El déficit de frataxina es la causa principal de la ataxia de Friedreich, una enfermedad hereditaria neurodegenerativa que afecta a las neuronas sensitivas del ganglio dorsal y del tracto espinocerebelar. Desde que se describi¨® el gen responsable de la enfermedad y sobre todo gracias a la generaci¨®n de organismos modelos para su estudio, se han postulado diferentes funciones para la frataxina: homeostasis del hierro mitocondrial, almacenamiento del hierro, respuesta al estr¨¦s oxidativo. Biog¨¦nesis de los clusters Fe-S, modulaci¨®n en la actividad de la aconitasa mitocondrial y un papel en la fosforilaci¨®n oxidativa. Nuestro planteamiento ha sido que la frataxina realiza su funci¨®n en la mitocondria mediante la interacci¨®n con otras prote¨ªnas y es posible que participe en diferentes procesos biol¨®gicos mitocondriales interactuando con distintas prote¨ªnas en cada uno de ellos. Por lo tanto, el objetivo del trabajo de tesis era la identificaci¨®n de prote¨ªnas capaces de interaccionar con Yfh1p, la frataxina de Sacchararomyces cerevisiae. En este trabajo mostramos que Yfh1p interacciona f¨ªsicamente con proteinas de la cadena de transporte de electrones mitocondrial. Hemos demostrado que Yfh1p coinmunoprecipita con succinato deshidrogenasa, concretamente con las subunidades Sdh1p y Sdh2p, de la cadena de transporte electr¨®nico mitocondrial de levadura, y tambi¨¦n con las subunidades ETFa y ETFb de la flavoprote¨ªna transferidora de electrones. Con el fin de confirmar la relaci¨®n funcional entre YFH1 y los genes SDH estudiamos si ambos genes manifestaban interacci¨®n sint¨¦tica. Nuestros resultados permiten afirmar que existe una relaci¨®n funcional entre el gen YFH1 y los genes de succinato deshidrogenasa SDH1 y SDH2, y seguramente su relaci¨®n sea a nivel de la misma ruta bioqu¨ªmica. Tambi¨¦n hemos demostrado una interacci¨®n f¨ªsica entre la frataxina humana y las subunidades SDHA y SDHB de la succinato deshidrogenasa humana. De estos hallazgos se infiere que la capacidad de interaccionar de frataxina con el complejo II de la cadena de transporte electr¨®nico est¨¢ conservada en humanos, sugiriendo que la frataxina tiene un papel en la cadena de transporte electr¨®nico mitocondrial en humanos. Nosotros planteamos que la frataxina puede intervenir en la entrada de electrones a la cadena de transporte electr¨®nico. Por lo tanto, proponemos una participaci¨®n directa de la cadena respiratoria en la patog¨¦nesis de la ataxia de Friedreich, la cual entendemos que se puede considerar como una enfermedad de la fosforilaci¨®n oxidativa (OXPHOS).Desde el descubrimiento de la frataxina y su localizaci¨®n como mol¨¦cula de la matriz mitocondrial, la ataxia de Friedreich se ha convertido en el prototipo de enfermedad mitocondrial causada por un gen nuclear. No obstante, no es la ¨²nica ataxia que se puede considerar como mitocondrial. Otro ejemplo es la anemia siderobl¨¢stica ligada al X asociada con ataxia cerebelosa (XLSA/A), causada por mutaciones en el gen del transportador mitocondrial ABC7. Esta enfermedad est¨¢ directamente relacionada con la homeostasis del hierro, al igual que la ataxia de Friedreich. Realizamos el aislamiento y caracterizaci¨®n del gen hom¨®logo del ABC7 en Caenorhabditis elegans y posteriormente la generaci¨®n de un knock-donw transitorio en C. elegans para el gen Y74C10AM.1 por RNAi. Los gusanos Y74C10AM.1(RNAi) presentan el siguiente fenotipo: letalidad embrionaria (Emb), retraso en el crecimiento (Gro), reducci¨®n en la puesta de huevos (Egl), defecaci¨®n alterada y aumento en la longevidad. Este fenotipo es similar a otros fenotipos asociados a mutantes transitorios de genes relacionados con la biog¨¦nesis de los clusters Fe-S en levadura. / Frataxin deficiency causes Friedreich ataxia, a neurodegenerative genetic disorder affecting sensory neurons of dorsal root ganglia and spinocerebellar tracts. Physiological function of frataxin in mitochondria has not been established yet, although several hypotheses have been postulated including mitochondrial iron homeostasis, iron storing, response to oxidative stress, iron-sulphur cluster biogenesis, modulation of mitochondrial aconitase activity and a role in oxidative phosphorylation. We showed that frataxin and its orthologue Saccharomyces cerevisiae, Yfh1p, interacts physically with proteins from the mitochondrial electron transfer chain. We demonstrated that Yfh1p co-immunoprecipitates with yeast succinate dehydrogenase complex subunits Sdh1p and Sdh2p, and with yeast orthologues of the electron transfer flavoprotein complex subunits ETFa and ETF¦Â. Genetic synthetic interaction experiments confirmed a functional relationship between YFH1 and succinate dehydrogenase genes SDH1 and SDH2. We postulate that Yfh1p might regulate the delivery of electrons via complex II and ETF systems towards ubiquinone in yeast. We also demonstrate a physical interaction between human frataxin and human succinate dehydrogenase complex subunits, suggesting also a key role of frataxin in the mitochondrial electron transport chain in humans. Consequently, we postulate a direct participation of the respiratory chain in the pathogenesis of the Friedreich ataxia, which we propose to be considered as an OXPHOS disease. Since the discovery of frataxin and its location within the mitocondrial matrix, Friedreich ataxia has become the prototype of mitocondrial disease caused by a nuclear gene. However, it is not the unique Mendelian ataxia that can be considered mitocondrial. Another example is the X-linked sideroblastic anemia with ataxia (XLSA/A), due to mutations in the gene encoding the mitocondrial transporter ABC7. This disease is directly related to the iron homeostasis, as Friedreich ataxia. We have characterized the genomic structure of Y74C10AM.1, the Caenorhabditis elegans ABC7 gene, and we have developed a transient knock-down model of C. elegans ABC7 deficiency by RNA interference. Y74C10AM.1(RNAi) worms show a phenotype that includes embryonic lethality (Emb), slow growth (Gro), egg laying defects (Egl), altered defecation and lifespan increase. This phenotype is similar to other phenotypes associated to transient knock-down models in C. elegans of genes related to the iron-sulphur cluster biogenesis in yeast.

Esta tesis versa sobre el estudio del enzima N-acetil-L-glutamato quinasa (NAGK), no regulado por arginina, de la enterobacteria Escherichia coli. Este enzima cataliza la transferencia del fosfato terminal del ATP al N-acetil-L-glutamato (NAG) en el segundo paso de la ruta de síntesis de arginina en microorganismos y plantas. En el desarrollo de esta tesis doctoral hemos clonado el gen que codifica para la NAGK de E. coli en un vector plasmídico adecuado, hemos sobreexpresado el enzima y lo hemos purificado en un grado muy elevado. Además, se ha conseguido cristalizar el enzima obteniendo varios complejos cristalinos tanto en su forma libre de sustratos como en presencia de varios ligandos, que incluyen sustratos y análogos de los sustratos. El empleo de técnicas de cristalografía de rayos X sobre los cristales obtenidos han permitido determinar las estructuras del complejo del enzima con MgAMPPNP y NAG a 1.5 Å de resolución y las de los complejos con MgADP y NAG con o sin tetrafluoruro de aluminio interpuesto, o de ADP y sulfato, todos ellos a una resolución de 1.9 Å. Todas las estructuras concuerdan en un mismo plegamiento básico, constituido por un homodímero nucleado por una hoja b molecular central de 16 elementos, rodeado de dos capas de hélices a, con bucles y dos hélices emergiendo del borde C-terminal de la hoja b central de cada subunidad, formando dichos bucles los sitios de unión de los sustratos. La estructura concuerda en su mayor parte con la descrita previamente por el laboratorio para la carbamato quinasa (CK), pudiendo constituir la NAGK el paradigma para los demás enzimas de la familia aminoácido quinasa. La presencia en la NAGK de NAG unido permite la caracterización por primera vez del sitio de unión del sustrato a fosforilar en estos enzimas. Además, los diferentes complejos han permitido dilucidar el modo de unión del nucleótido y establecer las bases de la especificidad para el mismo, de la catálisis, así como el curso del grupo fosforilo desde los sustratos a los productos. La comparación con la CK revela un mismo modo de unión de nucleótido a ambos enzimas. Los complejos con MgAMPPNP-NAG y con MgADP-tetrafluoruro de aluminio-NAG revelan que la transferencia de fosforilo sucede en un sólo paso, en línea, con carácter asociativo y con formación de un intermediario pentavalente bipiramidal. Las cargas positivas de dos lisinas conservadas, los extremos N-terminales de dos hélices a y la formación de una red de puentes de hidrógeno del fosfato que se transfiere con la proteína, son elementos catalíticos clave. Un aspartato conservado, tres moléculas fijas de agua y el catión metálico divalente parecen elementos adicionales clave en la organización del centro activo. El centro activo comprime los sustratos en la dirección del intermediario o estado de transición, proponiéndose que la complementariedad del enzima con dicho intermediario estabiliza este último y es un elemento catalítico clave con este enzima. Se propone también que el centro activo sufre fuertes cambios conformacionales con la unión de los sustratos, y que parte de la energía de dicha unión de los sustratos se utiliza para la generación de la conformación catalíticamente productiva.La presencia de una molécula de AMPPNP unida periféricamente al enzima, muy extendida, no acomplejada con Mg2+, nos informa acerca de la conformación que adopta el nucleótido en solución o en sus colisiones con moléculas de proteína. La hipótesis de que este nucleótido tenga importancia funcional para la reacción de la NAGK no parece apoyada por la ausencia del nucleótido periférico en los demás complejos. Por último, se han iniciado los estudios para la caracterización de las bases moleculares de la inhibición "feed-back" de la NAGK por arginina, mediante la cristalización de la NAGK de Pseudomonas aeruginosa, que a diferencia del enzima de E. coli, está sometida a este tipo de inhibición. / N-acetyl-L-glutamate kinase (NAGK) catalyzes the second step of microbial arginine biosynthesis. The gene for Escherichia coli NAGK was cloned and expressed in E. coli, allowing enzyme purification and crystallization with and without substrates. The E. coli NAGK crystal structure to 1.5 Å resolution reveals a 258-residue subunit homodimer nucleated by a central 16-stranded molecular open _-sheet sandwiched between _-helices. In each subunit MgAMPPNP binds along the sheet C-edge, and N-acetyl-L-glutamate (NAG) binds near the dyadic axis with its _-carboxilate aligned at short distance from the _-phosphoryl. The structural resemblance with carbamate kinase and sequence alignment suggest that NAGK is the prototype for the amino acid kinase family. Moreover, a large volume of unexplained electron density in this crystal is interpreted as an external, very extended, metal-free AMPPNP molecule that occupies two alternative positions and that makes contacts with the protein exclusively through its _-imidophosphate.We determine here also the crystal structures of NAGK complexes with MgADP and NAG alone or with the transition-state analog AlF4- and with ADP and sulphate. Comparison of these structures allows to delineate three successive steps during phosphoryl transfer. The transfer occurs in line and is strongly associative, with Lys8 and Lys217 stabilizing the transition state and the leaving group, respectively. Three water molecules play, together with Asp162 and the Mg, crucial structural roles. Two glycine-rich loops are also very important, moving in concert with the ligands. The active site is too narrow to accommodate the substrates without compressing the reacting groups, and this compressive strain appears a crucial component of the catalytic mechanism of NAGK. Initial binding of the two substrates would require a different enzyme conformation with a wider active site, and the energy of substrate binding would be used to change the active center conformation.In many species, NAGK is the pathway-controlling enzyme and is subject to feedback inhibition by arginine. The arginine-inhibitable NAGK from Pseudomonas aeruginosa has been cloned, overexpressed, purified and crystallized in presence of MgADP and NAG. Prismatic crystals diffract to 2.75 Å resolution with space group P1. Self-rotation function suggest the presence of 3-7 dimers in the unit cell.

Acidithiobacillus ferrooxidans es una de las principales bacterias ácidofilas y quimiolitoautotróficas involucradas en los procesos de biolixiviación. Esta bacteria Gramnegativa es capaz de oxidar tanto el ión ferroso (Fe2+), como compuestos reducidos del azufre con el objetivo de obtener energía para su crecimiento. La mayor parte de las bacterias biolixiviantes crecen adheridas a superficies de sustratos sólidos (minerales). A. ferrooxidans además es capaz de desarrollar biopelículas y exhibir modificaciones morfológicas durante el proceso de adherencia. La formación de biopelículas está regulada en diversas bacterias por el sistema de “Quorum Sensing” (QS). El QS es un proceso en el cual las bacterias se comunican con otras de su misma especie para coordinar su comportamiento y funcionar como un organismo multicelular. El QS regula diversos fenotipos los cuales son el resultado de cambios en la expresión de múltiples genes. Estos son cambios globales dependientes de una familia de reguladores transcripcionales llamadas proteínas tipo R. Este conjunto de genes que se activan o se reprimen en una condición determinada se denomina regulón. Para poder determinar qué genes forman parte de un regulón, se deben realizar experimentos de genómica y proteómica comparativa. Recientemente en nuestro laboratorio se ha caracterizado un sistema QS funcional del tipo AI-1 en la bacteria A. ferrooxidans. Sin embargo, aún no se han identificado ni los genes ni los fenotipos que este sistema regula. Por lo tanto, nos propusimos con esta tesis analizar los efectos sobre el patrón de expresión proteica de A. ferrooxidans de extractos de sobrenadantes de cultivo de A. ferrooxidans, AHLs sintéticas y sus análogos (aAHLs) mediante estudios proteómicos para indagar el regulón QS en esta bacteria. Estos experimentos fueron realizados en un fondo silvestre debido a que aún no se disponen de metodologías para manipular genéticamente a esta bacteria. Se observó que la adición de AHLs y aAHLs inducen cambios que se traducen en variaciones a nivel fisiológico (aumento de número de células), del medio (mayor oxidación de hierro y acumulación de azufre) y del patrón de expresión de proteínas. Otro punto abordado en esta tesis, fue determinar el efecto que tiene el Fe2+ sobre las AHLs producidas por la bacteria. Aparentemente el circuito regulatorio paradigmático de todos los sistemas de QS parece no ocurrir cuando A. ferrooxidans crece en un medio con hierro, puesto que tanto los niveles de AHLs como de transcrito del gen afeI son bajos en este medio de cultivo en comparación con azufre y tiosulfato. Por esta razón, nos propusimos estudiar cuál sería la posible explicación de este fenómeno. Experimentos preliminares nos llevaron a pensar que pudiese existir un putativo complejo entre hierro y AHLs. No es claro aún qué tipo de estructura forman las AHLs con hierro, pero sí es claro que estas moléculas autoinductoras son capaces de unirse al Fe2+ y alterar su patrón de migración en una cromatografía en capa fina (cambia la polaridad).

En este trabajo de tesis doctoral y bajo la hipótesis de la utilización por parte la bacteria de Bordetella pertussis del desarrollo en biofilm como un posible mecanismo de persistencia en el hospedador se evaluó la capacidad de formación de biofilm por parte de aislados clínicos de Bordetella pertussis obtenidos de pacientes infectados y tratados en el Hospital Sor María Ludovica de la ciudad de La Plata. Todos los aislados clínicos estudiados, incluyendo cepas aisladas entre los años 2001 y 2007 presentaron mayor capacidad de formación de biofilm en superficies abióticas cuando se las comparó con la cepa de referencia Bordetella pertussis Tohama I, cepa adaptada al laboratorio y utilizada en la producción de vacunas contra la enfermedad. De los ocho aislados clínicos estudiados se seleccionó uno, debido a una exacerbada producción de biofilm (produjo 5 veces más biomasa en las mismas condiciones de cultivo cuando se la comparó con la cepa de referencia) y se realizó un estudio de proteómica comparativa para establecer un posible fenotipo adaptado a la condición de cultivo en estudio. Los experimentos se llevaron a cabo en colaboración con el grupo de la Dra. Monika Elingh Schulz de la Universidad de Veterinaria de Viena, Austria y se utilizó la tecnología 2D-DIGE para evaluar la expresión diferencial de proteínas de la fracción soluble entre ambas cepas en condiciones de cultivo líquido y biofilm. Un análisis de componente principal indicó que las diferencias más significativas entre los fenotipos expresados es consecuencia de la diferencia de cepas y posteriormente consecuencia de la condición de cultivo. Se identificaron 32 proteínas diferencialmente expresadas (mayor de 3 veces de diferencia) entre ambas cepas, las cuales fueron asignadas a las categorías: metabolismo y obtención de energía, síntesis de aminoácidos y proteínas, transporte y virulencia (Bcrh2, OmpQ, Vag8 y BrkA). Todos los factores de virulencia identificados corresponden a proteínas reguladas por el sistema de dos componentes BVGAS. Sabiendo que dicho sistema regula la expresión de importantes adhesinas en Bordetella pertussis y que su inactividad provoca la incapacidad de formación de biofilm es que se decidió estudiar a través de la técnica de PCR en tiempo real la expresión del ARN mensajero de un conjunto mayor de factores de virulencia regulados por este sistema incluyendo adhesinas tales como FHA, PRN, Fim, BipA y la proteína de secreción del sistema tipo III Bsp22 que ha sido reportada en la bibliografía como participante junto a Fim en la producción de filamentos que brindarían estructura a la matriz extracelular del biofilm de B. pertussis. Los resultados obtenidos indicaron un aumento en la expresión de ARN mensajero para la totalidad de los genes estudiados indicando que posiblemente el aumento en la expresión de adhesinas reguladas por el sistema BvgAS, sumado a la expresión de enzimas involucradas en la producción de energía que podrían explicar la alta velocidad de duplicación de la cepa clínica Bp2723 le conferirían la capacidad de formar un biofilm más robusto comparado con la cepa de referencia en las condiciones de cultivo estudiadas.

Introdução: Os estudos com proteômica especificamente relacionada à nefrologia e urologia pediátrica são limitados. O diagnóstico do comprometimento da função renal e da sua deterioração na presença de uropatias obstrutivas congênitas (UOC) representa o desafio na rotina da nefro-urologia pediátrica. Novos biomarcadores com o potencial para detecção precoce da lesão renal surgiram recentemente, permitindo a escolha da melhor opção terapêutica no tempo hábil, e assim minimizando ou prevenindo o dano renal definitivo. Objetivos: Avaliar o perfil de dois biomarcadores renais séricos: creatinina (CrS) e cistatina C (CyCs); e seis biomaracadores renais urinários: lipocalina associada à gelatinase neutrofílica (NGAL), proteína ligadora de retinol (RBP), molécula de injúria renal 1 (KIM-1), cistatina C na urina (CyCu), fator transformador de crescimento-beta 1 (TGF-beta1) e microalbuminúria (uALB) durante o primeiro ano de vida em lactentes saudáveis; em relação à detecção precoce da lesão renal em lactentes com UOC; em relação à sua capacidade de prever a necessidade de intervenção cirúrgica em lactentes com UOC. Metodologia: 37 lactentes com UOC foram divididos em três subgrupos: 14/37 casos com hidroureteronefrose unilateral (HU), 13/37 com hidroureteronefrose bilateral (HB) e 10/37 com obstrução de vias urinárias baixas (OTUB); e comparados com 24 lactentes saudáveis. No grupo dos pacientes, as amostras de sangue e urina foram obtidas ao nascer e entre o 3º e 7º dia, 1º, 2º, 3º, 6º, 9º e 12º mês de vida. Grupo de controle seguia o mesmo cronograma, com exceção da coleta de sangue que ocorria ao nascer, entre o 3º e 7º dia, no 6º e 12º mês de vida. Todas as amostras foram armazenadas sob - 70 ºC, e analisadas posteriormente através de imunoensaio enzimático quantitativo (ELISA). Resultados: No grupo-controle, CrS, CyCs, CyCu e RBP refletiram a maturação glomerular e tubular. O ritmo de filtração glomerular pela CyCs atingiu os níveis estáveis no 6º mês de vida (93 ± 22 mL/min/1,73 m2). KIM-1 e TGF-beta1 mantiveram os níveis absolutos próximos ao limite de detecção pelo método. Os valores do NGAL no sexo feminino foram significativamente maiores (p=0,005) ao longo do 1º ano, quando comparados aos do sexo masculino. Em comparação aos controles, a coorte dos pacientes apresentou valores mais elevados para todos os biomarcadores urinários no 1º mês de vida (p <= 0,009), sendo que NGAL (p=0,005), TGF-betsa1 (p < 0,001) e ?ALB (p < 0,001) mostraram-se elevados desde o nascimento, em comparação aos controles. O RBP apresentou o melhor desempenho no subgrupo com HB e OTUB (AUC=0,844, sensibilidade >=83,3%, especificidade 94,3%), assim como o KIM-1 no HU (AUC=0,768, sensibilidade 70,7%, especificidade 82,7%). RBP em combinação com TGF-ß1 ou KIM- 1 e NGAL com CyCs e CyCu, atingiram os melhores resultados para detecção da lesão renal (AUC=0,934, sensibilidade 89,4%, especificidade 92,8%; AUC=0,896, sensibilidade 86,8%, especificidade 81,1%; AUC=0,867, sensibilidade 92,4%, especificidade 79,5%, respectivamente). Nos pacientes operados, os níveis elevados de RBP (p <= 0,043), NGAL (p <= 0,043), KIM-1 (p <= 0,03) e TGF-beta1 (p <= 0,034) baixaram significativamente após a cirurgia, no subgrupo com HU e OTUB. NGAL, isolado ou em combinação, com CyCs e CyCu demonstrou o melhor desempenho para determinar a necessidade cirúrgica (AUC=0,801, sensibilidade 63,6%, especificidade 96,7%; AUC=0,881, sensibilidade 87,7%, especificidade 82,2%, respectivamente). A analise do perfil dos biomarcadores indicou a necessidade da intervenção cirúrgica em 55,4% (7/13) dos casos não-operados e antecipou a decisão cirúrgica no mínimo 3 meses, em 58% (14/24) de todos os pacientes operados, baseada nas diretrizes atuais. Conclusão: A evolução dos valores normais dos biomarcadores no primeiro ano de vida, pode servir como a base para os próximos estudos de detecção precoce de afecções uro-nefrologicas. RBP, NGAL, KIM-1, TGF-beta1 e CyC, individualmente ou em combinação, demonstraram um forte potencial para identificar a lesão renal e servir como uma ferramenta de diagnóstico não-invasivo para diferenciar pacientes que necessitam de intervenção cirúrgica precoce daqueles que se beneficiariam de uma conduta conservadora / Introduction: The proteomics studies specifically related to pediatric nephrology and urology are limited. The diagnosis of renal function impairment and deterioration in congenital obstructive uropathies (COU) represents challenge in pediatric nephrourology routine. New renal biomarkers applied in this setting have potential for early renal injury detection, allowing reliable choice of optimal therapeutic options and thus preventing or minimizing definitive renal damage. Objectives: To analyze the first-year profiles of two serum renal biomarkers: Creatinine (CrS) and Cystatin C (CyCs); and six urinary renal biomarkers: Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin (NGAL), Retinol- Binding Protein (RBP), Kidney Injury Molecule-1 (KIM-1), urine Cystatin C (CyCu), Transforming Growth Factor Beta 1 (TGF-beta1), and microalbuminuria (uALB) in a cohort of healthy infants; in relation to early detection of renal injury capability in a group of infants with COU; in relation to capability of predicting the need for surgery in a group of infants with COU. Methods: 37 infants with COU were divided in 3 subgroups: 14/37 cases with unilateral hydro(uretero)nephrosis (UH), 13/37 with bilateral hydro(uretero)nephrosis (BH) and 10/37 patients with lower urinary tract obstruction (LUTO), compared with 24 healthy infants matched by gestational age and birth weight. In the patient group, blood and urine samples were collected at birth, between 3rd-7th day, at 1st, 2nd, 3rd, 6th, 9th and 12th month of age. In the control group urine sampling followed the same routine with exception that blood sampling was obtained between 3rd-7th day, at 6th and 12th month of age. The samples were stored at -70 ºC, and thereafter analyzed by quantitative enzymatic immunoassay (ELISA). Results: In the group of healthy controls, the values of CrS, CyCs, CyCu and RBP reflected glomerular and tubular maturation. The glomerular filtration rate by CyCs reached steady-state levels at 6th month of life (93 ± 22 mL/min/1,73 m2). KIM-1 and TGF-beta1maintained very low absolute levels, near to the limit of detection by the method. NGAL levels in females were significantly higher (p=0,005) throughout the first year of life, when compared to male gender. In the cohort of patients, all the urinary biomarkers showed significantly higher values at the first month of life (p <= 0,009), while NGAL (p=0,005), TGF-beta1(p < 0,001) e uALB (p < 0,001) were high since birth, compared to control group. The best single biomarker performance was achieved by RBP in BH and LUTO subgroups (AUC=0,844, sensitivity >= 83,3%, specificity 94,3%), and by KIM-1 in UH subgroup (AUC=0,768, sensitivity 70,7%, specificity 82,7%). The best biomarker combination results for all subgroups were obtained by matching RBP with TGF-beta1 or KIM-1 and NGAL with CyC (AUC=0,934, sensitivity 89,4%, specificity 92,8%; AUC=0,896, sensitivity 86,8%, specificity 81,1%; AUC=0,867, sensitivity 92,4%, specificity 79,5%, respectively). In the operated group of patients, the levels of RBP (p <= 0,043), NGAL (p <= 0,043), KIM-1 (p <= 0,03) e TGF-beta1 (p <= 0,034) dropped significantly after surgery, in UH and LUTO subgroups. NGAL alone or in combination with CyCs and CyCu, demonstrated the best performance to determine the need for surgery (AUC=0,801, sensitivity 63,6%, specificity 96,7%; AUC=0,881, sensitivity 87,7%, specificity 82,2%, respectively). Biomarkers\' profile analysis indicated the need for surgical intervention in 55,4% (7/13) of non-operated cases and anticipated clinically based surgical decision for at least 3 months, in 58% (14/24) of all operated patients. Conclusions: The presented biomarkers\' normal values evolution during the first year of life can be of use as a base for future studies that will involve early detection of uronephrological disorders in infants. RBP, NGAL, KIM-1, TGF-beta1 and CyC, alone or in combination, demonstrated strong capability to identify renal injury and serve as a noninvasive diagnostic tool for differentiating between infants that require early surgical intervention from those who would benefit from conservative approach

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Introdução: Os estudos com proteômica especificamente relacionada à nefrologia e urologia pediátrica são limitados. O diagnóstico do comprometimento da função renal e da sua deterioração na presença de uropatias obstrutivas congênitas (UOC) representa o desafio na rotina da nefro-urologia pediátrica. Novos biomarcadores com o potencial para detecção precoce da lesão renal surgiram recentemente, permitindo a escolha da melhor opção terapêutica no tempo hábil, e assim minimizando ou prevenindo o dano renal definitivo. Objetivos: Avaliar o perfil de dois biomarcadores renais séricos: creatinina (CrS) e cistatina C (CyCs); e seis biomaracadores renais urinários: lipocalina associada à gelatinase neutrofílica (NGAL), proteína ligadora de retinol (RBP), molécula de injúria renal 1 (KIM-1), cistatina C na urina (CyCu), fator transformador de crescimento-beta 1 (TGF-beta1) e microalbuminúria (uALB) durante o primeiro ano de vida em lactentes saudáveis; em relação à detecção precoce da lesão renal em lactentes com UOC; em relação à sua capacidade de prever a necessidade de intervenção cirúrgica em lactentes com UOC. Metodologia: 37 lactentes com UOC foram divididos em três subgrupos: 14/37 casos com hidroureteronefrose unilateral (HU), 13/37 com hidroureteronefrose bilateral (HB) e 10/37 com obstrução de vias urinárias baixas (OTUB); e comparados com 24 lactentes saudáveis. No grupo dos pacientes, as amostras de sangue e urina foram obtidas ao nascer e entre o 3º e 7º dia, 1º, 2º, 3º, 6º, 9º e 12º mês de vida. Grupo de controle seguia o mesmo cronograma, com exceção da coleta de sangue que ocorria ao nascer, entre o 3º e 7º dia, no 6º e 12º mês de vida. Todas as amostras foram armazenadas sob - 70 ºC, e analisadas posteriormente através de imunoensaio enzimático quantitativo (ELISA). Resultados: No grupo-controle, CrS, CyCs, CyCu e RBP refletiram a maturação glomerular e tubular. O ritmo de filtração glomerular pela CyCs atingiu os níveis estáveis no 6º mês de vida (93 ± 22 mL/min/1,73 m2). KIM-1 e TGF-beta1 mantiveram os níveis absolutos próximos ao limite de detecção pelo método. Os valores do NGAL no sexo feminino foram significativamente maiores (p=0,005) ao longo do 1º ano, quando comparados aos do sexo masculino. Em comparação aos controles, a coorte dos pacientes apresentou valores mais elevados para todos os biomarcadores urinários no 1º mês de vida (p <= 0,009), sendo que NGAL (p=0,005), TGF-betsa1 (p < 0,001) e ?ALB (p < 0,001) mostraram-se elevados desde o nascimento, em comparação aos controles. O RBP apresentou o melhor desempenho no subgrupo com HB e OTUB (AUC=0,844, sensibilidade >=83,3%, especificidade 94,3%), assim como o KIM-1 no HU (AUC=0,768, sensibilidade 70,7%, especificidade 82,7%). RBP em combinação com TGF-ß1 ou KIM- 1 e NGAL com CyCs e CyCu, atingiram os melhores resultados para detecção da lesão renal (AUC=0,934, sensibilidade 89,4%, especificidade 92,8%; AUC=0,896, sensibilidade 86,8%, especificidade 81,1%; AUC=0,867, sensibilidade 92,4%, especificidade 79,5%, respectivamente). Nos pacientes operados, os níveis elevados de RBP (p <= 0,043), NGAL (p <= 0,043), KIM-1 (p <= 0,03) e TGF-beta1 (p <= 0,034) baixaram significativamente após a cirurgia, no subgrupo com HU e OTUB. NGAL, isolado ou em combinação, com CyCs e CyCu demonstrou o melhor desempenho para determinar a necessidade cirúrgica (AUC=0,801, sensibilidade 63,6%, especificidade 96,7%; AUC=0,881, sensibilidade 87,7%, especificidade 82,2%, respectivamente). A analise do perfil dos biomarcadores indicou a necessidade da intervenção cirúrgica em 55,4% (7/13) dos casos não-operados e antecipou a decisão cirúrgica no mínimo 3 meses, em 58% (14/24) de todos os pacientes operados, baseada nas diretrizes atuais. Conclusão: A evolução dos valores normais dos biomarcadores no primeiro ano de vida, pode servir como a base para os próximos estudos de detecção precoce de afecções uro-nefrologicas. RBP, NGAL, KIM-1, TGF-beta1 e CyC, individualmente ou em combinação, demonstraram um forte potencial para identificar a lesão renal e servir como uma ferramenta de diagnóstico não-invasivo para diferenciar pacientes que necessitam de intervenção cirúrgica precoce daqueles que se beneficiariam de uma conduta conservadora / Introduction: The proteomics studies specifically related to pediatric nephrology and urology are limited. The diagnosis of renal function impairment and deterioration in congenital obstructive uropathies (COU) represents challenge in pediatric nephrourology routine. New renal biomarkers applied in this setting have potential for early renal injury detection, allowing reliable choice of optimal therapeutic options and thus preventing or minimizing definitive renal damage. Objectives: To analyze the first-year profiles of two serum renal biomarkers: Creatinine (CrS) and Cystatin C (CyCs); and six urinary renal biomarkers: Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin (NGAL), Retinol- Binding Protein (RBP), Kidney Injury Molecule-1 (KIM-1), urine Cystatin C (CyCu), Transforming Growth Factor Beta 1 (TGF-beta1), and microalbuminuria (uALB) in a cohort of healthy infants; in relation to early detection of renal injury capability in a group of infants with COU; in relation to capability of predicting the need for surgery in a group of infants with COU. Methods: 37 infants with COU were divided in 3 subgroups: 14/37 cases with unilateral hydro(uretero)nephrosis (UH), 13/37 with bilateral hydro(uretero)nephrosis (BH) and 10/37 patients with lower urinary tract obstruction (LUTO), compared with 24 healthy infants matched by gestational age and birth weight. In the patient group, blood and urine samples were collected at birth, between 3rd-7th day, at 1st, 2nd, 3rd, 6th, 9th and 12th month of age. In the control group urine sampling followed the same routine with exception that blood sampling was obtained between 3rd-7th day, at 6th and 12th month of age. The samples were stored at -70 ºC, and thereafter analyzed by quantitative enzymatic immunoassay (ELISA). Results: In the group of healthy controls, the values of CrS, CyCs, CyCu and RBP reflected glomerular and tubular maturation. The glomerular filtration rate by CyCs reached steady-state levels at 6th month of life (93 ± 22 mL/min/1,73 m2). KIM-1 and TGF-beta1maintained very low absolute levels, near to the limit of detection by the method. NGAL levels in females were significantly higher (p=0,005) throughout the first year of life, when compared to male gender. In the cohort of patients, all the urinary biomarkers showed significantly higher values at the first month of life (p <= 0,009), while NGAL (p=0,005), TGF-beta1(p < 0,001) e uALB (p < 0,001) were high since birth, compared to control group. The best single biomarker performance was achieved by RBP in BH and LUTO subgroups (AUC=0,844, sensitivity >= 83,3%, specificity 94,3%), and by KIM-1 in UH subgroup (AUC=0,768, sensitivity 70,7%, specificity 82,7%). The best biomarker combination results for all subgroups were obtained by matching RBP with TGF-beta1 or KIM-1 and NGAL with CyC (AUC=0,934, sensitivity 89,4%, specificity 92,8%; AUC=0,896, sensitivity 86,8%, specificity 81,1%; AUC=0,867, sensitivity 92,4%, specificity 79,5%, respectively). In the operated group of patients, the levels of RBP (p <= 0,043), NGAL (p <= 0,043), KIM-1 (p <= 0,03) e TGF-beta1 (p <= 0,034) dropped significantly after surgery, in UH and LUTO subgroups. NGAL alone or in combination with CyCs and CyCu, demonstrated the best performance to determine the need for surgery (AUC=0,801, sensitivity 63,6%, specificity 96,7%; AUC=0,881, sensitivity 87,7%, specificity 82,2%, respectively). Biomarkers\' profile analysis indicated the need for surgical intervention in 55,4% (7/13) of non-operated cases and anticipated clinically based surgical decision for at least 3 months, in 58% (14/24) of all operated patients. Conclusions: The presented biomarkers\' normal values evolution during the first year of life can be of use as a base for future studies that will involve early detection of uronephrological disorders in infants. RBP, NGAL, KIM-1, TGF-beta1 and CyC, alone or in combination, demonstrated strong capability to identify renal injury and serve as a noninvasive diagnostic tool for differentiating between infants that require early surgical intervention from those who would benefit from conservative approach

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El aumento creciente de la incidencia de Bordetella pertussis en poblaciones con elevada cobertura de vacunación ha puesto de manifiesto que las vacunas en uso presentan falencias que han cobrado importancia con el tiempo. Con el fin diseñar vacunas con mayor capacidad protectora nuestra investigación se ha orientado al estudio del fenotipo infectante. Parte de los esfuerzos en este sentido se han centrado en la identificación de los cambios fenotípicos inducidos en B. pertussis en respuesta a la falta de hierro libre, por ser éste el stress nutricional mas importante durante infección. Para ello se ha elegido una estrategia de trabajo que es una combinación de proteómica bidimensional comparativa y análisis serológico del proteoma. La ventaja de emplear esta estrategia es que permitió identificar potenciales factores de virulencia y, a la vez, seleccionar inmunógenos que se expresan en condiciones fisiológicas y que, sin embargo, no están incluidos en ninguna de las formulaciones vacunales en uso. En este trabajo de tesis, por un lado se amplió la caracterización del proteoma de B. pertussis cultivada bajo limitación de hierro mediante una proteómica shotgun, una técnica que presenta alta sensibilidad. Además se describen dos nuevos inmunógenos capaces de mejorar la protección conferida por la vacuna acelular actualmente en uso.