PEDROSA, Alano Martins. Estudo de citotoxicidade, inflamação e estresse oxidativo em neutrófilos de pacientes com anemia falciforme : influência do tratamento com hidroxiuréia. 2013. 111 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-05-17T16:35:04Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_ampedrosa.pdf: 808373 bytes, checksum: b4f933762ac58a15a0212b4c8cbefccf (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-05-20T12:59:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_ampedrosa.pdf: 808373 bytes, checksum: b4f933762ac58a15a0212b4c8cbefccf (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-20T12:59:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_ampedrosa.pdf: 808373 bytes, checksum: b4f933762ac58a15a0212b4c8cbefccf (MD5) Previous issue date: 2013 / Falciform Anemia (FA) is a hereditary hemoglobinopathy resulting from a β-globin gene mutation (α2β26 GLU→ VAL) that originates a hemoglobin variant called S (HbS). Its polymerization promotes hemolytic and vaso-occlusive crises (VOC). Nowadays it is known that these reactions are initial FA events that unleash a chain reaction that ends with the generation of oxygen reactive types (ORT) nitric oxide (NO) bioavailability reduction, endothelial lesion, susceptibility to infections and a chronic inflammatory process with direct involvement of neutrophils in the development of such mechanisms. Neutrophils of FA patients, besides developing more rigid, non-deformable structures, also show alterations in the expression of adhesion molecules and the production of cytokines and other mediators that may induce or aggravate clinical events observed in the disease. Hydroxyurea (HU) is the most important improvement in FA treatment and the only medicine with a strong impact on the patients’ quality of life, reducing the number of VOC, hospitalizations and deaths resulting from this condition. However, not much is known about the effects of this medicine on neutrophils and on the functionality of these cells. The present study aimed at investigating cytotoxicity, inflammation and oxidative stress markers in neutrophils of FA patients, as well as the effect of HU treatment over these parameters in hematology ambulatory patients from a university hospital and a blood center, both reference centers in Fortaleza – Ceará. The sample included 101 adult patients of both sexes diagnosed with FA through molecular study and it was divided into two groups: the SS Group – composed of 47 FA patients and the SSHU Group – composed of 54 FA patients under HU treatment. A control Group AA was composed of 50 healthy individuals, voluntary blood donors matched by age and sex. Neutrophils were isolated from whole blood by differential gradient and used to measure test. In toxicity tests carried out, it was observed that HU did not have any cytotoxic effect on patients’ neutrophils, however, was shown a cytoprotective action when compared to group AA and SS patients, with a significant reduction (p<0,001) in lactate dehydrogenase (LDH) levels and an increase in the percentage of viable cells through the metil tiazol tetrazolium (MTT) (p<0,001) and the Trypan Blue exclusion tests. Analyzing neutrophil involvement in inflammatory and oxidative stress processes and in FA, there was a significant elevation in the levels of cytokines and pro-inflammatory markers (TNF-α, MPO) and reduced antiinflammatory interleukin IL-10 group SS, as well as a significant decrease in the activity of antioxidant enzymes (SOD and GSH-Px). Patients under medical treatment with the tested medicine showed similar levels to those found in group AA. Oxidative damage were analyzed through malonaldehyde measurement (MDA), which was evidenced statistical differences between all studied groups (p<0,001), however with a higher average value in the non-treated group of patients. The present study ratified the important role of neutrophils in the inflammatory response promoted by the AF, and shown in an unprecedented way, with the Northeast-BR patients, treatment with HU did not reduce the viability of neutrophils, and modulates its mechanisms pro-inflammatory and pro -oxidants at levels comparable to those of healthy individuals. / Anemia Falciforme (AF) é uma hemoglobinopatia hereditária resultante de uma mutação pontual do gene da β-globina (α2β26 GLU→ VAL), originando a hemoglobina S (HbS), cuja polimerização promove crises hemolíticas e vaso-oclusivas (CVO). Atualmente, sabe-se que as mesmas são eventos iniciais na AF desencadeando uma cascata de reações que culmina com geração de espécies reativas de oxigênio, redução da biodisponibilidade do óxido nítrico, lesão endotelial, susceptibilidade às infecções e processo inflamatório crônico, com envolvimento direto dos neutrófilos nesses mecanismos. Os neutrófilos de pacientes com AF exibem estruturas mais rígidas e indeformáveis e alterações na expressão de moléculas de adesão e produção de citocinas e outros mediadores que podem induzir ou agravar as manifestações clínicas da doença. A hidroxiuréia (HU) constitui o avanço mais importante no tratamento da AF, sendo o único medicamento que, efetivamente, tem forte impacto na melhora da qualidade de vida dos pacientes, reduzindo o número de CVO, hospitalizações e óbitos. No entanto, pouco se sabe sobre os efeitos deste medicamento sobre os neutrófilos e na funcionalidade dessas células. O estudo teve como objetivo principal investigar a citotoxicidade, inflamação e estresse oxidativo em neutrófilos de pacientes com AF, bem como o efeito do tratamento com HU sobre esses parâmetros em pacientes atendidos pelos serviços ambulatoriais de hematologia de um hospital universitário e de um hemocentro, ambos de referência em Fortaleza-Ceará. A amostra foi constituída por 101 pacientes adultos, de ambos os sexos, diagnosticados por estudo molecular, sendo divididos em dois grupos: Grupo SS– formado por 47 pacientes com AF, e, Grupo SSHU– formado por 54 pacientes em tratamento com HU. Um grupo controle, Grupo AA, foi formado por 50 indivíduos saudáveis, doadores voluntários de sangue, com idade e sexo pareados. Os neutrófilos foram isolados do sangue total por diferença de gradiente e utilizados para mensuração dos testes. Nos ensaios de toxicidade, observou-se que a HU não exerceu efeito citotóxico nos neutrófilos dos pacientes, entretanto, foi evidenciado uma ação citoprotetora sobre os mesmos quando comparados aos pacientes SS e grupo AA, com uma redução significativa (p<0,001) na atividade de lactato desidrogenase (LDH) e aumento no percentual de células viáveis pelo teste de exclusão por Azul de Tripan e ensaio do metil tiazol tetrazólio (MTT) (p<0,001). Analisando o envolvimento dos neutrófilos nos processos de inflamação e estresse oxidativo na AF, constatou-se uma significativa elevação nos níveis de citocinas e marcadores pró-inflamatórios (TNF-α, MPO) e uma redução da interleucina anti-inflamatória IL-10 no grupo SS, bem como uma diminuição significante da atividade das enzimas antioxidantes (SOD e GSH-Px). Os pacientes em terapia com HU apresentaram níveis semelhantes aos encontrados no grupo AA. Danos oxidativos foram analisados pela mensuração do malonaldeído (MDA), evidenciando diferença estatística entre todos os grupos do estudo (p<0,001), porém, com valor de média superior no grupo SS. O presente estudo ratificou o papel preponderante dos neutrófilos na resposta inflamatória promovida pela AF, e mostrou de maneira inédita, com pacientes do Nordeste-BR, que o tratamento com HU não reduziu a viabilidade de neutrófilos, e modulou seus mecanismos pró-inflamatórios e pró-oxidantes a níveis comparáveis aos de indivíduos sadios.

Submitted by Simone Fortunato (simone.fortunato@conveniado.bahia.fiocruz.br) on 2017-10-04T13:49:03Z No. of bitstreams: 1 2017 Rifkath_19 de setembro colorido.pdf: 1577388 bytes, checksum: db9deae3ad793c3fb4c568df25016401 (MD5) / Approved for entry into archive by Uillis de Assis Santos (uillis.assis@ufba.br) on 2017-10-04T14:02:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017 Rifkath_19 de setembro colorido.pdf: 1577388 bytes, checksum: db9deae3ad793c3fb4c568df25016401 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-04T14:02:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017 Rifkath_19 de setembro colorido.pdf: 1577388 bytes, checksum: db9deae3ad793c3fb4c568df25016401 (MD5) / RESUMO INTRODUÇÃO: Os níveis séricos de bilirrubina encontram-se frequentemente aumentados em pacientes com anemia falciforme, já acometidos por hemólise exacerbada, favorecendo a agravação do quadro clinico e a ocorrência de litíases biliares. OBJETIVO: O objetivo foi analisar a influência do polimorfismo A(TA)nTAA no promotor do gene UGT1A1 (rs8175347) e de dois polimorfismos no gene BCL11A (rs1427407 e rs7606173), sobre alguns parâmetros laboratoriais e sobre a resposta à hidroxiureia em pacientes pediátricos com anemia falciforme. MATERIAL E MÉTODOS: Amostras de sangue total e soro foram utilizadas para a realização das análises hematológicas e bioquímicas. O DNA foi extraído a partir de amostras de sangue periférico, e os fragmentos contendo os polimorfismos foram amplificados por PCR seguida de sequenciamento com primers específicos. RESULTADOS: Foram estudados 97 pacientes, com idade variando entre dois e 17 anos (7,433±4,075). Para o polimorfismo em UGT1A1, foram encontrados de cinco até oito repetições (TA) e as frequências do alelo selvagem (TA)6 e do alelo mutante (TA)7 foram respectivamente de 0,60 e 0,34. Quarenta pacientes (41,24%) eram homozigotos para o alelo (TA)6, 33 heterozigotos (TA)6/7, e 13 homozigotos (TA)7/7. Os níveis de bilirrubina total e indireta foram significativamente maiores nos pacientes com sete ou mais repetições (TA), p=0,0038 e p=0,0022, respectivamente, em comparação aos homozigotos (TA)6/6 ou heterozigotos (TA)5/6 ou (TA)5/7. Foi encontrada uma correlação negativa significativa entre os níveis de hemoglobina fetal e os níveis de bilirrubina total (r=-0,3782, p=0,0001) e de bilirrubina indireta (r=-0,3761, p=0,0015), sendo que para os indivíduos (TA)7/7 e (TA)7/8, essa correlação deixou de ser válida (p>0,05), tanto para a bilirrubina total quanto para a bilirrubina indireta. Ademais, os níveis maiores de bilirrubina nos indivíduos (TA)7/7 e (TA)7/8 não estavam associados com o aumento dos níveis de marcadores de hemólise. A frequência do alelo mutante T do rs1427407 foi de 0,22 e a do alelo selvagem G do rs7606173 foi 0,57. Nenhum indivíduo com o genótipo mutante TT para o rs1427407 estava sob tratamento com hidroxiureia. Em indivíduos sem uso de hidroxiureia, o maior nível de hemoglobina fetal foi associado com o genótipo mutante TT. Já para o genótipo selvagem GG do rs7606173 ocorreu aumento de hemoglobina fetal, mas não foi significativo. Quanto aos níveis de bilirrubina, os homozigotos TT para o rs1427407 e GG para o rs7606173 apresentaram níveis menores. Além disso, o efeito dos polimorfismos em BCL11A sobre a bilirrubina pareceu superar o efeito do rs8175347 no grupo (TA)7/7 e (TA)7/8. Não foi encontrada associação TT/CC, e também não foi encontrado nenhum mutante TT entre os portadores do haplótipo CAR/CAR. Conclusões: Este estudo confirmou a associação do alelo (TA)7 a níveis elevados de bilirrubina, independentemente do grau de hemólise. O alelo mutante T do rs1427407 e o alelo ancestral G do rs7606173 são associados à níveis maiores de hemoglobina fetal e menores níveis de bilirrubina, sendo o efeito maior associado ao alelo T. / ABSTRACT INTRODUCTION: Serum bilirubin levels are frequently increased in patients with sickle cell anemia, who already are affected by exacerbated hemolysis, which worsens symptoms and especially favors the occurrence of pigment gallstones. AIM: The aim of the present study was to analyze the influence of the polymorphism A(TA)nTAA in the UGT1A1 gene promoter (rs8175347) and two polymorphisms in the BCL11A gene (rs1427407 and rs7606173), on some laboratory parameters and on the response to hydroxyurea in pediatric patients with sickle cell anemia. MATERIAL AND METHODS: Whole blood and serum samples were used to perform hematological and biochemical analysis. DNA was extracted from peripheral blood samples, and fragments containing the polymorphisms were amplified by Polymerase Chain Reaction followed by sequencing with specific primers. RESULTS: We studied 97 patients, ranging in age from 2 to 17 years (7.433±4.075). For the UGT1A1 polymorphism, five to eight (TA) repeats were found and the wild-type (TA)6 and mutant allele (TA)7 frequencies were respectively 0.60 and 0.34. Forty patients (41.24%) were homozygous (TA)6/6, 33 heterozygotes (TA)6/7, and 13 homozygous (TA)7/7. Total and unconjugated bilirubin levels were significantly higher in patients with seven or more (TA) repeats, p=0.0038 and p=0.0022, respectively, compared to homozygotes (TA)6/6 or heterozygotes (TA)5/6 or (TA)5/7. A significant negative correlation was found between fetal hemoglobin levels and total bilirubin levels (r =-0.3782, p=0.0001) and unconjugated bilirubin levels (r =-0.3761, p=0.0015). This correlation was no longer valid (p> 0.05) for individuals (TA)7/7 and (TA)7/8. In addition, the higher levels of bilirubin in (TA)7/7 and (TA)7/8 individuals were not associated with increased markers of markers of hemolysis. The frequency of the mutant allele G of rs1427407 was 0.22, and for the wild-type allele G of rs7606173, the frequency was 0.57. In individuals that were not using hydroxyurea, a significant higher fetal hemoglobin level was associated with the TT mutant genotype, while a non-significant increase occurred for the wild-type genotype GG of rs7606173. Subsequently, patients homozygous for the TT genotype of rs1427407 had significant lower levels of total and unconjugated bilirubin (p=0.0102 and p=0.0108, respectively). Furthermore, the effect of the BCL11A polymorphisms on bilirubin levels appeared to outweigh the effect of rs8175347 in the group (TA)7/7 and (TA)7/8. No patient simultaneously carrying the homozygous mutant genotypes TT/CC was found; and no mutant homozygotes TT was found in patients with the CAR/CAR haplotype. CONCLUSION: This study confirmed that allele (TA)7 is associated with elevated levels of bilirubin, regardless of the rate of hemolysis. The mutant allele T of rs1427407 and the ancestral allele G of rs7606173 are associated with higher levels of fetal hemoglobin and lower levels of bilirubin, the strongest effect being associated with the T allele.

SANTOS, Bruna Stefânia Carvalho dos. Impacto da terapia com a hidroxiuréia e dos haplóticos no perfil oxidativo na anemia falciforme. 2011. 96 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2011. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2014-01-06T11:47:35Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_bscsantos.pdf: 1202381 bytes, checksum: 7d35d3c9692b5223a1a2a04d9ccc2ffe (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2014-01-06T11:49:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_bscsantos.pdf: 1202381 bytes, checksum: 7d35d3c9692b5223a1a2a04d9ccc2ffe (MD5) / Made available in DSpace on 2014-01-06T11:49:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_bscsantos.pdf: 1202381 bytes, checksum: 7d35d3c9692b5223a1a2a04d9ccc2ffe (MD5) Previous issue date: 2011 / The sickle cell anemia is one of the most common genetic disorders in our country. The -globin haplotypes are associated with the clinical heterogeneity of the disease. Individuals with sickle cell disease are subjected to high levels of oxidative stress. Hydroxyurea (HU) has been used as treatment and it increases the levels of fetal hemoglobin having an action antioxidant. The study aimed to investigate the impact of the use of HU and haplotypes in the oxidative status in patients with sickle cell anemia. Samples from 64 patients treated at the University Hospital Walter Cantídio - HUWC and the control group of 20 individuals without hemoglobinopathies. Patients were stratified into groups: the first one using HU > 1 year, the second using HU ≤ 1 year and the third using of HU (SHU). Confirmation of the diagnosis and analysis of haplotypes were performed by molecular study. The measurements of nitrite (NO2-), malonaldehyde (MDA), glutathione peroxidase (GSH-Px), catalase (CAT), glutathione total (GSSG+GSH), oxidized (GSSG) and reduced (GSH) and the ratio GSSG/GSH (glutathione oxidized/reduced) were performed by spectrophotometry. Mean levels of NO2- and MDA were shown to be higher in SHU group, being significant only for MDA (p < 0,05). The assessment of oxidative stress in relation to haplotypes showed that the population without the use of HU levels of NO2- and MDA were similar between groups, with an insignificant increase of GSH-Px in the Bantu/n compared with Benin/n and index GSSG/GSH in the Benin/n compared with Bantu/n. In the population using the HU there was a nonsignificant increase in the levels of NO2- in the Bantu/n compared with Benin/n with similar results between groups of MDA and a significant increase in GSH-Px (p <0.03) in the Benin/n compared with Bantu/n. The results of CAT were similar between groups. The ratio of GSSG/GSH was higher but not significant in the Bantu/n compared to Benin/n. The results of this study support the hypothesis that patients with the sickle cell anemia have a state hiperoxidativo products with high levels of oxidative stress and decreased antioxidant status and that of hydroxyurea had an impact on oxidative stress. However, regarding the impact of the haplotypes in oxidative stress, further studies with a larger sample should be recommended to confirm our results, considering that the group of patients not treated with HU was lower than the group of patients using HU, the which may have interfered in the statistical analysis of results. / A anemia falciforme (AF) é uma das alterações genéticas mais comuns em nosso país. Os haplótipos da s-globina estão associados com a heterogeneidade clínica apresentada pela doença. Os portadores de AF são submetidos a elevados níveis de estresse oxidativo. A hidroxiuréia (HU) tem sido utilizada no tratamento por sua ação de elevar os níveis de hemoglobina fetal e ação antioxidante. O estudo teve como objetivo investigar o impacto do uso da HU e dos haplótipos no perfil oxidativo nos pacientes com AF. Foram analisadas amostras de 64 pacientes acompanhados no Hospital Universitário Walter Cantídio - HUWC e do grupo controle de 20 indivíduos sem hemoglobinopatias. Os pacientes foram estratificados em grupos: uso de HU > 1 ano, uso de HU ≤ 1 ano e sem uso de HU (SHU). A confirmação do diagnóstico e a análise dos haplótipos foram realizadas através de estudo molecular. As dosagens do nitrito (NO2-), malonaldeído (MDA), glutationa peroxidase (GSH-Px), catalase (CAT), glutationas total (GSSG+GSH), oxidada (GSSG) e reduzida (GSH) e da relação GSSG/GSH (glutationas oxidada/reduzida) foram realizadas por espectrofotometria. Os níveis médios de NO2-, e MDA mostraram-se mais elevados no grupo SHU, sendo significante apenas para o MDA (p < 0,05). O grupo SHU apresentou atividade média das enzimas CAT (p = 0,031) e GSH-Px (p = 0,036) inferiores aos demais grupos e maior relação GSSG/GSH (p < 0,05). A avaliação do estresse oxidativo em relação aos haplótipos demonstrou que na população sem uso de HU os níveis de NO2- e de MDA foram semelhantes entre os grupos, com um aumento não significante da GSH-Px no grupo Bantu/n em relação ao Benin/n e do índice GSSG/GSH no grupo Benin/n em relação ao Bantu/n. Na população em uso de HU verificou-se um aumento não significante dos níveis de NO2- no grupo Bantu/n em relação ao Benin/n com resultados semelhantes de MDA entre os grupos e um aumento significante da GSH-Px (p<0,03) no grupo Benin/n em relação ao Bantu/n. Os resultados da CAT foram semelhantes entre os grupos. A relação GSSG/GSH foi maior, porém não significante no grupo Bantu/n em relação ao Benin/n. Os resultados do presente estudo reforçam a hipótese de que os pacientes com AF apresentam um estado hiperoxidativo com níveis elevados dos produtos do estresse oxidativo e diminuídos do perfil antioxidante e que a hidroxiuréia teve um impacto sobre o perfil oxidativo. No entanto, em relação ao impacto dos haplótipos no estresse oxidativo, estudos posteriores com uma maior amostragem devem ser recomendados para confirmar nossos resultados, considerando que o grupo de pacientes não tratados com HU foi menor que o grupo de pacientes em uso de HU, o que pode ter interferido na análise estatística dos resultados.

Orientadores : Helena Zerlotti Wolf Grotto, Carmen Silvia Passos Lima / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-01T18:09:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Borba_Ronaldo_M.pdf: 2686096 bytes, checksum: 9c069274b60d010afb07b8626a0cebf5 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: A hemoglobina Fetal (HbF) é um inibidor eficaz da polimerização da HbS. A hidroxiuréia (HU) é usada para aumentar a síntese de HbF e melhorar a evolução clínica de pacientes com síndromes fa1ciformes. Foram estudados uma série de parâmetros laboratoriais relativos à produção de HbF e à resposta dos reticulócitos (RTC), e foram comparados os dados entre 2 grupos: 13 pacientes com síndromes falciformes tratados com HU e 33 pacientes com síndromes fa1ciformes sem tratamento. No grupo tratado com HU, os resultados mostraram uma maior concentração de Hb, no volume corpuscular médio (VCM), na hemoglobina corpuscular média (HCM), no volume corpuscular médio dos RTC (VCMr), na concentração de HbF, na porcentagem de células F e na quantidade de Hb F/célula F. O número de RTC, o índice médio de fluorescência (MFI) e o número de neutrófilos foram significativamente menores em pacientes usando HU. Houve uma correlação significativa entre o VCMr e os níveis de HbF e entre o VCMr e as células F em pacientes tomando HU. A concentração de HbF/célula F foi significativamente maior em pacientes tratados com HU, mas este aumento aparentemente é independente da produção de células F. Esses dados demonstram que os parâmetros reticulocitários fornecidos por analisadores hematológicos de última geração, podem ser úteis para acompanhar as mudanças eritropoiéticas em pacientes usando HU e, permitem uma melhor compreensão de como essa terapia induz o aumento da produção de HbF e celsF nos pacientes com síndromes falciformes / Abstract: Haemoglobin F (HbF) is an effective inhibitor of HbS polymerisation. Hydroxyurea (HU) is used to increase HbF synthesis and to improve the clinical course of the sickle cell disease (SCD) patients. We studied a series of laboratorial parameters concerning to HbF production and reticulocyte response and compared the data between 2 groups: 13 SCD patients treated with HU and 33 SCD patients without treatment. Higher Hb concentration, mean cell volume (MCV), mean cell hemoglobin (MCH), mean reticulocyte volume (MRV), HbF concentration, percentage of Fce11 and proportion of HbF/Fcell were observed in the treated group ofpatients. There was no correlation between Hb and HbF increase. Reticulocyte count, immature reticulocyte count, mean fluorescence index (MFI) and neutrophil count were significantly lower in treated patients. These fmdings taken together suggest that a milder hemolytic process occurred in patients under HU treatment. There was significant correlation between MCV and HbF, MRV and HbF, and between MRV and Fce11 in patients taking HU. These data suggest that macroreticulocytes correspond to Freticulocytes, and that the increased MRV in SCD patients using HU may be an indirect evidence of F cell production. Concentration of HbF/Fcell was higher in patients treated with HU, but it is apparently independent Fcell production. RTC parameters provided by hematological analysers may be use fuI to follow erythropoietic changes in patients using HU and can, indirectly, indicate HbF and Fce11 production induced by HU therapy / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-23Bitstream added on 2014-06-13T18:53:57Z : No. of bitstreams: 1 belinijunior_e_me_sjrp.pdf: 995631 bytes, checksum: d866ab976032b462435b7ca7899faf6d (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A causa principal da doença falciforme (DF) é uma mutação pontual no gene β globina que codifica uma hemoglobina (Hb) com características diferentes da Hb normal, denominada de Hb S. Sua fisiopatologia multifacetada envolve múltiplas alterações nos eritrócitos falcêmicos, episódios vaso-oclusivos, hemólise, ativação de mediadores inflamatórios, disfunção das células endoteliais e estresse oxidativo. Com isso, há uma diminuição do fluxo sanguíneo e obstrução da microcirculação acarretando aos portadores, anemia, crises de dor e insuficiência de múltiplos órgãos. Visto que o excesso de espécies reativas de oxigênio é citotóxico modificando vários mecanismos celulares e, consequentemente, ocasionando danos aos órgãos, pretendeu-se avaliar a capacidade antioxidante e o estresse oxidativo em DF, correlacionando com os genótipos da DF, haplótipos do cluster β globina e o uso de medicação específica. Em um estudo longitudinal, foram avaliadas, para o Tempo 1 (T1) de análise, 69 amostras de sangue e, para o Tempo 2 (T2), 55 amostras de DF do Hemocentro de São José do Rio Preto (SJRP) e do Hemocentro da Santa Casa de São Paulo (SP). As amostras foram submetidas a testes eletroforéticos, cromatográficos e moleculares para a identificação dos genótipos da DF e haplótipos do cluster , bem como dosagens bioquímicas para determinação das espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e da capacidade antioxidante em equivalência ao Trolox (TEAC). Por meio da caracterização genotípica da DF, encontramos um maior número de Hb SS, tanto em SP quanto em SJRP. Houve maior frequência da interação Hb S/Beta talassemia em SJRP (10,9%) com as mutações características de países mediterrâneos como a CD39 e IVS-I-110. O haplótipo Bantu foi mais frequente nos dois grupos (60,6%); o haplótipo II esteve associado à mutação... / The main cause of sickle cell disease (SCD) is a single β-globin gene mutation that encodes a hemoglobin (Hb) with different characteristics from normal Hb, called Hb S. This disease is characterized by presenting a multifaceted pathophysiology which involves multiple changes in sickle erythrocytes, vaso-occlusive episodes, hemolysis, inflammatory mediators activation, oxidative stress and endothelical cells dysfunction. Thereby, there is a decrease in blood flow and obstruction of the microcirculation leading the patients to anemia, pain crises and failure of multiple organs. Since the excess of reactive oxygen species is cytotoxic, modifying various cellular mechanisms, and thus, causing damage to organs, the aim of this work was to assess the antioxidant capacity and oxidative stress in SCD, correlating with SCD genotypes, cluster β-globin haplotypes and specific medication. In a longitudinal study were evaluated for the T1: 69 samples of peripheral blood, and for the T2: 55 samples of the SCD patients from Blood Center of the São José do Rio Preto (SJRP) and the Blood Center of the Santa Casa Medical School of São Paulo (SP). We performed electrophoretics, chromatographic and molecular assays for SCD genotypes and cluster β-globin identification, such as biochemical measurements for the determination of thiobarbituric acid reactive species (TBARS) and Trolox equivalence antioxidant capacity (TEAC). Through SCD genetic characterization, we found a greater number of Hb SS in both SP and in SJRP. There was a higher frequency of interaction Hb S/Beta-thalassemia in SJRP (10.9%) with typical mutation of Mediterranean countries such as CD39 and IVS-I -110. The Bantu haplotype was more frequent in both groups (60.6%); the haplotype II was associated with CD39 mutation and the haplotype I with the IVS-I-110. We found a patient with Cameroon haplotype, rare in the Brasilian... (Complete abstract click electronic access below)

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2018-05-24T17:30:38Z No. of bitstreams: 1 keniadeassisboy.pdf: 53006692 bytes, checksum: 65f398b7012273fa08a2843e4d1f6878 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-06-14T11:54:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 keniadeassisboy.pdf: 53006692 bytes, checksum: 65f398b7012273fa08a2843e4d1f6878 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-14T11:54:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 keniadeassisboy.pdf: 53006692 bytes, checksum: 65f398b7012273fa08a2843e4d1f6878 (MD5) Previous issue date: 2018-03-20 / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A doença falciforme (DF) é um grave problema de saúde pública mundial, com grande impacto na morbimortalidade da população acometida. Até o momento, a hidroxiureia (HU) é considerada a terapia farmacológica de maior sucesso para a DF, pois promove redução do número e gravidade dos eventos falcêmicos, melhora os parâmetros hematológicos, reduz o número de internações e aumenta a expectativa e qualidade de vida dos pacientes. Ainda que sejam evidentes os benefícios do tratamento com HU, existe grande variabilidade interindividual de resposta farmacológica e os fatores genéticos parecem estar associados, em parte, a essa variação. Assim, o objetivo do presente estudo foi investigar se polimorfismos de um único nucleotídeo (SNPs) em quatro genes candidatos relacionados à farmacocinética e farmacodinâmica da HU afetam a resposta hematológica a tal fármaco. Para tanto, foram avaliados 185 pacientes com DF tratados (n=93) ou não tratados (n=92) com HU. Os níveis médios de hemoglobina (Hb), hematócrito (Hct), reticulóticos (Rtc) e leucometria global (LG) foram medidos em cinco diferentes tempos ao longo de 18 meses, enquanto a concentração de hemoglobina fetal (HbF) foi analisada antes e após o tratamento farmacológico. Os pacientes foram agrupados como "respondedores" à HU se os níveis de HbF estivessem maiores que 20%, enquanto aqueles pacientes com níveis inferiores a esse foram considerados como "não respondedores". O DNA genômico foi extraído a partir do sangue total e amostras foram então genotipadas por PCR em tempo real (qPCR) para os polimorfismos G>T (rs1799983) e T>C (rs2070744) no gene da eNOS, C>T (rs17599586) da ARG1, A>C (rs766432) e G>A (rs4671393) do BCL11A e G>A (rs9960464) do gene do UTA. As análises de associação entre as variáveis categóricas foram feitas pelo teste do qui-quadrado ou teste exato de Fisher. Para as variáveis contínuas com distribuição normal, as análises foram realizadas utilizando ANOVA seguido pelo teste t não pareado e as variáveis que não seguiram distribuição normal foram analisadas pelos testes de Wilcoxon, Kruskal-Wallis seguidos por Mann-Whitney. As análises por regressão multivariada e logística foram realizadas através do método stepwise pelo software R. A população estudada apresentou idade de 15,8 ± 11,3 anos e foi constituída de 54% de voluntários do sexo masculino. As frequências genotípica e alélica para os seis SNPs estudados apresentaram-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg e foram semelhantes àquelas encontradas em outras populações. Pacientes com o genótipo GT para o polimorfismo no rs1799983 do gene da eNOS apresentaram maiores valores de Hb quando comparados aos homozigotos para o alelo G (r=0,364; p=0,033). Adicionalmente, a frequência dos genótipos AC e CC no gene BCL11A (polimorfismo A>C rs766432) foi maior entre os pacientes respondedores quando comparado ao grupo dos não respondedores (p=0,03). Além disso, pacientes com o genótipo GA para o polimorfismo no gene UTA também responderam melhor à terapia com HU quando comparados àqueles com o genótipo GG (p=0,005). Não foram encontradas outras influências significativas nos demais polimorfismos avaliados após análise por regressão logística. Em conclusão, este trabalho é pioneiro ao avaliar a influência de polimorfismos nos genes da eNOS, ARG1, BCL11A e UTA na resposta à HU em pacientes com doença falciforme em Minas Gerais. Os achados nos sugerem que pacientes com genótipo GT no rs1799983 do gene da eNOS apresentam maiores valores de Hb quando comparados com genótipo GG. Os polimorfismos A>C (rs766432) no gene do BCL11A (p=0,001) e G>A (rs9960464) do gene UTA (p=0,005) parecem afetar a resposta hematológica à HU, sendo que pacientes que possuem pelo menos uma cópia do alelo de menor frequência possivelmente apresentam maior chance de resposta ao tratamento farmacológico. / Sickle cell disease (SCD) is a serious global public health problem, with great impact on the morbidity and mortality of the affected population. To date, hydroxyurea (HU) is considered the most successful pharmacological therapy for SCD since it promotes a reduction in the number and severity of sickle cell events, improves hematological parameters, reduces the number of hospitalizations and increases the expectation and quality of life of the patients. Although the benefits of the treatment with HU are evident, there is a large inter-individual variability of pharmacological response and genetic factors seem to be partially associated with this variation. Thus, the aim of the present study is to investigate whether single nucleotide polymorphisms (SNPs) in four candidates genes related to the pharmacokinetics and pharmacodynamics of HU affect the hematological response to such a drug. For this, 185 patients were evaluated with SCD, treated with HU (93) or untreated (92). The mean hemoglobin (Hb), hematocrit (Hct), reticulocytes (Rct) and global leukometry (LG) levels were measured at five different times over 18 months, while fetal hemoglobin (HbF) levels were analyzed before and after pharmacological treatment. Patients were grouped as "responders" to HU if HbF levels were higher than 20%, while those patients with levels below this value were considered "non-responders". Genomic DNA was extracted from the whole blood and samples were then genotyped by real-time PCR (qPCR) for the polymorphisms G>T (rs1799983) and T>C (rs2070744) on the eNOS gene, C>T (rs17599586) of ARG1 gene, A>C (rs766432) and G>A (rs4671393) of the gene BCL11A and G>A (rs9960464) of the UTA gene. The analysis of the association between the categorical variables was done by chi-square test or Fisher's exact test. For continuous variables with normal distribution, analyses were performed using ANOVA followed by the unpaired t-test and the variables that did not follow normal distribution were analyzed by the Wilcoxon, Kruskal-Wallis tests followed by Mann-Whitney. The multivariate and logistic regression analyses were performed through the stepwise method by software R. The population studied presented a mean age of 15.8 ± 11.3 years and was made up of 54% of male volunteers. The genotypic and allelic frequencies for the six SNPs studied were in Hardy-Weinberg equilibrium and were similar to those found in other populations. Patients with the GT genotype for rs1799983 polymorphism of the eNOS gene showed higher Hb values when compared to patients homozygous for the G allele (r=0,364; p=0,033). In addition, the frequency of AC and CC genotypes in the BCL11A gene (A>C polymorphism rs766432) was higher among the responders when compared to the non-responders group (p=0,03). In addition, patients with the GA genotype for the UTA gene polymorphism also responded better to HU therapy when compared to those with the GG genotype (p=0,005). No other significant influences were found in the other polymorphisms evaluated after logistic regression analysis. In conclusion, this work is a pioneer in evaluating the influence of polymorphisms in eNOS, ARG1, BCL11A and UTA genes in the response to HU in patients with sickle cell disease in Minas Gerais. The findings suggest that patients with the GT genotype for rs1799983 of the eNOS gene showed higher Hb values when compared to GG genotype. The A> C polymorphisms (rs766432) in the BCL11A (p=0,001) and G> A gene (rs9960464) of the UTA gene (p=0,005) appear to affect the hematological response to HU, and patients who have at least one copy of less frequent allele may present higher chance of respond to pharmacological treatment.

Orientador: Fernando Ferreira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T03:49:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gambero_Sheley_D.pdf: 3649073 bytes, checksum: a76d9a7da22f0e08a3f4556b9b24330f (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A anemia falciforme (AF) é um distúrbio genético da hemoglobina causado por uma mutação de ponto no gene da beta-globina com consequente produção de hemoglobina S (HbS). A polimerização de HbS causa a deformação, enrijecimento e diminuição da flexibilidade das hemácias, resultando em uma série de eventos que levam a redução da sua vida média. Os principais fatores que influenciam a polimerização são: concentração de oxigênio e concentração de hemoglobina fetal (HbF). Pacientes com AF apresentam aumento dos níveis circulantes de citocinas, incluindo fator de necrose tumoral-'alfa' (TNF-'alfa') que possui efeitos pró-inflamatórios resultando no aumento das propriedades quimiotáxicas e a aderência de neutrófilos ao endotélio vascular. Muitos estudos têm sido realizados com o intuito de buscar novas estratégias terapêuticas que contribuam para o aumento dos níveis de HbF e diminuam os níveis de citocinas inflamatórias. Com este objetivo, novos compostos que agregam funções anti-inflamatórias e são moléculas doadoras de óxido nítrico, foram desenvolvidas. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos dos compostos derivados da hidroxiureia e da talidomida na produção de HbF, na atividade quimiotática e na produção de espécies reativas de oxigênio em células de pacientes com anemia falciforme e indivíduos controles, tratadas com o composto denominado Lapdesf 1, assim como a concentração de citocinas inflamatórias, em culturas de células mononucleares de camundongos falciforme. Os resultados obtidos demonstram que o composto Lapdesf 1 foi capaz de aumentar os níveis de HbF em cultura de células CD34+ e em linhagem celular K562. Os neutrófilos de indivíduos controles e pacientes com AF, tratados com este composto apresentaram a capacidade quimiotática induzida por Il-8 significativamente reduzida em relação ao controle, e o tratamento com Lapdesf 1 não alterou a geração de espécies reativas de oxigênio em plaquetas, neutrófilos, eritrócitos e células mononucleares. O tratamento de camundongos transgênicos para a AF demonstrou a capacidade desse composto em aumentar os níveis de HbF, além de diminuir a quantidade de citocinas inflamatórias no sobrenadante de culturas de células mononucleares de camundongos. Em resumo nossos resultados sugerem que o composto Lapdesf 1, apresenta-se como uma nova alternativa terapêutica, pela capacidade de aumentar a síntese de HbF e diminuir os níveis de citocinas inflamatórias e seus efeitos, que merece ser testada como possível tratamento da anemia falciforme / Abstract: Sickle cell anemia is a genetic hemoglobin disorder caused by a point mutation that produces hemoglobin S (HbS). Polymerization of HbS causes deformation, stiffness and decreased flexibility of red blood cells, resulting in different events. The main factors influencing polymerization are: oxygen concentration and intracellular concentration of fetal hemoglobin (HbF). It has been reported that patients with sickle cell disease have increased circulating levels of cytokines, including tumor necrosis factor-'alfa' (TNF-'alfa') which has pro-inflammatory effects, resulting in increased chemotactic properties and adhesion of neutrophils to vascular endothelium. Many studies have been conducted in order to pursue new therapeutic strategies that increase fetal hemoglobin levels and lower levels of inflammatory cytokines. New compounds have been developed for the treatment of some sickle cell anemia symptoms. These compounds have several functions: they act as antiinflammatory agents, and donate nitric oxide. Thus the objectives of this study were to evaluate effects of compounds derived from hydroxyurea and thalidomide in the production of HbF, chemotactic activity and production of reactive oxygen species in cells from patients with sickle cell anemia and controls treated with the compound called Lapdesf1, and also the concentration of inflammatory cytokines in cultures of mononuclear cells from sickle cell mice. Our results demonstrate that the compound, Lapdesf 1, was able to increase levels of fetal hemoglobin in CD34+ cultured cells and K562 lineage cells. Neutrophils from control subjects and patients with sickle cell anemia had their chemotactic capacity significantly reduced following treatment with this compound; furthermore, the compound did not alter the generation of reactive oxygen species in platelets, neutrophils, red cells and mononuclear cells. Treatment of transgenic sickle cell anemia mice demonstrated the ability of the compound to increase fetal hemoglobin in vivo and reduce the amount of inflammatory cytokines such as TNF-'alfa', IL-8, IL-6 and IL- 1ß in the supernatant of cultures of mononuclear cells from sickle mice. In summary, our results suggest that the compound Lapdesf 1 has the ability to increase HbF synthesis and decrease the levels of inflammatory cytokines and their effects. So this compound may present promise as a new drug for the treatment of sickle cell disease, minimizing the clinical complications associated with this disease / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

Orientadores: Fernando Ferreira Costa, Nicola Conran / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-07T10:27:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gambero_Sheley_M.pdf: 2005109 bytes, checksum: faec483bdfe41c20b920e16808d8eb59 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A anemia falciforme é um distúrbio genético da hemoglobina causado por uma mutação de ponto produzindo hemoglobina S (HbS) que quando desoxigenada causa, entre outros sintomas, eventos vaso-oclusivos. Um dos mecanismos indicados como causador da vaso-oclusão é a adesão de hemácias falciformes ao endotélio dos vasos. Eritrócitos falciformes e normais aderem ao endotélio vascular utilizando moléculas de adesão como, CD 36 e integrina VLA-4, entre outras moléculas de adesão. Hidroxiuréia (HU) é um agente quimioterápico que diminui a freqüência de crises vaso-oclusivas, síndrome torácica aguda e necessidade de transfusão. Longos tratamentos com HU levam a uma redução global das proteínas de superficie dos neutrófilos, monócitos e linfócitos, além de aumentar os níveis de Hemoglobina fetal (Hb F), que inibe a polimerização da célula falciforme desoxigenada. O NO é um importante vaso-dilatador responsável por inúmeros efeitos benéficos durante as crises vaso-oclusivas. Estudos demonstram que o NO pode diminuir a expressão endotelial de moléculas de adesão, mas estudos diretos sobre os níveis de expressão dessas moléculas em anemia falciforme na presença de NO não tem sido encontrados na literatura. Deste modo objetivamos neste trabalho, analisar a expressão, gênica e protéica, e a função das moléculas de adesão VLA-4 (CD49d ou cadeia a. e CD29 ou cadeia 13) e CD 36 em células vermelhas de pacientes com anemia falciforme com e sem terapia com HU e os efeitos do tratamento in vitro com HU e agentes doadores de NO na adesão dessas células. Analisando a adesão das células vermelhas normais e de pacientes com e sem terapia com HU confirmamos que as células vermelhas de pacientes falciformes são mais aderentes que as células vermelhas normais e que a terapia com HU provoca uma diminuição dessa aderência. A citometria de fluxo comprovou a maior presença de células CD36+ e CD49d+ além de maior índice de expressão dessas moléculas nos pacientes falciformes em relação ao controle e a diminuição da expressão e positividade dessas moléculas em células de pacientes em terapia com HU quando comparadas com pacientes sem terapia. Adicionalmente, a análise por Real Time PCR demonstrou que a expressão gênica de CD36, CD49d e CD29 em reticulócitos falciformes é significativamente menor em pacientes em terapia com HU quando comparado com pacientes que não recebem essa terapia. Em resumo, nossos resultados sugerem que: as propriedades adesivas à fibronectina (FN) são aumentadas em células SS e que estas propriedades diminuem nos pacientes que tomam a terapia de HU; a terapia com HU diminui a expressão protéica e a positividade, das células vermelhas falciformes, hemácias e células jovens, para os receptores CD36 e CD49d; e a expressão gêniea das moléculas de adesão CD36 e CD49d em reticulócitos de pacientes com anemia falciforme que recebem terapia com HU é diminuída em relação ao grupo de pacientes falciformes que não recebem essa terapia / Abstract: Sickle cell vaso-occlusion constitutes a complex process involving interactions between SS red blood cells (RBC), endothelial cells, leukocytes, platelets, coagula tive factors and plasma proteins. Propagation ofthe vaso-occlusive process in sickle cell anemia (SCA) is a complex process involving the adhesion of SS red cells and reticulocytes to the vascular endothelium. The effect of hydroxyurea therapy (HUT) on the adhesive properties of sickle red cells and the expression of adhesion molecule genes by erythroid cells of SCA individuals is not yet fully understood. The expressions of the CD36 gene and the VLA-4 integrin subunit genes, CD49d (a-subunit) and CD29 (J3-subunit), were compared in the reticulocytes of steady-state SCA patients and patients on HUT using Real-Time PCR Basal adhesion of red cells ftom these subjects was also compared using static adhesion assays, as was surface protein expression, using flow cytometry. Basal sickle red cell adhesion to fibronectin was significantly greater than that of normal cells (P<O.OI); in contrast, HUT significantly decreased (P<O.OI) red cell adhesion to levels similar to those of control cells and this decrease could not be justified solely by alterations in reticulocyte numbers in this population. Accordingly, flow cytometry demonstrated that HUT significantly decreased CD36 and CD49d surface expression (P<O.Ol) and, importantly, significant reductions in the expressions of the CD36, CD49d and CD29 genes were seen (P<O.O5) in the reticulocytes of SCA patients on HU. Taken together, data support the hypothesis that HUT reduces the adhesive properties of sickle cells and that this decrease appears to be mediated, at least in part, by a decrease in the gene and, consequently, surface protein expression of adhesion molecules such as VLA-4 and CD36 / Mestrado / Patologia Clinica / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Nicola Amanda Conran Zorzetto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T23:21:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vital_DaianaMorelli_M.pdf: 1971637 bytes, checksum: 022329e1e83ad1bd2ea02de3d37d61c9 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A inflamação é uma resposta fisiológica normal à infecção ou lesão tecidual que permite a sobrevivência do indivíduo a diversos agentes lesivos e mantém a homeostase dos tecidos sob uma variedade de condições nocivas. Os neutrófilos têm um papel importante em processos inflamatórios e, na presença de estímulos inflamatórios, como citocinas e quimiocinas, são recrutados da circulação para o tecido inflamado por uma sequência de interações adesivas. Recentemente, novas técnicas in vitro têm levado a importantes avanços no entendimento de patologias vasculares e hematológicas e sistemas microfluídicos, que mimetizam a microcirculação humana, demonstrando a utilidade para o estudo de interações adesivas de células inflamatórias. As interações dos neutrófilos e outros leucócitos com a parede vascular tem contribuição importante para as doenças inflamatórias crônicas, como a anemia falciforme (AF) e aterosclerose, pois podem participar em processos de oclusão vascular. O objetivo deste trabalho foi avaliar se a hidroxiureia (HU), uma droga utilizada como terapia na AF, modula as propriedades adesivas de neutrófilos quando incubados in vitro com a droga e frente um estímulo inflamatório. Os neutrófilos, isolados do sangue periférico de indivíduos saudáveis, foram estimulados com a citocina TNF-? (Fator de Necrose Tumoral alfa) e tratados com HU em três concentrações (100, 500, 1000 ?M); as propriedades adesivas das células foram avaliadas por ensaios de adesão estática e por ensaios microfluídicos, utilizando como ligantes proteínas expressas no endotélio (ICAM-1 e E-selectina), proteínas da matriz extracelular (fibronectina - FN) e células endoteliais (HUVEC). Além disso, foi analisada a ativação celular (spreading celular, observado como o espalhamento das células redondas que se tornam achatadas sobre um substrato sólido 2D). Observamos que os neutrófilos, quando estimulados com TNF-?, demonstram aumentos significantes na adesão e spreading celular. O pré-tratamento das células com HU reduziu significativamente o spreading dos neutrófilos nas três proteínas estudas (FN, ICAM-1 e E-selectina). Sob condições estáticas, o pré e o pós-tratamento dos neutrófilos com a HU diminuiu significativamente a adesão à FN quando comparados ao estimulados por TNF-?. Nos ensaios de adesão em fluxo, foi possível observar que o pré-tratamento com HU nas três concentrações (100, 500 e 1000 ?M) diminuiu significativamente a adesão dos neutrófilos a FN e o pós-tratamento com HU diminuiu apenas na concentração de 100 ?M. Avaliamos a adesão em fluxo de neutrófilos aderidos a proteínas de adesão presentes no endotélio, ICAM-1 e E-selectina; o pré e o pós-tratamento de neutrófilos com HU diminuiu a suas propriedades adesivas frente ao estímulo inflamatório de TNF-? à proteína E-selectina, enquanto que o pré-tratamento nas três concentrações diminuiu a adesão dos neutrófilos ao ICAM-1 e ao ICAM-1 e E-selectina adicionados juntos ao chip. A técnica de citometria de fluxo demonstrou que as integrinas LFA-1 (CD11a) e Mac-1 (CD11b), mostraram-se aumentadas na superfície dos neutrófilos após estímulo com TNF-?. Todavia, a expressão da L-selectina, mostrou-se diminuída com este potente estímulo inflamatório, provavelmente devido o mecanismo de "shedding" celular. A incubação dos neutrófilos com HU, após o estímulo com o TNF-?, reduziu significativamente a expressão de CD11a nos neutrófilos tratados com HU nas concentrações de 100 e 1000 ?M para níveis de expressão equivalentes ao grupo de neutrófilos não estimulados com TNF-?. Observamos também que houve aumento da presença da integrina LFA-1 (CD11a) na sua conformação ativada, após estímulo com TNF-? e que a pós-incubação das células estimuladas com HU na concentração de 1000 ?M, reduziu a ativação da subunidade CD11a da molécula de adesão LFA-1, comparado ao grupo apenas estimulado com TNF-?. Diante destes resultados, é possível concluir que o tratamento de neutrófilos com HU foi capaz de proteger ou até reverter algumas das ações inflamatórias do TNF-?. A HU é utilizada como uma terapia de uso crônico em pacientes com AF, mas estes dados indicam que a HU também pode exercer efeitos imediatos que são independentes da elevação de hemoglobina fetal. Dados melhor clarificam o mecanismo de ação de HU na AF e sugerem que a droga pode ter potencial para uso em outras doenças inflamatórias. Ainda será necessário entender como a HU exerce estes efeitos anti-inflamatórios nos neutrófilos / Abstract: Inflammation is a normal physiological response to infection or tissue injury that defends against various damaging agents and maintains tissue homeostasis in a variety of deleterious conditions. Neutrophils play an important role in inflammatory processes and, in the presence of inflammatory stimuli, such as cytokines and chemokines, are recruited from the circulation into the inflamed tissue by a sequence of adhesive interactions. Recently, new in vitro techniques have led to significant advances in our understanding of vascular and hematological conditions and microfluidic systems that mimic the human microcirculation have been shown to be useful for the study of adhesive interactions in inflammatory cells. The interaction of neutrophils and other leukocytes with the vascular wall makes an important contribution to chronic inflammatory diseases, such as sickle cell anemia (SCA) and atherosclerosis, as these may participate in vascular occlusion processes. The aim of this study was to evaluate whether hydroxyurea (HU), a drug used as a therapy in SCA, modulates the adhesive properties of neutrophils in vitro under an inflammatory stimulus. The neutrophils isolated from the peripheral blood of healthy subjects were stimulated with the cytokine TNF-? (Tumor Necrosis Factor alpha) and treated with HU in three concentrations (100, 500, 1000 ?M); the adhesive properties of the cells were evaluated by static adhesion assays and microfluidic assays using ligands such as proteins expressed on the endothelium (ICAM-1 and E-selectin), extracellular matrix proteins (fibronectin - FN) and endothelial cells (HUVEC). Furthermore, cellular activation was evaluated as cell spreading (observed when round cells become flattened and spread on a 2D solid substrate). When stimulated with TNF-?, neutrophils presented a significant increase in cell adhesion and spreading. Pre-treatment of cells with HU significantly reduced neutrophil spreading on all three proteins studied (FN, ICAM-1 and E-selectin). Under static conditions, the pre-treatment and post-treatment of neutrophils with HU significantly decreased adhesion to FN, compared to TNF-?-stimulated cells. In the flow adhesion assays, pre-treatment of neutrophils with HU at three concentrations (100, 500 and 1000 ?M) significantly reduced the adhesion of neutrophils to FN and post-treatment with HU decreased only at the concentration of 100 ?M. We evaluated the in vitro flow adhesion of neutrophils to proteins present on endothelial cells, ICAM-1 and E-selectin; pre-treatment and post-treatment of neutrophils with HU decreased their adhesive properties after TNF-? inflammatory stimulus to the E-selectin ligand, while pre-treatment in the three concentrations decreased neutrophil adherence to ICAM-1 ligand and ICAM-1/E-selectin ligands added together to the chip. Flow cytometry demonstrated that the expressions of the integrins LFA-1 (CD11a) and Mac-1 (CD11b) were elevated on the surface of neutrophils after a TNF-? stimulus. However, L-selectin expression was reduced with this potent inflammatory stimulus, probably due to the mechanism of "shedding". Incubation of neutrophils with HU (100 and 1000 ?M), after stimulation with TNF-?, significantly reduced the CD11a expression on neutrophils to levels similar to those found on the neutrophils of the non-TNF-?-stimulated group. We also observed that there was an increased expression of the LFA-1 (CD11a) integrin in its active conformation after stimulation with TNF-? and that, post-incubation with HU (1000 ?M) was able to reduce the activation of the adhesion molecule CD11a (LFA-1 subunit), compared to the group with TNF-? stimulus only. Given these results, it is possible to conclude that treatment of neutrophils with HU was able to protect or even reverse some of the inflammatory actions of TNF-?. HU is used as a chronic therapy in patients with SCA, but our data indicate that HU may also have immediate effects that are independent of the increase in fetal hemoglobin usually observed in patients in therapy. Our results further clarify the mechanism of action of HU in SCA and suggest that this drug may have potential for use in other inflammatory diseases. Further studies will be needed to better comprehend how these HU anti-inflammatory effects act on neutrophils / Mestrado / Fisiopatologia Médica / Mestra em Ciências

Orientador: Fernando Ferreira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-13T02:17:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moreira_LucianaSarmento_D.pdf: 2827950 bytes, checksum: 18e2b9c5f588fd10a022f548459239b5 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Anemia Falciforme (AF) é uma desordem hereditária das hemoglobinas, ausada por uma substituição de um único nucleotídeo adenina por timina (GAG?GTG), que resulta na presença de um aminoácido valina ao invés de ácido glutâmico na cadeia ? e na formação de uma hemoglobina anormal denominada hemoglobina S (Hb S). Hb S possui uma tendência de polimerização no estado deoxigenado. O grau de polimerização de Hb S na circulação determina o quanto um indivíduo terá crises vaso-oclusivas ou outro evento adverso. Altos níveis de hemoglobina fetal (Hb F) durante a vida adulta estão associados a uma melhora nos sintomas clínicos da AF devido à sua habilidade em inibir a polimerização de Hb S. Consequentemente, a busca por moduladores terapêuticos de Hb F continua a motivar a pesquisa básica e clínica, resultando em vários agentes farmacológicos que tem demonstrado um efeito no aumento da produção de Hb F. Hidroxiuréia (HU) é um fármaco que tem sido utilizado com sucesso na terapia de AF. Estudos multicêntricos demonstram que a administração de HU a pacientes com AF aumenta significativamente a produção de HbF e melhora os sintomas clínicos, pela redução da frequência de crises de dor e vaso-oclusivas, síndrome torácica aguda, necessidade de transfuções e hospitalizações. Acredita-se que HU beneficie indivíduos com AF através de vários mecanismos, incluindo o aumento dos níveis de Hb F. HU também promove a proliferação de precursors eritróides e uma diferenciação eritróide acelerada. Entretanto, o mecanismo completo de atuação da HU permanence desconhecido. Tem sido demonstrado que HU induz a expressão do gene ?-globina, possivelmente pela indução da via da guanilato ciclase, ou pelo aumento da expressão de fatores de transcrição, como EGR1, GATA-1 e outros genes com papel importante na eritropoese. Em um estudo recente, o padrão de expressão gênica global de células de medulla óssea humana foi avaliado em uma paciente com AF antes e após a administração de HU, utilizando SAGE (Serial Analysis of Gene Expression). Os autores identificaram vários genes envolvidos em diversos processos biológicos, tais como fatores de transcrição, transdução de sinal e atividade de transporte de canal ou poro, que podem representar novos alvos para a terapia da AF. Aqui, neste trabalho, nós investigamos o possível envolvimento de genes na indução da transcrição de ?-globina, utilizando o método SSH (Suppression Subtractive Hybridization) como um rastreamento inicial para identificar transcritos diferencialmente expressos na linhagem eritroleucêmica K562 com e sem a administração de HU, e reticulócitos obtidos de pacientes com AF (SSH) submetidos ou não submetidos ao tratamento com HU. A expressão de alguns genes identificados também foi avaliada por PCR em tempo real. Nós identificamos NACA (nascent-polypeptide-associated complex alpha subunit), STAT5 (signal transducer and activator of transcription-5), CRTC2 (CREB regulated transcription coactivator 2), ZDHHC2 (zinc finger, DHHC-type containing 2), dentre outros genes diferencialmente expressos, e confirmamos, por PCR em tempo real, seu aumento de expressão em reticulócitos de um grupo de pacientes em tratamento com HU. Como discutido aqui, estes genes podem desempenhar um papel importante no mecanismo de ação da HU. Este é o primeiro estudo demonstrando uma associação entre o tratamento com HU e a expressão dos genes descritos em células eritróides. Entretanto, estas alterações podem ter um papel importante no aumento típico de HbF nas células de pacientes tratados com HU e na diferenciação eritróide. Estudos funcionais posteriores com os genes mencionados podem ajudar na elucidação de seu papel potencial na regulação de globinas e na diferenciação eritróide mediada por HU ou outros agentes quimioterápicos, bem como contribuir para a compreensão dos mecanismos genéticos envolvidos em patologias das células eritróides, como AF e talassemias / Abstract: Sickle cell anemia (SCA) is an inherited disorder of hemoglobin, caused by a single nucleotide substitution of thymidine for adenine (GAG?GTG) in the ?-chain that results in the presence of the amino acid valine instead of glutamic acid and the formation of an abnormal hemoglobin called hemoglobin S (Hb S). Hb S is responsible for alterations in the properties of the hemoglobin tetramer, which has a tendency to polymerize in the deoxygenated state. The degree of Hb S polymerization in the circulation determines how likely the individual is to experience a vaso occlusive crisis or other adverse event. High levels of fetal haemoglobin (Hb F) during adult life have long been recognized to ameliorate the clinical symptoms of SCA due to its ability to inhibit the polymerization of Hb S. Consequently, the decades-long search for therapeutic modulators of Hb F has continued to motivate basic and clinical investigators alike. As a result, several pharmacological agents have been shown to increase Hb F production. A drug that has been successfully used for therapy in SCA is hydroxyurea (HU). Multicenter studies have shown that HU administration to SCA patients significantly increases Hb F production and improves clinical symptoms by reducing the frequency of pain and vaso-occlusive crisis, acute chest syndrome, transfusion requirements and hospitalizations. This drug is thought to benefit SCA individuals via several mechanisms, including the increase of Hb F levels. HU also promotes proliferation of erythroid precursors and an accelerated erythroid differentiation. However the complete pathway by which HU acts remains unclear. HU has been shown to induce the expression of ?-globin genes, possibly by the induction of guanylate cyclase protein kinase G pathways, or by the enhancement of the expression of transcription factors, such as early growth response 1 (EGR1), GATA-1 and other genes with important roles in erythropoiesis. In a recent study, Costa et. al. evaluated the global gene expression pattern of human bone marrow cells from a SCA patient before and after the administration of HU, using SAGE (Serial Analysis of Gene Expression). These authors identified a set of genes involved in various such as pathways as transcriptional factors, signal transduction and channel or pore class transporter activity that may represent new targets for SCA therapy. We herein, investigated the possible involvement of genes in HU- mediated induction of fetal globin transcription, using the suppression subtractive hybridization (SSH) method as an initial screen to identify differentially-expressed transcripts in K562 erythroleukemia cell line without and under HU administration and reticulocytes obtained from SCA patients in use or not of HU treatment. The expression of some of the detected genes were also evaluated using Real Time PCR. We identified NACA (nascent-polypeptide-associated complex alpha subunit), STAT5 (Signal transducer and activator of transcription-5), CRTC2 (CREB regulated transcription coactivator 2), ZDHHC2 (zinc finger, DHHC-type containing 2) transcripts, among other differentially expressed genes, and confirmed, by Real-Time PCR, their over-expression upon HU treatment in circulating reticulocytes from SCA patients. As discussed herein, these genes may play an important role in the mechanism of action of HU / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica