TORRES, Alba Fabiola Costa. Ação antibacteriana antifúngica e antiparasitária de veneno de serpentes do gênero Bothrops e suas frações fosfolipase A2 e L-Aminoácido oxidase. 2009. 101 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Fortaleza, 2009. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-12-14T14:38:42Z No. of bitstreams: 1 2009_dis_afctorres.pdf: 2178640 bytes, checksum: 4644d2bdefaf8f6b7927d8188303e1ef (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2012-12-17T13:51:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_dis_afctorres.pdf: 2178640 bytes, checksum: 4644d2bdefaf8f6b7927d8188303e1ef (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-17T13:51:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_dis_afctorres.pdf: 2178640 bytes, checksum: 4644d2bdefaf8f6b7927d8188303e1ef (MD5) Previous issue date: 2009 / Snakes venoms contain biologically active substances primarily consisting of proteins (90-95%). Some of these present enzymatic activities, such as phospholipases A2 and the L-amino acid oxidases. In this study we verify the action of Bothrops leucurus (BleuTV) and Bothrops marajoensis (BmarTV) venoms, and fractions PLA2 (BleuPLA2 and BmarPLA2) and LAAO (BleuLAAO and BmarLAAO) on strains of bacteria, yeast, Leishmania sp and T. cruzi. The susceptibility of bacterial and yeast strains was analyzed through disc-diffusion assay, for determination of antimicrobial potential; and the microdilution method, for determination of MIC and MLC, with modifications. The antiparasitic activity was evaluated through of the culture treatment of parasites with different concentrations of venoms or their fractions. The forms promastigotes of Leishmania sp. had been cultived, during 72h, in NNN/Schneider media, 28ºC; and the forms epimastigotes of T. cruzi had been cultived in LIT media, during 5d, 28ºC. The macrophages were cultured in RPMI 1640 media, during 24h, 37ºC and 5% of CO2, with different concentrations of venoms or fractions. After, they were analyzed by MTT method. The results was statistically analyzed with t test or ANOVA followed the Bonferroni’s test, when appropriated, with p<0.05. The BmarLAAO was able to inhibit the growth of gram negative P. aeruginosa, of yeast C. albicans and of gram positive S. aureus; and the BleuTV inhibited the growth of S. aureus, being the inhibitions dose-dependent. The order of susceptibility of microorganisms tested against BmarLAAO was S. aureus > C. albicans > P. aeruginosa. On the other hand the BmarTV, BmarPLA2, BleuPLA2 and BleuLAAO had not provided any degree of inhibition on strains in study. The inhibitory effect was more significant on S. aureus presenting CIM= 50µg/mL and CLM=200µg/mL for BmarLAAO, and CIM=CLM=25µg/mL for the BleuTV. In concentrations greater than 1.56µg/mL BmarLAAO was able to inhibit the growth of promastigotes forms of L. chagasi and L.amazonensis, after 72h of culture. The IC50 values were 2.55µg/mL for L. amazonenis, and 2.86 µg/mL for L. chagasi. BmarTV and BleuTV also provided significant inhibition of the parasitic growth, with an IC50 value of 86.56 µg/mL for L. amazonensis and 79.02 µg/mL for L. chagasi, when treated with BmarTV; and 5.49µg/mL for L. amazonensis and 1.94µg/mL for L. chagasi, when treated with BleuTV. The venoms and BmarLAAO showed inhibitory effect on epimastigotes forms of T. cruzi. The IC50 value for BleuTV, BmarTV and BmarLAAO where, respectively 1.14µg/mL, 24.19µg/mL and 0.89µg/mL.This effects presented behavior dose-dependent. The fractions BmarPLA2, BleuPLA2 and BleuLAAO had not been capable to promote any inhibition on the growth of these parasites. The BmarLAAO, BmarTV and BleuTV presented low toxicity in studied concentrations. In conclusion, the whole venoms as well as the L-amino acid oxidase from Bothrops marajoensis showed to be capable to interfere in the growth of several microorganisms as S.aureus, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Leishmania sp. and T. cruzi. / Os venenos de serpentes contem substâncias biologicamente ativas, primariamente consistindo de proteínas (90-95%). Algumas delas apresentam atividade enzimática como as fosfolipases A2 e L-aminoácido oxidase. O presente estudo verificou a ação dos venenos de Bothrops leucurus (BleuVT) e Bothrops marajoensis (BmarVT), e suas frações PLA2 (BleuPLA2 e BmarPLA2) e LAAO (BleuLAAO e BmarLAAO) sobre cepas de bactéria, C. albicans, Leishmania sp e T. cruzi, bem com sua toxicidade sobre macrófagos murinos. A susceptibilidade das cepas bacterianas e fúngica foi analisada através do método de difusão em ágar, para determinação do potencial antimicrobiano; e microdiluição em caldo, para determinação da CIM e CLM, com modificações. A atividade antiparasitária foi avaliada através do tratamento das culturas de parasitos com diferentes concentrações dos venenos ou de suas frações. As formas promastigotas de Leishmania sp. foram cultivadas, durante 72h, em meio NNN/Schneider a 28ºC; e as formas epimastigotas de T. cruzi foram cultivadas em meio LIT, durante 5 dias, a 28ºC. Os macrófagos foram cultivados em meio RPMI 1640, em presença de diferentes concentrações dos venenos e frações, durante 24h, e submetidos ao ensaio com MTT. Os resultados foram estatisticamente analisados através do teste t ou ANOVA seguida do teste Bonferroni, quando apropriado, com p<0.05. A BmarLAAO foi capaz de inibir o crescimento bacteriano do Gram-negativo P. aeruginosa, da levedura C. albicans e do Gram-positivo S. aureus; e o BleuTV inibiu o crescimento de S. aureus, sendo a inibição dose-dependente. A ordem de susceptibilidade dos microorganismos testados com BmarLAAO foi S. aureus > C. albicans > P. aeruginosa. Por outro lado o BmarTV, BmarPLA2, BleuPLA2 e BleuLAAO não apresentaram nenhum grau de inibição sobre as cepas em estudo. O potencial inibitório foi mais significante sobre S. aureus apresentando CIM= 50µg/mL e CLM=200µg/mL para BmarLAAO, e CIM=CLM=25µg/mL para BleuTV. Em concentrações maiores que 1.56µg/mL a BmarLAAO foi capaz de inibir o crescimento de formas promastigotas de L. chagasi e L.amazonensis, sendo os valores de IC50, após 72h de cultivo, para L. amazonenis, 2.55µg/mL e 2.86 µg/mL para L. chagasi. BmarTV e BleuTV também apresentaram significante inibição sobre o crescimento parasitário, sendo os valores de IC50 86.56 µg/mL para L. amazonensis e 79.02µg/mL para L. chagasi, quando tratado com BmarTV; e 5.49µg/mL para L. amazonensis e 1.94µg/mL para L. chagasi, quando tratado com BleuTV. Os venenos e BmarLAAO mostraram efeito inibitório sobre formas epimastigotas de T. cruzi. Os valores de IC50 para BleuTV, BmarTV e BmarLAAO foram, respectivamente, 1.14µg/mL, 24.19µg/mL e 0.89µg/mL. As frações BmarPLA2, BleuPLA2 e BleuLAAO não foram capazes de promover nenhum efeito inibitório sobre os parasitos em estudo. O BmarLAAO , BmarTV e BleuTV apresentaram baixa toxicidade sobre macrófagos nas concentrações estudadas. Em conclusão, os veneno de B. leucurus e de B. marajoensis, bem como a L-aminoácido oxidase de Bothrops marajoensis mostraram ser capazes de interferir no crescimento de diferentes microorganismos como S.aureus, C. albicans, P. aeruginosa, Leishmania sp. e T. cruzi.

NERY, Marinetes Dantas de Aquino. Efeitos biológicos e caracterização inicial da peçonha da serpente Philodryas nattereri steindachner 1870. 2012. 206 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortleza, 2012. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-06-06T13:10:33Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_mdanery.pdf: 7462167 bytes, checksum: b3210d2007bbb99f761f89651d8fe108 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-06-06T13:14:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_mdanery.pdf: 7462167 bytes, checksum: b3210d2007bbb99f761f89651d8fe108 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-06-06T13:14:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_mdanery.pdf: 7462167 bytes, checksum: b3210d2007bbb99f761f89651d8fe108 (MD5) Previous issue date: 2012 / A peçonha da serpente Philodryas nattereri é uma mistura de proteínas e peptídeos tóxicos com diversas ações locais e sistêmicas importantes, similares às que ocorrem nos acidentes botrópicos. Os mecanismos envolvidos nas ações locais e sistêmicas desta peçonha são pouco conhecidos. O objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos renais, cardiovasculares, citotóxicos e a identificação molecular da peçonha bruta. O teor proteíco total da peçonha foi de 85-90% de proteínas. Foram utilizados ratos Wistar nos experimentos de perfusão de rim isolado, em que o orgão foi perfundido com a peçonha da serpente Philodryas nattereri em diversas concentracões para se determinar as possíveis alterações em parâmetros funcionais, além de alterações vasculares em anel de aorta e pressão arterial. A peçonha foi utilizada em células epiteliais de túbulos renais de cachorro (MDCK) e macrófago peritonial de rato (RAW) e mensurada por pletismografia. O edema de pata, as contorções abdominais e a injeção intramuscular foram realizados em camundongos Swiss. A peçonha foi testada em cepas de bactérias Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella choleraesuis subsp, Staphylococcus aureus e as culturas foram diluidas 100x. Para a determinação do número de cromossomos da serpente Philodryas nattereri e Philodryas olfersil, utilizou-se uma cultura temporária de leucócitos. Da glândula de Duvernoy construiu-se uma Biblioteca de cDNA com o objetivo de identificar seus genes. A peçonha bruta foi submetida a RMN (Ressonância Magnética Nuclear). Os resultados encontrados demonstraram que a peçonha da Philodryas nattereri promoveu alterações em todos os parâmetros renais estudados, principalmente na diminuição da pressão renal (PP) e da resistência vascular renal (RVR), assim como um aumento do fluxo urinário (FU) e do ritmo de filtração glomerular (RFG). O resultado mais relevante é que essa peçonha é altamente lesiva aos túbulos renais, sendo tal fato comprovado com a redução do percentual de transporte dos eletrólitos de sódio (Na+), (K+) e cloreto (CI¯) nas concentrações estudadas, independente da redução da PP. O clearance osmótico e as alterações nos glomérulos e túbulos com material proteíco e hemorrágico. As lesões foram observadas por análise histológica, mediante indícios de apoptose/ necrose e verificadas na cultura das células MDCK. A redução da pressão arterial e da frequência cardiaca parecem estar relacionadas ao relaxamento de vasos renais, cujos efeitos vasodilatadores foram comprovados nos protocolos de anel de aorta. A peçonha da Philodryas nattereri parece comprometer os túbulos renais, independentemente das ações vasculares. O edema de pata causado pela peçonha atingiu o máximo 2 horas após a inoculação e foi inibido pelo dexametasona e o soro anti-bothrops já a indometacina não foi capaz de interferir significativamente no edema. A injeção intramuscular de 50μg da peçonha produziu efeitos de desorganização das fibrilas musculares, hemorragia interfibrilar, edema infiltrado inflamatório e mionecrose dos tipos coagulativa e miolítica. Verificou-se que estas alterações diminuiram com o passar do tempo. As contorções abdominais causadas pela peçonha parecem ser tão agressivas quanto o acido acético quando comparado ao controle salino. A atividade da peçonha em cultura de bactérias foi significante para as culturas S. aureus, P. aeruginosa e Salmomela entretanto não apresentou significância para E. Coli. As serpentes Philodryas nattereri e Philodryas olfersii possuem um número de cromossomos 2n = 36. Da extração do RNAtotal da glândula da peçonha, junto com a enzima transcriptase reversa in vitro produziu-se RNAm transcrito a partir de vários genes diferentes. Assim, os DNAc clonados constituem uma biblioteca de cDNA com uma coleção de genes. Os resultados espectrofotômétrico de RMN da peçonha bruta da serpente Philodryas nattereri revelaram na identificação da presença de acoplamentos 13C, !H por comprimento de onda de rádio.

MENEZES, Ramon Róseo Paula Pessoa Bezerra de. Estudo da atividade enzimática e dos efeitos do veneno da serpente Bothropoides insularis sobre macrófagos RAW 264.7 in vitro. 2013. 95 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2014-03-17T12:55:11Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_rrppbmenezes.pdf: 1516830 bytes, checksum: 86a400657ecf5d9f932cff467f9e5916 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2014-03-17T12:55:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_rrppbmenezes.pdf: 1516830 bytes, checksum: 86a400657ecf5d9f932cff467f9e5916 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-03-17T12:55:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_rrppbmenezes.pdf: 1516830 bytes, checksum: 86a400657ecf5d9f932cff467f9e5916 (MD5) Previous issue date: 2013 / Around the world, there are recorded over 3 million accident involving bites of venomous animals per year, of which 125 to 150 thousand culminate in death. In Brazil, most cases occur with snakes from Bothrops and Bothropoides genus, causing several local and systemic complications, such myotoxicity, disseminated intravascular coagulation, cytotoxicity, acute renal failure and sepsis. Bothropoides insularis is a snake from Queimada Grande Island, whose venom shows pronounced toxicity. However, its effect over cells with defense function remains unclear, as well as how these effects can influence the toxicity observed in vivo. The present study aimed to investigate the cellular changes induced by Bothropoides insularis whole venom (BinsVT) over murine macrophage from RAW 264.7 lineage. In this context, colorimetric tests were performed to determine proteolytic activity and the production of hydrogen peroxide in vitro. The results showed high catalytic activity in both tests, suggesting that the biological effects of this venom may be related to the presence of enzymes such metalloproteinases (svMPs) and L-amino acid oxidases (LAAOs) at concentrations relevant in these experimental conditions. The determination of the cytotoxic potential was conducted by MTT reduction assay, a method of assessing redox metabolism, after 2, 6, 12 and 24 hours of incubation. It was observed cytotoxic effect at high concentrations in a time-dependent way, with cell death more evident at 200 and 100 µg/mL after 12 and 24 hours of treatment. In lower concentrations, there was a gradual increase in cell viability, reaching around 200% of cell viability in groups treated for 24 hours. This result suggests that BinsVT possess proliferative effect over these cells. Then, lactate dehydrogenase (LDH) activity was determined in culture supernatants from experimental groups for investigation of cell lysis induced by BinsVT. It was observed a significant increase in enzymatic activity in all groups, suggesting the coexistence of fractions with cytotoxic and proliferative effect and that concentration and exposure time determine its outcomes. For morphological evaluation of RAW 264.7 cells after exposure to BinsVT, the experiments were performed on the surface of coverslips for staining with May-Grunwald Giemsa method. The experimental groups were analyzed by optical microscopy and the most representative morphological characteristics were photographed. Various morphological changes were observed, such as appearance of cellular debris and bare nuclei, vacuolated cells, reduced cell volume and increased cytoplasmic projections. Finally, the mechanism of cell death induced by BinsVT was assessed by flow cytometry, by staining with propidium iodide (PI) and annexin V-FITC. The analysis revealed the presence of apoptosis and necrosis, and the appearance of doubly labeled cells with Annexin-FITC and PI, indicating the occurrence of late apoptosis. In conclusion, BinsVT has a cytotoxic effect on RAW 264.7 cell, which necrotic and apoptotic mechanisms, besides stimulatory effect on these cells in dose-and time-dependent ways. These effects may be related to the enzymatic activities found in vitro. / Em todo o mundo, são registrados mais de 3 milhões de acidentes envolvendo picadas de animais peçonhentos por ano, das quais 125 a 150 mil culminam em óbito. No Brasil, a maioria dos casos ocorre com serpentes dos gêneros Bothrops e Bothropoides, provocando uma grande variedade de complicações locais e sistêmicas, dentre os quais se destacam efeito mionecrótico, coagulação intravascular disseminada, citotoxicidade, insuficiência renal aguda e sepse. A serpente Bothropoides insularis é uma espécie nativa da Ilha de Queimada Grande, cujo veneno apresenta efeito tóxico acentuado em diversos modelos experimentais. Entretanto, pouco é conhecido a respeito do efeito dessa peçonha sobre células com função de defesa, nem o quanto esse efeito pode influenciar na toxicidade observada in vivo. O presente trabalho teve como objetivo investigar as alterações celulares induzidas pelo veneno total da serpente Bothropoides insularis (BinsVT) sobre macrófagos murinos da linhagem RAW 264.7. Nesse contexto, foi realizada a determinação da atividade proteolítica e da produção de peróxido de hidrogênio in vitro de BinsVT através de reações colorimétricas. Os resultados demonstraram alta atividade catalítica em ambos os testes, sugerindo que os efeitos biológicos desse veneno podem estar relacionados à presença de enzimas como metaloproteinases (svMPs) e L-aminoácido oxidases (LAAOs) em concentrações relevantes nas condições experimentais adotadas. A determinação do potencial citotóxico foi realizada pelo método de redução do MTT, um teste de avaliação da capacidade oxirredutora das células, após 2, 6, 12 e 24 horas de incubação. Foi observado efeito citotóxico em altas concentrações de forma tempo-dependente, com morte celular mais pronunciada nas concentrações de 200 e 100 µg/mL após 12 e 24 horas de tratamento. Nas menores concentrações estudadas, ocorreu um aumento gradativo da viabilidade celular, com valores percentuais em torno de 200% em relação ao grupo controle nos grupos tratados por 24 horas. Esse resultado sugere a presença de efeito proliferativo de BinsVT sobre essa linhagem celular. Em seguida, a atividade da enzima lactato desidrogenase (LDH) no sobrenadante de cultivo dos grupos experimentais foi determinado para investigação de lise celular induzida por BinsVT. Foi verificado aumento significativo da atividade dessa enzima em todos os grupos testados, sugerindo a coexistência de frações com efeito proliferativo e citotóxico, e a concentração e o tempo de exposição do veneno determinam qual irá prevalecer. Para avaliação morfológica das células RAW 264.7 após exposição à substância em estudo, os experimentos foram realizados na superfície de lamínulas, para coloração com May-Grunwald Giemsa. Os grupos experimentais foram analisados por microscopia óptica e as características morfológicas mais representativas foram fotomicrografadas. Foram observadas diversas alterações morfológicas, tais como aparecimento de fragmentos celulares e núcleos desnudos, células vacuolizadas, redução do volume celular e aumento de projeções citoplasmáticas. Por fim, o mecanismo de morte celular induzida por BinsVT foi avaliado por citometria de fluxo, pela marcação com o iodeto de propídio (PI) e a anexina V-FITC. A análise revelou a presença de envolvimento necrótico e apoptótico no efeito citotóxico da substância, além do aparecimento de células marcadas duplamente com PI e anexina-FITC, indicando a ocorrência de apoptose tardia. Em conclusão, BinsVT apresenta efeito citotóxico sobre macrófagos RAW 264.7, com aparente envolvimento de necrose e apoptose, além de provável efeito estimulatório sobre essas células, de forma concentração- e tempo-dependente. Esses efeitos podem estar relacionados às atividades enzimáticas encontradas in vitro.

JORGE, Roberta Jeane Bezerra. Venômica e antivenômica de Bothrops erythromelas : estudo da variação intraespecífica. 2015. 131 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2015. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-03-06T13:00:26Z No. of bitstreams: 1 2015_tese_rjbjorge.pdf: 8490082 bytes, checksum: d6ca5417614b4fb1e727b7db3ef1d01d (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-03-06T13:02:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_tese_rjbjorge.pdf: 8490082 bytes, checksum: d6ca5417614b4fb1e727b7db3ef1d01d (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-06T13:02:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_tese_rjbjorge.pdf: 8490082 bytes, checksum: d6ca5417614b4fb1e727b7db3ef1d01d (MD5) Previous issue date: 2015 / ABSTRACT Bothrops erythromelas snake is a species of medical importance responsible for snakebites, predominantly in the Northeast of B razil. This study aimed to conduct a comparative proteomic study of venoms pool of this species from five geographical regions of the Northeast: Ceará, Pernambuco, Juazeiro, Paraíba and Itaparica Island. In addition, we investigated the ability of Bothrops antivenom (SAB) of the Vital Brazil Institute and polyspecific serum (BCL) of Costa Rica to neutralize the venoms from these populations (antivenomics) and the ability to neutralize the in vivo haemorrhagic activity of venom. Two - dimensional electrophores is (2DE) showed similar patterns of protein distributed in the range of 14 - 95 kDa molecular mass and isoelectric points ranging from 4 to 8.5. Thirty to forty fractions were collected by Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography (RP - HPLC). Each chromatographic fraction collected manually were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis - SDS (SDS - PAGE) and protein bands were excised and subjected to venomic analysis resulting in the identification of approximately 65 proteins and 8 species of peptides belonging to 12 protein families (Bradykinin - Potentiating Peptides (BPPs), Snake Venom Vascular Endothelial Growth Factor (svVEGF), Phospholipase A 2 , Serine Preotease, Metalloproteases class I and class III (PI and PIII - Symp), Disintegrins and Disintegrin - like and Rich in Cysteine domains, C - type Lectins, Nucleotidases (5' - nucleotidase; 5'NT and Phosphodiesterase; PDE), Secretory Proteins rich in Cysteine (CRISP) and snake venoms Phospholipase B. Through this work it was shown that the proteomes of venoms of B. erythromelas of different regions of Northeast are similar and seem to be quite kept according to their geographical distribution, although they contain peculiar differences such as the presence of CRISP detected only in the venoms of Pern ambuco and 5 'NT in the population of Juazeiro; and PDEs only in proteomes of populations of Ceará and Pernambuco and PLB in Ceará, Juazeiro and Itaparica Island. The antivenomics results showed that SAB pentavalent serum immunoreactivity is similar across the five populations and more efficient compared to the polyvalent BCL. However, it can be seen that especially low molecular weight fractions are not efficiently recognized by both antivenoms. Although differences were shown in their neutralization effic acy, both were effective in neutralizing antivenom hemorrhagic activity. Despite the B.erythromelas snake inhabit acomprehensivegeographical area , the five populations showed similar composition, displaying a highly conserved profile of representative venom protein classes. Therefore, this study assigned all proteins in the venom of B. erythromelas that have been characterized in the literature (BPP, PLA2 Asp49, PIII - Symp and svVEGF) and provided additional information to the presence of Serine Proteases and C - type Lectins and other minor or specific components (PDE, 5'NT, PLB, CRISP). / UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA PÓS - GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA ROBERTA JEANE BEZERRA JORGE VENÔMICA E ANTIVENÔMICA DE Bothro p s eryth r omelas : ESTUDO DA VARIAÇÃO INTRAESPECÍ FICA . ORIEN TADORA: HELENA SERRA AZUL MONTEIRO CO - ORIENTADOR : JUAN JOSÉ CALVETE CHORNET Fortaleza 2015 ROBERTA JEANE BEZERRA JORGE VENÔMICA E ANTIVENÔMICA DE Bothro ps eryth r omelas : ESTUDO DA VARIAÇÃO INTRAESPECIFICA . Tese de Doutorado apresentada ao Cur so de Pós - G raduação em Farmacologia da Universidade Federal do Ce ará para obtenção do titulo de Doutor em Farm a cologia ORIENTADORA: HELENA SERRA AZUL MONTEIRO CO - ORIENTADOR : JUAN JOSÉ CALVETE CHORNET Fortaleza 2015 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará Biblioteca de Ciências da Saúde J71v Jorge, Roberta Jeane Bezerra. Venô mica e Antivenômica de Bothrops erythromelas : estudo da variação intraespecífi ca. / Roberta Jeane B ezerra Jorge. – 2015. 130 f.: il. color., enc.; 30 cm. Tese (doutorado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina, Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Programa de Pós - Graduação em Farmacologia, Doutorado em Farmacologia, Fortaleza, 201 5. Área de Concentração: Farmacologia. Orientação: Profa. Dra. Helena Serra Azul Monteiro. Co - Orientação: Prof. Dr. Juan José Calvete Chornet. 1. Bothrops. 2. Proteômica. 3. Venenos de Serpente. I. Título. CDD 615.942 A os meus pais Nádja e Roberto e ao meu irmão Júnior. AGRADECIMENTOS A Deus, minha força maior e inexaurível . A os meus pais pelo que sou hoje. A todos meus familiares e amigos pelo companheirismo e presteza, seria impossível e a té passível de cometer algum esquecimento citar o nome de todos eles, mas cada um sabe o quanto sou grata e que podem sempre contar comigo . Aos que contribuíram diretamente para a realização deste trabalho: M inha orientadora P rofa Dra Helena Serra Azul M onteiro e ao meu co - orientador Prof . Dr. Juan José Calvete e a sua equipe do Laboratório de Ve nômica y Proteinómica Estructural do Instituto de Biomedicina de Valencia e aos grandes amigos que fiz no período de estágio de doutorado na Espanha . A todos os colaboradores deste trabalho no Brasil, Espanha e Costa Rica . A todos do Laboratório de Farmacologia Venenos e Toxina s (LAFAVET) , aos companheiros científicos, em especial aos amigos que fiz e a Pós - graduação em Farmacologia da Universidade Federal do Cea rá, os quais me proporcionaram crescimento profissional e pessoal. A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior ( CAPES ) pela concessão da bolsa de Doutorado Sanduiche e m Valencia - Espanha . Ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) pelo apoio financeiro . “ Entrega teu caminho ao S enhor, confia nele , e ele o fará ” Salmo 37:5 RESUMO A serpente Bothrops erythromelas é uma espécie de importância médica responsável por acidentes ofídicos, com predominância no N ordeste do Brasil. O presente trabalho teve como objetivo realizar um estudo proteômico comparativo do pool de venenos desta espécie procedentes de cinco regiões geográficas do Nordeste: Ceará, Pernambuco, Juazeiro, Paraíba e Ilha de Itaparica. Além disso, foi investigada a capacidade do soro antibotrópico (SAB) do Instituto Vital Brazil e soro poliespecífico (BCL) da Costa Rica em neutralizar os venenos provenientes dessas populações através da antivenômica e a capacidade de neutralização frente à atividad e hemorrágica in vivo . A eletroforese bidimensional (2DE) mostrou padrões similares de proteínas distribuídas no intervalo de 14 - 95 kDa de massa molecular e pontos isoelétricos variando de 4 - 8,5. Trinta a quarenta frações foram recolhidas por meio de Cro matografia Líquida de Alta Eficiência em Fase Reversa (RP - HPLC). Cada fração cromatográfica coletada manualmente foi analisada por eletroforese em gel de poliacrilamida – SDS ( SDS - PAGE) e as bandas de proteínas foram excisadas e submetidas à análise venômi ca que resultaram na identificação de aproximadamente 65 proteínas e 8 espécies de peptídeos pertencentes a 12 famílias de proteínas de venenos de serpentes: (Peptídeos Potenciadores de Bradicinina (BPPs), Fator de Crescimento Endotelial Vascular de Veneno de Serpente (svVEGF), Fosfolipase A 2 , Serinoproteases, Metaloproteases da classe I e da classe III (PI e PIII – SVMP), Desintegrinas e Domínios tipo Desintegrina e rico em Cisteínas, Lectinas do tipo C, Nucleotidases (5' - nucleotidase; 5’NT e Fosfodiester ase; PDE), Proteínas Secretórias Ricas em Cisteína (CRISP) e Fosfolipase B). Através desse trabalho foi demonstrado que os proteomas dos venenos das B. erythromelas das diferentes regiões do Nordeste são similares e parecem ser bastante conservados de acor do com sua distribuição geográfica, embora contenham diferenças peculiares tais como, a presença de CRISP detectadas apenas nos venenos de Pernambuco e da 5’ NT na população de Juazeiro; assim como PDEs apenas nos proteomas das populações do Ceará e Pernam buco e da PLB no Ceará, Juazeiro e Ilha de Itaparica. Os resultados da antivenômica mostraram que a imunorreatividade do soro pentavalente SAB é similar frente às cinco populações e mais eficiente em relação ao polivalente BCL. No entanto, pode - se observar especialmente que as frações de baixo peso molecular não são reconhecidas pelos dois antivenenos de forma eficiente. Embora tenham mostrado diferenças na sua eficácia de neutralização, ambos os antivenenos foram eficazes na neutralização da atividade hemo rrágica in vivo . Apesar da serpente de B. erythromelas habitar uma abrangente área geográfica, as cinco populações estudadas apresentaram composição semelhante, exibindo um perfil altamente conservado das classes das proteínas representativas do veneno. Po rtanto, este estudo identificou as proteínas do veneno de B. erythromelas já caracterizadas na literatura (BPP, PLA 2 Asp49, PIII - SVMP e svVEGF) e forneceu informações adicionais para a presença de Serinoproteases e Lectinas do tipo C e de outros component es minoritários ou específicos (PDE, 5’NT, PLB, CRISP).

AMORA, Daniela Nascimento. Estudos dos efeitos renais do veneno da serpente Crotalus durrissus collilineatus. 2005. 100 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2005. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-03-09T16:25:34Z No. of bitstreams: 1 2005_dis_dnamora.pdf: 2079060 bytes, checksum: 4c0e0d1661e484a80753314f168cfcd4 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-03-12T12:12:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2005_dis_dnamora.pdf: 2079060 bytes, checksum: 4c0e0d1661e484a80753314f168cfcd4 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-12T12:12:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2005_dis_dnamora.pdf: 2079060 bytes, checksum: 4c0e0d1661e484a80753314f168cfcd4 (MD5) Previous issue date: 2005 / Crotalus durissus collilineatus is a snake usually found in semideciduous forest, the Cerrado region and its bites constitutes an important health problem. The most serious systemic change and primary cause of death is acute renal failure although the mecanisms of the damaging effects are not totally understood. We investigated the biological effects promoted by Crotalus durissus collilineatus crude venom and its fractions crotoxin and phopholipase A2. The toxic effects of C d collilineatus crude venom were evaluated by the histopathological analysis of organs such as heart, kidney, brain, lung and liver. Wistar rats were inoculated intraperitoneally with C d collilineatus crude venom. The liver showed steatosis and microvacuolation.The other organs showed normal morphological aspects. Renal effects were evaluated by the isolated perfused rat kidney method.The crude venom used at the lowest dose (10µg) increased perfusion pressure (PP), urinary flow (UF), and glomerular filtration rate (GFR), with maximal effect at 120min (PP: control(120) 110.3+/-3.69; venom(120) 126.8+/-10.2; UF: control(120) 0.19+/-0.03; venom(120) 0.23+/-0.06; GFR: control(120) 0.79+/-0.07; venom(120) 1.17+/-0.4). There was no effect on the percent of sodium tubular transport (%TNa+), the percent of potassium tubular transport (%TK+) and the percent of chloride tubular transport (%TCl-) The highest dose of the crude venom (30µg) caused a significantly decrease in PP (control(120) 110.3±3.69; venom(120) 96.7±8.1), RVR (control(120) 6.42±0.78; venom(120)4.8±0.56), UF (control(120) 0.19±0.03; venom(120) 0.12±0.01) and GFR (control(120) 0.79±0.07; venom(120)0.53±0.09). There was not effect on the percent of electrolytes tubular transport (%TNa+, %TK+ and %TCl-). Crotoxin (10mcg) produced a decrease in GFR (control(120) 0.79±0.07; crotoxin(120) 0.31±0.10), while PP, RVR and UF remained stable. Crotoxin also reduced %TK+ (control(120) 69.94±6.49; crotoxin(120) 33.28±4.78) and %TCl- (control(120) 79.53±2.67; crotoxin (120) 64.62±6.93) with maximal effect at 120min. Kidney perfused with phospholipase A2 (PLA2) showed a decrease in GFR (control(120) 0.79±0.07; PLA2 (120) 0.52±0.07) at 120min, whereas PP, RVR, UF and %TNa+ remained stable. PLA2 also reduced %TK+ (control(120) 69.94±6.49; PLA2 (120) 56.26±6.81) and %TCl- (control(60) 82.25±2.72; PLA2 (60) 75.04±4.26) at 60min. These results altogether indicate that Crotalus durissus collilineatus venom caused significative alterations in the renal parameters as well as hepatic damage. / A serpente Crotalus durissus collilineatus é encontrada na região do Cerrado e o acidente causado por esta espécie constitui um problema de saúde pública. A insuficiência renal aguda é a alteração sistêmica mais séria, apesar dos seus mecanismos não serem completamente esclarecidos. O objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos biológicos produzidos pelo veneno bruto de Crotalus durissus collilineatus e pelas frações crotoxina e fosfolipase A2. Foi realizado o estudo da toxicidade aguda do veneno bruto de C d collilineatus, através da análise histológica de coração, cérebro, rins, pulmões e fígado de ratos tratados com doses crescente do veneno. Nesse estudo foi observada a presença de alterações hepáticas como microvacualização e esteatose, enquanto os demais órgãos apresentaram aspectos normais. Os efeitos renais foram avaliados através do método de perfusão de rim isolado de rato. O veneno bruto, usado na dose de 10µg, causou um aumento na pressão de perfusão (PP), no fluxo urinário (FU) e no ritmo de filtração glomerular (RFG), com efeito máximo aos 120min (PP: controle(120) 110,3+/-3,69; veneno(120) 126,8+/-10,2;FU: controle(120) 0,19+/-0,03; veneno(120) 0,23+/-0,06; RFG: controle(120) 0,79+/-0,07; veneno(120) 1,17+/-0,4). Essa dose não produziu alterações no transporte tubular de sódio (%TNa+), potássio (%TK+) e de cloreto (%TCl-). A dose mais elevada de veneno bruto (30µg) causou um decréscimo significativo, com efeito máximo, aos 120min, na PP(controle(120) 110,3+/-3,69; veneno(120) 96,7+/-8,1), na RVR (controle(120) 6,42+/-0,78; veneno(120) 4,8+/-0,56), no FU (controle(120) 0,19+/-0,03; veneno(120) 0,12+/-0,01) e no RFG (controle(120) 0,79+/-0,07; veneno(120) 0,53+/-0,09). Não ocorreram alterações no transporte tubular de eletrólitos. A fração crotoxina não produziu alterações no RFG (controle(120) 0,79+/-0,07; crotoxina(120) 0,31+/-0,10). Esta fração também reduziu os %TK+ (controle(120) 69,94+/-6,49; crotoxina(120) 33,28+/-4,78) e %TCl- (controle(120) 79,53+/-2,67, crotoxina(120) 64,62+/-6,93). O grupo perfundido com FLA2 apresentou um decréscimo no RFG (controle(120) 0,79+/-0,07; FLA2 (120) 0,52+/-0,07), enquanto a PP, a RVR, o FU e o %TNa+ permaneceram estáveis. Foram observadas reduções no %TK+ aos 120min (controle(120) 69,94+/-6,49; FLA2(120) 56,26+/-6,81) e aos 60min, no %TCl- (controle(60) 82,25+/-2,72; FLA2(60) 75,04+/-4,26). Foi observada degeneração hidrópico vacuolar e a presença de material proteináceo nos túbulos renais, na análise histológica dos rins perfundidos tanto com veneno bruto quanto com as frações. Estes resultados indicam que o veneno de Crotalus durissus collilineatus causou alterações significativas nos parâmetros renais e nos aspectos morfológicos hepáticos.

SOUSA, Fabíola Carine Monteiro de. Efeito renal do veneno da Bothrops erythomelas e bloqueio induzido pelo fator antibotrópico do Dedelphis marsupialis. 2004. 128 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2004. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-03-22T16:10:34Z No. of bitstreams: 1 2004_dis_fcmsousa.pdf: 1396935 bytes, checksum: 05b7233fbbba81191027570385fec567 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-03-26T11:51:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2004_dis_fcmsousa.pdf: 1396935 bytes, checksum: 05b7233fbbba81191027570385fec567 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-26T11:51:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2004_dis_fcmsousa.pdf: 1396935 bytes, checksum: 05b7233fbbba81191027570385fec567 (MD5) Previous issue date: 2004 / Some animals present natural resistance to the effects of snake venoms that can be explained by the presence of neutralizing factors in their blood serum. The resistance of South American Didelphis marsupialis, against crotalid venoms, especially of the genus Bothrops, of utmost medical importance in Brazil, has been object of investigation in the last few years. Bothrops erythromelas, known as “jararaca-da-seca” or “jararaca-malha-de-cascavel” is responsible for a great deal of snakebites in Northeastern Brazil. The venom of this snake induces acute renal failure (Wen et al., 1989). In this work, we examined the action of the antibothropic factor isolated from Didelphis marsupialis on the renal effects of B. erythromelas venom in the absence of systemic interactions. Isolated kidneys from Wistar rats, weighing 260 to 300g, were perfused with Krebs-Henseleit solution containing 6g% of bovine serum albumin, Bothrops erythromelas venom (10mg/mL), antibothropic factor from Didelphis marsupialis (10mg/mL), antibothropic factor from Didelphis marsupialis (10mg/mL) incubated with Bothrops erythromelas venom (10mg/mL) and antibothropic factor from Didelphis marsupialis (30mg/mL) incubated with Bothrops erythromelas venom (10mg/mL). The parameters studied included perfusion pressure (PP), renal vascular resistance (RVR), glomerular filtration rate (GFR), urinary flow (UF), percent sodium, potassium and chloride tubular transport (%TNa+, %TK+ and %TCl-), and osmotic clearance (Cosm). The control group perfused with albumin was functionally stable for over 120 min. The administration of antibothropic factor from Didephis marsupialis (10µg/mL) did not modify the functional kidney parameters when compared with control group. The infusion of B. erythromelas venom (10µg/mL) caused a significant decrease (p< 0,05*) in perfusion pressure and renal vascular resistance at 60, 90 and 120 min. with maximum effect at 90 min. (PP→ ct90 = 108.70 ± 5.1 mmHg vs vBE90 = 65.20 ± 5.6* mmHg) and (RVR→ ct90 = 5.76 ± 0.65 mmHg/mL.g-1.min-1. vs vBE90 = 3.10 ± 0.45* mmHg/mL.g-1.min-1). The glomerular filtration rate decreased at 60 min. and increased at 90 and 120 min (ct120 = 0.72 ± 0.10 mL.g-1.min-1. vs vBE120 = 1.24 ± 0.26* mL.g-1.min-1). After administration of the venom, the urinary flow increased at 90 and 120 min when compared with control group (ct120 = 0.14 ± 0.07 mL.g-1.min-1. vs vBE120 = 0.47 ± 0.08* mL.g-1.min-1). Sodium transport percent decreased at 90 and 120 min. (ct90 = 79.18 ± 0.88% vs vBE90 = 58.35 ± 4.86* %). Potassium transport percent decreased at 90 and 120 min. (ct90 = 67.20 ± 4.04% vs vBE90 = 57.32 ± 5.28* %). Chloride transport percent decreased at 60, 90 and 120 min. (ct90 = 77.32 ± 2.22% vs vBE90 = 55.97 ± 5.52* %). The osmotic clearance increased at 90 and 120 min. (ct120 = 0.13 ± 0.01 mL. g-1.min-1 vs vBE120 = 0.42 ± 0.07* mL.g-1.min-1). The antibothropic factor from Didelphis marsupialis (10µg/mL) incubated with B. erythromelas venom (10µg/mL) blocked only the effects promoted by venom in the perfusion pressure and in the renal vascular resistance, whereas the highest concentration of the antibothropic factor from Didelphis marsupialis (30µg/mL) reversed the effects on renal vascular resistance, urinary flow, glomerular filtration rate, percent sodium potassium and chloride tubular transport (%TNa+, %TK+ and %TCl-), and osmotic clearance (Cosm). In conclusion, B. erythromelas venom altered all the renal functional parameters evaluated and the antibothropic factor from D.marsupialis was able to inhibit the effects induced by the venom in rat isolated kidney.

Orientadores: Marcos Dias Fontana, Stephen Hyslo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-23T08:18:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Heleno_MauricioAurelioGomes_M.pdf: 2260788 bytes, checksum: bb0c80c20559ca4739a7106cee974804 (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: Esta tese descreve as atividades bioquímicas, biológicas e farmacológicas do extrato aquoso da glândula de Duvernoy ( GD.) da colubrídea áglifa Dryadophis bifossatus bifossatus (Jararacussú- do-brejo). As glândulas foram obtidas de espécimes adultos de ambos os sexos (sacrificados com pentobarbital sódico, Nembutal®, > 30 mg/kg) e homogenizadas em solução tampão de carbonato de amónio (0,1 M; pH 8,0) mantidas em gelo até a centrifugação (4.000 rpm, 30 min, 4°C) e liofilização do sobrenadante. O extrato da G.D. preparado como descrito acima contém cerca de 82% de proteínas e não possui atividade hialuronidásica, fosfolipásica A2 ou pró- coagulante, mas potencializou o tempo de recalcificação do plasma e demonstrou níveis moderados de atividade fosfodiesterásica (2,12 ± 0,09 u/mg) e proteásíca (4,45 ± 0,1 u/mg) (n=3 para cada ensaio). O extrato (200jig/poço) não aglutinou os eritrócitos humanos tripsinizados e fixados em formaldeído nem causou hemorragia intradérmica em ratos (500|ig/sítio, n=3). Fracionamento do extrato da G.D.(20mg) por gel filtração em Sephacryl S-200 HR (coluna de 1,1 cm x 50 cm) em carbonato de amónio (0,1 M; pH 8,0) e eletroforese em SDS-PAGE revelou a presença de proteínas na faixa de massa molecular de 14 - 60 KDa. O extrato da G.D. inibiu fortemente a transmissão neuromuscular em preparações de aves , mas não de mamíferos. Este bloqueio dose-dependente e irreversível envolveu os receptores pós-sinápticos nicotínicos. Gel filtração em Sephacryl S-200 HR seguida por troca iônica em coluna Resource S (Pharmacia), revelou uma proteína com massa molecular de 14-18 KDa responsável pela atividade neurotóxica do extrato da G.D. sem, contudo, apresentar efeito direto sobre a fibra muscular na preparação biventer cervicis / Abstract: This thesis describes the biochemical, biological and pharmacological activities of an aqueous extract of the Duvernoy's gland (DG) of the aglyphous colubrid Dryadophis bifossatus bifossatus (jararacussu-do-brejo). The glands were removed from adult specimens of both sexes (sacrificed with sodium pentobarbital, Nembutal®, >30 mg/kg) and then homogenized in ammonium carbonate buffer (0.1 M, pH 8.0) on ice prior to centrifugation (4000 rpm, 30 min, 4°C) and lyophilization of the resulting supernatant. DG extract prepared as above contained 82% protein and possessed no hyaluronidase, phospholipase A or pro-coagulant activities but potentiated the plasma recalcifi cation time and showed moderate levels of phosphodiesterase (2.12 ± 0,09 u/mg) and protease (4.45 ± 0.1 u/mg) (n=3 for each assay). The extract (200 mg/well) did not agglutinate human trypsinized, formaldehyde-fixed erythrocytes nor did it cause intradermal hemorrhage in rats (500 mg/site, n=3). Fractionation of the DG extract (20 mg) by gel filtration on Sephacryl S-200 HR (1.1 cm x 50 cm column) in 0.1 M ammonium carbonate buffer (pH 8.0) and electrophoresis in SDS-containing polyacrylamide gels revealed the presence of proteins ranging in molecular mass from 14 kDa-60 kDa. The DG extract potently inhibited neuromuscular transmission in avian, but not mammalian, nerve muscle preparations. This blockade, which was dose- and time-dependent as well as irreversible, involved post-synaptic nicotinic receptors. Sequential gel filtration on Sephacryl S-200 HR followed by ion exchange on a Resource S column (Pharmacia), yielded a protein with a molecular mass of 14-18 kDa that accounted for nearly all of the neurotoxic activity of the DG extract. The extract had no direct effect on biventer cervicis muscle / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Sergio Marangoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T00:13:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bonfim_VeraLucia_M.pdf: 864621 bytes, checksum: a69159638df711b5aa8e490b77c0ddee (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Bothrops jararacussu é uma espécie de grande importância epidemiológica no estado do Rio de Janeiro. No entanto a sua distribuição é ampla, pois pode ser encontrada nos estados de Santa Catarina, Paraná, Mato Grosso, São Paulo, Minas Gerais, Espírito Santo, Sul da Bahia e também na Argentina, Paraguai e Bolívia. De um modo geral, os venenos botrópicos das espécies brasileiras foram pouco estudados tanto em relação aos seus componentes isolados como quanto ao veneno total, devido 'a falta de otimização das técnicas de purificação capazes de revelar a presença de novos componentes ou de suas isoformas. Desta forma justifica-se o interesse no isolamento e caracterização de duas novas isoformas de BthTX-II PLA2 (D49), lembrando que esta última citada é uma fração importante no veneno de Bothrops jararacussu. As isoformas foram isoladas em uma coluna de troca iônica catiônica (Protein Pack SP 5PW Waters) acoplada a um sistema LC 650 (Waters), sendo caracterizadas como isoformas de BthTX-II e denominadas como Bj-IV e Bj-V. O alto grau de pureza foi revelado ao serem re-purificadas em uma coluna de hidrofobicidade µ-Bondapack C18 acoplada a um sistema de HPLC de fase reversa, sendo eluídas em tempos de retenção muito próximos (Bj-IV 31,25 ± 0,31 minuto e para Bj-V 31,31 ± 0,28 minuto). A caracterização físico-química revelou o fato de serem isoformas, pois apresentaram vários fatores similares como, a tendência para a formação de dímeros na eletroforese com ausência de redutores, sendo que o valor de massa molecular relativa encontrada para isoformas foi de ~14 kDa, através da eletroforese em SDS-PAGE Tricina (16,5%) também, a basicidade semelhante e o alto grau de hidrofobicidade, confirmados pela composição de aminoácidos. A caracterização cinética das isoformas de BthTX-II PLA2 (D49) mostrou que tais isoformas são altamente estáveis e apresentam um pH ótimo ao redor de 8,0 e temperatura próxima a 37ºC. Frente a diferentes concentrações de substrato as isoformas mostraram um comportamento tipo alostérico, em nossas condições experimentais. Na ausência de Ca+2 (1Mm) e na presença de alguns íons divalentes tais como Mn+2, Mg+2, Zn+2, Cu+2 (na concentração de 10 mM) as isoformas Bj-IV e V foram inibidas, já na presença de Ca+2 (1mM) e com os mesmos íons divalentes citados elas mostraram uma discreta atividade. Também foi demonstrado o efeito inibitório de crotapotinas crotálicas sobre a atividade PLA2 das isoformas, fato que sugere a possível presença de crotapotinas ¿like¿ no veneno botrópico. A análise da composição de aminoácidos confirmou o comportamento estável de sua atividade cinética, ao mostrar um alto conteúdo de aminoácidos hidrofóbicos, assim como a presença de 14 cisteínas envolvidas em possíveis sete pontes dissulfeto. A presença de um alto conteúdo de aminoácidos básicos como Lys, His e Arg, também confirmaram o caráter básico das isoformas, característica própria do veneno deste tipo de víperide sul americano. O estudo de homologia seqüencial da região N-terminal entre ambas isoformas e também com outras PLA2 (D49) revelou um alto grau de homologia, no entanto, foram encontradas algumas substituições que não contribuíram com diferenças significativas, tanto com relação à atividade catalítica quanto neurotóxica. O efeito neurotóxico das isoformas de BthTX-II PLA2 (D49) Bj-IV e V, foi avaliado usando-se duas preparações farmacológicas: nervo frênico-diafragma isolado de camundongo e biventer cervicis de pintainho. Foram encontradas diferenças em ambas preparações, pois o efeito de bloqueio da resposta contrátil evidenciou-se de maneira significativa na preparação nervo frênico-diafragma isolado de camundongo, nas concentrações empregadas (50 e 100 µg/mL), enquanto que na preparação biventer não houve efeito notório. No entanto, para a dosagem de 100 µg/mL, no caso do veneno total na preparação biventer cervicis de pintainho evidenciou-se um efeito miotóxico indireto pois, foi observada uma diminuição nas respostas contraturante dadas pela diminuição das curvas de KCl e Acetilcolina (ACh). A importância do isolamento das isoformas de BthTX-II, Bj-IV e V, está apoiada no fato de ter sido possível a obtenção destas duas novas isoformas, usando-se métodos que garantiram a manutenção da sua atividade biológica, sendo assim possível correlacionar a estrutura e a função desta família de proteínas / Abstract: Bothrops jararacussu is a species of great importance in the state of Rio de Janeiro, but its has a wide distribution: from Argentina, state of Santa Catarina, Paraná, Mato Grosso, São Paulo, Minas Gerais, Espírito Santo, south of Bahia, Paraguay and Bolivia. In a general the venom botropics of the Brazilian species, were probably rarely studied in relation to their isolated components as the total venom, due to a lack in the optimization of technologies to isolate the presence of new components or isoforms. In this way it justified to isolate and to characterize two new isoforms of these of BthTX-II PLA2 (D49) is a important fraction in the venom of Bothrops jararacussu, which were isolated through a column of exchange cationic (Protein Pack SP 5 PW Waters) coupled to a system LC 650 (Waters), being characterized as isoforms of BthTX-II and denominated Bj- IV and Bj-V. The high degree of purity was revealed and was eliminated in very close times of retention (Bj-IV 31.25 ± 0.31 minutes and Bj-V 31.31 ± 0.28). The physical-chemistry characterization revealed the reason of being isoforms, because they present several similar factors, such as the tendency of forming aggregates through the electrophoreses PAGE in the absence of SDS, as well as the mass is around 14 kDa characterized in the electrophoreses SDS-PAGE Tricina (16%). The kinetic characterization of the isoforms of BthTX-II PLA2 (D49) showed that isoforms are higly stable and they present good pH around 8,0 and a good temperature around 37 0C. Different concentration substrates showed a behavior type allosteric under our experimental conditions. In the presence of some ions such divalents as Mn+2, Mg+2, Zn+2, Cu+2 (in the concentration of 10 Mm) and in the absence of Ca+2 the isoforms Bj-IV and Bj-V, were inhibited. But in the presence of Ca+2 (1mM) the isoforms showed a discreet activity. The effect of the inhibition of crotapotins crotalics were also demonstrated in the activity PLA2, it is suggested that there is probably a presence crotapotin in these PLA2. The analysis composition of amino acids confirmed the stable behavior of its enzymatic kinetics when showing a high content of amino acids hidrophobics, as well as the presence of 14 cysteine involved in 14 bridges disulfide. The presence of a high content of basic amino acids as Lys, His and Arg confirmed the basic character of the isoforms. The study of the N-terminal region of both isoforms in relation to other PLA2 reveals a high homology degree, nevertheless some substitutions observed didn't show significant differences in the catalytic and neurotoxic activity. The neurotoxic effect of the isoforms of BthTX-II PLA2 (D49): Bj-IV and Bj-V were evaluated using two pharmacological preparations: nerve isolated frenic-diaphragm a mouse and a chick biventer cervicis muscle. There were differences in both preparations, because the blockade effect of the concentration was more significant in the preparation of the mouse. It observed in the 100 ug/ml dose to total venom a indirect effect miotoxic in the preparation chick biventer cervicis. The importance of the isolation of the isoforms of BthTX-II Bj-IV and Bj-V are not restricted to the fact of having used optimized methodologies that guaranteed the biological function of these, being able to correlate the structure and function in this proteins family of great importance in the study of venom of snakes / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador : Julia Prado Franceschi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-13T23:59:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moreno_RonilsonAgnaldo_M.pdf: 3561288 bytes, checksum: 2129a152af3cfce348015fb2b921125b (MD5) Previous issue date: 1991 / Resumo: Não informado / Abstract: Not informed. / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Lea Rodrigues Simioni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-16T01:43:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 HeluanySobrinho_NadimFarah_M.pdf: 6197856 bytes, checksum: ad2ebac7b90e14268dbd404f0c07d696 (MD5) Previous issue date: 1992 / Resumo: A peçonha de B. jararacussu tem sido objeto de estudo desde o início do século. Recentemente foi realizado um estudo sistemático do veneno total e de suas frações. Neste estudo foi identificado, através de cromatografia por gel filtração, o pico de maior massa (o pool IV ou SIII) como o responsável pela atividade do veneno bruto na junção neuromuscular. O presente trabalho refere-se aos efeitos da fração purificada, oriunda da recromatografia do pico principal SIII, isenta de atividades fosfolipásica e hemolítica, sobre a junção neuromuscular. A fração purificada foi chamada de Bothropstoxina (BthTX). Exibe um peso molecular de 13.000. A BthTX foi estudada em duas preparações distintas: De camundongo (frênico diafragma) e de pintainho (biventer cervicis) / Abstract: The effects of Bothropstoxin, a component from Bothrops Jaracussu snake venom on the mouse and chick muscle preparations. Bothropstoxin on the mouse preparations inhibited muscle twitch tension, evoked either directly or indirectly through the motor herve and abolished the compound action potential of the muscle with a similar time course of aetion. The toxin evoked membrane depolarization and that effeet was inhibited in the presence of 10mM Ca2+. On chick muscle, the toxin induced a contracture that reached the maximum amplitude in 44.8 '+ OR -' 15.6 min (n = 6) and was not blocked by d-Tc nor TTX. The time course of the maximum amplitude was shorted in Krebs solutions Ca2+ free (5.5 '+ OR -'1.0 min, n = 4). The contraeture indueed by toxin was completely inhibited in Krebs Ca2+ free plus 1mM EGTA. As it lacks PLA2, protease and hemolytie aetivity, it may belong to the elass of cardiotoxins / Mestrado / Mestre em Odontologia