a N-dimetilglicina em sarcosina e formaldeído), PIPTβ (transporta fosfatidilcolina e fosfatidilinositol sem gasto de energia), Scinderin (proteína estrutural responsável pela fragmentação da actina), Rab 14 e Rabaptin_Rab2GTPase (ambas envolvidas no transporte de grânulos no RE e Complexo de Golgi)] e 77 spots exclusivos da condição fMLP, sendo três proteínas identificadas [Posmeiotic Segregation Increased 2 (envolvido no reparo celular), Pyrophosphatase (hidrolisa o pirofosfato em fosfato inorgânico) e Coactosin like protein (F-actina envolvida na formação de LTB4)]. O mesmo pareamento possibilitou a detecção de spots diferencialmente expressos, sendo 24 com expressão significativamente aumentada para fMLP e três identificadas [Vimentin (filamento intermediário), Septin 11 (atua reorganizando os microtubulos e actina durante a desgranulação) e CLIC4 (canal de cloreto)] e 28 spots com expressão diminuída para fMLP, sendo sete identificadas [Promyelocite Leukemia Protein (envolvida na mutação do receptor do ácido retinóico); Zinc Finger (proteína efetora com sítio de ligação para PIP3); Modulator of retrovirus infection (modula o proteassoma diminuindo a degradação de material genético viral), tubulin1B, tubulin1A e tubulin4A (formam os microtubulos presentes no citoesqueleto). _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Neutrophils are cells of the immune system that are the first-responders against microorganisms, like bacteria and fungus. They have a short-life, that lasts from 6 up to 10 hours in peripheral blood, migrating quickly to the injured area. Neutrophils can be activated by various substances, like fMLP, a bacterial Gram-positive peptide responsible for the neutrophil activation in patients who were stricken by sepsis. This activation involves central proteins in reactive oxygen species (ROS) production like ERK, o38MAPK and PKC. The activation of neutrophils caused by fMLP is not restricted to the NADPH oxidase assembly, but also includes the cytoskeleton reorganization, favoring the degranulation process, transmigration and cell extravasation. Besides the ROS production, cytokines and chemokines are also produced, along with inflammation mediators like prostaglandines and leukotrienes. This research has as objective to compare the proteomic map of quiescent neutrophils with the proteomic map of fMLP activated ones, highlighting proteins with significant differential expression. The proteomic map pairing of quiescent and fMLP activated neutrophils revealed 157 exclusive spots of the quiescent cells, and 7 from these proteins were identified [CLIC1 (chloride channel), Dimethylglycine Dehydrogenase (demethylates the N-dimethylglicine in sarcosine and fornaldehyde), PIPTβ (transports phosphatidilinositol with no energy cost), Scinderin (structural protein responsible for the fragmentation of actinin), Rab 14 and Rabaptin_Rab2GTPase (both proteins involved in the transport of granules in the ER and Golgi Apparatus)] and 77 spots exclusive of fMLP activated neutrophils, 3 of which were identified [Posmeiotic Segregation Increased 2 (involved in cell repair), Pyrophosphatase (hydrolyses the pyrophosphate in inorganic phosphate) and Coactosin like protein (F-actin involved in LTB4 formation)]. This pairing also resulted in detection of differentially expressed proteins, 24 with up regulated expression by fMLP. Also, 28 spots presented down-regulated expression by fMLP. Among the statistically verified spots, three proteins with up-regulated expression by fMLP: Vimentin (intermediary filament), Septin 11 (acts reorganizing the microtubules and actin during degranulation) and CLIC4 (chloride channel) and seven proteins with down-regulated expression by fMLP: Promyelocite Leukemia Protein (involved in the retinoic acid mutation), Zinc Finger (effector protein with PIP3 bond site), Modulator of retrovirus infection (protein that regulates the proteasome, diminishing the viral genetic material degradation), tubulin1B, tubulin 1A and tubulin 4A (forms the microtubules present in the cytoskeleton)
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Estudio de la activación y apoptosis de neutrófilos en pacientes con enfermedad periodontal

Chandía Espinosa, Sabrita January 2005 (has links)
Memoria para optar el título de Bioquímico / La periodontitis crónica es una enfermedad periodontal, caracterizada por la inflamación de la encía, iniciada por la placa microbiana y propagada por el hospedero, con la posterior destrucción de la estructura de soporte de los dientes. Los neutrófilos son la primera línea de defensa frente a patógenos como parte de la respuesta inmune innata. En la periodontitis los neutrófilos responden a la presencia de la bacterias anaerobias Gram negativas, que colonizan el tejido subgingival, que incluye a Porphyromonas gingivalis. Los neutrófilos reconocen patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs), dentro de los cuales se encuentran los lipopolisacaridos (LPS), por medio de receptores de reconocimiento de patrones (PRR) de los que forman parte los TLR. Una vez que los neutrófilos han reconocido al patógeno, se producen cambios en la membrana plasmática señal de su activación. Dentro de estos cambios se encuentran la disminución de L-selectina (CD62L), seguido por el incremento en la expresión de Mac-1 de la familia β2 integrina (CD11b) en la superficie de los neutrófilos. Después de la activación de los neutrófilos comienza el proceso apoptótico asociado con algunas funciones importantes, tales como adhesión y fagocitosis, las que eventualmente llevan a la resolución de la inflamación. En la periodontitis, los neutrófilos presentarían una desregulación en la apoptosis, acumulándose y aumentando el daño tisular. De esta manera, nosotros proponemos que los pacientes con periodontitis crónica presentan activación y un retardo de la apoptosis de neutrófilos con respecto a los controles sanos. Como una forma de acercarnos a los cambios en el sistema inmune que hacen a un sujeto más susceptible a la periodontitis, se estudió la activación y apoptosis de neutrófilos en cultivo, de sangre periférica de individuos periodontalmente sanos y con periodontitis crónica. También estudiamos el efecto de LPS Escherichia coli y el extracto bacteriano de P. gingivalis sobre ambos grupos. Los neutrófilos se purificaron desde sangre periférica de 11 pacientes con periodontitis crónica sin tratamiento y 8 controles periodontalmente sanos. Los neutrófilos purificados se incubaron con LPS E. coli o extracto de P. gingivalis por periodos de 0, 4 y 8 h, para posteriormente la determinación de los nivel relativos de expresión de CD62L y CD11b y apoptosis, por citometría de flujo. Los resultados muestran una disminución de la expresión de CD62L y de CD11b en los neutrófilos de pacientes con respecto a los controles sanos en sus niveles basales. Además existe una disminución significativa de la intensidad de florescencia media (MFI) en el tiempo de los niveles basales de CD11b en el grupo control. Al ser estimulados los neutrófilos de pacientes y controles con LPS E. coli o P. gingivalis, existe una disminución de MFI de CD62L y un aumento de CD11b en ambos grupos sin llegar a ser significativos estadísticamente frente P. gingivalis. Sin embargo, LPS E. coli alcanza significación estadística con respecto a los basales en pacientes y controles. MFI de CD11b y CD62 de pacientes y controles a las 8 h de incubación se igualan. Además, los neutrófilos de pacientes presentan un retardo apoptótico en sus niveles basales, con respecto a los controles, y que no es alterada por los estímulos de LPS E. coli o P. gingivalis. Este retardo de la apoptosis ayudaría al neutrófilo a demorar su acción en el tejido liberando el contenido de sus gránulos, contribuyendo al daño tisular y a la etiopatogénesis de la enfermedad periodontal
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Análise proteômica comparativa entre neutrófilos não ativados e ativados com PMA, um análogo do diacilglicerol

Santos, Karina Cunha dos 13 July 2007 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2007. / Submitted by mariana castro (nanacastro0107@hotmail.com) on 2009-12-14T18:09:13Z No. of bitstreams: 1 2007_KarinaCunhadosSantos.pdf: 3450951 bytes, checksum: aa8b711edd0b318c7ea8250d3da45bfb (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-01-07T23:54:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_KarinaCunhadosSantos.pdf: 3450951 bytes, checksum: aa8b711edd0b318c7ea8250d3da45bfb (MD5) / Made available in DSpace on 2010-01-07T23:54:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_KarinaCunhadosSantos.pdf: 3450951 bytes, checksum: aa8b711edd0b318c7ea8250d3da45bfb (MD5) Previous issue date: 2007-07-13 / Os neutrófilos constituem o principal tipo de leucócito do sangue periférico e protegem contra infecções fúngicas e bacterianas. Devido à sua capacidade de quimiotaxia, conseguem chegar rapidamente a um sítio de infecção e destruir os patógenos invasores. Essas células podem existir em três estágios de ativação denominados, quiescente, estimulado e ativado. Neutrófilos ativados produzem espécies reativas de oxigênio (ROS), aumentam sua capacidade fagocitária; têm a apoptose retardada além de outras funções. Os polimorfonucleares podem ser ativados in vitro por várias substâncias, dentre elas o PMA, que atravessa as membranas e ativa, diretamente, várias isoformas de PKC. Neste trabalho, os neutrófilos foram purificados a partir do sangue venoso periférico, e obtidos após centrifugação do sangue total em um gradiente de percoll (pureza maior que 96% e viabilidade maior que 97%). Em seguida, 107 células foram ativadas com PMA 100 ng/mL, por 30 minutos, mantendo também um grupo controle não ativado. Análises citométricas foram executadas para se acompanhar a ativação celular através da explosão respiratória e a viabilidade e pureza da separação dos neutrófilos. Também foi realizada uma análise comparativa dos géis bidimensionais na condição Normal e ativada com PMA, verificando que 12 spots tiveram sua expressão aumentada com a ativação e 62 apresentaram expressão diminuída nesta condição. Além disso, 141 spots foram considerados como pertencentes apenas ao gel Normal e 109 spots foram exclusivos da condição PMA. Trinta e cinco spots foram sujeitos à identificação por peptide mass fingerprinting, dos quais seis foram identificados. Entre as proteínas identificadas, quatro são relacionadas ao processo inflamatório e duas foram classificadas como estruturais. RBCK1 e CRAa, foram encontradas pela primeira vez em neutrófilos. Nossa hipótese é que MEK1 e MEKK1, reduzam a atividade transcricional de RBCK1, enquanto PKA aumenta sua atividade. A lisozima, proteína microbicida de grânulos específicos e a ?-actina, classificada como a principal isoforma do citoesqueleto de neutrófilos, também foram identificadas. MRP-14, presente no citoplasma de neutrófilos, apresenta efeitos bacteriostáticos e semelhantes às citocinas. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Neutrophils are the major type of leukocytes in peripheral blood and protect against fungal and bacterial infections. Directed migration in a gradient of chemotactic stimuli enables these cells to rapidly find the site of infection and destroy the invading pathogens. PMNs can exist in three different activation states, namely, resting, primed, and activated states. Activated neutrophils produce reactive oxygen species (ROS), in what is known as respiratory burst, increase phagocytosis, delay apoptosis, among other functions. These cells can also be activated in vitro by particles and substances such as phorbol-myrystate-acetate (PMA). The PMA is a diacylglicerol (DAG) analog that bypasses membrane receptors and directly activates intracellular protein kinase C isoforms (PKC). In this study, human neutrophils were prepared from peripheral venous blood of healthy volunteers (greater than 96% purity, greater than 97% viability) and were obtained by density centrifugation on percoll gradient. 107 cells were activated with 100ng PMA for 30 minutes in 1 mL of PBS. Cytometric analysis was executed for measurement of respiratory burst, viability and purity from neutrophils. A comparative analysis of 2D-eletrophoresis gels, of normal and PMA activated neutrophils was executed, and 83 spots revealed differential expression, from which 13 spots were up regulated after PMA activation and 70 were down regulated in this condition (p≤0,05). Moreover, 141 spots were regarded as belonging only to normal gel, and 109 spots were exclusive of the PMA activated neutrophil map Thirty five conserved spots were subjected to peptide mass fingerprinting, yielding six identifications. Among the identified proteins, four are related to the inflammatory process and two are classified as structural. RBCK1 and CRAa, were found for first time in neutrophils. Our hypothesis is that MEK1 and MEK kinase 1 (MEKK1) represses the RBCK1 activity, and PKA enhances its activity. Lysozyme, a microbicidal protein of specific granules, and β-actin, the main isoform of neutrophil cytoskeleton were identified too. MRP-14, present in the neutrophil cytoplasm, provides bacteriostatic and cytokine-like effects.
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Estudio de la respuesta bioquímica de neutrófilos humanos frente a patógenos periodontales

Restaíno Bianchi, Carmen Gloria January 2005 (has links)
Magíster en Bioquímica / Los neutrófilos polimorfonucleares (PMNs) son un tipo de leucocito que tiene participación en la primera etapa de la inmunidad innata. Constituyen la primera línea de defensa del hospedero frente a un agente patógeno, pero la liberación de sus componentes puede causar destrucción de tejido. Estas células al activarse secretan citoquinas inflamatorias, fagocitan a las bacterias y las destruyen a través de agentes microbicidas como intermediarios de oxígeno reactivo (ROS) y óxido nítrico (NO) y, también, a través de la secreción de metaloproteinasas (MMPs). Las MMPs son enzimas hidrolíticas con características neutras que degradan colágeno, gelatina, laminina y otros componentes de la matriz extracelular, secretándose desde neutrófilos la MMP-8 (colagenasa) y la MMP-9 (gelatinasa B). La periodontitis es una enfermedad que causa la destrucción del colágeno en el ligamento periodontal provocando inflamación. El proceso destructivo es el resultado de una compleja interacción entre estas bacterias, la inmunidad del hospedero y los sistemas inflamatorios.Las principales bacterias implicadas en la enfermedad periodontal son anaeróbicas y gram-negativaseincluyen Porphyromonas gingivalis (Pg) y Actinobacillus actinomycetemcomitans(Aa), entre otras. El reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), por parte de los neutrófilos lo realiza una importante familia de receptores llamada receptores de tipo Toll (TLR). Los objetivos de esta tesis fueron: 1) estudiar la respuesta de los neutrófilos periféricos (circulantes) frente a periodontopatógenos como Pg y Aa y, además, de algunos de los PAMPs más conocidos como LPS de Escherichia coli (componente de la pared celular), Zymosan A (extracto de Saccharomyces cerevisiae) y la lectina fitohemaglutinina (PHA); y 2) comparar la respuesta de neutrófilos provenientes de pacientes con periodontitis con la de individuos sanos. La respuesta de los neutrófilos frente a agentes potencialmente estimuladores o activadores se estudió, tanto en sangre completa como en neutrófilos purificados, a través del análisis de la secreción de la enzima MMP-9 y la citoquina IL-8, intentándose además medir la liberación al medio de óxido nítrico (NO). La actividad de MMP-9 se determinó por zimografía en geles de poliacrilamida en presencia de gelatina (colágeno desnaturalizado) como sustrato, en condiciones desnaturantes, lo que permite evaluar las formas activa y latente de la gelatinasa. Los niveles de IL-8 se determinaron utilizando el método ELISA. Los intentos de demostrar un aumento de liberación de NO en respuesta a los estimuladores fueron infructuosos, no obstante se trataron de cuantificar los niveles de sus metabolitos estables (nitrito y nitrato) por el sensible método de electroforesis capilar. En sangre completa, al comparar la condición estimulada con la condición basal en ausencia de estimulador, PHA aumentó la liberación de MMP-9 en ambos grupos (sanos y pacientes). Por otra parte, LPS y Pg estimularon la secreción de IL-8 sólo en el grupo de pacientes. No se encontraron diferencias significativas entre el grupo de pacientes con enfermedad periodontal y el grupo control de los individuos sanos en cuanto la liberación de MMP-9 e IL-8. Al trabajar con neutrófilos purificados, en ambos grupos LPS y Pg aumentó significativamente la liberación de MMP-9 respecto a la condición basal, encontrándose además un aumento significativo en el grupo de pacientes comparado con el grupo sano. La secreción de IL-8 respecto a la condición basal aumentó sólo en pacientes por efecto de LPS y Zymosan A. La comparación entre los dos grupos mostró diferencias significativas en la liberación de IL-8 al incubar con LPS, Pg, Aa y Zymosan A, observándose una mayor activación en los neutrófilos de los pacientes. La secreción de IL-8 se encontró atenuada en pacientes, pero se observó una gran aumento en su secreción (activación) por todos los estimuladores estudiados (entre 3 y 7 veces), a diferencia del grupo control. Los resultados en neutrófilos purificados apoyan la hipótesis propuesta de que este tipo de leucocitos periféricos en pacientes con periodontitis son más reactivos (hiper-reactivos) que los de individuos sanos. La determinación de la respuesta de los neutrófilos periféricos podría ser una herramienta útil para el seguimiento de la eficacia del tratamiento en los pacientes con periodontitis. La baja proporción de neutrófilos en las muestras de sangre completa no permitió observar esta hiper-reactividad, ni tampoco la respuesta estimuladora en general / Polymorphonuclear neutrophils (PMN) are a kind of leukocyte involved in the early innate immune response. They constitute the first line of host defense against a pathogenic agent, but the release of their components may cause tissue destruction. When these cells are activated they release proinflammatory cytokines, they phagocyte bacteria and destroy them through microbicidal agents like oxygen intermediates (ROS), nitric oxide (NO) and, also, through the release of metalloproteinases (MMPs). MMPs are hydrolytic enzymes with neutral characteristics which are able to degradate collagen, gelatin, laminin and other extracellular matrix components, releasing from neutrophils MMP-8 (collagenase) and MMP-9 (gelatinase B). Periodontitis is a disease that destroys collagen in the periodontal ligament producing inflammation. The destructive process is the result of a complex interaction between these bacteria, the host immunity and the inflammatory systems. The main bacteria involved in the periodontal disease are anaerobic and gram-negative and they include Porphyromonas gingivalis (Pg) and Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa), among others. Recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) by neutrophils is carried out by an important family of receptors called Toll like receptors (TLR). The objectives of this thesis were two: 1) to study the response of peripheric (circulating) neutrophils against periodontopathogens Pg and Aa and, also against some of well known PAMPs such like LPS from Escherichia coli (cell wall component), Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae extract) and the lectin phytohemagglutinin (PHA); and 2) to compare the response of neutrophils from patients with periodontitis to those from healthy individuals. The response of neutrophils against potentially stimulating agents or activators was studied in both whole blood and purified neutrophils, through the analysis of the release of the MMP-9 enzyme and the cytokine IL-8, trying to measure also the release of nitric oxide (NO) to the incubation medium. The activity of the MMP-9 was determinated by zymography on polyacrylamide gels, including gelatin (denaturalized collagen) as a substrate, in denaturating conditions, to evaluate both the active and latent forms of the gelatinase. The IL-8 levels were assayed using the ELISA method. Attempts to demonstrate an increase in the release of NO in response to the stimulators were unsuccessful, even though the nitrite and nitrate determination was used in an attempt to quantify the levels of its stable metabolites by the sensitive method of capillary electrophoresis. In whole blood, when comparing the stimulated condition with the basal condition in absence of a stimulator, PHA increased the release of MMP-9 in both groups (healthy and patients). On the other hand, LPS and Pg stimulated the release of IL-8 only in the patient group. Significant differences between the group of patients with periodontal disease and the control group of healthy individuals in terms of the release of MMP-9 and IL-8 were not found. When working with purified neutrophils, in both groups LPS and Pg significantly increased the release of MMP-9 with respect to the basal condition; a significant increase in the patients group compared to the healthy group was also found. The release of IL-8 with respect to the basal condition increased only in patients due to the effects of LPS and Zymosan A. The comparison between the two groups showed significant differences in the release of IL-8, during incubation with LPS, Pg, Aa and Zymosan, with a greater activation in the neutrophils from patients. The secretion of IL-8 was reduced in patients, but with all the stimulators studied a larger secretion (activation) between 3 and 7 fold was observed in patient neutrophils as compared to that of the healthy group. The results in purified neutrophils support the proposed hypothesis that this type of peripheric leucocyte in patients with periodontitis is more reactive (hyper-reactive) than in healthy individuals. Determination of peripheral neutrophil response can be an useful tool for monitoring the efficacy of the treatment in periodontitis-affected patients. The proportion of neutrophils in whole blood samples was too low to observe this hyper-reactivity, or the stimulating response in general
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Proteômica abrangente de alta resolução na análise de neutrófilos humanos ativados pelo peptideo formyl Methyl Leucyl Phenylalanine (fMLP)

Fonseca, Micaella Pereira da 12 July 2017 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2017-08-22T14:42:46Z No. of bitstreams: 1 2017_MicaellaPereiradaFonseca.pdf: 4630281 bytes, checksum: 0e37678d479f619b59d863660a07a446 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-09-26T19:21:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_MicaellaPereiradaFonseca.pdf: 4630281 bytes, checksum: 0e37678d479f619b59d863660a07a446 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-26T19:21:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_MicaellaPereiradaFonseca.pdf: 4630281 bytes, checksum: 0e37678d479f619b59d863660a07a446 (MD5) Previous issue date: 2017-09-26 / Os neutrófilos são granulócitos polimorfonucleares que utilizam mecanismos intra e extracelulares para eliminar patógenos. A ativação de neutrófilos pela N-formil-Metionil-Leucyl-Phenylalanine (fMLP), uma molécula quimiotáctica liberada de bactérias Gram-positivas, disparadores de explosão respiratória, modificações morfológicas, degranulação e liberação de NETs. No entanto, a desregulamentação de neutrófilos está envolvida com várias patologias, em parte, devido à exacerbação da descarga de espécies reativas de oxigênio e enzimas citolíticas Embora haja um número considerável de estudos sobre condições, as questões sobre como essas desregulações permanecem sem resposta; Para os caminhos exatos que são percorridos por esses caminhos intracelulares ainda estão preenchidos com lacunas. Atualmente, a comunidade científica vem usando uma ferramenta de análise conhecida como espectrometria de massa (MS) para desempenhar melhor o papel dos neutrófilos na resposta imune; a realização de estudos relacionados aos neutrófilos de proteômica comparativa são ferramentas essenciais para a compreensão dos mecanismos intracelulares que regem a resposta inflamatória. Usando ferramentas proteômicas de alta resolução, o presente trabalho identificou 8362 proteínas no total, na ativação de neutrófilos por fmp de 100 nmL / L. Em conclusão este trabalho representa a eficiência dos métodos de análise proteômica proporcionaram a identificação de 8362 proteínas, sendo 301 proteínas reguladas diante do estímulo com fMLP. Pois, proteínas importantes para a resposta inflamatória dos neutrófilos foram identificadas, mostrando que a análise comparativa dos mapas proteômicos utilizando diferentes métodos de aquisição e extração proteicas atuaram de forma complementar na robustez da identificação mais abrangente de proteínas de neutrófilos, tanto quiescentes quanto ativados com fMLP. Ademais, E que existe uma forte conexão entre a família das pequenas GTPases com a maioria dos processo desencadeados pela ativação de vias por fMLP, como por exemplo as evidências de alterações estruturais em MEV. Com as análises conjugadas será possível sugerir pontos de modulação da resposta inflamatória promovidas por agentes ativadores relacionados a receptores ligados a proteína G. A identificação de regulações por subunidades do proteassoma 26S tendo extensa participação nas vias reguladas, o que pode ser um indicativo para um mecanismo de regulação por esse complexo. Outrossim, a proteômica se mostra uma ferramenta essencial para a análise de vias, pois proporciona a identificação de proteínas que estão em pequenas quantidades como citocinas liberadas pela ativação. No mais, os mecanismos de morte celular programada com divergência entre vias de ativação e bloqueio da apoptose, podendo acarretar desregulação pois os dados tentem a sugerir um fino balanço entre as vias de vida e morte. O presente trabalho apresenta um conjunto de proteínas com diversas funções relacionadas aos processos da resposta inflamatória, que incluem a atividade oxidativa, motilidade, metabolismo energético e sinalização intra e intercelular. Este estudo adiciona dados relacionados à ativação de neutrófilos por fMLP, também revelando proteínas que não foram previamente identificadas em neutrófilos, ampliando as possibilidades de modulação da resposta inflamatória. Nosso estudo também comtempla o maior número de proteínas nos neutrófilos ativados por fMLP, ampliando assim as possibilidades de sugerir uma modulação da resposta inflamatória em neutrófilos. / Neutrophils are polymorphonuclear granulocytes that use intra- and extracellular mechanisms to eliminate pathogens. Activation of neutrophils by N-formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanine (fMLP), a chemotactic molecule released from gram-positive bacteria, triggers respiratory burst, morphological modifications, degranulation and NETs´ release. However, neutrophils´ deregulation are involved with several pathologies, in part, due to the exacerbated discharge of reactive oxygen species and cytolytic enzymes; in other words, prolonged lifespan of activated neutrophils and their migration to non-injured tissues may result in severe clinical conditions. Although there are a considerable number of studies on conditions, questions about how such deregulations still remain unanswered; For the exact pathways that are traversed by these intracellular pathways are still filled with gaps. Currently, the scientific community has been using an analysis tool known as mass spectrometry (MS) to better play the role of neutrophils in the immune response; studies related to comparative proteomics neutrophils are essential tools for understanding the intracellular mechanisms governing the inflammatory response. In conclusion, this work represents the efficiency of the methods of proteomic analysis, which allowed the identification of 8362 proteins, 301 of which were regulated proteins before the stimulation with fMLP. Because proteins important for the inflammatory response of neutrophils were identified, showing that the comparative analysis of proteomic maps using different methods of protein acquisition and extraction acted in a complementary way in the robustness of the more comprehensive identification of neutrophil proteins, both quiescent and activated with fMLP . In addition, there is a strong connection between the family of small GTPases with most of the processes triggered by the activation of fMLP pathways, such as the evidence of structural alterations in SEM. With the conjugated analyzes it will be possible to suggest modulation points of the inflammatory response promoted by activating agents related to G protein-linked receptors. The identification of 26S proteasome subunit regimens having extensive participation in the regulated pathways, which may be indicative of a mechanism of regulation by this complex. In addition, the mechanisms of programmed cell death with divergence between activation pathways and apoptosis blockade, may lead to deregulation as the data try to suggest a fine balance between the life and death pathways. The present work presents a set of proteins with diverse functions related to the processes of the inflammatory response, which include oxidative activity, motility, energetic metabolism and intra and intercellular signaling. This study adds data related to the activation of neutrophils by fMLP, also revealing proteins that were not previously identified in neutrophils, increasing the possibilities of modulation of the inflammatory response. Our study also contemplates the largest number of proteins in the neutrophils activated by fMLP, thus increasing the possibilities of suggesting a modulation of the inflammatory response in neutrophils.
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Ativação de neutrófilos por superfícies de titânio e zircônia

Resende, Roberto Vieira 31 July 2017 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2018-04-13T21:19:06Z No. of bitstreams: 1 2017_RobertoVieiraResende.pdf: 3460980 bytes, checksum: ee92906dcea8b64da90b6b60babe2513 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-05-09T12:19:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_RobertoVieiraResende.pdf: 3460980 bytes, checksum: ee92906dcea8b64da90b6b60babe2513 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-09T12:19:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_RobertoVieiraResende.pdf: 3460980 bytes, checksum: ee92906dcea8b64da90b6b60babe2513 (MD5) Previous issue date: 2018-05-09 / Os glóbulos brancos neutrófilos são as primeiras células de defesa a chegar a qualquer local lesionado, seja lesão por processo biológico, seja por trauma acidental ou cirúrgico. No caso de implantes osteointegráveis, os neutrófilos interagem com a superfície dos implantes desencadeando uma série de sinalização. O titânio é reconhecidamente o material de implante mais bem estudado com altos índices de sucesso. Recentemente, a zircônia está tendendo a substituir o titânio, em diversas partes do corpo humano, como material de implante. Foram separados neutrófilos do sangue periférico de 8 doadores, jovens, sadios, do sexo masculino. Esses neutrófilos foram colocados sobre superfícies de titânio, zircônia comum, zircônia sinterizada e polietileno (controle), e incubados por 1 hora, para permitir a ativação. Depois, as amostras foram centrifugadas para testar a adesão dos neutrófilos e descartar aqueles fracamente aderidos. Tanto as amostras quanto o precipitado foram preparadas para microscopia eletrônica de varredura, teste de produção de espécies reativas de oxigênio (NBT lâmina e colorimétrico). Os exames de microscopia mostraram neutrófilos altamente ativados e aderidos às superfícies de titânio, zircônia e zircônia sinterizada. Quanto à produção de EROs, o titânio causou maior produção que a zircônia comum que, por sua vez causou maior produção que a zircônia sinterizada. Pode-se concluir que superfícies de titânio, zircônia e zircônia sinterizada promovem ativação de neutrófilos, que se aderem fortemente a suas superfícies, e produzem espécies reativas de oxigênio. Há necessidades de mais pesquisas para desvendar os mecanismos e mediadores dessa adesão. / Neutrophil white blood cells are the first imune cells to reach any injured part of the human body, when wounded by biological causes, accidental or surgical trauma. In relation to osteointegrated implants, the neutrophils interact with the surface of the implants triggering a series of signaling. Titanium is recognized as the best studied implant material with high success rates. Recently, zirconia was proposed as a substitute to titanium as implant material in different parts of the human body. In our experimental design, neutrophils were separated from the blood of 8 healthy young, male donors. These neutrophils were placed on surfaces of titanium, common zirconia, sintered zirconia and polyethylene (control), and incubated for 1 hour to allow activation. The samples were then centrifuged to test for adhesion of neutrophils and to separate the weakly adhered cells. Both the samples and the precipitate were prepared for scanning electron microscopy, and reactive oxygen species production test (colorimetric and slide NBT). Microscopy studies showed highly activated neutrophils adhering to the surfaces of titanium, zirconia and sintered zirconia. The tests for detection of ROS showed that titanium produced higher level than ordinary zirconia, which showed higher production than sintered zirconia. Conclusions were that titanium, zirconia and sintered zirconia surfaces promote activation of neutrophils, which adhere strongly to their surfaces, and produce Reactive Oxygen Species. There is a need for deep researches to find out the mechanisms and mediators of these adhesion and signaling.
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Análise morfológica e proteômica da captação de nanopartículas de dióxido de titânio por neutrófilos humanos in vitro

Rosa, Everton Luís Santos da 20 December 2012 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-01-25T13:04:19Z No. of bitstreams: 1 2012_EvertonLuisSantosRosa.pdf: 14261948 bytes, checksum: a595deada5e0408cb827506c88a1d850 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2013-01-28T10:34:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_EvertonLuisSantosRosa.pdf: 14261948 bytes, checksum: a595deada5e0408cb827506c88a1d850 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-28T10:34:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_EvertonLuisSantosRosa.pdf: 14261948 bytes, checksum: a595deada5e0408cb827506c88a1d850 (MD5) / O crescente uso de nanomateriais como dióxido de titânio (TiO 2) em seres humanos na área biomédica, cosmética, alimentícia entre outras, tem estimulado pesquisas sobre toxicidade pelo potencial risco à saúde humana. Alguns aspectos da resposta inflamatória ao titânio no organismo ainda não foram completamente elucidados. Sabe-se que a exposição celular a nanopartículas (NPs) de TiO 2 pode induzir estresse oxidativo que desencadeia uma cascata de eventos com sinalização celular, respostas inflamatórias, proliferativas e genotóxicas. Os neutrófilos (PMNs) representam a primeira linha de defesa celular imunológica do organismo, sendo ativados e rapidamente recrutados para as regiões onde as NPs de TiO 2 foram implantadas. Este estudo teve como objetivo analisar as interações de neutrófilos humanos com NPs de TiO 2 in vitro, em diferentes tempos de exposição (1, 5, 30 e 60 minutos). A análise morfológica da interação foi obtida por microscopias de luz, eletrônica de varredura e de transmissão enquanto a espectroscopia de força atômica permitiu a análise das modificações mecânicas dos PMNs. A expressão de moléculas de adesão, CD-11b e CD-62L foi analisada por Citometria de Fluxo e o teste do Nitroblue tetrazolium (NBT) possibilitou a avaliação da produção de ânion superóxido pelos PMNs após incubação com NPs de TiO 2 . A eletroforese bidimensional de extratos protéicos de neutrófilos quiescentes e ativados por TiO 2 no tempo 30 minutos permitiu a comparação de mapas proteômicos e a identificação de proteínas por PMF (Peptide Mass Fingerprinting). As análises por microscopia de luz, de varredura e transmissão demonstraram que o fator tempo teve um efeito significativo sobre a capacidade de fagocitose e as alterações da morfologia dos PMNs. As análises de citometria de fluxo não demonstraram correlação entre as alterações morfológicas e do citoesqueleto e a expressão de moléculas de adesão (CD-11b e CD-62L). Ativação celular e produção de ânion superóxido foram demonstrados pelo teste do NBT ao longo do tempo. A espectroscopia de força atômica demonstrou aumento das forças de atração, de adesão bem como da rigidez, elasticidade e energia dissipada nos PMNs. A análise comparativa dos géis bidimensionais resultou em 7 spots com diferença significativa de abundância (p≤0,05), dos quais 3 proteínas foram identificadas por PMF. Tais proteínas têm funções relacionadas à regulação da organização do citoesqueleto, fagocitose e ao ciclo celular. O presente estudo representa uma contribuição para o esclarecimento dos mecanismos fisiológicos celulares envolvidos na interação de nanomateriais com o organismo. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The increasing use of nanomaterials such as titanium dioxide (TiO 2) in humans in the biomedical, cosmetics, food and other fields, has stimulated the research on toxicity, due to the potential risk to human health. Some molecular aspects of the inflammatory response after implantation of titanium in the body has not yet been fully elucidated. It is known that the exposure of cells to nanoparticles (NPs) can induce oxidative stress that triggers a cascade of events resulting in cell signaling, inflammatory, proliferative and genotoxic responses. Neutrophils are the first line of cellular immunological defense and are quickly recruited to the titanium implantation areas. The present study aimed to analyze the interactions of human neutrophils with TiO 2 NPs in vitro at different incubation times (1, 5, 30 and 60 minutes). The morphological characteristics of this interaction were analyzed by light, electron scanning and transmission microscopy, whilst atomic force spectroscopy allowed PMNs mechanical forces analysis. The expression of adhesion molecules, CD-11b and CD-62L, was analyzed by Flow Cytometry and the Nitroblue tetrazolium (NBT) test enabled the evaluation of superoxide anion production by PMN after incubation with TiO 2 NPs. The two-dimensional electrophoresis of protein extracts from quiescent and TiO 2 activated neutrophils after 30 minutes of incubation allowed the comparison of proteomic maps and protein identification by PMF (Peptide Mass Fingerprint). Light, scanning and transmission microscopies results showed that the time factor had a significant effect on PMNs phagocytosis and morphology changes. Flow cytometry analysis showed no correlation between adhesion molecules expression (CD-11b and CD-62L) and morphological alterations. The NBT test demonstrated PMNs activation and superoxide anion production after exposure to TiO 2 NPs. Moreover, atomic force spectroscopy demonstrated increased parameters for attractive and adhesion forces, stiffness, elasticity and dissipated energy in PMNs along the time course. The comparative analysis of two-dimensional gels resulted in 7 spots with statistically significant abundance (p ≤ 0.05), among which 3 proteins were identified by PMF. The identified proteins are related to the regulation of cytoskeleton organization, phagocytosis and cell cycle. This study represents a contribution to the elucidation of the physiological mechanisms involved in cellular interactions of nanomaterials with the body.
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Estudos comparativos de neutrófilos estimulados e ativados in vitro

Aquino, Elaine Nascimento 14 December 2012 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-02-28T13:32:44Z No. of bitstreams: 1 2012_ElaineNascimentoAquino (2).pdf: 9008075 bytes, checksum: c569ceb054814e541f3b633f843c0317 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-02-28T15:17:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_ElaineNascimentoAquino (2).pdf: 9008075 bytes, checksum: c569ceb054814e541f3b633f843c0317 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-02-28T15:17:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_ElaineNascimentoAquino (2).pdf: 9008075 bytes, checksum: c569ceb054814e541f3b633f843c0317 (MD5) / A imunidade inata é o primeiro sistema ativado contra a invasão de microorganismos e partícula ao organismo. Esse sistema compreende a resposta humoral e celular. Os neutrófilos, partícipes da resposta imune celular, são encontrados na circulação sanguínea e se movimentam para o tecido quando são estimulados ou ativados por quimioatraentres. A ativação e/ou estimulação provocam mudanças celulares em prol da movimentação, fagocitose e destruição dos microorganismo. Essa ativação pode ser exacerbada provocando até injúrias teciduais. O processo de ativação pode ser subdividido em três estados fenotípicos distintos: quiescentes, estimulados ou ativados e esses estados podem ser desencadeados por substâncias como PAF e fMLP respectivamente. No presente estudo, tais condições foram comparadas. Ensaios que comprovaram a estimulação e ativação dos neutrófilos por esses agentes foram utilizados, como: explosão respiratória, clivagem da L-selectina e a mobilização da CD11b. Após essa avaliação foram comparados géis bidimensionais entre os três fenótipos (quiescentes, estimulados e ativados), o que resultou em 166 spots apresentando abundância diferencial e dentre eles 87 identificações proteicas. A análise dos termos do gene ontology para essas proteínas detectou que a maioria delas encontra-se no citoplasma e núcleo, e o processo biológico com maior número de proteínas envolvidas foi a transcrição em neutrófilos estimulados e dobramento de proteínas em neutrófilos ativados. Na comparação entre os três fenótipos, 16 spots apresentaram abundância diferencial e 11 proteínas foram identificadas, dentre elas 6 proteínas mais abundantes em neutrófilos quiescentes, envolvidas em processos como transdução de sinal, motilidade celular e modulação da resposta inflamatória. Seis outras proteínas eram mais abundantes em neutrófilos estimulados pelo PAF, relacionadas a adesão celular, transdução de sinal e atividade antimicrobiana. Dentre as proteínas identificadas neste estudo, 17 foram descritas pela primeira vez em neutrófilos e 30 foram associadas pela primeira vez ao estímulo por PAF ou à ativação por fMLP. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Innate immunity is the first system activated against the invasion of microorganisms and particles in the body. This system includes the humoral and cellular responses. Neutrophils, a participant in the cellular immune response, are found in the bloodstream and move to the tissue when they are stimulated or activated by chemoattractants, known as effector cells of the inflammatory response. The activation and/or stimulation causes changes in this cell favouring movement, phagocytosis and destruction of microorganisms. This activation may be exacerbated by causing tissue injury. The activation process can be subdivided into three distinct phenotypic states: quiescent, stimulated or activated and these states can be triggered by substances as PAF and fMLP respectively. In the present study such conditions were compared. Tests demonstrating stimulation and activation of neutrophils by these agents were used as respiratory burst, cleavage of L-selectin and CD11b mobilization. After this evaluation, were compared two-dimensional gels among the three phenotypes (quiescent, stimulated and activated), which resulted in 166 proteins presenting differential abundance and among them 87 were identified. Analysis of the gene ontology terms for such proteins localized most of them in the cytoplasm and nucleus, and associated them to the biological processes of transcription in stimulated neutrophils and protein folding in activated neutrophils. Comparing among the three phenotypes, 16 proteins showed differential abundance and 11 were identified, among them 6 were more abundant in quiescent neutrophils, involved in processes like signal transduction, cell motility and modulation of the inflammatory response. Six other proteins were more abundant in neutrophils stimulated by PAF, related to cellular adhesion, signal transduction and antimicrobial activity. Among the identified proteins, 17 were described for the first time in neutrophils and 30 were associated for the first time to the stimulation by PAF or activation by fMLP.
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Efeito inibitório do pré-condicionamento isquêmico a distância sobre a migração de neutrófilos : mecanismos e mediadores / Inhibitory effect of ischemic preconditioning distance on migration of neutrophils : mechanisms and mediators

Simão, Antonio Felipe Leite January 2010 (has links)
SIMÃO, Antônio Felipe Leite. Efeito inibitório do pré-condicionamento isquêmico a distância sobre a migração de neutrófilos: mecanismos e mediadores. 2010. 140 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2010. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-03-06T16:30:27Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_aflsimão.pdf: 1240434 bytes, checksum: eb336efc4efecb613952674e3f5ecb50 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-03-07T11:38:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_aflsimão.pdf: 1240434 bytes, checksum: eb336efc4efecb613952674e3f5ecb50 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-07T11:38:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_aflsimão.pdf: 1240434 bytes, checksum: eb336efc4efecb613952674e3f5ecb50 (MD5) Previous issue date: 2010 / Ischemic preconditioning (IPC) has been considered as a potent endogenous mechanism capable of inhibiting the inflammatory response. The migration of neutrophils (mn) is a central event in the development of inflammation. Our group has demonstrated that PCI inhibits mn in experimental models, however the mechanisms and mediators involved are not yet known. Aim: To study the involvement of mediators nitric oxide and carbon monoxide, adhesion proteins (ICAM-1 and β2-integrin) and expression of CXCR2 in the inhibitory effect of PCI on the distance min. Methods: The model of distance PCI was performed with a tourniquet in the right hind limb of mice for 10 minutes followed by 30 reperfusion. Involvement of NO and CO was investigated using inhibitors of iNOS (1400 W, 3 mg/kg or aminoguanidine (Amg), 50 mg/kg) and HO-1 (ZnPPIX, 10 mg/kg) as pretreatment 30 min. Later, peritonitis was induced by carrageenan (Cg) (500 mg/cav). Four hours later the peritoneal cavity (pc) was washed and leukocytes were counted. After that same procedure, the animals were subjected to intravital microscopy (IVM) to evaluate the effects of NO and CO in the mesenteric venules of 3rd order. Neutrophils from animals preconditioned and pre-treated or untreated, were used for testing chemotaxis in vitro, using the stimulus to chemokine KC (30ng/ml). The expression of GRK2 and CXCR2 in neutrophils was determined by flow cytometry and immunohistochemistry, respectively. The stakes and ICAM-1/CD54 β2-integrina/CD11b been investigated in knockout mice for genes of these molecules. The mn in these animals was evaluated according to protocol previously described by washed peritonela. In the investigation of the role of NO and CO in the modulation of cell adhesion protein (β2-integrin), we used iNOS inhibitor (1400W, 3 mg/kg or Amg, 50 mg/kg, sc), HO-1 (ZnPPIX, 10 mg/kg, sc) and guanylate cyclase (ODQ (5 µmol/kg, ip)) in pre-treatment 30 min before PCI. After peritonitis, blood was collected and the expression of CD11b on neutrophils was determined by flow cytometry. For statistical analysis, we used ANOVA/Bonferroni. P<0,05 was accepted. Results: The CO and NO inhibitors prevented the inhibitory effect of PCI on mn (P<0,05). Moreover, neutrophils from animals preconditioned showed reduced chemotaxis (p<0,05), a finding that correlated with decreased expression of CXCR2 in the membrane of neutrophils (p<0,05) and increased expression of GRK2. There was no change in chemotaxis or the expression of GRK2 when neutrophils were obtained from animals pre-conditioned and pretreated with inhibitors of CO, NO and sGC. Preconditioned animals showed a reduction in circulating neutrophils and the grip on IVM, which were prevented by pretreatment with inhibitors (P<0,05). The inhibitory effect of PCI was shown in knockout animals for β2-integrin, which was not observed in the knockout animals to ICAM-1. Moreover, neutrophils from animals preconditioned showed a significant reduction in the expression of CD11b, which was prevented in animals pretreated with inhibitors of iNOS, HO-1 and GCs. Conclusions: The results suggest that NO and CO act in the inhibitory effect of PCI via iNOS and HO-1 in place apart by modulating ICAM-1, β2-integrin and CXCR2 via GRK2. / O pré-condicionamento isquêmico (PCI) vem sendo considerado como um potente mecanismo endógeno capaz de inibir a resposta inflamatória. A migração de neutrófilos (mn) é um evento central no desenvolvimento da reação inflamatória. Nosso grupo tem demonstrado que o PCI inibe a mn em modelos experimentais, entretanto os mecanismos e mediadores envolvidos ainda não são conhecidos.Objetivo:Estudar a participação dos mediadores Óxido nítrico e Monóxido de carbono, proteínas de adesão (ICAM-1 e β2-integrina) e da expressão de CXCR2 no efeito inibitório do PCI a distância sobre a mn. Métodos:O modelo de PCI a distância foi realizado com um torniquete no membro posterior direito de camundongos durante 10 minutos seguidos de 30 de reperfusão. Participação do NO e CO foi investigada através de inibidores de iNOS (1400 W, 3 mg/kg ou Aminoguanidina (Amg), 50 mg/kg) e HO-1 (ZnPPIX, 10 mg/kg) como pré-tratamento de 30 min. Posteriormente, induziu-se peritonite comCarragenina(Cg) (500 mg /cav). Quatro horas após, a cavidade peritoneal (cp) era lavada e leucócitos eram contados. Após aquele mesmo procedimento, os animais foram submetidos a microscopia intravital (miv) para avaliar os efeitos do NO e CO nas vênulas mesentéricas de 3ª ordem.Neutrófilos de animais pré-condicionados e pré-tratados ou não, foram utilizados para o ensaio de quimiotaxiain vitro, usandocomo estímulo a quimiocina KC(30ng/ml). Aexpressão de CXCR2 e GRK2 dos neutrófilos foi determinada por citometria de fluxo e imunofluorescência, respectivamente.Asparticipações de ICAM-1/CD54 e β2-integrina/CD11b foram investigadas em camundongos nocautes para os genes dessas moléculas. A mn nesses animais foi avaliada segundo protocolo já descrito pelo lavado peritonela.Na investigação do papel do NO e CO na modulação da proteína de adesão celular (β2-integrina), utilizou-se inibidores da iNOS (1400W, 3 mg/kg ou Amg, 50 mg/kg, sc), HO-1 (ZnPPIX, 10 mg/kg, sc) eGuanilato Ciclase (ODQ (5 µmol/kg, ip)) em pré-tratamento de 30 min antes do PCI. Após peritonite, o sangue foi colhido e a expressão de CD11bem neutrófilos foi determinada por citometria de fluxo. Para análise estatística, utilizou-se ANOVA/Bonferroni. P<0,05 foi aceito. Resultados:Os inibidores de CO e NO preveniram o efeito inibitório do PCIsobre a mn (p <0,05). Além disso, os neutrófilos de animais pré-condicionados apresentaram redução de quimiotaxia (p <0,05),achado que se correlacionou com a diminuição da expressãode CXCR2 na membrana dos neutrófilos (p <0,05) e comaumento da expressão de GRK2. Não houve alteração da quimiotaxia, nem da expressão de GRK2 quando os neutrófilos foram obtidos a partir de animais pré-condicionados e pré-tratados com inibidores de de CO, NO e GCs. Os animais pré-condicionados apresentaram redução nos neutrófilos circulantes e da aderênciana miv, as quais foram prevenidas pelo pré-tratamento com os inibidores (p <0,05). O efeito inibitório do PCI persistiu em animais nocautes para β2-integrina, o que não se observou nos animais nocautes para ICAM-1. Além disso, os neutrófilos de animais pré-condicionados apresentaram redução significativa na expressão de CD11b, que foi prevenida nos animais pré-tratados com os inibidores de iNOS, HO-1 e GCs.Conclusões: Os resultados sugerem que o NO e CO atuam no efeito inibitório do PCI via iNOS e HO-1 em sitio distante, modulando ICAM-1, β2-integrina e CXCR2 via GRK2.
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Estudo de citotoxicidade, inflamação e estresse oxidativo em neutrófilos de pacientes com anemia falciforme : influência do tratamento com hidroxiuréia / Study cytotoxicity, inflammation and oxidative stress in neutrophils of patients with sickle cell disease : the influence treatment with hydroxyurea

Pedrosa, Alano Martins January 2013 (has links)
PEDROSA, Alano Martins. Estudo de citotoxicidade, inflamação e estresse oxidativo em neutrófilos de pacientes com anemia falciforme : influência do tratamento com hidroxiuréia. 2013. 111 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-05-17T16:35:04Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_ampedrosa.pdf: 808373 bytes, checksum: b4f933762ac58a15a0212b4c8cbefccf (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-05-20T12:59:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_ampedrosa.pdf: 808373 bytes, checksum: b4f933762ac58a15a0212b4c8cbefccf (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-20T12:59:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_ampedrosa.pdf: 808373 bytes, checksum: b4f933762ac58a15a0212b4c8cbefccf (MD5) Previous issue date: 2013 / Falciform Anemia (FA) is a hereditary hemoglobinopathy resulting from a β-globin gene mutation (α2β26 GLU→ VAL) that originates a hemoglobin variant called S (HbS). Its polymerization promotes hemolytic and vaso-occlusive crises (VOC). Nowadays it is known that these reactions are initial FA events that unleash a chain reaction that ends with the generation of oxygen reactive types (ORT) nitric oxide (NO) bioavailability reduction, endothelial lesion, susceptibility to infections and a chronic inflammatory process with direct involvement of neutrophils in the development of such mechanisms. Neutrophils of FA patients, besides developing more rigid, non-deformable structures, also show alterations in the expression of adhesion molecules and the production of cytokines and other mediators that may induce or aggravate clinical events observed in the disease. Hydroxyurea (HU) is the most important improvement in FA treatment and the only medicine with a strong impact on the patients’ quality of life, reducing the number of VOC, hospitalizations and deaths resulting from this condition. However, not much is known about the effects of this medicine on neutrophils and on the functionality of these cells. The present study aimed at investigating cytotoxicity, inflammation and oxidative stress markers in neutrophils of FA patients, as well as the effect of HU treatment over these parameters in hematology ambulatory patients from a university hospital and a blood center, both reference centers in Fortaleza – Ceará. The sample included 101 adult patients of both sexes diagnosed with FA through molecular study and it was divided into two groups: the SS Group – composed of 47 FA patients and the SSHU Group – composed of 54 FA patients under HU treatment. A control Group AA was composed of 50 healthy individuals, voluntary blood donors matched by age and sex. Neutrophils were isolated from whole blood by differential gradient and used to measure test. In toxicity tests carried out, it was observed that HU did not have any cytotoxic effect on patients’ neutrophils, however, was shown a cytoprotective action when compared to group AA and SS patients, with a significant reduction (p<0,001) in lactate dehydrogenase (LDH) levels and an increase in the percentage of viable cells through the metil tiazol tetrazolium (MTT) (p<0,001) and the Trypan Blue exclusion tests. Analyzing neutrophil involvement in inflammatory and oxidative stress processes and in FA, there was a significant elevation in the levels of cytokines and pro-inflammatory markers (TNF-α, MPO) and reduced antiinflammatory interleukin IL-10 group SS, as well as a significant decrease in the activity of antioxidant enzymes (SOD and GSH-Px). Patients under medical treatment with the tested medicine showed similar levels to those found in group AA. Oxidative damage were analyzed through malonaldehyde measurement (MDA), which was evidenced statistical differences between all studied groups (p<0,001), however with a higher average value in the non-treated group of patients. The present study ratified the important role of neutrophils in the inflammatory response promoted by the AF, and shown in an unprecedented way, with the Northeast-BR patients, treatment with HU did not reduce the viability of neutrophils, and modulates its mechanisms pro-inflammatory and pro -oxidants at levels comparable to those of healthy individuals. / Anemia Falciforme (AF) é uma hemoglobinopatia hereditária resultante de uma mutação pontual do gene da β-globina (α2β26 GLU→ VAL), originando a hemoglobina S (HbS), cuja polimerização promove crises hemolíticas e vaso-oclusivas (CVO). Atualmente, sabe-se que as mesmas são eventos iniciais na AF desencadeando uma cascata de reações que culmina com geração de espécies reativas de oxigênio, redução da biodisponibilidade do óxido nítrico, lesão endotelial, susceptibilidade às infecções e processo inflamatório crônico, com envolvimento direto dos neutrófilos nesses mecanismos. Os neutrófilos de pacientes com AF exibem estruturas mais rígidas e indeformáveis e alterações na expressão de moléculas de adesão e produção de citocinas e outros mediadores que podem induzir ou agravar as manifestações clínicas da doença. A hidroxiuréia (HU) constitui o avanço mais importante no tratamento da AF, sendo o único medicamento que, efetivamente, tem forte impacto na melhora da qualidade de vida dos pacientes, reduzindo o número de CVO, hospitalizações e óbitos. No entanto, pouco se sabe sobre os efeitos deste medicamento sobre os neutrófilos e na funcionalidade dessas células. O estudo teve como objetivo principal investigar a citotoxicidade, inflamação e estresse oxidativo em neutrófilos de pacientes com AF, bem como o efeito do tratamento com HU sobre esses parâmetros em pacientes atendidos pelos serviços ambulatoriais de hematologia de um hospital universitário e de um hemocentro, ambos de referência em Fortaleza-Ceará. A amostra foi constituída por 101 pacientes adultos, de ambos os sexos, diagnosticados por estudo molecular, sendo divididos em dois grupos: Grupo SS– formado por 47 pacientes com AF, e, Grupo SSHU– formado por 54 pacientes em tratamento com HU. Um grupo controle, Grupo AA, foi formado por 50 indivíduos saudáveis, doadores voluntários de sangue, com idade e sexo pareados. Os neutrófilos foram isolados do sangue total por diferença de gradiente e utilizados para mensuração dos testes. Nos ensaios de toxicidade, observou-se que a HU não exerceu efeito citotóxico nos neutrófilos dos pacientes, entretanto, foi evidenciado uma ação citoprotetora sobre os mesmos quando comparados aos pacientes SS e grupo AA, com uma redução significativa (p<0,001) na atividade de lactato desidrogenase (LDH) e aumento no percentual de células viáveis pelo teste de exclusão por Azul de Tripan e ensaio do metil tiazol tetrazólio (MTT) (p<0,001). Analisando o envolvimento dos neutrófilos nos processos de inflamação e estresse oxidativo na AF, constatou-se uma significativa elevação nos níveis de citocinas e marcadores pró-inflamatórios (TNF-α, MPO) e uma redução da interleucina anti-inflamatória IL-10 no grupo SS, bem como uma diminuição significante da atividade das enzimas antioxidantes (SOD e GSH-Px). Os pacientes em terapia com HU apresentaram níveis semelhantes aos encontrados no grupo AA. Danos oxidativos foram analisados pela mensuração do malonaldeído (MDA), evidenciando diferença estatística entre todos os grupos do estudo (p<0,001), porém, com valor de média superior no grupo SS. O presente estudo ratificou o papel preponderante dos neutrófilos na resposta inflamatória promovida pela AF, e mostrou de maneira inédita, com pacientes do Nordeste-BR, que o tratamento com HU não reduziu a viabilidade de neutrófilos, e modulou seus mecanismos pró-inflamatórios e pró-oxidantes a níveis comparáveis aos de indivíduos sadios.

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