Considerando as várias propriedades fisiológicas e patológicas já descritas para os nucleotídeos da adenina, muitos estudos têm sugerido um importante papel destas moléculas no desenvolvimento de tumores. Enquanto o ATP parece ser citotóxico às células tumorais, a adenosina possui uma atividade tumorogênica. Além disso, muitos estudos demonstram o envolvimento dos nucleotídeos na modulação da resposta imune. As ações induzidas pela sinalização purinérgica são reguladas pelas nucleotidases, que podem estar localizadas nas membranas celulares ou podem apresentar-se de forma solúvel no meio intracelular e/ou extracelular. Pertencem a este grupo de enzimas a família das nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase (NTPDases), a família das nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterase (NPPs) e a 5’-nucleotidase. Muitos estudos sugerem que o uso de antiinflamatórios não-esteroidais está associado com a proteção contra o desenvolvimento de muitos tipos de câncer. Neste estudo, nós avaliamos a hidrólise extracelular dos nucleotídeos da adenina em linfócitos de ratos adultos submetidos ao modelo tumoral de Walker 256, bem como uma possível modulação do ácido acetilsalicílico (AAS) nas atividades nucleotidásicas em linfócitos e soro de ratos submetidos ao mesmo modelo. Nossos resultados demonstraram um aumento significativo nas hidrólises de ATP e ADP em linfócitos no décimo dia após a indução tumoral e/ou o tratamento com AAS. Nenhuma alteração na hidrólise do AMP foi observada. A administração de AAS aumentou a hidrólise de ATP e ADP em linfócitos de ratos inoculados com o tumor. Os níveis transcricionais das NTPDases1-3 foram significativamente aumentados na presença do tumor e diferentemente afetados pela administração do AAS. No soro, a hidrólise do ATP foi alterada pelo AAS apenas no décimo dia de tratamento, enquanto as hidrólises de ADP e AMP foram alteradas no sexto e no décimo dias. A administração de AAS aos animais inoculados com o tumor promoveu uma redução significativa nas hidrólises de ATP e AMP no sexto dia. A partir desses resultados, podemos concluir que a modulação dos níveis dos nucleotídeos em linfócitos pareceu não contribuir para os efeitos benéficos do AAS no câncer. Por outro lado, na circulação, um efeito potencialmente benéfico do AAS sobre o tumor foi observado no período inicial de tratamento. Assim, é possível sugerir, que o AAS possa desempenhar um importante papel na prevenção da invasão do tumor, parecendo não ser mais efetivo após sua instalação e desenvolvimento no hospedeiro. / In addition to the various physiological and pathological properties already known for adenine nucleotides, an important role of these molecules in tumor development has been proposed. Whereas ATP has been shown to be cytotoxic for tumoral cells, adenosine has been shown to posses a tumor-promoting action. Moreover, many studies have also demonstrated the nucleotide involvement in immune response modulation. The actions induced by purinergic signaling are regulated by nucleotidases, that are located on cell membrane or they are present in soluble forms on the intracellular and/or extracellular milieu. These enzymes comprise the nucleoside triphosphate diphosphohydrolase family (NTPDases), the nucleotide pyrophosphatase/ phosphodiesterase family (NPPs) and the 5’- nucleotidase. Numerous studies have suggested that the use of non-steroidal antiinflammatory drugs can protect against the development of cancer. In the present study, we evaluated the extracellular adenine nucleotide hydrolysis from rat lymphocytes submitted to the Walker 256 tumor model and a possible modulation of acetylsalicylic acid on nucleotidase activities from rat lymphocytes and rat blood serum submitted to the same model. Our results demonstrated a significant increase on ATP and ADP hydrolysis from rat lymphocyte ten days after the tumor induction and/or the ASA treatment. No alterations were observed to AMP hydrolysis. The ASA administration increased ATP and ADP hydrolysis from tumor-bearing rat lymphocytes. The transcriptional levels of NTPDases1-3 were significantly increased in the tumor presence and differently affected by ASA administration. In the blood serum, the ATP hydrolysis was altered by ASA only at 10 days of treatment whereas the ADP and AMP hydrolysis were altered at 6 and 10 days. The ASA administration in tumor-bearing rats promoted a significant reduction on ATP and AMP hydrolysis at 6 days of treatment. Considering our results, it is possible to conclude that modulation on nucleotide levels in lymphocytes seems not contribute to beneficial effects of ASA in cancer. By other hand, in the circulation, a potential beneficial effect of ASA on tumor was observed in the initial period of treatment. Thus, it is possible to suggest that ASA could have an important role in the tumor invasion, but does not seem to be effective after its installation and development in the host.

Considerando as várias propriedades fisiológicas e patológicas já descritas para os nucleotídeos da adenina, muitos estudos têm sugerido um importante papel destas moléculas no desenvolvimento de tumores. Enquanto o ATP parece ser citotóxico às células tumorais, a adenosina possui uma atividade tumorogênica. Além disso, muitos estudos demonstram o envolvimento dos nucleotídeos na modulação da resposta imune. As ações induzidas pela sinalização purinérgica são reguladas pelas nucleotidases, que podem estar localizadas nas membranas celulares ou podem apresentar-se de forma solúvel no meio intracelular e/ou extracelular. Pertencem a este grupo de enzimas a família das nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase (NTPDases), a família das nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterase (NPPs) e a 5’-nucleotidase. Muitos estudos sugerem que o uso de antiinflamatórios não-esteroidais está associado com a proteção contra o desenvolvimento de muitos tipos de câncer. Neste estudo, nós avaliamos a hidrólise extracelular dos nucleotídeos da adenina em linfócitos de ratos adultos submetidos ao modelo tumoral de Walker 256, bem como uma possível modulação do ácido acetilsalicílico (AAS) nas atividades nucleotidásicas em linfócitos e soro de ratos submetidos ao mesmo modelo. Nossos resultados demonstraram um aumento significativo nas hidrólises de ATP e ADP em linfócitos no décimo dia após a indução tumoral e/ou o tratamento com AAS. Nenhuma alteração na hidrólise do AMP foi observada. A administração de AAS aumentou a hidrólise de ATP e ADP em linfócitos de ratos inoculados com o tumor. Os níveis transcricionais das NTPDases1-3 foram significativamente aumentados na presença do tumor e diferentemente afetados pela administração do AAS. No soro, a hidrólise do ATP foi alterada pelo AAS apenas no décimo dia de tratamento, enquanto as hidrólises de ADP e AMP foram alteradas no sexto e no décimo dias. A administração de AAS aos animais inoculados com o tumor promoveu uma redução significativa nas hidrólises de ATP e AMP no sexto dia. A partir desses resultados, podemos concluir que a modulação dos níveis dos nucleotídeos em linfócitos pareceu não contribuir para os efeitos benéficos do AAS no câncer. Por outro lado, na circulação, um efeito potencialmente benéfico do AAS sobre o tumor foi observado no período inicial de tratamento. Assim, é possível sugerir, que o AAS possa desempenhar um importante papel na prevenção da invasão do tumor, parecendo não ser mais efetivo após sua instalação e desenvolvimento no hospedeiro. / In addition to the various physiological and pathological properties already known for adenine nucleotides, an important role of these molecules in tumor development has been proposed. Whereas ATP has been shown to be cytotoxic for tumoral cells, adenosine has been shown to posses a tumor-promoting action. Moreover, many studies have also demonstrated the nucleotide involvement in immune response modulation. The actions induced by purinergic signaling are regulated by nucleotidases, that are located on cell membrane or they are present in soluble forms on the intracellular and/or extracellular milieu. These enzymes comprise the nucleoside triphosphate diphosphohydrolase family (NTPDases), the nucleotide pyrophosphatase/ phosphodiesterase family (NPPs) and the 5’- nucleotidase. Numerous studies have suggested that the use of non-steroidal antiinflammatory drugs can protect against the development of cancer. In the present study, we evaluated the extracellular adenine nucleotide hydrolysis from rat lymphocytes submitted to the Walker 256 tumor model and a possible modulation of acetylsalicylic acid on nucleotidase activities from rat lymphocytes and rat blood serum submitted to the same model. Our results demonstrated a significant increase on ATP and ADP hydrolysis from rat lymphocyte ten days after the tumor induction and/or the ASA treatment. No alterations were observed to AMP hydrolysis. The ASA administration increased ATP and ADP hydrolysis from tumor-bearing rat lymphocytes. The transcriptional levels of NTPDases1-3 were significantly increased in the tumor presence and differently affected by ASA administration. In the blood serum, the ATP hydrolysis was altered by ASA only at 10 days of treatment whereas the ADP and AMP hydrolysis were altered at 6 and 10 days. The ASA administration in tumor-bearing rats promoted a significant reduction on ATP and AMP hydrolysis at 6 days of treatment. Considering our results, it is possible to conclude that modulation on nucleotide levels in lymphocytes seems not contribute to beneficial effects of ASA in cancer. By other hand, in the circulation, a potential beneficial effect of ASA on tumor was observed in the initial period of treatment. Thus, it is possible to suggest that ASA could have an important role in the tumor invasion, but does not seem to be effective after its installation and development in the host.

Considerando as várias propriedades fisiológicas e patológicas já descritas para os nucleotídeos da adenina, muitos estudos têm sugerido um importante papel destas moléculas no desenvolvimento de tumores. Enquanto o ATP parece ser citotóxico às células tumorais, a adenosina possui uma atividade tumorogênica. Além disso, muitos estudos demonstram o envolvimento dos nucleotídeos na modulação da resposta imune. As ações induzidas pela sinalização purinérgica são reguladas pelas nucleotidases, que podem estar localizadas nas membranas celulares ou podem apresentar-se de forma solúvel no meio intracelular e/ou extracelular. Pertencem a este grupo de enzimas a família das nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase (NTPDases), a família das nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterase (NPPs) e a 5’-nucleotidase. Muitos estudos sugerem que o uso de antiinflamatórios não-esteroidais está associado com a proteção contra o desenvolvimento de muitos tipos de câncer. Neste estudo, nós avaliamos a hidrólise extracelular dos nucleotídeos da adenina em linfócitos de ratos adultos submetidos ao modelo tumoral de Walker 256, bem como uma possível modulação do ácido acetilsalicílico (AAS) nas atividades nucleotidásicas em linfócitos e soro de ratos submetidos ao mesmo modelo. Nossos resultados demonstraram um aumento significativo nas hidrólises de ATP e ADP em linfócitos no décimo dia após a indução tumoral e/ou o tratamento com AAS. Nenhuma alteração na hidrólise do AMP foi observada. A administração de AAS aumentou a hidrólise de ATP e ADP em linfócitos de ratos inoculados com o tumor. Os níveis transcricionais das NTPDases1-3 foram significativamente aumentados na presença do tumor e diferentemente afetados pela administração do AAS. No soro, a hidrólise do ATP foi alterada pelo AAS apenas no décimo dia de tratamento, enquanto as hidrólises de ADP e AMP foram alteradas no sexto e no décimo dias. A administração de AAS aos animais inoculados com o tumor promoveu uma redução significativa nas hidrólises de ATP e AMP no sexto dia. A partir desses resultados, podemos concluir que a modulação dos níveis dos nucleotídeos em linfócitos pareceu não contribuir para os efeitos benéficos do AAS no câncer. Por outro lado, na circulação, um efeito potencialmente benéfico do AAS sobre o tumor foi observado no período inicial de tratamento. Assim, é possível sugerir, que o AAS possa desempenhar um importante papel na prevenção da invasão do tumor, parecendo não ser mais efetivo após sua instalação e desenvolvimento no hospedeiro. / In addition to the various physiological and pathological properties already known for adenine nucleotides, an important role of these molecules in tumor development has been proposed. Whereas ATP has been shown to be cytotoxic for tumoral cells, adenosine has been shown to posses a tumor-promoting action. Moreover, many studies have also demonstrated the nucleotide involvement in immune response modulation. The actions induced by purinergic signaling are regulated by nucleotidases, that are located on cell membrane or they are present in soluble forms on the intracellular and/or extracellular milieu. These enzymes comprise the nucleoside triphosphate diphosphohydrolase family (NTPDases), the nucleotide pyrophosphatase/ phosphodiesterase family (NPPs) and the 5’- nucleotidase. Numerous studies have suggested that the use of non-steroidal antiinflammatory drugs can protect against the development of cancer. In the present study, we evaluated the extracellular adenine nucleotide hydrolysis from rat lymphocytes submitted to the Walker 256 tumor model and a possible modulation of acetylsalicylic acid on nucleotidase activities from rat lymphocytes and rat blood serum submitted to the same model. Our results demonstrated a significant increase on ATP and ADP hydrolysis from rat lymphocyte ten days after the tumor induction and/or the ASA treatment. No alterations were observed to AMP hydrolysis. The ASA administration increased ATP and ADP hydrolysis from tumor-bearing rat lymphocytes. The transcriptional levels of NTPDases1-3 were significantly increased in the tumor presence and differently affected by ASA administration. In the blood serum, the ATP hydrolysis was altered by ASA only at 10 days of treatment whereas the ADP and AMP hydrolysis were altered at 6 and 10 days. The ASA administration in tumor-bearing rats promoted a significant reduction on ATP and AMP hydrolysis at 6 days of treatment. Considering our results, it is possible to conclude that modulation on nucleotide levels in lymphocytes seems not contribute to beneficial effects of ASA in cancer. By other hand, in the circulation, a potential beneficial effect of ASA on tumor was observed in the initial period of treatment. Thus, it is possible to suggest that ASA could have an important role in the tumor invasion, but does not seem to be effective after its installation and development in the host.

Orientador: Lauro Tatsuo Kubota / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-04T14:04:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moreira_AltairBenedito_D.pdf: 839003 bytes, checksum: df3c721cb44a6846a7d2abd555ad8847 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Neste trabalho são descritos o desenvolvimento dos métodos analíticos para a determinação de ácido acetilsalicílico (AAS), paracetamol (PA) e cafeína (CF) em fase sólida por espectroscopia de fluorescência. A fluorescência nativa do PA no estado sólido foi demonstrada pela primeira vez. Todos os estudos realizados neste trabalho foram desenvolvidos visando principalmente a aplicação no controle de qualidade em indústrias químicas e farmacêuticas. Os estudos foram direcionados ao desenvolvimento de métodos analíticos para a determinação de AAS e PA, individualmente. Também foram desenvolvidos métodos para a determinação simultânea das misturas (CF e AAS) e (CF e PA) usando como ferramenta estatística a calibração multivariada para a construção dos modelos, empregando o algoritmo de regressão por mínimos quadrados parciais (PLSR-1). Foram otimizadas a quantidade de amostra colocada no porta amostra e a distância desta da fibra óptica para todos os métodos analíticos desenvolvidos neste trabalho, e as melhores condições foram de 25 mg e 0,9 cm, respectivamente. Os métodos desenvolvidos para a determinação individual de AAS e PA em amostras sólidas apresentaram boa precisão, exatidão e alta freqüência analítica, podendo chegar a 300 determinações por hora. A exatidão foi checada comparando os valores obtidos pelo método desenvolvido com os procedimentos adotados pela farmacopéia britânica e os resultados foram estatisticamente o mesmo a nível de 95% de confiança. Para a determinação simultânea das misturas, os modelos construídos apresentaram excelente desempenho de previsão. Os resíduos foram inferiores a 10% para a maior parte das amostras usadas nos conjuntos de validação externa. A qualidade dos modelos foi avaliada através do coeficiente de variabilidade (CV), o qual variou entre 4 e 7% para todos os modelos. Desta maneira, os métodos desenvolvidos neste trabalho são uma boa alternativa aos métodos tradicionais descritos na literatura, devido suas características favoráveis como elevada freqüência analítica, possibilidade de monitoramento on line em linha de produção e principalmente por serem não destrutivos, não gerarem resíduos e serem de baixo custo. / Abstract: In this work are described the development of analytical method for acetylsalicylic acid (AAS), paracetamol (PA) and caffeine (CF) determinations in solid phase by fluorescence spectroscopy. The native fluorescence of PA was demonstrated in the solid state for the first time. All studies performed here were developed seeking mainly the application in the quality control in chemical and pharmaceutical industries. The studies were addressed to the development of analytical methods for the AAS and PA determination, individually. Methods for the simultaneous determination (CF and AAS) and (CF and PA) using as statistical tool the multivariate calibration for the models construction, employing the partial least squares regression (PLSR-1) algorithm were also developed. The amount of sample placed in the sample compartment and the distance between the fiber optic and sample were optimized for all analytical methods developed in this work and the better conditions were 25 mg and 0.9 cm, respectively. The developed methods for single determination of AAS and PA in samples gave good performance. A high analytical frequency, being able to reach 300 determinations per hour. The accuracy checked comparing the obtained values by the developed methods with the procedures adopted by the British Pharmacopoeia and the results were statistically the same at 95% confidence level. For the simultaneous determination of the mixtures, the built models presented excellent performance of prediction. The residuals were lower than 10% for most used samples in the external validation set. The quality of the models was evaluated through the coefficient of variability (CV), which changed between 4 and 7% for the models. Looking for innovative methods that generate no residue, quick, non-destructive, on line monitoration in production line and low cost is a good option to the traditional methods. / Doutorado / Quimica Analitica / Doutor em Quimica

A homocisteína é um aminoácido sulfurado derivado do metabolismo da metionina. Quando os níveis plasmáticos de homocisteína ultrapassam 10-15 μM, tem-se uma condição conhecida como hiperhomocisteinemia, a qual pode ser classificada em leve (>10 μM), moderada (>30 μM) ou severa (>100 μM). A hiperhomocisteinemia leve não tem origem genética, sendo considerada um fator de risco para o desenvolvimento de doenças neurodegenerativas e vasculares, incluindo isquemia cerebral e cardíaca. Nosso grupo de pesquisa desenvolveu um modelo químico induzido de hiperhomocisteinemia leve crônica em ratos adultos jovens e, usando esse modelo foi mostrado que existe associação entre essa condição e alterações em parâmetros de inflamação e estresse oxidativo/nitrativo em tecido cerebral. O objetivo do presente estudo foi avaliar se o ácido acetilsalicílico tem papel neuroprotetor no efeito da homocisteína sobre os níveis de interleucinas IL-1β e IL-6, atividade e imunoconteúdo da acetilcolinesterase, biodisponibilidade de óxido nítrico, atividade e imunoconteúdo das enzimas antioxidantes superóxido dismutase e catalase, conteúdo de sulfidrilas e índice de dano ao DNA. Também realizamos análise morfológica por microscopia eletrônica de transmissão em córtex cerebral de ratos submetidos ao modelo. Ratos Wistar receberam homocisteína (0,03 μmol/g de peso corporal) por injeções subcutâneas duas vezes ao dia e ácido acetilsalicílico (25 mg/Kg de peso corporal) por injeções intraperitoneais uma vez ao dia, do dia 30 ao 60º dia pós-parto Ratos controles receberam o mesmo volume da solução veículo. Doze horas após a última injeção, alguns animais foram decapitados para posteriores análises bioquímicas, e outros animais foram perfundidos para posterior análise morfológica. Os resultados mostraram que os ratos submetidos à hiperhomocisteinemia leve apresentaram aumento significativo dos níveis de IL-1β, IL-6 e da atividade da acetilcolinesterase, bem como níveis reduzidos de nitritos. A homocisteína também diminuiu as atividades da superóxido dismutase e catalase, bem como o imunoconteúdo da catalase. Danos às proteínas e DNA, assim como alterações ultraestruturais também foram observadas no córtex cerebral dos animais hiperhomocisteinêmicos. O ácido acetilsalicílico preveniu totalmente o efeito da homocisteína sobre a atividade da acetilcolinesterase, atividade e imunoconteúdo da catalase, e alterações ultraestruturais. As alterações nos níveis de IL-1β, atividade de superóxido dismutase, conteúdo de sulfidrilas e dano ao DNA foram parcialmente prevenidas pelo ácido acetilsalicílico. Nossos achados mostraram que o modelo induzido quimicamente de hiperhomocisteinemia leve alterou alguns parâmetros inflamatórios, oxidativos/nitrativos e morfológicos. Nossos resultados também sugerem que o ácido acetilsalicílico desempenha um papel neuroprotetor nas condições apresentadas, pois preveniu a maior parte dessas alterações. Porém, a administração crônica do ácido acetilsalícico também apresentou efeito per se significativo de dano ao DNA, o qual deve ser melhor elucidado em estudos posteriores. / Homocysteine is a sulfur amino acid derived from methionine metabolism. When plasma homocysteine levels exceed 10-15 μM, there is a condition known as hyperhomocysteinemia, which can be classified as mild (>10 μM), moderate (>30 μM), or severe (>100 μM). Mild hyperhomocysteinemia does not have genetic origin and it is considered a risk factor for the development of neurodegenerative and vascular diseases, including cerebral and cardiac ischemia. Our research group has developed an induced chemical model of chronic mild hyperhomocysteinemia in young adult rats and using this model, it has been shown an association between this condition and changes in parameters of inflammation and oxidative/nitrative stress in brain tissue. The objective of the present study was to evaluate if acetylsalicylic acid has a neuroprotective role in the effect of homocysteine on IL-1β and IL-6 interleukin levels, acetylcholinesterase activity and immunocontent, nitric oxide bioavailability, activity and immunocontent of antioxidant enzymes superoxide dismutase and catalase, sulfhydryl content and DNA damage index. We also performed morphological analysis by transmission electron microscopy in the cerebral cortex of rats submitted to the model. Wistar male rats received homocysteine (0.03 μmol/g of body weight) by subcutaneous injections twice a day and acetylsalicylic acid (25 mg/Kg of body weight) by intraperitoneal injections once a day from the 30th to the 60th postpartum day Control rats received the same volume of vehicle solution. Twelve hours after the last injection, some animals were decapitated for subsequent biochemical analyzes, and other animals were perfused for subsequent morphological analysis. The results showed that rats submitted to mild hyperhomocysteinemia significantly increased levels of IL-1β, IL-6, acetylcholinesterase activity and reduced nitrite levels. Homocysteine also decreased the activities of superoxide dismutase and catalase, as well as catalase's immunocontent. Damage to proteins and DNA as well as ultrastructural changes were also observed in the cerebral cortex of hyperhomocysteinemic animals. Acetylsalicylic acid totally prevented the effect of homocysteine on acetylcholinesterase activity, catalase activity and immunocontent, and ultrastructural changes. Alterations in IL-1β levels, superoxide dismutase activity, sulfhydryl content and DNA damage were partially prevented by acetylsalicylic acid. Our findings showed that the chemically induced model of mild hyperhomocysteinemia altered some inflammatory, oxidative/nitrative and morphological parameters. Our results also suggest that acetylsalicylic acid plays a neuroprotective role in the conditions presented, as it prevented most of these changes. However, chronic administration of acetylsalicylic acid also had a significant effect of DNA damage, which should be better elucidated in later studies.

A homocisteína é um aminoácido sulfurado derivado do metabolismo da metionina. Quando os níveis plasmáticos de homocisteína ultrapassam 10-15 μM, tem-se uma condição conhecida como hiperhomocisteinemia, a qual pode ser classificada em leve (>10 μM), moderada (>30 μM) ou severa (>100 μM). A hiperhomocisteinemia leve não tem origem genética, sendo considerada um fator de risco para o desenvolvimento de doenças neurodegenerativas e vasculares, incluindo isquemia cerebral e cardíaca. Nosso grupo de pesquisa desenvolveu um modelo químico induzido de hiperhomocisteinemia leve crônica em ratos adultos jovens e, usando esse modelo foi mostrado que existe associação entre essa condição e alterações em parâmetros de inflamação e estresse oxidativo/nitrativo em tecido cerebral. O objetivo do presente estudo foi avaliar se o ácido acetilsalicílico tem papel neuroprotetor no efeito da homocisteína sobre os níveis de interleucinas IL-1β e IL-6, atividade e imunoconteúdo da acetilcolinesterase, biodisponibilidade de óxido nítrico, atividade e imunoconteúdo das enzimas antioxidantes superóxido dismutase e catalase, conteúdo de sulfidrilas e índice de dano ao DNA. Também realizamos análise morfológica por microscopia eletrônica de transmissão em córtex cerebral de ratos submetidos ao modelo. Ratos Wistar receberam homocisteína (0,03 μmol/g de peso corporal) por injeções subcutâneas duas vezes ao dia e ácido acetilsalicílico (25 mg/Kg de peso corporal) por injeções intraperitoneais uma vez ao dia, do dia 30 ao 60º dia pós-parto Ratos controles receberam o mesmo volume da solução veículo. Doze horas após a última injeção, alguns animais foram decapitados para posteriores análises bioquímicas, e outros animais foram perfundidos para posterior análise morfológica. Os resultados mostraram que os ratos submetidos à hiperhomocisteinemia leve apresentaram aumento significativo dos níveis de IL-1β, IL-6 e da atividade da acetilcolinesterase, bem como níveis reduzidos de nitritos. A homocisteína também diminuiu as atividades da superóxido dismutase e catalase, bem como o imunoconteúdo da catalase. Danos às proteínas e DNA, assim como alterações ultraestruturais também foram observadas no córtex cerebral dos animais hiperhomocisteinêmicos. O ácido acetilsalicílico preveniu totalmente o efeito da homocisteína sobre a atividade da acetilcolinesterase, atividade e imunoconteúdo da catalase, e alterações ultraestruturais. As alterações nos níveis de IL-1β, atividade de superóxido dismutase, conteúdo de sulfidrilas e dano ao DNA foram parcialmente prevenidas pelo ácido acetilsalicílico. Nossos achados mostraram que o modelo induzido quimicamente de hiperhomocisteinemia leve alterou alguns parâmetros inflamatórios, oxidativos/nitrativos e morfológicos. Nossos resultados também sugerem que o ácido acetilsalicílico desempenha um papel neuroprotetor nas condições apresentadas, pois preveniu a maior parte dessas alterações. Porém, a administração crônica do ácido acetilsalícico também apresentou efeito per se significativo de dano ao DNA, o qual deve ser melhor elucidado em estudos posteriores. / Homocysteine is a sulfur amino acid derived from methionine metabolism. When plasma homocysteine levels exceed 10-15 μM, there is a condition known as hyperhomocysteinemia, which can be classified as mild (>10 μM), moderate (>30 μM), or severe (>100 μM). Mild hyperhomocysteinemia does not have genetic origin and it is considered a risk factor for the development of neurodegenerative and vascular diseases, including cerebral and cardiac ischemia. Our research group has developed an induced chemical model of chronic mild hyperhomocysteinemia in young adult rats and using this model, it has been shown an association between this condition and changes in parameters of inflammation and oxidative/nitrative stress in brain tissue. The objective of the present study was to evaluate if acetylsalicylic acid has a neuroprotective role in the effect of homocysteine on IL-1β and IL-6 interleukin levels, acetylcholinesterase activity and immunocontent, nitric oxide bioavailability, activity and immunocontent of antioxidant enzymes superoxide dismutase and catalase, sulfhydryl content and DNA damage index. We also performed morphological analysis by transmission electron microscopy in the cerebral cortex of rats submitted to the model. Wistar male rats received homocysteine (0.03 μmol/g of body weight) by subcutaneous injections twice a day and acetylsalicylic acid (25 mg/Kg of body weight) by intraperitoneal injections once a day from the 30th to the 60th postpartum day Control rats received the same volume of vehicle solution. Twelve hours after the last injection, some animals were decapitated for subsequent biochemical analyzes, and other animals were perfused for subsequent morphological analysis. The results showed that rats submitted to mild hyperhomocysteinemia significantly increased levels of IL-1β, IL-6, acetylcholinesterase activity and reduced nitrite levels. Homocysteine also decreased the activities of superoxide dismutase and catalase, as well as catalase's immunocontent. Damage to proteins and DNA as well as ultrastructural changes were also observed in the cerebral cortex of hyperhomocysteinemic animals. Acetylsalicylic acid totally prevented the effect of homocysteine on acetylcholinesterase activity, catalase activity and immunocontent, and ultrastructural changes. Alterations in IL-1β levels, superoxide dismutase activity, sulfhydryl content and DNA damage were partially prevented by acetylsalicylic acid. Our findings showed that the chemically induced model of mild hyperhomocysteinemia altered some inflammatory, oxidative/nitrative and morphological parameters. Our results also suggest that acetylsalicylic acid plays a neuroprotective role in the conditions presented, as it prevented most of these changes. However, chronic administration of acetylsalicylic acid also had a significant effect of DNA damage, which should be better elucidated in later studies.

A homocisteína é um aminoácido sulfurado derivado do metabolismo da metionina. Quando os níveis plasmáticos de homocisteína ultrapassam 10-15 μM, tem-se uma condição conhecida como hiperhomocisteinemia, a qual pode ser classificada em leve (>10 μM), moderada (>30 μM) ou severa (>100 μM). A hiperhomocisteinemia leve não tem origem genética, sendo considerada um fator de risco para o desenvolvimento de doenças neurodegenerativas e vasculares, incluindo isquemia cerebral e cardíaca. Nosso grupo de pesquisa desenvolveu um modelo químico induzido de hiperhomocisteinemia leve crônica em ratos adultos jovens e, usando esse modelo foi mostrado que existe associação entre essa condição e alterações em parâmetros de inflamação e estresse oxidativo/nitrativo em tecido cerebral. O objetivo do presente estudo foi avaliar se o ácido acetilsalicílico tem papel neuroprotetor no efeito da homocisteína sobre os níveis de interleucinas IL-1β e IL-6, atividade e imunoconteúdo da acetilcolinesterase, biodisponibilidade de óxido nítrico, atividade e imunoconteúdo das enzimas antioxidantes superóxido dismutase e catalase, conteúdo de sulfidrilas e índice de dano ao DNA. Também realizamos análise morfológica por microscopia eletrônica de transmissão em córtex cerebral de ratos submetidos ao modelo. Ratos Wistar receberam homocisteína (0,03 μmol/g de peso corporal) por injeções subcutâneas duas vezes ao dia e ácido acetilsalicílico (25 mg/Kg de peso corporal) por injeções intraperitoneais uma vez ao dia, do dia 30 ao 60º dia pós-parto Ratos controles receberam o mesmo volume da solução veículo. Doze horas após a última injeção, alguns animais foram decapitados para posteriores análises bioquímicas, e outros animais foram perfundidos para posterior análise morfológica. Os resultados mostraram que os ratos submetidos à hiperhomocisteinemia leve apresentaram aumento significativo dos níveis de IL-1β, IL-6 e da atividade da acetilcolinesterase, bem como níveis reduzidos de nitritos. A homocisteína também diminuiu as atividades da superóxido dismutase e catalase, bem como o imunoconteúdo da catalase. Danos às proteínas e DNA, assim como alterações ultraestruturais também foram observadas no córtex cerebral dos animais hiperhomocisteinêmicos. O ácido acetilsalicílico preveniu totalmente o efeito da homocisteína sobre a atividade da acetilcolinesterase, atividade e imunoconteúdo da catalase, e alterações ultraestruturais. As alterações nos níveis de IL-1β, atividade de superóxido dismutase, conteúdo de sulfidrilas e dano ao DNA foram parcialmente prevenidas pelo ácido acetilsalicílico. Nossos achados mostraram que o modelo induzido quimicamente de hiperhomocisteinemia leve alterou alguns parâmetros inflamatórios, oxidativos/nitrativos e morfológicos. Nossos resultados também sugerem que o ácido acetilsalicílico desempenha um papel neuroprotetor nas condições apresentadas, pois preveniu a maior parte dessas alterações. Porém, a administração crônica do ácido acetilsalícico também apresentou efeito per se significativo de dano ao DNA, o qual deve ser melhor elucidado em estudos posteriores. / Homocysteine is a sulfur amino acid derived from methionine metabolism. When plasma homocysteine levels exceed 10-15 μM, there is a condition known as hyperhomocysteinemia, which can be classified as mild (>10 μM), moderate (>30 μM), or severe (>100 μM). Mild hyperhomocysteinemia does not have genetic origin and it is considered a risk factor for the development of neurodegenerative and vascular diseases, including cerebral and cardiac ischemia. Our research group has developed an induced chemical model of chronic mild hyperhomocysteinemia in young adult rats and using this model, it has been shown an association between this condition and changes in parameters of inflammation and oxidative/nitrative stress in brain tissue. The objective of the present study was to evaluate if acetylsalicylic acid has a neuroprotective role in the effect of homocysteine on IL-1β and IL-6 interleukin levels, acetylcholinesterase activity and immunocontent, nitric oxide bioavailability, activity and immunocontent of antioxidant enzymes superoxide dismutase and catalase, sulfhydryl content and DNA damage index. We also performed morphological analysis by transmission electron microscopy in the cerebral cortex of rats submitted to the model. Wistar male rats received homocysteine (0.03 μmol/g of body weight) by subcutaneous injections twice a day and acetylsalicylic acid (25 mg/Kg of body weight) by intraperitoneal injections once a day from the 30th to the 60th postpartum day Control rats received the same volume of vehicle solution. Twelve hours after the last injection, some animals were decapitated for subsequent biochemical analyzes, and other animals were perfused for subsequent morphological analysis. The results showed that rats submitted to mild hyperhomocysteinemia significantly increased levels of IL-1β, IL-6, acetylcholinesterase activity and reduced nitrite levels. Homocysteine also decreased the activities of superoxide dismutase and catalase, as well as catalase's immunocontent. Damage to proteins and DNA as well as ultrastructural changes were also observed in the cerebral cortex of hyperhomocysteinemic animals. Acetylsalicylic acid totally prevented the effect of homocysteine on acetylcholinesterase activity, catalase activity and immunocontent, and ultrastructural changes. Alterations in IL-1β levels, superoxide dismutase activity, sulfhydryl content and DNA damage were partially prevented by acetylsalicylic acid. Our findings showed that the chemically induced model of mild hyperhomocysteinemia altered some inflammatory, oxidative/nitrative and morphological parameters. Our results also suggest that acetylsalicylic acid plays a neuroprotective role in the conditions presented, as it prevented most of these changes. However, chronic administration of acetylsalicylic acid also had a significant effect of DNA damage, which should be better elucidated in later studies.

Il periparto della bovina da latte è caratterizzato da processi infiammatori, che aumentano la vulnerabilità delle vacche alle malattie tipiche peripartali, spesso dovute a patogeni occasionali. In tale periodo, si hanno notevoli variazioni metabolico-fisiologiche, che si evidenziano con la tipica risposta “di fase acuta”, caratterizzata dall’aumento delle proteine positive di fase acuta (es. aptoglobina) e di alcuni specifici metaboliti (es. metaboliti reattivi all’ossigeno) ma anche dalla diminuzione delle proteine negative di fase acuta (es. albumina, colesterolo, PON). In queste prove si è cercato di attenuare e/o modulare tali fatti infiammatori mediante trattamenti specifici caratterizzati dalla somministrazione di: una citochina antinfiammatoria (interferon-alfa) due settimane dal parto per via orale con 1000 UI/Kg (1° prova), 0,5 UI/Kg (2° prova), un antibiotico (tilosina) a circa 10 giorni prima del parto per via intramuscolare, in tre giorni consecutivi ed un farmaco antinfiammatorio (acido acetilsalicilico) nel pre e post parto per via orale con un dosaggio di 30g/d a giorni alterni. L’interferone-alfa ha mostrato un effetto pro-infiammatorio, verosimilmente dovuto alla persistenza della citochina nel rumine (confermata dalla prova in vitro); di qui il ritorno in bocca con il bolo ed una reiterazione dell’effetto, quale fosse un alto dosaggio. La tilosina non ha modificato i processi infiammatori, probabilmente per l’effetto limitato nel tempo degli antibiotici. L’unico trattamento che ha modulato i fatti infiammatori e migliorato talune performance delle bovine trattate è stato quello con l’acido acetilsalicilico. / The transition period in dairy cows is characterized by inflammatory processes, which can contribute to the of their increased susceptibility to periparturient diseases, health disorders and lowered performance. During that phase, dairy cows show metabolic and physiological changes characterized by the rise of positive acute phase proteins (i.e. haptoglobin) and some specific metabolite (i.e. ROS), besides a reduction of negative acute phase proteins (i.e albumin, lipoproteins, PON, etc.). The aim in this study was the attempt to reduce and/or to prevent inflammations, with specific treatment: an antinflammatory cytokine (interferon-alfa) before calving about 1000 UI/Kg/day (1st trial), 0.5 UI/Kg (2st trial) per os, an antibiotic parenterally (tylosin) 10 days before calving and a conventional antinflammatory drug (acetylsalicylic acid), about 30 g/day orally before and after calving. Interferon- increased inflammatory response maybe due to a high-dose, because the cytokine (whom activity site is oral cavity) showed to be persistent in the rumen and renewed the cytokine effect with rumination. The use of an antibiotic (tylosin) did not change the inflammatory status of the dairy cows. The oral administration of Acetylsalicylic acid has otherwise reduced the inflammatory effect and improved the performance of treated dairy cows.

Il periparto è la parte più critica della vita della bovina da latte. I cambiamenti importanti ed improvvisi nel metabolismo e nelle condizioni di vita possono favorire l’insorgenza di problemi di salute e di uno stato infiammatorio. Una risposta eccessiva dell’organismo all’infiammazione può sottrarre risorse fondamentali, causando un peggioramento delle condizioni di salute e un calo della produzione di latte. Nella prima parte della tesi si propone un nuovo indice basato su alcuni parametri plasmatici utile a descrivere meglio la risposta all’infiammazione nel post-parto. Una identificazione rapida degli animali caratterizzati da una risposta eccessiva all’infiammazione, specialmente quelli senza sintomi esterni, permette un intervento efficace per evitare ulteriori conseguenze negative. La seconda e terza parte della tesi descrivono due prove sperimentali finalizzate a ridurre la risposta all’infiammazione impiegando acidi grassi ω-3 e/o acido acetilsalicilico. La somministrazione di acidi grassi ω-3 a cavallo del parto ha ridotto la risposta all’infiammazione e migliorato il bilancio energetico, mentre la loro somministrazione esclusivamente prima del parto ha evidenziato alcuni leggeri miglioramenti nella risposta all’infiammazione e nel bilancio energetico. La somministrazione prima del parto di acido acetilsalicilico ha causato l’insorgenza di alcuni problemi e pertanto dovrebbe essere somministrata solo dopo il parto. / The peripartum period is the most critical stage of the dairy cows. The sudden and major changes in metabolism and life conditions may favor the onset of health problems together with an inflammatory status. An excessive response by the organism to inflammation may subtract primary resources, resulting in a worsening of health status and in a lower milk yield. In the first part of the thesis a new index based on some plasma parameters is proposed to better describe the response to inflammation in the post-calving of dairy cows. An early identification of the animals characterized by a severe response to inflammation, especially without any external symptom, allows an effective intervention in order to avoid further negative consequences. The second and the third part of the thesis describe two experiments aiming to reduce the response to inflammation using ω-3 fatty acids and/or acetylsalicylic acid. The administration of ω-3 fatty acids around calving reduced the inflammatory response and improved the energy balance, while their pre-calving only administration highlighted some slight improvements in inflammatory response and energy balance. The pre-calving administration of acetylsalicylic acid caused the onset of some problems and should be used only after calving.