Nucleotídeos da adenina e adenosina estão envolvidos em uma variedade de processos patofisiológicos em diferentes células. O metabolismo extracelular destes nucleotídeos gerando nucleosídeos tem uma importante função regulatória no controle da homeostase, principalmente por regularem a agregação plaquetária, via receptores purinérgicos P2. Além disso, uma associação destes nucletídeos e nucleosídeo em processos neoplásicos tem sido sugerida. Enquanto ATP tem demonstrado exibir atividade anticâncer em uma grande variedade de células animais e humanas, estudos sugerem que adenosina possui ações promotoras de tumor. Muitos estudos também demonstram que antiinflamatórios não esteroidais, como o ácido acetil salicílico (AAS), podem proteger contra o desenvolvimento do câncer. As ações induzidas pela sinalização purinérgica são reguladas pelas ectonucleotidases, que incluem membros da família das ectonucleosídeo trifosfato difosfoidrolase (E-NTPDase) e ecto-nucleotídeo pirofosfatases/fosfodiesterases (E-NPPs), e ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’N). Assim, no presente estudo nós investigamos o efeito do AAS na hidrólise do ATP até adenosina, bem como estudamos as características bioquímicas e expressão das ectonucleotidases no tumor de W256. A hidrólise dos nucleotídeos da adenina por plaquetas de ratos foi significativamente inibida por AAS, tanto para ATP quanto para ADP, mas não houve alteração na hidrólise do AMP. Em ratos submetidos ao tumor de W256, a hidrólise dos nucleotídeos da adenina em plaquetas e soro, obtidos 6, 10 e 15 dias após a indução subcutânea do tumor, foi significativamente reduzida. Em células tumorais de W256 (forma ascítica do tumor), a análise cinética indicou que várias ectonucleotidases estão envolvidas nessa cascata enzimática. Quanto às propriedades bioquímicas das E-NTPDases e ecto-5'-nucleotidase, para a hidrólise de ATP, ADP e AMP, o pH ótimo ficou entre 6,5-8,0 e também foi observado um requerimento de cátions divalentes (Mg2+ > Ca2+). Uma significativa inibição na hidrólise do ATP e ADP foi observada em presença de altas concentrações de azida sódica e de 0,5 mM de cloreto de gadolínio. Ainda, a análise de mRNA por PCR identificou a presença das NTPDases 2 e 5, e também da ecto-5'-nucleotidase nas células tumorais de W256. Com o objetivo de investigar as enzimas envolvidas no catabolismo dos nucleotídeos da adenina durante o crescimento do tumor, nós avaliamos a expressão destas enzimas bem como o padrão de degradação dos nucleotídeos extracelulares no tumor de W256, 6, 10 e 15 dias após a indução subcutânea. Os mRNAs de todas as ectonucleotidases estudadas (NTPDase 1, 2, 3 5 e 6 e ecto- 5’-nucleotidase), foram identificados por RT-PCR. A análise quantitativa, realizada por real-time PCR, apresentou como genes dominantes expressos durante o crescimento do tumor, as NTPDases 1 e 2 e ecto-5’-nucleotidase. O padrão de hidrólise do ATP extracelular determinado por HPLC, embora com alguma diferença entre os tempos estudados, se manteve similar. As células do tumor de W256 rapidamente hidrolisaram ATP levando à formação transitória de ADP, que foi completamente hidrolisado a AMP. A participação das NPPS 1, 2 e 3 na forma ascítica do tumor e VI durante o desenvolvimento do tumor subcutâneo de W256 também foi investigada. Nas duas formas do tumor o gene dominante foi o da enzima NPP3. Considerando que o ATP é reconhecido como um composto citotóxico em células tumorais, e que adenosina tem sido considerada promotora de tumor, é possível sugerir que, na circulação, a substancial redução na hidrólise dos nucleotídeos da adenina em plaquetas e soro após a indução do tumor pode representar um mecanismo de proteção contra o desenvolvimento tumoral. Por outro lado, nas células tumorais de W256, a elevada expressão de enzimas potencialmente envolvidas na hidrólise do ATP e do AMP, bem como a rápida hidrólise do ATP, pode representar um mecanismo que facilita a proliferação e invasão do tumor. / Adenine and adenosine nucleotides are involved in a variety of pathophysiological process in different cells. The extracellular metabolism of these nucleotides creating nucleosides has an important regulatory function in controlling the homeostasis, mainly for regulate the platelets aggregation, via purinergic P2 receptors. Besides this, an association of these nucleotides and nucleoside in neoplasics process has been suggested. While ATP has shown to exhibit anticancer activity in a great variety of animals and human cells, studies suggest that adenosine presents tumor-promoting actions. Many studies have also demonstrated that nonsteroidal anti-inflamatory, such as acetylsalicylic acid (ASA) can protect against the cancer development. The induced actions from purinergic signalization are ruled by the ectonucleotidases, that include members of the ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolases (E-NTPDases) and ecto-nucleotide pyrophosphatases/phosphodiesterases (E-NPPs) families, and ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’N). Then, in the present study we have investigated the effect of the ASA on the ATP hydrolysis to adenosine, such as studied the biochemical characteristics and expression of the ectonucleotidases in W256 tumor. The hydrolysis of the adenine nucleotides by rat platelets was significantly inhibited by ASA, both for ATP and ADP, but there was no alteration on AMP hydrolysis. In rats submitted to W256 tumor, hydrolysis of the adenine nucleotides by platelets and serum, obtained 6, 10 and 15 days after tumor’s subcutaneous induction, was significantly reduced. In W256 tumor cells (ascitic form of tumor), the kinetic analysis indicated that various ectonucleotidases are involved in this enzymatic cascade. Regarding the biochemistry properties of E-NTPDases and ecto-5'-nucleotidase, for the ATP, ADP e AMP hydrolysis, the optimum pH was reached among 6,5-8,0 and it was also observed a requirement of divalent cations (Mg2+ > Ca2+). A significant inhibition on ATP and ADP hydrolysis was observed in the presence of high concentrations of sodium azide and 0.5 mM of gadolinium chloride. Also, the mRNA by PCR analysis identified the presence of NTPDases 2 and 5, and also the ecto-5'-nucleotidase in W256 tumor cells. With the purpose of investigating the enzymes involved in the catabolism of adenine nucleotides during the tumor’s growth, we evaluated the expression of these enzymes as well as the pattern degradation of extracellular nucleotides in W256 tumor, 6, 10 and 15 days after the tumor’s subcutaneous induction. The mRNAs of all ectonucleotidases studied (NTPDase 1, 2, 3 5 e 6 and ecto-5’-nucleotidase) were identified by RT-PCR. The quantitative analysis, done by real-time PCR, presented as dominant genes expressed during the tumor’s growth, the NTPDases 1 and 2 and ecto-5’-nucleotidase. The pattern of ATP extracellular hydrolysis determined by HPLC, despite a small difference between the times studied, kept similar. The W256 tumor’s cells quickly hydrolyzed ATP, leading to the transitory formation of ADP, which was completely hydrolyzed to AMP. Considering that ATP is recognized as a citotoxic compound in tumor cells, and that adenosine has been considered tumor’s promoter, it is possible to suggest that, in the circulation, the substantial VIII reduction on adenine nucleotides hydrolysis in platelets and serum after tumor’s induction may represent a mechanism of protection against the tumor’s development. The participation of NPPs 1, 2 and 3 in the ascitic form of tumor and during the subcutaneous W256 tumor’s growth was also investigated. In the two forms of the tumor, the dominant gene expressed was the NPP3 enzyme. On the other hand, in W256 tumor cells, the high expression of enzymes potentially involved in ATP and ADP hydrolysis, as well as the fast ATP hydrolysis, may represent a mechanism that facilitate the proliferation and invasion of tumor.

Nucleotídeos da adenina e adenosina estão envolvidos em uma variedade de processos patofisiológicos em diferentes células. O metabolismo extracelular destes nucleotídeos gerando nucleosídeos tem uma importante função regulatória no controle da homeostase, principalmente por regularem a agregação plaquetária, via receptores purinérgicos P2. Além disso, uma associação destes nucletídeos e nucleosídeo em processos neoplásicos tem sido sugerida. Enquanto ATP tem demonstrado exibir atividade anticâncer em uma grande variedade de células animais e humanas, estudos sugerem que adenosina possui ações promotoras de tumor. Muitos estudos também demonstram que antiinflamatórios não esteroidais, como o ácido acetil salicílico (AAS), podem proteger contra o desenvolvimento do câncer. As ações induzidas pela sinalização purinérgica são reguladas pelas ectonucleotidases, que incluem membros da família das ectonucleosídeo trifosfato difosfoidrolase (E-NTPDase) e ecto-nucleotídeo pirofosfatases/fosfodiesterases (E-NPPs), e ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’N). Assim, no presente estudo nós investigamos o efeito do AAS na hidrólise do ATP até adenosina, bem como estudamos as características bioquímicas e expressão das ectonucleotidases no tumor de W256. A hidrólise dos nucleotídeos da adenina por plaquetas de ratos foi significativamente inibida por AAS, tanto para ATP quanto para ADP, mas não houve alteração na hidrólise do AMP. Em ratos submetidos ao tumor de W256, a hidrólise dos nucleotídeos da adenina em plaquetas e soro, obtidos 6, 10 e 15 dias após a indução subcutânea do tumor, foi significativamente reduzida. Em células tumorais de W256 (forma ascítica do tumor), a análise cinética indicou que várias ectonucleotidases estão envolvidas nessa cascata enzimática. Quanto às propriedades bioquímicas das E-NTPDases e ecto-5'-nucleotidase, para a hidrólise de ATP, ADP e AMP, o pH ótimo ficou entre 6,5-8,0 e também foi observado um requerimento de cátions divalentes (Mg2+ > Ca2+). Uma significativa inibição na hidrólise do ATP e ADP foi observada em presença de altas concentrações de azida sódica e de 0,5 mM de cloreto de gadolínio. Ainda, a análise de mRNA por PCR identificou a presença das NTPDases 2 e 5, e também da ecto-5'-nucleotidase nas células tumorais de W256. Com o objetivo de investigar as enzimas envolvidas no catabolismo dos nucleotídeos da adenina durante o crescimento do tumor, nós avaliamos a expressão destas enzimas bem como o padrão de degradação dos nucleotídeos extracelulares no tumor de W256, 6, 10 e 15 dias após a indução subcutânea. Os mRNAs de todas as ectonucleotidases estudadas (NTPDase 1, 2, 3 5 e 6 e ecto- 5’-nucleotidase), foram identificados por RT-PCR. A análise quantitativa, realizada por real-time PCR, apresentou como genes dominantes expressos durante o crescimento do tumor, as NTPDases 1 e 2 e ecto-5’-nucleotidase. O padrão de hidrólise do ATP extracelular determinado por HPLC, embora com alguma diferença entre os tempos estudados, se manteve similar. As células do tumor de W256 rapidamente hidrolisaram ATP levando à formação transitória de ADP, que foi completamente hidrolisado a AMP. A participação das NPPS 1, 2 e 3 na forma ascítica do tumor e VI durante o desenvolvimento do tumor subcutâneo de W256 também foi investigada. Nas duas formas do tumor o gene dominante foi o da enzima NPP3. Considerando que o ATP é reconhecido como um composto citotóxico em células tumorais, e que adenosina tem sido considerada promotora de tumor, é possível sugerir que, na circulação, a substancial redução na hidrólise dos nucleotídeos da adenina em plaquetas e soro após a indução do tumor pode representar um mecanismo de proteção contra o desenvolvimento tumoral. Por outro lado, nas células tumorais de W256, a elevada expressão de enzimas potencialmente envolvidas na hidrólise do ATP e do AMP, bem como a rápida hidrólise do ATP, pode representar um mecanismo que facilita a proliferação e invasão do tumor. / Adenine and adenosine nucleotides are involved in a variety of pathophysiological process in different cells. The extracellular metabolism of these nucleotides creating nucleosides has an important regulatory function in controlling the homeostasis, mainly for regulate the platelets aggregation, via purinergic P2 receptors. Besides this, an association of these nucleotides and nucleoside in neoplasics process has been suggested. While ATP has shown to exhibit anticancer activity in a great variety of animals and human cells, studies suggest that adenosine presents tumor-promoting actions. Many studies have also demonstrated that nonsteroidal anti-inflamatory, such as acetylsalicylic acid (ASA) can protect against the cancer development. The induced actions from purinergic signalization are ruled by the ectonucleotidases, that include members of the ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolases (E-NTPDases) and ecto-nucleotide pyrophosphatases/phosphodiesterases (E-NPPs) families, and ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’N). Then, in the present study we have investigated the effect of the ASA on the ATP hydrolysis to adenosine, such as studied the biochemical characteristics and expression of the ectonucleotidases in W256 tumor. The hydrolysis of the adenine nucleotides by rat platelets was significantly inhibited by ASA, both for ATP and ADP, but there was no alteration on AMP hydrolysis. In rats submitted to W256 tumor, hydrolysis of the adenine nucleotides by platelets and serum, obtained 6, 10 and 15 days after tumor’s subcutaneous induction, was significantly reduced. In W256 tumor cells (ascitic form of tumor), the kinetic analysis indicated that various ectonucleotidases are involved in this enzymatic cascade. Regarding the biochemistry properties of E-NTPDases and ecto-5'-nucleotidase, for the ATP, ADP e AMP hydrolysis, the optimum pH was reached among 6,5-8,0 and it was also observed a requirement of divalent cations (Mg2+ > Ca2+). A significant inhibition on ATP and ADP hydrolysis was observed in the presence of high concentrations of sodium azide and 0.5 mM of gadolinium chloride. Also, the mRNA by PCR analysis identified the presence of NTPDases 2 and 5, and also the ecto-5'-nucleotidase in W256 tumor cells. With the purpose of investigating the enzymes involved in the catabolism of adenine nucleotides during the tumor’s growth, we evaluated the expression of these enzymes as well as the pattern degradation of extracellular nucleotides in W256 tumor, 6, 10 and 15 days after the tumor’s subcutaneous induction. The mRNAs of all ectonucleotidases studied (NTPDase 1, 2, 3 5 e 6 and ecto-5’-nucleotidase) were identified by RT-PCR. The quantitative analysis, done by real-time PCR, presented as dominant genes expressed during the tumor’s growth, the NTPDases 1 and 2 and ecto-5’-nucleotidase. The pattern of ATP extracellular hydrolysis determined by HPLC, despite a small difference between the times studied, kept similar. The W256 tumor’s cells quickly hydrolyzed ATP, leading to the transitory formation of ADP, which was completely hydrolyzed to AMP. Considering that ATP is recognized as a citotoxic compound in tumor cells, and that adenosine has been considered tumor’s promoter, it is possible to suggest that, in the circulation, the substantial VIII reduction on adenine nucleotides hydrolysis in platelets and serum after tumor’s induction may represent a mechanism of protection against the tumor’s development. The participation of NPPs 1, 2 and 3 in the ascitic form of tumor and during the subcutaneous W256 tumor’s growth was also investigated. In the two forms of the tumor, the dominant gene expressed was the NPP3 enzyme. On the other hand, in W256 tumor cells, the high expression of enzymes potentially involved in ATP and ADP hydrolysis, as well as the fast ATP hydrolysis, may represent a mechanism that facilitate the proliferation and invasion of tumor.

Nucleotídeos da adenina e adenosina estão envolvidos em uma variedade de processos patofisiológicos em diferentes células. O metabolismo extracelular destes nucleotídeos gerando nucleosídeos tem uma importante função regulatória no controle da homeostase, principalmente por regularem a agregação plaquetária, via receptores purinérgicos P2. Além disso, uma associação destes nucletídeos e nucleosídeo em processos neoplásicos tem sido sugerida. Enquanto ATP tem demonstrado exibir atividade anticâncer em uma grande variedade de células animais e humanas, estudos sugerem que adenosina possui ações promotoras de tumor. Muitos estudos também demonstram que antiinflamatórios não esteroidais, como o ácido acetil salicílico (AAS), podem proteger contra o desenvolvimento do câncer. As ações induzidas pela sinalização purinérgica são reguladas pelas ectonucleotidases, que incluem membros da família das ectonucleosídeo trifosfato difosfoidrolase (E-NTPDase) e ecto-nucleotídeo pirofosfatases/fosfodiesterases (E-NPPs), e ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’N). Assim, no presente estudo nós investigamos o efeito do AAS na hidrólise do ATP até adenosina, bem como estudamos as características bioquímicas e expressão das ectonucleotidases no tumor de W256. A hidrólise dos nucleotídeos da adenina por plaquetas de ratos foi significativamente inibida por AAS, tanto para ATP quanto para ADP, mas não houve alteração na hidrólise do AMP. Em ratos submetidos ao tumor de W256, a hidrólise dos nucleotídeos da adenina em plaquetas e soro, obtidos 6, 10 e 15 dias após a indução subcutânea do tumor, foi significativamente reduzida. Em células tumorais de W256 (forma ascítica do tumor), a análise cinética indicou que várias ectonucleotidases estão envolvidas nessa cascata enzimática. Quanto às propriedades bioquímicas das E-NTPDases e ecto-5'-nucleotidase, para a hidrólise de ATP, ADP e AMP, o pH ótimo ficou entre 6,5-8,0 e também foi observado um requerimento de cátions divalentes (Mg2+ > Ca2+). Uma significativa inibição na hidrólise do ATP e ADP foi observada em presença de altas concentrações de azida sódica e de 0,5 mM de cloreto de gadolínio. Ainda, a análise de mRNA por PCR identificou a presença das NTPDases 2 e 5, e também da ecto-5'-nucleotidase nas células tumorais de W256. Com o objetivo de investigar as enzimas envolvidas no catabolismo dos nucleotídeos da adenina durante o crescimento do tumor, nós avaliamos a expressão destas enzimas bem como o padrão de degradação dos nucleotídeos extracelulares no tumor de W256, 6, 10 e 15 dias após a indução subcutânea. Os mRNAs de todas as ectonucleotidases estudadas (NTPDase 1, 2, 3 5 e 6 e ecto- 5’-nucleotidase), foram identificados por RT-PCR. A análise quantitativa, realizada por real-time PCR, apresentou como genes dominantes expressos durante o crescimento do tumor, as NTPDases 1 e 2 e ecto-5’-nucleotidase. O padrão de hidrólise do ATP extracelular determinado por HPLC, embora com alguma diferença entre os tempos estudados, se manteve similar. As células do tumor de W256 rapidamente hidrolisaram ATP levando à formação transitória de ADP, que foi completamente hidrolisado a AMP. A participação das NPPS 1, 2 e 3 na forma ascítica do tumor e VI durante o desenvolvimento do tumor subcutâneo de W256 também foi investigada. Nas duas formas do tumor o gene dominante foi o da enzima NPP3. Considerando que o ATP é reconhecido como um composto citotóxico em células tumorais, e que adenosina tem sido considerada promotora de tumor, é possível sugerir que, na circulação, a substancial redução na hidrólise dos nucleotídeos da adenina em plaquetas e soro após a indução do tumor pode representar um mecanismo de proteção contra o desenvolvimento tumoral. Por outro lado, nas células tumorais de W256, a elevada expressão de enzimas potencialmente envolvidas na hidrólise do ATP e do AMP, bem como a rápida hidrólise do ATP, pode representar um mecanismo que facilita a proliferação e invasão do tumor. / Adenine and adenosine nucleotides are involved in a variety of pathophysiological process in different cells. The extracellular metabolism of these nucleotides creating nucleosides has an important regulatory function in controlling the homeostasis, mainly for regulate the platelets aggregation, via purinergic P2 receptors. Besides this, an association of these nucleotides and nucleoside in neoplasics process has been suggested. While ATP has shown to exhibit anticancer activity in a great variety of animals and human cells, studies suggest that adenosine presents tumor-promoting actions. Many studies have also demonstrated that nonsteroidal anti-inflamatory, such as acetylsalicylic acid (ASA) can protect against the cancer development. The induced actions from purinergic signalization are ruled by the ectonucleotidases, that include members of the ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolases (E-NTPDases) and ecto-nucleotide pyrophosphatases/phosphodiesterases (E-NPPs) families, and ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’N). Then, in the present study we have investigated the effect of the ASA on the ATP hydrolysis to adenosine, such as studied the biochemical characteristics and expression of the ectonucleotidases in W256 tumor. The hydrolysis of the adenine nucleotides by rat platelets was significantly inhibited by ASA, both for ATP and ADP, but there was no alteration on AMP hydrolysis. In rats submitted to W256 tumor, hydrolysis of the adenine nucleotides by platelets and serum, obtained 6, 10 and 15 days after tumor’s subcutaneous induction, was significantly reduced. In W256 tumor cells (ascitic form of tumor), the kinetic analysis indicated that various ectonucleotidases are involved in this enzymatic cascade. Regarding the biochemistry properties of E-NTPDases and ecto-5'-nucleotidase, for the ATP, ADP e AMP hydrolysis, the optimum pH was reached among 6,5-8,0 and it was also observed a requirement of divalent cations (Mg2+ > Ca2+). A significant inhibition on ATP and ADP hydrolysis was observed in the presence of high concentrations of sodium azide and 0.5 mM of gadolinium chloride. Also, the mRNA by PCR analysis identified the presence of NTPDases 2 and 5, and also the ecto-5'-nucleotidase in W256 tumor cells. With the purpose of investigating the enzymes involved in the catabolism of adenine nucleotides during the tumor’s growth, we evaluated the expression of these enzymes as well as the pattern degradation of extracellular nucleotides in W256 tumor, 6, 10 and 15 days after the tumor’s subcutaneous induction. The mRNAs of all ectonucleotidases studied (NTPDase 1, 2, 3 5 e 6 and ecto-5’-nucleotidase) were identified by RT-PCR. The quantitative analysis, done by real-time PCR, presented as dominant genes expressed during the tumor’s growth, the NTPDases 1 and 2 and ecto-5’-nucleotidase. The pattern of ATP extracellular hydrolysis determined by HPLC, despite a small difference between the times studied, kept similar. The W256 tumor’s cells quickly hydrolyzed ATP, leading to the transitory formation of ADP, which was completely hydrolyzed to AMP. Considering that ATP is recognized as a citotoxic compound in tumor cells, and that adenosine has been considered tumor’s promoter, it is possible to suggest that, in the circulation, the substantial VIII reduction on adenine nucleotides hydrolysis in platelets and serum after tumor’s induction may represent a mechanism of protection against the tumor’s development. The participation of NPPs 1, 2 and 3 in the ascitic form of tumor and during the subcutaneous W256 tumor’s growth was also investigated. In the two forms of the tumor, the dominant gene expressed was the NPP3 enzyme. On the other hand, in W256 tumor cells, the high expression of enzymes potentially involved in ATP and ADP hydrolysis, as well as the fast ATP hydrolysis, may represent a mechanism that facilitate the proliferation and invasion of tumor.

FÉLIX, Francisco Hélder Cavalcante. Modelo de implante de tumor de Walker no cérebro de ratos. 2001. 177 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2001. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-03-27T13:08:04Z No. of bitstreams: 1 2001_dis_fhcfelix.pdf: 4918370 bytes, checksum: 720386029513bd002287f139bb860805 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-03-27T15:59:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2001_dis_fhcfelix.pdf: 4918370 bytes, checksum: 720386029513bd002287f139bb860805 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-27T15:59:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2001_dis_fhcfelix.pdf: 4918370 bytes, checksum: 720386029513bd002287f139bb860805 (MD5) Previous issue date: 2001 / The disabling effects of central nervous system (CNS) tumors are out of proportion to their low incidence. They’re second only to stroke as neurologic mortality causes. Brain metastases are the commonest intracranial tumors in adults, almost 10 times more frequent than primary brain tumors. Their diagnosis and treatment have met significant advances, although much more research about drug resistance and new treatment modalities are needed. New and even better brain tumor animal models will help to evaluate novel drug regimens and adjuvant therapies for CNS neoplasms. In the present work, the author presents a simple and easily reproducible brain tumor model utilizing the tumor cell line W256 transplanted to Wistar rats. They tested a drug widely used for palliative treatment of tumoral brain edema (dexamethasone), for survival impact. They also have tested the effects of a drug newly proposed as multidrug resistance reversal agent (cyclosporin – CS). Wistar albino rats had stereotaxic intracranial tumor inoculation after the surgical installation of a permanent canulla on the area of interest (right subfrontal caudate). The brain tumor model, as a model of metastatic brain disease, was successful, with reproducible tumor growth (95%), low incidence of extracranial tumor implantation (21% local, no distant metastasis) and few evidence of surgical site infection (21%). The median survival of the animals was 12.5 days (control), 13 days (CS vehicle treated), 11 days (CS treated), 9.5 and 9 days (dexamethasone 0.3 and 3.0 mg/kg/day). These differences were not significant, although the survival rates on the 12th day post-inoculation have showed a significant survival decrease for the case of dexamethasone 3,0 mg/kg/day (p < 0.05), but not for CS treatment (Fischer’s Exact Test). The estimated tumor volume was 17.08 ± 6.7 mm3 (control) and 12.61 ± 3.6 mm3 (CS treatment, not significant, Student’s t-test). The tumor volume in the 9th day post-inoculation was estimated in 67,25 ± 19,8 mm3. The doubling time was 24.25 h. This model behaved as an undifferentiated tumor, with local invasiveness features compared with that of primary brain tumors. It fits well, in this way, for the study of tumor cell migration on CNS parenchyma. Phenomena like neuronal degeneration, neuron cell edema and death, and gliosis, as well as perivascular cell infiltrates, were seen frequently. One could find, also, neoangiogenesis, satellite tumor growth, and tumor cell migration in normal brain parenchyma. Besides heavy parenchymatous infiltration, it was also disclosed markedly tumor cell migration along white matter tracts, such as callosal fibers and infiltration in the Virchow-Robins perivascular space. The model presents as a dual brain tumor and leptomeningeal carcinomatosis model. It could be used for the study and treatment test in the scenario of these two pathologies. The intracerebral tumor growth induced peripheral blood neutrophil count elevation (ANOVA, p < 0.01), higher chance for neutrophilia (Fischer’s Exact Test, p < 0.01), higher chance for lymphopenia (Fischer’s Exact Test, p < 0.01) and brain weight increase (Student’s t-test, p < 0.001) comparing to control. There was no significant change in any of the other hematologic, biochemical and biological parameters tested. CS treatment did not alter any of the tests, as compared to non-treated brain tumor animals. The only exception was the mean animal weight on the first week post-inoculation (ANOVA, p < 0.05). CS, in this way, was responsible for an early cachexia in the brain tumor inoculated animals. CS treatment of brain tumor animals did show non-significant effects indicating a volume (26%) and weight tumor decrease, and tumor infiltrating neutrophil increase (odds ratio - OR = 5.6). This indicates the necessity to further study morphologically and functionally the local inflammation in brain tumor inoculated animals, as well the effects of CS administration. In conclusion, the W256 intracerebral tumor model is simple, easily performed, reproducible and of great potential utility. In this model, tumor inoculation can lead to hematologic and biologic modifications in the experimental animals. CS could apparently lead to early tumor caquexia in this tumor model. However, CS treatment did not modify the survival chance of the brain tumor animals, in sharp contrast to dexamethasone 3.0mg/kg/day, a much-used drug in the treatment of brain tumors, which decreased the animal survival. / Os importantes efeitos incapacitantes dos tumores do sistema nervoso central (SNC) são desproporcionais a sua baixa incidência. Mesmo assim, entre as doenças neurológicas, ficam atrás apenas dos acidentes vasculares do SNC como causa de morte. Metástases cerebrais constituem os tumores intracranianos mais comuns do adulto, ocorrendo até 10 vezes mais freqüentemente que tumores primários. Avanços significativos ocorreram em seu diagnóstico e tratamento, embora mais pesquisa sobre os fenômenos que diminuem o efeito de drogas em metástases cerebrais e tratamentos eficazes para estas patologias sejam cada vez mais necessários. O desenvolvimento de melhores modelos animais de tumores do SNC será necessário para a avaliação in vivo de novas formas de quimioterapia (QT) e terapia adjuvante para tumores cerebrais. No presente trabalho, o autor objetivou desenvolver um modelo de tumor cerebral simples e de fácil reprodução utilizando a linhagem W256, além de testar o efeito na sobrevida animal de uma droga largamente usada para o tratamento de efeitos secundários a edema cerebral (dexametasona). O autor também testou uma droga envolvida numa nova proposta de reversão de multirresistência a drogas anti-neoplásicas em tumores cerebrais (ciclosporina – CS). Ratos albinos (Wistar) tiveram o tumor inoculado através de estereotaxia, após a instalação cirúrgica de uma cânula no ponto escolhido (caudato subfrontal direito). O modelo de tumor implantado no cérebro de ratos, simulando uma metástase cerebral, mostrou-se bem sucedido e reprodutível (95% de crescimento tumoral), com baixa incidência de disseminação tumoral extracraniana local (21%), baixa evidência de infecção local (21%), ausência de metástases à distância e ausência de sinais de infecção sistêmica. Os animais sobreviveram uma mediana de 12,5 dias (grupo controle), 13 dias (tratados com veículo da CS), 11 dias (tratados com CS), 9,5 e 9 dias (dexametasona 0,3 e 3,0 mg/kg/dia, respectivamente). As diferenças entre estas medianas não foram significantes (teste de Kruskal-Wallis), embora as diferenças entre as taxas de sobrevida no 12o dia após a inoculação tenham mostrado redução significante no grupo que recebeu dexametasona 3,0 mg/kg/dia (p < 0,05), mas não no grupo tratado com CS (teste de Fischer). O volume tumoral estimado (VTE) no sétimo dia pós-inoculação (7DPI) foi de 17,08 ± 6,7 mm3 no controle e 12,61± 3,6 mm3 após tratamento com CS, sem diferença significante (teste t-Student). O VTE no 9DPI de animais do grupo Tumor foi de 67,25 ± 19,8 mm3. O tempo de duplicação foi de 24,25 h. O modelo comportou-se como um tumor de características indiferenciadas, apresentando invasividade local comparada à de tumores primários do SNC, prestando-se ao estudo da migração de células tumorais no SNC. Observaram-se fenômenos como degeneração neuronal hidrópica, edema celular neuronal, sinais de morte celular neuronal e gliose, além da presença de infiltrados celulares tumorais e inflamatórios perivasculares. Observaram-se, também, neoformação vascular, formação de nódulos tumorais satélites ao tumor principal e migração celular tumoral no parênquima cerebral normal. Observou-se, além da infiltração parenquimatosa, marcante migração celular tumoral ao longo de tratos de substância branca (corpo caloso) e ao longo dos espaços perivasculares de Virchow-Robins. O modelo apresenta-se como um misto de tumor cerebral intraparenquimatoso e carcinomatose leptomeníngea, podendo ser utilizado para estudar o comportamento e testar formas de tratamento para ambas as patologias. O crescimento tumoral intracerebral induziu aumento do número de neutrófilos no sangue periférico (ANOVA, p < 0,01), maior chance de apresentar neutrofilia (teste de Fischer, p < 0,01), maior chance de apresentar linfopenia (teste de Fischer, p < 0,01) e aumento do peso dos cérebros dos animais experimentais (teste t-Student, p < 0,001) em relação ao controle. Nenhum dos outros valores hematológicos, bioquímicos e biológicos foi alterado de maneira significante. O tratamento de animais inoculados com tumor com a CS, não alterou nenhuma das medidas hematológicas, bioquímicas ou biológicas em relação aos animais inoculados com tumor e não tratados, exceto o peso dos animais na primeira semana após inoculação tumoral (ANOVA, p < 0,05). A CS, dessa forma, induziu significantemente uma caquexia precoce nos animais inoculados com tumor cerebral. O tratamento com CS de animais inoculados com tumor mostrou tendências não significantes a diminuir volume (26%) e massa (7%) tumorais e aumentar número de neutrófilos infiltrantes de tumor (razão de chance - RC = 5,6) e necrose tumoral, indicando a necessidade de posteriores estudos para caracterizar morfológica e funcionalmente a resposta inflamatória local em animais inoculados com tumor e a influência da CS neste processo, além do efeito da CS na angiogênese tumoral. Concluindo, o modelo de W256 intracerebral mostrou-se simples, de fácil execução, reprodutível e útil. Neste modelo, a inoculação tumoral induz modificações hematológicas e biológicas nos animais. A CS pareceu exarcebar a caquexia tumoral neste modelo. A CS, todavia, não alterou a chance de sobrevida de animais inoculados com tumor cerebral, ao contrário da dexametasona 3,0 mg/kg/dia, que reduziu esta chance. A CS, assim, parece ser mais segura neste modelo tumoral que uma droga largamente utilizada para tratamento de pacientes com metástase cerebral.

GOMES NETO, Antero. Modelo experimental de tumor no pulmão com implante de células tumorais por via intrabrônquica : avaliação dos efeitos da talidomida, gefitinib e paclitaxe. 2006. 164 f. Tese (Doutorado em Cirurgia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2010. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2014-03-14T16:07:25Z No. of bitstreams: 1 2006_tese_agomesneto.pdf: 6071120 bytes, checksum: 96d84eba70f3a6b3fae12b1700c5ff69 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2014-03-14T16:09:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_tese_agomesneto.pdf: 6071120 bytes, checksum: 96d84eba70f3a6b3fae12b1700c5ff69 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-03-14T16:09:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_tese_agomesneto.pdf: 6071120 bytes, checksum: 96d84eba70f3a6b3fae12b1700c5ff69 (MD5) Previous issue date: 2006 / Lung cancer has been the main cause of death from cancer worldwide over the past decade in spite of the appearance of new chemotherapy drugs and targeted therapies. It is therefore necessary to clarify the molecular and biological changes involved in carcinogenesis and tumor growth and to develop experimental models for the study of the biology of lung tumors and the effects of antineoplastic drugs. The objective of the study was to develop a practical and easily reproducible lung tumor model using immunocompetent rats and to evaluate the activity of antineoplastic drugs. One hundred ninety-one female Wistar rats, with an average weight of 199±23g, were randomly assigned to one of three experimental groups. All animals were anesthetized intraperitonially (ip) with 2.5% tribromoetanol (1ml/100g live weight), tracheostomized and intubated with a polyethylene catheter (16G) guided intrabronchially (ib) to the bottom of the lung for inoculation with Walker 256 tumor cells. Group 1 (n=32) established the ib cell implant technique and the tumor take rate with inoculation of 105 to 5×105 cells. Group 2 (n=16) evaluated tumor volume on the fifth day of implant with 4×105 cells and correlated chest findings from high-resolution computerized tomography (HRCT) and necropsy. Group 3 (n=143) evaluated the effect of antineoplastic drugs and validated the model in two stages. Stage 1 (n=72) evaluated tumor volume on the fifth day of implant with 4×105 cells, divided into 5 groups: control (CG), 0.9% NaCl (1ml/gavage); celecoxib (Gclx), 15, 30 and 60mg/kg/day/gavage; thalidomide (Gtld), 45mg/kg/d/sc; gefitinib (Ggfb), 25mg/kg/day/gavage; and thalidomide + gefitinib (Gtld + gfb). Stage 2 (n=71) evaluted the survival of the animals divided into six groups: Gc, Gclx, Gtld, Ggfb, Gtld + gfb, and Gpcl (paclitaxel) 8mg/kg ip. The overal take rate for implants of 4×105 cells was 96% (149/155), specifically 90% in the first experimental group, 100% in the second and 96% in the third. Surgical mortality was 4.2% (8/191); 21 animals were excluded due to absence of tumor in the lung, death from infection (pulmonary abscess) and other causes not related to the tumor. In Group 2, measures obtained with HRCT and necropsy were similar (r=0, 953, p<0.0001). In the first stage of Group 3 no difference in tumor volume was observed between treated animals and controls; in the second stage median survival time was significantly extended in animals treated with TLD, GFB and PCL (13, 13 and 29 days, respectively) compared to controls (11 days) (Log Rank test: p<0.001). In conclusion, the present lung tumor model with intrabronchial tumor cell implantation was shown to be feasible and was associated with high tumor take rates, minor surgical mortality, simple execution and easy reproducibility. HRCT was found to be a highly accurate method of diagnosis, localization and tumor measurement. The model was efficient in the evaluation of the antitumoral activity of the antineoplastic drug paclitaxel, the antiangiogenic drug thalidomide, and the EGFR tyrosine kinase inhibitor gefitinib, making it a valid model for testing new drugs in lung cancer. / O câncer de pulmão tem sido, na última década, a principal causa de morte por câncer no mundo, apesar do surgimento de novos quimioterápicos e das terapias alvo-direcionadas. Por isso, faz-se necessário o entendimento das alterações moleculares e biológicas envolvidas nos processos de carcinogênese e crescimento tumoral, bem como o desenvolvimento de modelos experimentais adequados que permitam estudar o comportamento biológico dos tumores de pulmão e o efeito de drogas antineoplásicas. O objetivo desse estudo foi desenvolver um modelo de tumor no pulmão em ratos imunocompetentes de execução simples e fácil reprodutibilidade, e avaliar a atividade de drogas antitumorais. Cento e noventa e um ratos Wistar fêmeas, peso médio de 199±23g, foram distribuídos ao acaso em três etapas experimentais. Todos os animais foram anestesiados com tribromoetanol 2,5% (1 ml/100g de rato) intraperitonial (ip), traqueostomizados e intubados com cateter de polietileno 16G, seguindo-o por via intrabrônquica (ib) até as porções inferiores do pulmão para inocular células do tumor 256 de Walker. A 1a etapa (n=32) foi feita para estabelecer a técnica do implante de células por via ib e o índice de pega tumoral, inoculando-se de 105 a 5×105 células. A 2a etapa (n=16) para avaliar o volume tumoral no 5o dia do implante de 4×105 células e correlacionar os achados da tomografia computadorizada de alta resolução (TCAR) de tórax com os da necropsia. A 3a etapa (n=143) para a avaliar o efeito de drogas e validar o modelo, sendo dividida em duas fases. A 1a fase (n=72) para avaliar o volume tumoral no 5o ou 6o dia do implante de 4×105 células do tumor, composta de cinco grupos: Grupo controle (Gc), NaCl 0,9% (1ml/gavagem); Grupo celecoxib (Gclx), 15, 30 e 60 mg/kg/dia/gavagem; Grupo talidomida (Gtld), 45 mg/kg/d/sc; Grupo gefitinib (Ggfb), 25 mg/kg/dia; Grupo talidominda + gefititinib (Gtld +gfb). A 2a fase (n=71) para avaliar a sobrevida dos animais, com seis grupos: Gc, Gclx (15, 30, 60), Gtld, Ggfb, Gtld + gfb, Grupo paclitaxel (Gpcl), 8 mg/kg ip. O índice geral de pega do tumor com o implante 4×105 células foi de 96% (149/155), sendo 90% na 1a etapa, 100% na 2a etapa e 96% na 3a etapa. A mortalidade cirúrgica foi de 4,2% (8/191) e 21 animais foram excluídos do estudo por ausência de tumor no pulmão, morte por infecção (abscesso pulmonar) e outras causas não relacionadas com o tumor. Na 2a etapa, as medidas do tumor feitas na TCAR e comparadas com a necropsia foram semelhantes (r=0, 953, p<0,0001). Na 1a fase da 3a etapa, não se observou diferença no volume tumoral dos animais dos grupos tratados em relação ao controle; e na 2a fase verificou-se aumento significante da sobrevida mediana dos animais tratados com TLD, GFB e PCL (13, 13 e 29 dias, respectivamente), em relação ao controle (11dias), teste de Log Rank: p<0,001. Conclui-se que o modelo de tumor de pulmão por implantação de células tumorais por via intrabrônquica mostrou-se viável, com alto índice de pega e mortalidade cirúrgica desprezível, de execução simples e fácil reprodutibilidade. A TCAR revelou-se um método de imagem de alta acurácia no diagnóstico, localização e mensuração das lesões tumorais. O modelo mostrou-se eficaz na avaliação de atividade antitumoral de drogas antineoplásicas como o paclitaxel, antiangiogênicas como a talidomida, e inibidores de tirosina quinase do EGFR como o gefitinib.

Considerando as várias propriedades fisiológicas e patológicas já descritas para os nucleotídeos da adenina, muitos estudos têm sugerido um importante papel destas moléculas no desenvolvimento de tumores. Enquanto o ATP parece ser citotóxico às células tumorais, a adenosina possui uma atividade tumorogênica. Além disso, muitos estudos demonstram o envolvimento dos nucleotídeos na modulação da resposta imune. As ações induzidas pela sinalização purinérgica são reguladas pelas nucleotidases, que podem estar localizadas nas membranas celulares ou podem apresentar-se de forma solúvel no meio intracelular e/ou extracelular. Pertencem a este grupo de enzimas a família das nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase (NTPDases), a família das nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterase (NPPs) e a 5’-nucleotidase. Muitos estudos sugerem que o uso de antiinflamatórios não-esteroidais está associado com a proteção contra o desenvolvimento de muitos tipos de câncer. Neste estudo, nós avaliamos a hidrólise extracelular dos nucleotídeos da adenina em linfócitos de ratos adultos submetidos ao modelo tumoral de Walker 256, bem como uma possível modulação do ácido acetilsalicílico (AAS) nas atividades nucleotidásicas em linfócitos e soro de ratos submetidos ao mesmo modelo. Nossos resultados demonstraram um aumento significativo nas hidrólises de ATP e ADP em linfócitos no décimo dia após a indução tumoral e/ou o tratamento com AAS. Nenhuma alteração na hidrólise do AMP foi observada. A administração de AAS aumentou a hidrólise de ATP e ADP em linfócitos de ratos inoculados com o tumor. Os níveis transcricionais das NTPDases1-3 foram significativamente aumentados na presença do tumor e diferentemente afetados pela administração do AAS. No soro, a hidrólise do ATP foi alterada pelo AAS apenas no décimo dia de tratamento, enquanto as hidrólises de ADP e AMP foram alteradas no sexto e no décimo dias. A administração de AAS aos animais inoculados com o tumor promoveu uma redução significativa nas hidrólises de ATP e AMP no sexto dia. A partir desses resultados, podemos concluir que a modulação dos níveis dos nucleotídeos em linfócitos pareceu não contribuir para os efeitos benéficos do AAS no câncer. Por outro lado, na circulação, um efeito potencialmente benéfico do AAS sobre o tumor foi observado no período inicial de tratamento. Assim, é possível sugerir, que o AAS possa desempenhar um importante papel na prevenção da invasão do tumor, parecendo não ser mais efetivo após sua instalação e desenvolvimento no hospedeiro. / In addition to the various physiological and pathological properties already known for adenine nucleotides, an important role of these molecules in tumor development has been proposed. Whereas ATP has been shown to be cytotoxic for tumoral cells, adenosine has been shown to posses a tumor-promoting action. Moreover, many studies have also demonstrated the nucleotide involvement in immune response modulation. The actions induced by purinergic signaling are regulated by nucleotidases, that are located on cell membrane or they are present in soluble forms on the intracellular and/or extracellular milieu. These enzymes comprise the nucleoside triphosphate diphosphohydrolase family (NTPDases), the nucleotide pyrophosphatase/ phosphodiesterase family (NPPs) and the 5’- nucleotidase. Numerous studies have suggested that the use of non-steroidal antiinflammatory drugs can protect against the development of cancer. In the present study, we evaluated the extracellular adenine nucleotide hydrolysis from rat lymphocytes submitted to the Walker 256 tumor model and a possible modulation of acetylsalicylic acid on nucleotidase activities from rat lymphocytes and rat blood serum submitted to the same model. Our results demonstrated a significant increase on ATP and ADP hydrolysis from rat lymphocyte ten days after the tumor induction and/or the ASA treatment. No alterations were observed to AMP hydrolysis. The ASA administration increased ATP and ADP hydrolysis from tumor-bearing rat lymphocytes. The transcriptional levels of NTPDases1-3 were significantly increased in the tumor presence and differently affected by ASA administration. In the blood serum, the ATP hydrolysis was altered by ASA only at 10 days of treatment whereas the ADP and AMP hydrolysis were altered at 6 and 10 days. The ASA administration in tumor-bearing rats promoted a significant reduction on ATP and AMP hydrolysis at 6 days of treatment. Considering our results, it is possible to conclude that modulation on nucleotide levels in lymphocytes seems not contribute to beneficial effects of ASA in cancer. By other hand, in the circulation, a potential beneficial effect of ASA on tumor was observed in the initial period of treatment. Thus, it is possible to suggest that ASA could have an important role in the tumor invasion, but does not seem to be effective after its installation and development in the host.

Considerando as várias propriedades fisiológicas e patológicas já descritas para os nucleotídeos da adenina, muitos estudos têm sugerido um importante papel destas moléculas no desenvolvimento de tumores. Enquanto o ATP parece ser citotóxico às células tumorais, a adenosina possui uma atividade tumorogênica. Além disso, muitos estudos demonstram o envolvimento dos nucleotídeos na modulação da resposta imune. As ações induzidas pela sinalização purinérgica são reguladas pelas nucleotidases, que podem estar localizadas nas membranas celulares ou podem apresentar-se de forma solúvel no meio intracelular e/ou extracelular. Pertencem a este grupo de enzimas a família das nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase (NTPDases), a família das nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterase (NPPs) e a 5’-nucleotidase. Muitos estudos sugerem que o uso de antiinflamatórios não-esteroidais está associado com a proteção contra o desenvolvimento de muitos tipos de câncer. Neste estudo, nós avaliamos a hidrólise extracelular dos nucleotídeos da adenina em linfócitos de ratos adultos submetidos ao modelo tumoral de Walker 256, bem como uma possível modulação do ácido acetilsalicílico (AAS) nas atividades nucleotidásicas em linfócitos e soro de ratos submetidos ao mesmo modelo. Nossos resultados demonstraram um aumento significativo nas hidrólises de ATP e ADP em linfócitos no décimo dia após a indução tumoral e/ou o tratamento com AAS. Nenhuma alteração na hidrólise do AMP foi observada. A administração de AAS aumentou a hidrólise de ATP e ADP em linfócitos de ratos inoculados com o tumor. Os níveis transcricionais das NTPDases1-3 foram significativamente aumentados na presença do tumor e diferentemente afetados pela administração do AAS. No soro, a hidrólise do ATP foi alterada pelo AAS apenas no décimo dia de tratamento, enquanto as hidrólises de ADP e AMP foram alteradas no sexto e no décimo dias. A administração de AAS aos animais inoculados com o tumor promoveu uma redução significativa nas hidrólises de ATP e AMP no sexto dia. A partir desses resultados, podemos concluir que a modulação dos níveis dos nucleotídeos em linfócitos pareceu não contribuir para os efeitos benéficos do AAS no câncer. Por outro lado, na circulação, um efeito potencialmente benéfico do AAS sobre o tumor foi observado no período inicial de tratamento. Assim, é possível sugerir, que o AAS possa desempenhar um importante papel na prevenção da invasão do tumor, parecendo não ser mais efetivo após sua instalação e desenvolvimento no hospedeiro. / In addition to the various physiological and pathological properties already known for adenine nucleotides, an important role of these molecules in tumor development has been proposed. Whereas ATP has been shown to be cytotoxic for tumoral cells, adenosine has been shown to posses a tumor-promoting action. Moreover, many studies have also demonstrated the nucleotide involvement in immune response modulation. The actions induced by purinergic signaling are regulated by nucleotidases, that are located on cell membrane or they are present in soluble forms on the intracellular and/or extracellular milieu. These enzymes comprise the nucleoside triphosphate diphosphohydrolase family (NTPDases), the nucleotide pyrophosphatase/ phosphodiesterase family (NPPs) and the 5’- nucleotidase. Numerous studies have suggested that the use of non-steroidal antiinflammatory drugs can protect against the development of cancer. In the present study, we evaluated the extracellular adenine nucleotide hydrolysis from rat lymphocytes submitted to the Walker 256 tumor model and a possible modulation of acetylsalicylic acid on nucleotidase activities from rat lymphocytes and rat blood serum submitted to the same model. Our results demonstrated a significant increase on ATP and ADP hydrolysis from rat lymphocyte ten days after the tumor induction and/or the ASA treatment. No alterations were observed to AMP hydrolysis. The ASA administration increased ATP and ADP hydrolysis from tumor-bearing rat lymphocytes. The transcriptional levels of NTPDases1-3 were significantly increased in the tumor presence and differently affected by ASA administration. In the blood serum, the ATP hydrolysis was altered by ASA only at 10 days of treatment whereas the ADP and AMP hydrolysis were altered at 6 and 10 days. The ASA administration in tumor-bearing rats promoted a significant reduction on ATP and AMP hydrolysis at 6 days of treatment. Considering our results, it is possible to conclude that modulation on nucleotide levels in lymphocytes seems not contribute to beneficial effects of ASA in cancer. By other hand, in the circulation, a potential beneficial effect of ASA on tumor was observed in the initial period of treatment. Thus, it is possible to suggest that ASA could have an important role in the tumor invasion, but does not seem to be effective after its installation and development in the host.

Considerando as várias propriedades fisiológicas e patológicas já descritas para os nucleotídeos da adenina, muitos estudos têm sugerido um importante papel destas moléculas no desenvolvimento de tumores. Enquanto o ATP parece ser citotóxico às células tumorais, a adenosina possui uma atividade tumorogênica. Além disso, muitos estudos demonstram o envolvimento dos nucleotídeos na modulação da resposta imune. As ações induzidas pela sinalização purinérgica são reguladas pelas nucleotidases, que podem estar localizadas nas membranas celulares ou podem apresentar-se de forma solúvel no meio intracelular e/ou extracelular. Pertencem a este grupo de enzimas a família das nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase (NTPDases), a família das nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterase (NPPs) e a 5’-nucleotidase. Muitos estudos sugerem que o uso de antiinflamatórios não-esteroidais está associado com a proteção contra o desenvolvimento de muitos tipos de câncer. Neste estudo, nós avaliamos a hidrólise extracelular dos nucleotídeos da adenina em linfócitos de ratos adultos submetidos ao modelo tumoral de Walker 256, bem como uma possível modulação do ácido acetilsalicílico (AAS) nas atividades nucleotidásicas em linfócitos e soro de ratos submetidos ao mesmo modelo. Nossos resultados demonstraram um aumento significativo nas hidrólises de ATP e ADP em linfócitos no décimo dia após a indução tumoral e/ou o tratamento com AAS. Nenhuma alteração na hidrólise do AMP foi observada. A administração de AAS aumentou a hidrólise de ATP e ADP em linfócitos de ratos inoculados com o tumor. Os níveis transcricionais das NTPDases1-3 foram significativamente aumentados na presença do tumor e diferentemente afetados pela administração do AAS. No soro, a hidrólise do ATP foi alterada pelo AAS apenas no décimo dia de tratamento, enquanto as hidrólises de ADP e AMP foram alteradas no sexto e no décimo dias. A administração de AAS aos animais inoculados com o tumor promoveu uma redução significativa nas hidrólises de ATP e AMP no sexto dia. A partir desses resultados, podemos concluir que a modulação dos níveis dos nucleotídeos em linfócitos pareceu não contribuir para os efeitos benéficos do AAS no câncer. Por outro lado, na circulação, um efeito potencialmente benéfico do AAS sobre o tumor foi observado no período inicial de tratamento. Assim, é possível sugerir, que o AAS possa desempenhar um importante papel na prevenção da invasão do tumor, parecendo não ser mais efetivo após sua instalação e desenvolvimento no hospedeiro. / In addition to the various physiological and pathological properties already known for adenine nucleotides, an important role of these molecules in tumor development has been proposed. Whereas ATP has been shown to be cytotoxic for tumoral cells, adenosine has been shown to posses a tumor-promoting action. Moreover, many studies have also demonstrated the nucleotide involvement in immune response modulation. The actions induced by purinergic signaling are regulated by nucleotidases, that are located on cell membrane or they are present in soluble forms on the intracellular and/or extracellular milieu. These enzymes comprise the nucleoside triphosphate diphosphohydrolase family (NTPDases), the nucleotide pyrophosphatase/ phosphodiesterase family (NPPs) and the 5’- nucleotidase. Numerous studies have suggested that the use of non-steroidal antiinflammatory drugs can protect against the development of cancer. In the present study, we evaluated the extracellular adenine nucleotide hydrolysis from rat lymphocytes submitted to the Walker 256 tumor model and a possible modulation of acetylsalicylic acid on nucleotidase activities from rat lymphocytes and rat blood serum submitted to the same model. Our results demonstrated a significant increase on ATP and ADP hydrolysis from rat lymphocyte ten days after the tumor induction and/or the ASA treatment. No alterations were observed to AMP hydrolysis. The ASA administration increased ATP and ADP hydrolysis from tumor-bearing rat lymphocytes. The transcriptional levels of NTPDases1-3 were significantly increased in the tumor presence and differently affected by ASA administration. In the blood serum, the ATP hydrolysis was altered by ASA only at 10 days of treatment whereas the ADP and AMP hydrolysis were altered at 6 and 10 days. The ASA administration in tumor-bearing rats promoted a significant reduction on ATP and AMP hydrolysis at 6 days of treatment. Considering our results, it is possible to conclude that modulation on nucleotide levels in lymphocytes seems not contribute to beneficial effects of ASA in cancer. By other hand, in the circulation, a potential beneficial effect of ASA on tumor was observed in the initial period of treatment. Thus, it is possible to suggest that ASA could have an important role in the tumor invasion, but does not seem to be effective after its installation and development in the host.

Orientador: Anibal Eugenio Vercesi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-09T14:37:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Degasperi_GiovannaRosa_D.pdf: 11126926 bytes, checksum: ac93e241fd745524d24266677f70d711 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A compreensão dos mecanismos de resposta imunológica do hospedeiro durante o desenvolvimento tumoral é fundamental para o estabelecimento de imunoterapias contra o câncer. Durante o desenvolvimento intraperitoneal do tumor de Walker 256, um modelo tumoral amplamente utilizado na oncologia experimental, foram avaliadas a bioenergética mitocondrial e a homeostase de Ca2+ em linfócitos esplênicos de animais portadores do tumor, bem como os processos de proliferação e morte linfocitária. Nos ratos portadores de tumor de Walker (TB), a proliferação linfocitária predominantemente do tipo TCD8+ e o aumento dos níveis de interleucina-2 indicaram a ocorrência de ativação linfocitária durante o desenvolvimento tumoral. O processo de ativação linfocitária acarretou produção exacerbada de espécies reativas de oxigênio (EROs). Considerando que o tratamento in vitro com difenileno-iodônio inibiu a produção de EROs e aumentou os níveis da proteína cinase C fosforilada, sugere-se que a maior fonte de EROs nesta situação é a NADPH oxidase. A elevação da concentração citosólica de Ca2+ induziu acúmulo mitocondrial deste cátion. A elevação da concentração de Ca2+ intramitocondrial e a sensibilidade a oligomicina, bem como a diminuição da razão ATP/ADP, observadas em ratos TB são indicativos de estímulo do metabolismo energético. O aumento dos níveis de interferon-gama, mas não de interleucina-10, sugere que linfócitos ativados com alta demanda energética, foram capazes de deflagrar resposta imunológica do tipo Th-1 durante o desenvolvimento tumoral. Embora linfócitos ativados apresentaram mecanismos de defesa, como maior expressão da proteína antiapoptótica Bcl-2 e da proteína desacopladora UCP-2, observou-se que os mesmos são mais susceptíveis aos danos celulares causados pela indução de estresse oxidativo in vitro. Desta forma, linfócitos isolados de baço de ratos TB apresentaram elevada taxa de morte celular por necrose após o tratamento com tert-butil hidroperóxido, um indutor clássico de estresse oxidativo. Desferoxamina, um antioxidante e quelante de Fe2+, preveniu a ocorrência de necrose, indicando a participação de EROs no processo de morte celular. Contrariamente ao FK506, a ciclosporina A inibiu de maneira significativa à morte celular. FK506 e ciclosporina A são importantes antagonistas da via da calcineurina, entretanto somente a ciclosporina A previne a formação do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (MPT). Desta forma, a indução de morte celular do tipo necrose em linfócitos ativados é via MPT. Considerando a ocorrência de linfopenia durante a quimioterapia associada ao estresse oxidativo, estes dados contribuem para a compreensão dos mecanismos que levam a linfopenia freqüentemente observada durante o tratamento quimioterápico em indivíduos portadores de tumor. Ainda, foi demonstrado que o influxo celular de Ca2+ exerce papel central no controle da resposta imunológica. A administração de verapamil, um inibidor de influxo de Ca2+ via canal tipo-L, preveniu a ativação linfocitária, bem como os mecanismos de defesa (níveis elevados de Bcl-2 e UCP-2), entre outros parâmetros estudados. Ainda, a administração de verapamil nos ratos TB contribuiu para o aparecimento de efeitos paraneoplásicos, a exemplo da anorexia e anemia. Em conjunto, os resultados deste estudo sugerem que linfócitos do hospedeiro são capazes de exercer o processo de vigilância imunológica, envolvendo o influxo celular de Ca2+ e a participação mitocondrial com a ativação da fosforilação oxidativa, que contribui para a demanda energética requerida pelo processo de resposta imune durante o desenvolvimento tumoral / Abstract: The understanding of the mechanisms of host immune response during the tumoral development is essential to establish the immunotherapy against cancer. During the intraperitoneal development of Walker 256 tumor, the tumor model widely used in experimental oncology, the mitochondrial bioenergetics and Ca2+ homeostasis were evaluated in splenic lymphocytes from adult Wistar rats, as well as the processes of lymphocyte proliferation and death. In Walker 256 tumor bearing rats (TB) rats, the lymphocyte proliferation predominantly TCD8+ type and the increase in the levels of interleukin-2 indicated that the tumor development induces the process of lymphocyte activation. The process of lymphocyte activation induced reactive oxygen species (ROS) overproduction. Considering that the treatment of TB rats with diphenylene iodonium in vitro inhibited ROS overproduction and increased the levels of protein Kinase C phosphorylation, the NADPH oxidase was suggested as the main ROS source under this situation. The increase in cytosolic free Ca2+ concentration induced mitochondrial uptake of this cation. The increase in intramitochondrial Ca2+ concentration and in the sensitivity to oligomycin, as well as the decrease in ATP/ADP ratio, observed in TB rats, indicate a stimulation of the energetic metabolism. The increase in interferongamma, but not interleukin-10, suggests that the activated lymphocytes with high energy demand are able to promote the Th1-type immune response during the tumor development. Although the activated lymphocytes showed protective mechanisms, such as the higher levels of the anti-apoptotic protein Bcl-2 and uncoupling protein UCP-2, it was observed that they are more susceptible to cellular damage caused by the induction of oxidative stress in vitro. Spleen lymphocytes isolated from TB rats presented an increase in necrotic cell death rate after treatment with tert-butyl hydroperoxide, a classical inductor of oxidative stress. Desferoxamine, an antioxidant and Fe2+ chelator, prevented the induction of cell death indicating the participation ROS in the process of cell death. However, cyclosporin A but not FK506 inhibited significantly the necrotic cell death. FK506 and cyclosporin A are important antagonists of calcineurin pathway, but only cyclosporin A inhibits the mitochondrial permeability transition (MPT). Therefore, it was suggested that the induction of necrotic cell death in activated lymphocytes is by MPT. Considering the processes of lymphopenia during the chemotherapy associated with oxidative stress, these data could help in the understanding of mechanisms that leads to lymphopenia frequently observed during the chemoterapic treatment of tumor bearing patients. Moreover, it was demonstrated that Ca2+ influx play a central rule in the control of immune response. The administration of verapamil, an inhibitor of Ca2+ influx through L-type Ca2+ channel, prevented the lymphocyte activation and the defense mechanisms (Bcl-2 and UCP-2) triggered by tumor development, between other parameters evaluated. Moreover, the administration of verapamil in TB rats contributes to the occurrence of paraneoplastic effects, such as anorexia and anemia. Together, these results suggest that lymphocytes are able to exert the immunologic vigilance process involving cell Ca2+ influx and participation of mitochondria through activated oxidative phosphorylation that sustains the energy demand required by immune response process during tumor development / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

Orientador: Jose Barreto Campello Carvalheira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-09T01:39:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ropelle_EduardoRochete_M.pdf: 1594903 bytes, checksum: c30fea33a399994a7ccd128d77733add (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A patogênese da anorexia induzida pelo câncer é multifatorial e está associada a distúrbios dos mecanismos centrais que controlam a ingestão alimentar. Todavia, os mecanismos neuroquímicos responsáveis pelo desenvolvimento da anorexia induzida pelo câncer são desconhecidos. Este presente estudo demonstra que a infusão crônica de 5-amino-4 imidazolecarboxamide-riboside (AICAR) no terceiro ventrículo hipotalâmico e a injeção intraperitoneal de 2 deoxi-D-glicose (2DG), promoveram a ativação da AMPK hipotalâmica, aumentaram a ingestão alimentar e prolongaram a sobrevida de ratos com anorexia induzida por tumor. Em paralelo, a ativação farmacológica da AMPK hipotalâmica em animais portadores de tumor, reduziu significativamente a produção hipotalâmica da óxido nítrico sintase induzível (iNOS), da Interleucina-1ß (IL-1ß) e do fator de necrose tumoral alfa (TNF-a) e modulou a expressão de neuropeptídeos hipotalâmicos (NPY e POMC) envolvidos no controle da homeostase energética. Além disso, o tratamento diário via oral com metformina, biguanida com ação anti-diabética, também aumentou a fosforilação da AMPK hipotalâmica, aumentou a ingestão alimentar e a sobrevida nos animais com anorexia induzida pelo tumor. Coletivamente, nossos achados sugerem que a ativação da AMPK hipotalâmica reverte a anorexia induzida pelo câncer através da inibição da produção de moléculas pró-inflamatórias e através do controle da expressão de neuropeptídeos no hipotálamo, refletindo em aumento da sobrevida dos ratos portadores de tumor. Assim nossos dados indicam que a ativação da AMPK representa uma atrativa oportunidade para o tratamento da anorexia induzida pelo câncer / Abstract: The pathogenesis of cancer anorexia is multifactorial and is associated with disturbances of the central physiological mechanisms controlling food intake. However the neurochemical mechanisms responsable for cancer induced-anorexia are unclear. Here, we show that chronic infusion of 5-amino-4imidazolecarboxamide-riboside (AICAR) into the third cerebral ventricle and a chronic peripheral injection of 2 deoxy-D-glucose (2DG) promotes hypothalamic AMPK activation, increased food intake and prolongs the survival of anorexic tumor bearing (TB) rats. In parallel, the pharmacological activation of hypothalamic AMPK in TB animals, markedly reduced the hypothalamic production of inducible nitric oxide synthase (iNOS), interleukin-1ß IL-1ß and tumor necrosis factor-alpha (TNF-a and modulated the expression of hypothalamic neuropeptides (NPY and POMC) involved in the control of energy homeostasis. Furthermore, the daily oral treatment with biguanide anti diabetic drug metformin also induced AMPK phosphorylation in the central nervous system and increased food intake and life span in anorexic TB rats. Collectively, the findings of this study suggest that hypothalamic AMPK activation reverses cancer anorexia by inhibiting the production of proinflammatory molecules and controlling the neuropeptide expression in the hypothalamus, reflecting in a prolonged life span in TB rats. Thus, our data indicate that hypothalamic AMPK activation presents an attractive opportunity for the treatment of cancer-induced anorexia / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica