Doctora en bioquímica / El Quorum Sensing (QS) es un sistema de comunicación bacteriana capaz de regular varios procesos celulares dependientes de la densidad de la población microbiana. En bacterias Gram-negativas esto ocurre mediante la producción, por parte de las bacterias, de moléculas señal autoinductoras (AI) de tipo acil homoserina lactonas (AHLs). La liberación de AHLs hacia el exterior de la célula provoca un aumento de su concentración, lo que es detectado por la población bacteriana generando como respuesta una regulación de la expresión de ciertos genes (regulón QS). Nuestro laboratorio ha estudiado e identificado un sistema QS funcional en la cepa ATCC 23270T de Acidithiobacillus (At.) ferrooxidans. Este sistema QS está compuesto principalmente por dos elementos: AfeI, una proteína AHL sintasa codificada por el gen afeI y AfeR, un regulador transcripcional de la familia LuxR codificado por el gen afeR. Además, mediante el uso de análogos sintéticos de AHLs revelamos que las moléculas de QS de tipo AHLs (OH-C14-AHL, OH-C12-AHL y tetrazol) modulan la adherencia a mineral, como pirita y cupones de azufre, de At. ferrooxidansT. En esta investigación nos planteamos identificar los genes que son regulados por QS en At. ferrooxidansT, y en particular definir aquellos que están relacionados con la formación de biopelículas. Nuestra hipótesis postula que los análogos sintéticos de AHL inducen el sistema QS. Así, nosotros proponemos modular la adherencia sobre el sustrato mineral de At. ferrooxidansT a través del uso de estas moléculas. La utilización de ellas permitirá caracterizar el regulón QS en esta cepa bacteriana mediante análisis transcriptómicos. La identificación de análogos sintéticos de AHLs que favorecen la adherencia a cupones de azufre de At. ferrooxidansT nos permitió estudiar el transcriptoma de este microorganismo en condiciones donde el regulón QS se encuentra estimulado. El análisis del transcriptoma de At. ferrooxidansT mediante la técnica de microarreglos de ADN en presencia o ausencia de un análogo sintético de AHLs nos permitió identificar el regulón QS y determinar aquellos genes relacionados con la formación de biopelículas. Este es el primer estudio de la expresión global de los genes de At. ferrooxidansT utilizando análogos sintéticos de AHLs como activadores del sistema QS. Esto permitió generar valiosa información respecto de la respuesta de estos microorganismos a estas señales de comunicación. Por consiguiente, la presente tesis respecto al estudio y caracterización del regulón QS, y en particular aquellos genes relacionados con la formación de biopelículas es el inicio de una serie de líneas de investigación, las cuales podrían ayudar a contribuir en la comprensión de cuáles y cómo son las condiciones fisiológicas de este microorganismo que favorecen el proceso de biolixiviación / Quorum sensing (QS) is a bacterial communication system capable of controlling several cellular processes dependent on the density of the microbial population. In Gramnegative bacteria, it occurs mainly through the production by bacteria of small diffusible signaling molecules, termed autoinducers (AI), of the acyl homoserine lactones type (AHLs). The release of AHLs outside the cell causes an increase in their concentration, which is detected by the bacterial population generating the regulation of the expression of several genes (regulon QS). Our laboratory has studied and identified a functional QS system in the Acidithiobacillus (At.) ferrooxidans ATCC 23270T type strain. The QS system is mainly composed of two elements: AfeI, an AHL synthase encoded by the afeI gene and AfeR, a transcriptional regulator of the LuxR family encoded by the afeR gene. Besides, by using synthetic analogs of AHLs (OH-C14-AHL, OH-C12-AHL and tetrazol), we have shown that AHL-type QS molecule analogs modulate adhesion of At. ferrooxidansT to minerals, such as pyrite, and sulfur coupons. In this research, we propose to identify the genes that are regulated by QS in At..ferrooxidansT, particularly those that are associated with biofilm formation. For this, we propose to modulate the adhesion of At. ferrooxidansT to mineral substrate through the use of a synthetic AHL analog. Our working hypothesis postulates that AHLs molecules induce the QS system, and that their use will allow the characterization of the QS regulon of this bacterial strain by transcriptomic analysis. The identification of synthetic AHLs improving adherence of At. ferrooxidansT on sulfur coupons allowed us to study the transcriptome of this organism in conditions in which QS regulon is stimulated. Transcriptome analysis of At. ferrooxidansT by the technique of DNA microarrays in the presence or absence of one of these AHLs synthetic analogues allowed us to identify the QS regulon and to determine genes involved in biofilm formation. This is the first study of global gene expression of At. ferrooxidansT using AHLs synthetic analogues as activators of the QS system. This allowed us to obtain valuable informations regarding the response of this organism to this communication signal. Therefore, this thesis on the study and characterization of the QS regulon, in particular those genes related to biofilm formation, is the beginning of a series of research lines, which could help to understand the At. ferrooxidans physiological conditions that improve bioleaching processes / Conicyt

Acidithiobacillus ferrooxidans es una de las principales bacterias ácidofilas y quimiolitoautotróficas involucradas en los procesos de biolixiviación. Esta bacteria Gramnegativa es capaz de oxidar tanto el ión ferroso (Fe2+), como compuestos reducidos del azufre con el objetivo de obtener energía para su crecimiento. La mayor parte de las bacterias biolixiviantes crecen adheridas a superficies de sustratos sólidos (minerales). A. ferrooxidans además es capaz de desarrollar biopelículas y exhibir modificaciones morfológicas durante el proceso de adherencia. La formación de biopelículas está regulada en diversas bacterias por el sistema de “Quorum Sensing” (QS). El QS es un proceso en el cual las bacterias se comunican con otras de su misma especie para coordinar su comportamiento y funcionar como un organismo multicelular. El QS regula diversos fenotipos los cuales son el resultado de cambios en la expresión de múltiples genes. Estos son cambios globales dependientes de una familia de reguladores transcripcionales llamadas proteínas tipo R. Este conjunto de genes que se activan o se reprimen en una condición determinada se denomina regulón. Para poder determinar qué genes forman parte de un regulón, se deben realizar experimentos de genómica y proteómica comparativa. Recientemente en nuestro laboratorio se ha caracterizado un sistema QS funcional del tipo AI-1 en la bacteria A. ferrooxidans. Sin embargo, aún no se han identificado ni los genes ni los fenotipos que este sistema regula. Por lo tanto, nos propusimos con esta tesis analizar los efectos sobre el patrón de expresión proteica de A. ferrooxidans de extractos de sobrenadantes de cultivo de A. ferrooxidans, AHLs sintéticas y sus análogos (aAHLs) mediante estudios proteómicos para indagar el regulón QS en esta bacteria. Estos experimentos fueron realizados en un fondo silvestre debido a que aún no se disponen de metodologías para manipular genéticamente a esta bacteria. Se observó que la adición de AHLs y aAHLs inducen cambios que se traducen en variaciones a nivel fisiológico (aumento de número de células), del medio (mayor oxidación de hierro y acumulación de azufre) y del patrón de expresión de proteínas. Otro punto abordado en esta tesis, fue determinar el efecto que tiene el Fe2+ sobre las AHLs producidas por la bacteria. Aparentemente el circuito regulatorio paradigmático de todos los sistemas de QS parece no ocurrir cuando A. ferrooxidans crece en un medio con hierro, puesto que tanto los niveles de AHLs como de transcrito del gen afeI son bajos en este medio de cultivo en comparación con azufre y tiosulfato. Por esta razón, nos propusimos estudiar cuál sería la posible explicación de este fenómeno. Experimentos preliminares nos llevaron a pensar que pudiese existir un putativo complejo entre hierro y AHLs. No es claro aún qué tipo de estructura forman las AHLs con hierro, pero sí es claro que estas moléculas autoinductoras son capaces de unirse al Fe2+ y alterar su patrón de migración en una cromatografía en capa fina (cambia la polaridad).