Tesis para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica, área de especialización Bioquímica de Proteínas y Biotecnología, y Memoria para optar al título de Bioquímico / La respuesta inmune de invertebrados se basa en un conjunto de elementos del sistema inmune innato, donde los péptidos antimicrobianos (AMPs) juegan un importante rol. Los AMPs son moléculas anfifílicas que se almacenan en el interior de los hemocitos o circulan libremente en la hemolinfa. Su efectividad en la defensa innata se basa en su baja especificidad, actuando contra un amplio rango de microorganismos; su pequeño tamaño y baja toxicidad abren potenciales aplicaciones como nuevos antibióticos, con la ventaja de que no hay evidencia de bacterias resistentes a ellos. Considerando la diversidad de moluscos marinos en nuestras costas, la hipótesis de este trabajo ha sido que existen AMPs en la hemolinfa o hemocitos de moluscos chilenos comestibles. Mediante ensayos en medio sólido, encontramos que extractos de hemocitos de Concholepas y especies de Lapas del género Fissurellidae, exhiben actividad AM contra V. parahaemolyticus y E. coli, ambas cepas Gram negativas. A través de análisis mediante microscopia electrónica, caracterizamos los hemocitos y encontramos al menos dos tipos celulares que presentan diferentes tipos de gránulos electrón-densos en su citoplasma, que de acuerdo a lo descrito en la literatura podrían almacenar AMPs. La caracterización y purificación de los extractos de hemocitos mediante métodos electroforéticos mostró un péptido principal de 3,7 kDa, y los estudios cromatográficos indican la presencia de AMPs de naturaleza hidrofóbica. La identificación de estos péptidos esta en progreso, y se espera a futuro iniciar su utilización en alguna aplicación biomédica o biotecnológica / The immune response of invertebrates relies on elements of the innate immune system, among them, antimicrobials peptides (AMPs) play a relevant role. They are amphiphilic molecules that are accumulated inside the hemocytes or are circulating freely in the hemolymph. Their effectiveness in the innate defence relay in their low specificity, thus acting on a wide range of microorganism; its small size and low toxicity open potential applications as new antibiotics, with the advantage that there are no evidence of building resistant bacteria. Considering the diversity of Chilean mollusc marine species, we hypothesized that there are AMPs in hemolymph or hemocytes of Chilean commercial molluscs. Using solid agar plate assays, we found that extracts of hemocytes from Concholepas and limpets of the Fissurellidae genus, exhibit antibacterial activity against Vibrio parahaemolyticus and Escherichia coli both Gram negative bacteria. Through electron microscopic analysis, we characterized the hemocytes and found at least two cellular types bearing different kind of electron-dense granules, according to literature, these granules may contain AMPs. The characterization and purification of hemocytes extracts through electrophoresis showed the presence of a principal peptide of 3,7 kDa, and chromatographic methods indicate the presence of AMPs with hydrophobic nature. The identification of these peptides is in progress to assess their utilization in some biomedical and biotechnological applications / Fundación COPEC-Pontificia Universidad Católica CQ057 Fondecyt

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctor en Bioquímica / La microcina E492 es un antibiótico peptídico de 7,9 kDa producido por Klebsiella pneumoniae RYC492 que mediante la formación de canales iónicos produce la despolarización de la membrana citoplasmática de bacterias gram negativo como E. coli, Salmonella, Citrobacter, Enterobacter y Klebsiella. Mediante estudios de clonamiento y expresión en E. coli se estableció que los determinantes genéticos implicados en la producción de microcina activa están contenidos en un segmento de 13 Kpb ubicado en el cromosoma de Klebsiella pneumoniae RYC492. La microcina E492 es exportada por un sistema de transporte de tipo I constituido por un transportador ABC (MceG), una proteína accesoria (MceH) y una proteína de membrana externa (TolC). El sistema de exportación de microcina E492 y el sistema de exportación de colicina V comparten alrededor de un 90% de similitud entre ellos. Estudios preliminares indicaron que el sistema de exportación de colicina V no reemplaza la función del sistema de exportación de microcina E492, y que la especificidad del transporte estaba relacionada con la presencia del gen mceF. El objetivo central de esta tesis consistió en estudiar los mecanismos de especificidad del sistema I de exportación para lo cual se usará como modelo los exportadores que permiten la secreción de colicina V y microcina E492. Mediante estudios de mutagénesis se determinó que MceF es prescindible en la exportación de microcina E492, y que más bien este producto génico participaría en la regulación de esta bacteriocina. Así, se determinó que MceF regula negativamente la expresión de la inmunidad de la microcina E492 y, posiblemente a través de este mecanismo, la expresión de la microcina E492. Para estudiar los determinantes de la especificidad de la exportación se clonaron los sistemas de exportación de microcina E492 (mceHG) y colicina V (cvaAB). Se determinó que el sistema de exportación de colicina no complementa la exportación de microcina E492. Mediante la construcción de sistemas de exportación híbridos entre las proteínas ABC y accesoria de los sistemas de microcina E492 y colicina V se estableció que el transportador de colicina V (CvaB) no permite la exportación de microcina E492. La construcción de transportadores quimeras entre los dominios del transportador de colicina V y microcina E492 permitió establecer que el dominio ABC del sistema de exportación de colicina V determina la exportación específica de su bacteriocina. Para entender los mecanismos moleculares de los determinantes de especificidad se generaron modelos 3D del transportador de microcina E492. Este modelo ayudó a predecir la importancia del residuo D121 en el procesamiento del péptido líder de la microcina E492, lo cual se comprobó experimentalmente. El modelo de MceG también permitió establecer que las diferencias entre los dominios ABC de los transportadores de microcina E492 y colicina V se localizan en una región específica. El modelo 3D también permitió entender la importancia de los cuatro últimos aminoácidos del transportador en el proceso de exportación, lo cual fue verificado experimentalmente. Esta región interactúa directamente con el nucleótido, elemento indispensable para energizar el sistema. Finalmente, se estudió mediante western blot de extractos celulares totales y extractos extracelulares de mutantes en los dominios peptidasa y ABC, el acoplamiento que existe entre el procesamiento de la bacteriocina y su exportación. Estos estudios indicaron que el procesamiento ocurre concomitante con la exportación y que el dominio ABC es necesario para activar a la peptidasa / Microcin E492 is peptide antibiotic of 7,9 kDa produced by Klebsiella pneumoniae RYC492 that through the formation of ion channels produces depolarization of cytoplasmatic membrane of gram-negative strains such as E. coli, Salmonella, Citrobacter, Enterobacter and Klebsiella. Through the cloning and expression in E. coli has been established that the genetic determinants involved in microcin E492 production are encoded in a 13 Kpb DNA segment from the chromosome of K. pneumoniae RYC492. Microcin E492 is secreted by a type I exporter system. This system is formed by an ABC transporter (MceG), an accessory protein (MceH), and the outer membrane protein TolC. The microcin E492 exporter system has more than 90% of similarity with the colicin V system. Preliminary studies showed that colicin V system is unable to replace the function of microcin E492 exporter, and this specificity was related to the mceF gene. The main goal of this thesis was to study the mechanisms of specificity in type I protein export system using as models colicin V and microcin E492 exporter systems. The use of mutants in MceF allowed to establish that MceF was not necessary to export microcin E492, and that this protein would participate in the regulation of microcin E492 expression. Thus, it was established that microcin E492 immunity is negatively regulated by MceF, and probably through this mechanism the expression of microcin E492 could be controlled. To study the elements that are involved in the specificity of export, the microcin E492 (mceHG) and colicin V (cvaAB) exporter systems were cloned. The colicin V exporter system was unable to complement the export of microcin E492. Through the construction of a hybrid between the accessory and exporter proteins of microcin E492 and colicin V exporter systems it was established that CvaB was unable to export microcin E492. The construction of chimeric proteins between the domains of microcin E492 and colicin V exporters showed that the ABC domain of colicin V exporter confers the specificity in the exportation of this bacteriocin. To understand the molecular mechanism of the specificity, 3D models of microcin E492 exporter were generated. These models helped to determine the importance of D121 residue in the processing of microcin E492 leader peptide. The 3D model of MceG allowed locate the region where the differences between the ABC domain of colicin V and microcin E492 exporters reside. The 3D model also permitted to assess the importance of MceG Cterminal region in the processing and export of microcin E492. This region also interacts directly with the nucleotide, a key step to energize the system. Finally, the coupling between microcin E492 processing and export was analyzed through western blot using intracellular and extracellular extracts of mutants in the ABC or peptidase domains. These studies showed that ABC domain is necessary to activate the peptidase

Durante el proceso de curado del jamón tienen lugar una serie de reacciones bioquímicas entre las que destaca la intensa proteolisis de las proteínas musculares. El resultado de esta proteolisis es una acumulación de oligopéptidos y aminoácidos que contribuyen tanto directa como indirectamente al aroma, sabor y calidad final del jamón. A pesar de tener evidencia de la presencia de oligopéptidos al final del proceso de curado del jamón, se sabe muy poco sobre sus secuencias en aminoácidos y del efecto que pueden tener sobre la salud humana. En este sentido, se tiene conocimiento de que los péptidos pueden regular diferentes procesos en el organismo ejerciendo un impacto positivo en algunas funciones del cuerpo que pueden tener una importante influencia en la salud. En la última década, péptidos biológicamente activos han sido aislados de alimentos de distinta naturaleza. A estos péptidos se les ha atribuido propiedades bioactivas tales como antihipertensiva, antioxidante o antimicrobiana, entre otras. Ante la evidencia de la presencia de péptidos en el jamón curado, en esta Tesis Doctoral se investigó la presencia de actividad inhibidora de la enzima convertidora de angiotensina I (ECA) y actividad antioxidante en fracciones peptídicas obtenidas de dicho producto. Además, se verificó in vivo el efecto que producían en la presión sanguínea sistólica de ratas espontáneamente hipertensas la administración de las fracciones peptídicas que poseían actividad inhibidora de la ECA. Los péptidos responsables de las actividades antihipertensiva y antioxidante, fueron aislados y secuenciados mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas. Así, se pudieron identificar varios péptidos con actividades in vitro antioxidante e inhibidora de la ECA e incluso identificar un péptido con una relevante actividad antihipertensiva in vivo. / Escudero Fernández, ME. (2012). ESTUDIO DE PEQUEÑOS PÉPTIDOS (<1500 Da) CON ACTIVIDAD ANTIHIPERTENSIVA Y ANTIOXIDANTE GENERADOS EN EL JAMÓN CURADO [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/18237 / Palancia

Magíster en Bioquímica área de Especialización en Bioquímica Ambiental y Memoria para optar al Título de Bioquímico / La astringencia es una importante característica de calidad del vino tinto. Al degustarlo, produce aspereza, rugosidad y sequedad en la cavidad bucal, sensaciones que se han atribuido a la presencia de compuestos fenólicos (taninos) en el vino tinto. Se ha señalado que estos compuestos interactúan con las proteínas de la saliva en la boca formando complejos, los cuales precipitan generando la pérdida de la capacidad lubricante de la saliva y la sensación que denominamos astringencia. Para estimar la astringencia que produce un vino se emplea un panel de degustación, de manera que implica siempre cierta subjetividad. Por otro lado, se ha señalado que la interacción y la precipitación de los complejos tanino-proteínas salivales se produce por la presencia de proteínas ricas en prolina (PRPs), abundantes en la saliva humana. La investigación de las interacciones tanino-saliva se aborda frecuentemente con taninos y proteínas específicas, soluciones proteicas ideales y/o muestra biológica procesada (mediante dilución, centrifugación o filtración). Tales interacciones son evaluadas en nuestro laboratorio empleando, en cambio, “saliva total humana”. Esta se utiliza en el estudio de la fracción proteica salival en ensayos de difusión sobre membranas de celulosa y mediante ensayos de precipitación. Hasta ahora, las evaluaciones asociadas a este fenómeno son prácticamente inexistentes, por lo cual se planteó como objetivo de esta Tesis: “Evaluar cuantitativamente interacciones entre la fracción proteica de la saliva total humana y polifenoles del vino”. Para ello, se ha propuesto como hipótesis que: “La medición sistemática de alteraciones tanto en la capacidad de difundir sobre matrices de celulosa como en la solubilidad de la fracción proteica salival, producidas por los polifenoles del vino, permite la cuantificación de la formación de complejos entre polifenoles del vino y la proteína salival.”. Se implementó un método de estudio cuantitativo de interacciones polifenoles-proteínas de la saliva total humana, se estableció un modelo de análisis donde la interacción es dependiente de la composición polifenólica en el vino y se especificaron parámetros para cotejar aspectos de la progresión de la interacción vino-fracción proteica de saliva total humana / Astringency is an important feature of red wine quality. On tasting, astringency produces roughness, puckering and dryness of the mouth, feelings that have been attributed to the presence of phenolic compounds (such as tannins) in red wine. These compounds interact with proteins in the saliva forming complexes in the mouth, which precipitate generating the loss of lubricant properties of saliva which is followed by the sensation of astringency. To estimate levels of wine astringency a taste panel is employed, a traditional procedure that always involves some subjectivity. Moreover, it´s been indicated that interaction and precipitation of tannin – salivary protein complexes it´s produced by the presence of proline-rich proteins (PRPs), typically abundant in human saliva. Previous investigations studying interactions between saliva and tannins used specific proteins, model proteins or ideal solutions and/or processed biological samples (by dilution, centrifugation or filtration). However, none study employed not disrupted human saliva. In our laboratory, interactions with tannins were evaluated using whole human saliva. With this biological sample, the study of salivary protein fraction in assays of diffusion on cellulose membrane and employing precipitation assays was performed. Until now, evaluations associated with this phenomenon were virtually nonexistent. Thus the objective of this thesis is "To assess quantitatively interactions between protein fraction of whole human saliva and wine polyphenols”. The working hypothesis is that: "The systematic measurement of disruptions both diffusion capability over cellulose membranes and solubility of salivary protein fraction, produced by wine polyphenols, allow quantitation of complex formation between wine polyphenols and the salivary protein”. A method for the quantitative study of polyphenol - protein of whole human saliva interactions was set up and established an analytical model where these interactions are dependent on the polyphenolic composition of wine, and defined specific parameters for the analysis of the interaction between wine and the salivary protein fraction of whole human saliva / Fondecyt

En esta Tesis Doctoral se ha estudiado en modelos experimentales el potencial antihipertensivo de dos tipos de péptidos bioactivos: péptidos derivados de distintas zonas de la secuencia de la lactoferrina bovina (LF), incluido su dominio antimicrobiano lactoferricina (LfcinB), y heptapéptidos obtenidos mediante diseño racional a partir de hexapéptidos parentales. Se han realizado tres tipos de ensayos: ensayos in vitro para determinar los efectos inhibitorios sobre la actividad de la enzima conversora de la angiotensina I (ECA); ensayos funcionales ex vivo, usando segmentos arteriales aislados de conejo, para analizar los efectos inhibitorios de los péptidos sobre la vasoconstricción ECA-dependiente producida por angiotensina I (Ang I); y ensayos in vivo mediante la administración de los péptidos a ratas espontáneamente hipertensas (SHR) para estudiar los efectos antihipertensivos. En algunos casos, también se han realizado ensayos in vitro para determinar el potencial efecto tóxico de los péptidos no naturales y de digestión gastrointestinal simulada para analizar la biodisponibilidad de los péptidos. Se obtuvieron péptidos derivados de LfcinB mediante elongaciones tanto del extremo C-t como del N-t del péptido LfcinB20-25 (RRWQWR). Estos péptidos mostraron diferentes potencias de inhibición de la actividad ECA in vitro, e inhibieron la vasoconstricción ECA-dependiente ex vivo. No se encontró una clara correlación entre los resultados in vitro y ex vivo. Solamente LfcinB20-25 y un fragmento derivado (WQ) producido mediante digestión gastrointestinal simulada mostraron efectos antihipertensivos in vivo. Sin embargo, el fragmento no mostró efecto inhibidor de la vasoconstricción ECA-dependiente en contraste con LfcinB20-25. Por otro lado, se preparó un hidrolizado de lactoferrina bovina con pepsina y se ultrafiltró para enriquecerlo en péptidos con peso molecular menor de 3 kDa (LFH<3kDa). Este hidrolizado mostró efectos antihipertensivos mantenidos hasta 24 h tras la administración oral. LFH<3kDa se fraccionó y se identificaron 38 péptidos de los cuales se sintetizaron los 11 péptidos más abundantes. Tres de estos péptidos (LIWKL, RPYL y LNNSRAP) mostraron diferentes grados de inhibición de la actividad ECA in vitro y efectos antihipertensivos in vivo, aunque solamente dos de ellos, LIWKL y RPYL, mostraron efectos inhibidores de la vasoconstricción ECA-dependiente ex vivo. Por último, seis heptapéptidos mostraron diferentes grados de inhibición de la actividad ECA in vitro y de la vasoconstricción ECA-dependiente, pero no de la vasoconstricción ECA-independiente producida por angiotensina II. Los heptapétidos PACEI50L (RKWHFLW) y PACEI52L (RKWLFHW), y el hexapéptido parental PACEI32L (RKWHFW), mostraron efectos antihipertensivos in vivo, sin afectar a la presión arterial en ratas normotensas. Los péptidos sintetizados con D-aminoácidos mostraron mucho menos efecto inhibidor de la actividad ECA in vitro, no tuvieron efecto ex vivo, y mostraron efectos antihipertensivos in vivo tras administración intravenosa pero no oral. La toxicidad de estos péptidos no naturales para reducir la viabilidad celular in vitro se mostró a concentraciones milimolares, mucho más altas que las concentraciones micromolares con efecto inhibidor de la actividad ECA. En conclusión, se ha demostrado el potencial antihipertensivo de un péptido derivado de la lactoferricina (LfcinB20-25), de un hidrolizado con pepsina de la lactoferrina enriquecido en péptidos de bajo peso molecular (LFH<3kDa), de péptidos contenidos en dicho hidrolizado procedentes de otras zonas de la lactoferrina diferentes de LfcinB (LIWKL, RPYL y LNNSRAP), y de hexa- y heptapéptidos obtenidos mediante diseño racional (PACEI32L, PACEI50L y PACEI52L). En la mayor parte de ellos, el efecto antihipertensivo se asocia a su efecto vasoactivo por su capacidad para inhibir la actividad ECA / Ruiz Giménez, P. (2013). Efecto antihipertensivo, mediante inhibición de la enzima conversora de angiotensina I, de péptidos derivados de lactoferrina bovina y péptidos diseñados racionalmente [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/31123 / TESIS

Tesis por compendio / [EN] A series of biochemical reactions responsible for aroma, color, texture and flavour of the final product occur during the dry-cured ham processing. Among these reactions, proteolysis of muscle proteins is one of the most important, resulting in the generation of a large amount of peptides which could be used as quality markers of dry-cured ham. In this sense, proteomic techniques based on mass spectrometry have become a fundamental tool for the identification of peptides naturally generated throughout the dry-cured ham processing. So, the present Thesis has been focused on the study of the intense degradation of three proteins present in dry-cured ham: LIM domain-binding protein 3, ubiquitin-60S ribosomal protein and titin protein, identifying the peptide sequences generated at different times along the process and evaluating their potential as markers of dry-cured ham processing time. Moreover, peptide oxidation that occurs during dry-curing process has been studied due to its importance on final quality of dry-cured ham as well as its influence on the nutrititional and sensory characteristics, showing oxidation of methionine residues in numerous peptides generated from the degradation of the major myofibrillar proteins. Besides the identification of peptidic sequences, recent advances in mass spectrometry techniques have allowed the precise quantitation of proteins in complex mixtures. So, a label-free methodology has been optimized for the relative quantitation of major sarcoplasmic proteins from the quantitation of the generated peptides and the study of the proteolytic degradation along the dry-cured ham processing. This methodology represents an advance regarding quantitative methods used to date as it allows a simple, accurate and reliable evaluation of changes in the abundance of proteins throughout the dry-cured ham processing. Several recent studies have been focused on the study of the potential of dry-cured ham as a source of bioactive peptides, mainly those showing angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory activity. However, it is not clear whether these peptides are able to cross the intestinal barrier and reach the blood stream in an active form. Thus, in the present Thesis the transepithelial transport of dry-cured ham peptides having ACE inhibitory activity has been simulated through a Caco-2 cell monolayer, showing the absorption of intact peptides or fragments generated by the action of intestinal peptidases, which could exert an in vivo antihypertensive effect. / [ES] Durante el proceso de elaboración del jamón curado tienen lugar una serie de reacciones bioquímicas responsables del aroma, color, textura y sabor del producto final. Entre estas reacciones destaca la intensa proteolisis de las proteínas musculares, cuyo resultado es la generación de una gran cantidad de péptidos algunos de los cuales podrían ser utilizados como marcadores de calidad del jamón. En este sentido, las técnicas proteómicas basadas en espectrometría de masas son una herramienta fundamental para la identificación de los péptidos generados de manera natural a lo largo de proceso de elaboración del jamón curado. Así, la presente Tesis Doctoral se ha centrado en estudiar la intensa degradación de tres proteínas presentes en el jamón: la proteína 3 de unión al dominio LIM, la proteína ribosomal ubiquitina-60S y la proteína titina, identificando las secuencias de los péptidos generados a distintos tiempos durante el proceso y evaluando su potencial como marcadores del tiempo de curado del jamón. Además, se han estudiado los cambios oxidativos a nivel peptídico que tienen lugar durante el proceso de curado del jamón, cuya importancia radica en su efecto sobre la calidad y las características tanto nutricionales como sensoriales del producto final, evidenciando la oxidación del aminoácido metionina en numerosos péptidos generados a partir de las principales proteínas miofibrilares. Además de la identificación de las secuencias peptídicas, los recientes avances en técnicas de espectrometría de masas han permitido la cuantificación precisa de proteínas en muestras complejas. Así, se ha optimizado un método sin marcaje ("label-free") para la cuantificación relativa de las principales proteínas sarcoplásmicas a partir de la cuantificación de los péptidos generados y de esta forma estudiar la degradación proteolítica durante el proceso de elaboración del jamón curado. Esta metodología supone un avance respecto a los métodos cuantitativos utilizados hasta el momento ya que permite evaluar de manera sencilla, precisa y fiable los cambios en la abundancia de proteínas a lo largo del proceso de elaboración del jamón curado. Varios estudios recientes se han centrado en estudiar el potencial del jamón curado como fuente de péptidos bioactivos, principalmente aquellos que son inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina I (ECA). Sin embargo, no se conoce si estos péptidos son capaces de atravesar la barrera intestinal y alcanzar la corriente sanguínea en forma activa. Por ello, en la presente Tesis Doctoral se ha simulado el transporte intestinal mediante la utilización de células Caco-2 de péptidos del jamón inhibidores de la ECA, evidenciado la absorción de péptidos enteros, o fragmentos de los mismos generados por acción de las peptidasas intestinales, que podrían ejercer un efecto antihipertensivo in vivo. / [CA] Al llarg del procés d'elaboració del pernil curat tenen lloc una sèrie de reaccions bioquímiques responsables de l'aroma, color, textura i sabor del producte final. Entre aquestes reaccions destaca la intensa proteolisis de les proteïnes musculars, el resultat de la qual és la generació d'una gran quantitat de pèptids alguns dels quals podrien ser utilitzats com a marcadors de qualitat del pernil. En aquest sentit, les tècniques proteòmiques basades en espectrometria de masses són una ferramenta fonamental per a la identificació dels pèptids generats de manera natural al llarg de procés d'elaboració del pernil curat. Així, la present Tesi Doctoral s'ha centrat a estudiar la intensa degradació de tres proteïnes presents en el pernil: la proteïna 3 d'unió al domini LIM, la proteïna ribosomal ubiquitina-60S i la proteïna titina, identificant les seqüències dels pèptids generats a distints temps al llarg del procés i avaluant el seu potencial com a marcadors del temps de curat del pernil. A més, s'han estudiat els canvis oxidatius a nivell peptídic que tenen lloc durant el procés de curat del pernil, la importància dels quals radica en el seu efecte sobre la qualitat i les característiques tant nutricionals com sensorials del producte final, evidenciant l'oxidació de l'aminoàcid metionina en nombrosos pèptids generats a partir de les principals proteïnes miofibrilars. A més de la identificació de les seqüències peptídiques, els recents avanços en tècniques d'espectrometria de masses han permés la quantificació precisa de proteïnes en mostres complexes. Així, s'ha optimitzat un mètode sense marcatge ("label-free") per a la quantificació relativa de les principals proteïnes sarcoplàsmiques a partir de la quantificació dels pèptids generats i d'esta manera estudiar la degradació proteolítica durant el procés d'elaboració del pernil curat. Esta metodologia suposa un avanç respecte als mètodes quantitatius utilitzats fins al moment ja que permet avaluar de manera senzilla, precisa i fiable els canvis en l'abundància de proteïnes al llarg del procés d'elaboració del pernil curat. Diversos estudis recents s'han centrat en estudiar el potencial del pernil curat com a font de pèptids bioactius, principalment aquells que són inhibidors de l'enzim convertidor d'angiotensina I (ECA). No obstant això, no es coneix si aquests pèptids són capaços de travessar la barrera intestinal i arrivar al corrent sanguini en forma activa. Per això, en la present Tesi Doctoral s'ha simulat el transport intestinal mitjançant l'utilització de cèl·lules Caco-2 amb pèptids del pernil inhibidors de l'ECA, evidenciant l'absorció de pèptids sencers, o fragments generats per acció de les peptidases intestinals, que podrien exercir un efecte antihipertensiu in vivo. / Gallego Ibáñez, M. (2015). PÉPTIDOS GENERADOS EN JAMÓN CURADO COMO MARCADORES DE CALIDAD [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/55506 / TESIS / Premios Extraordinarios de tesis doctorales / Compendio

Los péptidos bioactivos son fragmentos que forman parte de muchas proteínas y que al ser liberados son capaces de regular una serie de procesos biológicos. Para liberarlos, las proteínas son degradas por medio de enzimas digestivas o procesos industriales. Estos péptidos mantienen propiedades antihipertensivas, antimicrobianas, antioxidantes, anticarcinógenas, antinflamatorias, entre otras, que podrían ser aprovechadas para el desarrollo de nuevos fármacos. En este trabajo de investigación, hemos resaltado la utilidad de los péptidos bioactivos como compuestos altamente específicos capaces de contribuir en la mejora de patologías tales como el cáncer, la hipertensión arterial y la enfermedad de Alzheimer. Particularmente, en estas enfermedades, mostramos experimentos in vitro e in vivo con resultados prometedores que motivan a continuar su estudio en humanos. Estos péptidos fueron extraídos del haba de la soja, la leche de vaca y el hígado de atún, evidenciando la disponibilidad de estos en la naturaleza y generando la incógnita de que otros compuestos podrían encontrarse en la flora y fauna del Perú. De la misma forma, se presentan una serie de tecnologías novedosas para el aislamiento de dichos compuestos, entre estas están la precipitación selectiva, la filtración por membrana, la cromatografía de exclusión por tamaño y el isoelectroenfoque. Éstas son escalables, de fácil aplicación, rápidas, no requieren mayor inversión en infraestructura u equipamiento y no necesitan de una gran cantidad de muestra. En conclusión, en este trabajo se demuestra que los péptidos bioactivos guardan gran promesa, en particular en la identificación de compuestos novedosos para el desarrollo de nuevas drogas. Si se genera una alianza en el Perú entre la comunidad científica, la industria y entes públicos financiadores, se podría explotar, responsablemente, la biodiversidad de nuestro país para proceder, en gran escala, con el aislamiento y la identificación masiva de compuestos bioactivos de gran interés a nivel mundial. / Bioactive peptides are fragments that are part of many proteins and which, upon release, are capable of regulating a series of biological processes. To release them, proteins need to be degraded by digestive enzymes or industrial processes. These peptides maintain antihypertensive, antimicrobial, antioxidant, anticarcinogenic, anti-inflammatory properties, amongst others, that could be used to develop new drugs. In this research work, we have highlighted the utility of bioactive peptides as highly-specific compounds capable to contribute in the improvements of pathologies such as cancer, high blood pressure and Alzheimer’s disease. Particularly, in these diseases, we show in vitro and in vivo experiments with promising results that motivate further studies in humans. These peptides were extracted from soy bean, cow milk and tuna liver, evidencing the availability of these in nature and posing the question of all the other compounds that could be found in the flora and fauna of Peru. Moreover, we present a serious of novel technologies to isolate said compounds, amongst these are selective precipitation, membrane filtration, size-exclusion chromatography and isoelectric focusing. These techniques are scalable, easily applied, rapid, do not require significant investment in infrastructure or equipment and do not need a significant amount of sample. In conclusion, in this work we demonstrate that bioactive peptides have great promise in particular in the identification of novel compounds to develop new drugs. If we generate an alliance in Peru between the scientific community, the industry and public financing entities, our country’s biodiversity could be responsibly exploited to proceed, in a big scale, with the massive isolation and identification of bioactive compounds of great interest worldwide / Trabajo de investigación

No description available.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Evalúa el potencial neuroprotector de los péptidos obtenidos mediante hidrólisis enzimática de forma secuencial de la proteína soluble aislada de las semillas de tarwi. Las semillas fueron sometidas a un proceso de deslupinizado para la eliminación de alcaloides y a un proceso de deslipidizado con etanol previo a la obtención del concentrado proteico el cual incrementó su contenido proteico hasta 76.74% y que fueron hidrolizadas utilizando de forma secuencial las enzimas pepsina 0,7 FIP (Federación Internacional de Farmacia)- U/mg (HP), pancreatina 350 FIP- U/g (HPP) y Alcalasa 2,4 U/g proteína (HPPA), durante 30, 60 y 138 min, respectivamente. El HPPA presentó un buen grado de hidrólisis (46.12 ± 2.77%), y se separó en tres fracciones peptídicas UF1, UF2 y UF3 de tamaños, > a 10 kDa, 3-10 kDa y < a 3 kDa, respectivamente. La UF3 presentó mayor actividad antioxidante con valores de 5.34 ± 0.45 y 7.62 µmol ET / mg proteína según los métodos ABTS y ORAC, respectivamente y una actividad quelante de Fe +2 de 96.39 ± 2.56% con 5 µg de proteína. Para evaluar el potencial neuroprotector de las fracciones se utilizó un modelo celular de peroxidación lipídica inducida con sulfato ferroso en tejido cerebral de ratón. La UF3 fue capaz de inhibir la peroxidación lipídica en 40.52 ± 1.13% a una concentración de 0.0125 mg/mL (p <0.05). Por tanto, la fracción menor a 3 kDa obtenida se podría utilizar como ingrediente de alimentos funcionales con potencial en la prevención o tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. / Tesis

[ES] La biogénesis ribosomal es uno de los procesos más complejos, esenciales y costosos energéticamente de la célula eucariota. La formación de las subunidades ribosomales en levaduras comienza en el nucléolo con la transcripción del ARNr. En este proceso se requiere la participación de más de doscientos factores de ensamblaje y ARNs pequeños nucleolares (snoARNs) que no formarán parte del ribosoma maduro aunque son necesarios para un apropiado procesamiento del ARNr y organización estructural de las subunidades ribosomales. Los estudios estructurales de los estadios de maduración de la subunidad 60S han permitido la identificación de algunas interacciones funcionales entre los distintos factores de ensamblaje. Entre ellos se encuentran las proteínas Nop7, Erb1 e Ytm1 que forman un heterotrímero discreto denominado subcomplejo Nop7 en levaduras, o complejo PeBoW en mamíferos, compuesto por los ortólogos Pes1, Bop1 y WDR12, respectivamente. Este complejo puede detectarse de forma aislada de las partículas prerribosomales. La formación de este heterotrímero es esencial para el ensamblaje de la subunidad 60S ya que garantizan la correcta maduración del extremo 5' del ARNr 5,8S facilitando así su asociación con el ARNr 25S, aunque se desconoce en detalle el papel exacto en la biogénesis ribosomal. En este trabajo se ha realizado un análisis de las interacciones entre los componentes del PeBoW así como una aproximación a la resolución estructural del complejo en solución. Usando una combinación de técnicas biofísicas, nuestros resultados indican que la conformación estructural que adopta el complejo PeBoW en el nucleoplasma es diferente a la descrita en el contexto prerribosomal. Además, se han identificado posibles funciones que podría estar ejerciendo el complejo PeBoW o bien las distintas proteínas del complejo de forma aislada fuera del prerribosoma. Asimismo se conoce que la biogénesis ribosomal es un mecanismo altamente regulado y estrechamente relacionado con crecimiento y proliferación celular. La imperiosa necesidad de síntesis de ribosomas y proteínas que tiene una célula tumoral convierte a este proceso en un punto débil de la misma. Por esta razón, hay un gran interés para estudiar la biogénesis ribosomal como diana terapéutica contra el cáncer. Se ha observado que la paralización de esta vía es capaz de promover la activación no genotóxica del supresor tumoral p53, a diferencia de los efectos indeseados que provocan las terapias convencionales contra el cáncer. Como primer paso hacia el desarrollo de herramientas inhibidoras de la biogénesis del ribosoma, hemos utilizado la información cristalográfica que poseíamos del complejo de Chaetomium thermophilum entre los factores de ensamblaje Erb1 e Ytm1 para realizar una selección guiada por la estructura de péptidos de interferencia. Los péptidos de interferencia han sido analizados in vitro para determinar su capacidad de interacción utilizando técnicas biofísicas. Además, se han generado péptidos de interferencia con la secuencia humana de Erb1/Ytm1 para evaluar sus efectos en cultivo de células de cáncer de colon HCT-116. Nuestros resultados indican que el estrés ribosómico se puede inducir en diferentes etapas del proceso de maduración al dirigirse a las interacciones proteína-proteína, elevándolas como una alternativa al uso de inhibidores de la ARN pol I. / [CA] La biogènesi ribosomal és un dels processos més complexos, essencials i costosos energèticament de la cèl·lula eucariota. La formació de les subunitats ribosomals en llevats comença en el nuclèol amb la transcripció de l'ARNr. En aquest procés es requereix la participació de més de dos-cents factors d'assemblatge i ARNs xicotets nucleolars (snoARNs) que no formaran part del ribosoma madur encara que són necessaris per a un apropiat processament de l'ARNr i organització estructural de les subunitats ribosomals. Els estudis estructurals dels estadis de maduració de la subunitat 60S han permès la identificació d'algunes interaccions funcionals entre els diferents factors d'assemblatge. Entre ells es troben les proteïnes Nop7, Erb1 i Ytm1 que formen un heterotrímer discret denominat subcomplex Nop7 en llevats, o complex PeBoW en mamífers, compost pels ortòlegs Pes1, Bop1 i WDR12, respectivament. Aquest complex pot detectar-se de forma aïllada de les partícules prerribosomals. La formació d'aquest heterotrímer és essencial per a l'assemblatge de la subunitat 60S ja que garanteix la correcta maduració de l'extrem 5' de l'ARNr 5,8S facilitant així la seua associació amb l'ARNr 25S, encara que es desconeix detalladament el paper exacte en la biogènesi ribosomal. En aquest treball s'ha realitzat una anàlisi de les interaccions entre els components del PeBoW així com una aproximació a la resolució estructural del complex en solució. Utilitzant una combinació de tècniques biofísiques, els nostres resultats indiquen que la conformació estructural que adopta el complex PeBoW en el nucleoplasma és diferent a la descrita en el context prerribosomal. A més, s'han identificat possibles funcions que podria estar exercint el complex PeBoW o bé les diferents proteïnes del complex de forma aïllada fora del prerribosoma. Així mateix es coneix que la biogènesi ribosomal és un mecanisme altament regulat i estretament relacionat amb creixement i proliferació cel·lular. La imperiosa necessitat de síntesi de ribosomes i proteïnes que té una cèl·lula tumoral converteix a aquest procés és un punt feble d'aquesta. Per aquesta raó, hi ha un gran interès per a estudiar la biogènesi ribosomal com a diana terapèutica contra el càncer. S'ha observat que la paralització d'aquesta via és capaç de promoure l'activació no genotòxica del supressor tumoral p53, a diferència dels efectes indesitjats que provoquen les teràpies convencionals contra el càncer. Com a primer pas cap al desenvolupament d'eines inhibidores de la biogènesi del ribosoma, hem utilitzat la informació cristal·logràfica que posseíem del complex de Chaetomium thermophilum entre els factors d'assemblatge Erb1 i Ytm1 per a realitzar una selecció guiada per l'estructura de pèptids d'interferència. Els pèptids d'interferència han sigut analitzats in vitro per a determinar la seua capacitat d'interacció utilitzant tècniques biofísiques. Així mateix, s'han generat pèptids d'interferència amb la seqüència humana de Erb1/Ytm1 per a avaluar els seus efectes en cultiu de cèl·lules de càncer de còlon HCT-116. Els nostres resultats indiquen que l'estrès ribosòmic es pot induir en diferents etapes del procés de maduració en dirigir-se a les interaccions proteïna-proteïna, elevant-les com una alternativa a l'ús d'inhibidors de l'ARN pol I. / [EN] Ribosomal biogenesis is a complex, essential and one of the most energy-costing process in eukaryotic cells. The assembling of the ribosomal subunits, in yeast, starts with the RNA transcription inside the nucleolus. This process requires the participation of more than two hundred assembly factors and small nucleolar RNAs (snoRNAs) that will not be part of the mature ribosome, however, they are still necessary to perform the appropriate rRNA processing and structural management. The structural studies on the maturation stages of the 60S subunit have shown functional interactions between different assembling factors. In this group, we find Nop7, Erb1 and Ytm1, that both form a discrete heterotrimer called Nop7 subcomplex in yeast, or PeBoW in mammalian, composed by the respective orthologues Pes1, Bop1 and WDR12. This complex can be found isolated from the pre-ribosomal particles. The presence of this complex is crucial to the 60S subunit assembling, once it ensures the correct maturation of the 5' tip of the rRNA 5,8S, supporting the association with the 25S rRNA. Yet, the details of the PeBoW complex roll in ribosomal biogenesis remain unknown. Hereafter, there are some analysis of interaction assays between the PeBoW component proteins, as well as an approach to structural of the complex in solution. Using different biophysical techniques, the results suggest that PeBoW complex adopts a different conformation in the nucleoplasm than the described in the pre-ribosomal context. Furthermore, it hints some other functions of the PeBoW complex, or the isolated component proteins out of the pre-ribosome path. Besides that, the ribosomal biogenesis is a highly regulated process and strictly related with cellular growth and proliferation. The mandatory demand of ribosome and protein synthesis of tumoral cells make this process a weak point of it. This is the reason why ribosomal biogenesis as cancer treatment target is a point of great interest. According to some studies, it is expected that the interruption of this pathway can lead the non-genotoxic activation of the tumor suppressor p53, unlike other conventional cancer therapies. As a first step to development of ribosomal biogenesis inhibiting tools, the structural information of Erb1 and Ytm1 in Chaetomium thermophilum complex, was taken to design structure-guided interfering peptides. Using biophysical techniques, the interfering peptides were evaluated in vitro to determine their interaction ability. Then, human-sequenced Erb1/Ytm1 interfering peptides were designed to look over the effects on colon cancer cells HCT-116. The results indicate that the ribosomal stress can be induced in different stages of the maturation process, by approaching protein-protein interactions, planting it as an alternative to RNA pol I inhibitors. / Este trabajo ha sido realizado con el apoyo económico de los proyectos de investigación enumerados a continuación: SAF2015-67077-R, SAF2017-89901-R y PROMETEO/2018/0 Durante el periodo de realización de esta tesis, la autora, Lidia Orea Ordóñez, ha sido beneficiaria de una subvención para la contratación de personal investigador de carácter predoctoral denominada “Ayudas para la contratación de personal investigador de carácter predoctoral”, (ACIF) (ACIF/2016/103), otorgada por la Generalitat Valenciana, Conselleria de Innovación, Universidades, Ciencia y Sociedad Digital, concedida en la convocatoria 2016. / Orea Ordóñez, L. (2022). Estructura y función del complejo PeBoW como modelo en el desarrollo de posibles herramientas terapéuticas [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/182347 / TESIS