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Estudio de la Destinación Intracelular de la Polifenol Oxidasa de Chirimoya (Annona Cherimola) Mediante la Expresión Transitoria de Construcciones Quiméricas con la Proteína Verde FluorescenteMontes Serey, Christian Fernando January 2007 (has links)
Memoria para optar el título de Bioquímico / La chirimoya (Annona cherimola Mill.) es uno de los candidatos más atractivos para su procesamiento por corte fresco en la nueva industria alimenticia. Sin embargo, este fruto presenta una marcada tendencia al pardeamiento, proceso en el que se ha descrito estar involucrada la enzima polifenol oxidasa (PPO). Resultados recientes nos han permitido definir la secuencia génica completa responsable de la síntesis de PPO en chirimoyas (Acppo). La proteína deducida desde esta secuencia (AcPPO) presentó dos codones de inicio candidatos (ATG), lo que llevó a un complejo análisis bioinformático sobre el significado de los aminoácidos encontrados en el extremo N-terminal de la proteína predicha.
En este trabajo, se describe un análisis funcional detallado de las secuencias N-terminal de AcPPO y su importancia en los eventos post-traduccionales relacionados a la destinación sub-celular final de la proteína propuesta. Se fusionaron al gen reportero GFP, las dos zonas candidatas a señal (definidas por estas metioninas) encontradas en el extremo N-terminal de AcPPO, junto con la secuencia completa y los respectivos controles. Las construcciones desarrolladas se evaluaron por transformación vía Agrobacterium tumefaciens e infiltración de plantas de Nicotiana tabacum, para evaluar la emisión de fluorescencia debido a GFP a través de microscopía confocal.
Los resultados indicaron que, efectivamente, el péptido definido como N-terminal de AcPPO posee la propiedad de dirigir GFP (y por lo tanto PPO) hacia cloroplastos, determinándose la existencia de una secuencia mínima necesaria para que esto ocurra (péptido CLORO). Esto demuestra experimentalmente, la idea previa de que AcPPO es destinada hacia cloroplasto / Cherimoya (Annona cherimola Mill.) fruit is an attractive candidate for food processing applications as fresh cut. However, it has a marked susceptibility to browning and this condition is mainly attributed to polyphenol oxidase activity (PPO). Recent work has allowed us the cloning, sequencing and experimental analysis of the full length Acppo gene. The predicted protein (AcPPO) presented two candidates ATG starting codons, generating a complex N-terminal analysis about the real compartmentalization of the enzyme by simple bionformatic processing of the sequences.
A detailed functional analysis of the post-translational events involved in the final AcPPO sorting and cell distribution, was carried out by fusion of the two putative N-terminal signals found in AcPPO, to the green fluorescent protein (GFP) gene. Constructs either with the full-length (first ATG) or the second-half (second ATG) segment of the N-terminal peptide, were separately studied in transient expression assays. Agrobacterium tumefaciens infections with clones harboring these constructs on Nicotiana tabacum leaves were then evaluated by confocal microscopy. The existence of a minimal sequence in this N-terminal segment of the gene needed to direct AcPPO into chloroplasts was well established, supporting the idea that the cloned gene generates a protein that is sorted into these organelles
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NADPH Oxidase 2-A novel regulator of molecular responses to exerciseHenríquez Olguín, Carlos January 2018 (has links)
Doctor en ciencias Biomédicas / Physical activity plays a protective role in the development of chronic non-communicable diseases.
Molecular adaptations explain the beneficial effects of exercise in diverse tissues such as skeletal
muscle, adipose tissue, and heart. One of the multiple signals involved in the benefits of exercise are
the oxidation-reduction reactions called redox signaling. Reversible and non-reversible
posttranslational modifications of cysteine residues are capable of changing the function, localization,
or stability of diverse proteins. In skeletal muscle, reactive oxygen species (ROS) are continuously
produced and cleared during resting and contracting conditions. There is substantial evidence
indicating that redox signaling plays a role in some of the health-benefits elicited by endurance
training, however, the precise mechanism has been long unknown.
The aim of the current Ph.D. thesis was therefore to study the involvement of NOX2 and redox signals
in the regulation of exercise-stimulated glucose transport and adaptive gene expression in mature
skeletal muscle. A combination of pharmacological inhibitors and murine NOX2-deficient models
were used to address the necessity of NOX2 for glucose transport and adaptive signals induced by
acute exercise. The current Ph.D. thesis demonstrated for the first time that NOX2 is activated during moderateintensity
endurance exercise in skeletal muscle and it is a major source of ROS under those conditions.
Furthermore, the analyses of genetic mouse models lacking the regulatory NOX2 subunits p47phox
and Rac1 revealed striking phenotypic similarities, including severely impaired exercise-stimulated
glucose uptake and GLUT4 translocation, indicating that NOX2 is a requirement for this classic acute
myocellular adaptation to exercise.
Overall, NOX2 is thus a major ROS source regulating adaptive responses to exercise in skeletal
muscle. / La actividad física juega un papel protector en el desarrollo de enfermedades crónicas no
transmisibles. Las respuestas moleculares explican los efectos beneficiosos del ejercicio en diversos
tejidos como el músculo esquelético, el tejido adiposo y el corazón. Una de las múltiples señales
involucradas en los beneficios del ejercicio son las reacciones de oxidación-reducción llamadas
señalización redox. Las modificaciones postraduccionales reversibles e irreversibles de residuos de
cisteína son capaces de cambiar la función, localización o estabilidad de diversas proteínas. En el
músculo esquelético, las especies de oxígeno reactivo (ROS) se producen y eliminan continuamente
durante las condiciones de reposo y contracción. Existe evidencia sustancial que indica que la
señalización redox juega un papel en algunos de los beneficios para la salud provocados por el
entrenamiento de resistencia, sin embargo, el mecanismo preciso ha sido desconocido durante mucho
tiempo. El objetivo de la presente la tesis fue estudiar la participación de NOX2 en la regulación del transporte
de glucosa durante el ejercicio y la expresión de genes adaptativos en el músculo esquelético adulto.
Se utilizó una combinación de inhibidores farmacológicos y modelos deficientes en NOX2 ratón para
abordar la necesidad de NOX2 para el transporte de glucosa y las señales adaptativas inducidas por
el ejercicio agudo.
Esta tesis demostró por primera vez que el NOX2 se activa durante el ejercicio de resistencia de
intensidad moderada en el músculo esquelético y es una fuente importante de ROS en esa condición.
Además, los análisis de modelos de ratones genéticos que carecen de las subunidades reguladoras
NOX2 p47phox y Rac1 revelaron sorprendentes similitudes fenotípicas, incluida la captación de
glucosa estimulada por el ejercicio y la translocación de GLUT4, lo que indica que NOX2 necesaria
para esta respuesta fisiológica durante el ejercicio.
En resumen, NOX2 es, por lo tanto, una importante fuente de ROS que regula las respuestas de
adaptación al ejercicio en el músculo esquelético. / 22/03/2020
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Participación de NAD(P)H oxidasa4 y quinasa c-Jun N-terminal en la diferenciación miofibroblástica de fibroblastos mamarios humanos en respuesta al factor de crecimiento transformante-[beta]1Toyos Riera, Marcela Alejandra January 2013 (has links)
Los tumores de mama pertenecen a un grupo de lesiones neoplásicas denominadas tumores desmoplásicos que, bajo la influencia de ciertos factores epiteliales, originan una estructura estromal rígida responsable de la consistencia dura de la masa tumoral. Este proceso fibrótico ocurre en etapas tempranas de la enfermedad, es controlado por una forma de fibroblastos conocidos como miofibroblastos, o fibroblastos activados, y sus mecanismos son pobremente comprendidos. La activación del tejido estromal es una etapa fundamental en la progresión tumoral, permitiendo tanto la adquisición de propiedades malignas en células epiteliales, como la capacidad invasiva y metastásica. En esta memoria de título estudiamos la miodiferenciación de fibroblastos mamarios no tumorales RMF-EG, frente al estímulo de TGF-β1, secretado por células tumorales y que es abundante en el microambiente tumoral.
Los resultados mostraron que 5ng/mL de TGF-β1 aumentó la expresión de actina α-SMA, marcador de miofibroblastos, y de CTGF, molécula asociada a diversos desórdenes fibróticos. A través del uso del inhibidor DPI y el knock-down de NOX4 demostramos que TGF-β1 promovió un ambiente oxidativo que favoreció la miodiferenciación fibroblástica de células RMF-EG.
Determinamos también que TGF-β1 activó la ruta de señalización JNK1,2 y que esta activación era fundamental para el aumento de la expresión de CTGF, NOX4 y α-SMA. Estudiamos la influencia de la activación de esta ruta alternativa junto con el aumento del tenor oxidativo, sobre la activación de la ruta canónica Smad2,3. Los resultados mostraron que el aumento en la expresión de NOX4 y la fosforilación de JNK1,2 actuaban de manera sinérgica para activar la ruta Smad2,3. En conjunto, estos resultados demuestran que TGF-β1 provoca la miodiferenciación de fibroblastos no tumorales, a través de un mecanismo que requiere de la activación de JNK1,2, el aumento temprano de la expresión de CTGF y NOX4 con un consecuente aumento de los niveles intracelulares de ROS. / Memoria para optar al título de Bioquímico / Brest tumors belong to a group of neoplastic lesions known as desmoplastics or scirrhous tumors which, under the influence of tumor cell factors, originate a fibrous structure responsible for the hard consistency of the tumor mass. This fibrotic process occurs during early stages of the disease, it is orchestrated by activated fibroblast i.e. myofibroblast and its mechanisms are poorly understood. Activation of the stromal compartment is a critical step in tumor progression, enabling the epithelial acquisition of malignant properties, such as invasive and metastatic capacities. In the present study, we investigated the myofibroblastic differentiation of normal human mammary fibroblast RMF-EG, induced by TGF-β1, a growth factor secreted by tumor cells and abundant in tumor microenvironment.
Our results reveal that a 5ng/mL TGF-β1 stimulus increased the expression of myofibroblast marker α-SMA and CTGF, a molecule associated to several fibrotic disorders. Using a NOX inhibitor (DPI) and a siRNA for NOX4, we demonstrated that TGF-β1 promoted an oxidative environment that favors myofibroblastic differentiation of RMF-EG cells.
We also determined that TGF-β1-dependant activation of JNK1,2 was essential for CTGF, NOX4 and α-SMA increased expression. We assessed the influence of JNK1,2 activation and NOX4 activity on canonical Smad2,3 activation. Our results reveal that the TGF-β1-dependant increase of NOX4 expression and JNK1,2 phosphorylation induced a synergical activation of the canonical TGF-β1 pathway, Smad2,3.Taken together, these results demonstrate that TGF-β1 promotes myofibroblastic differentiation of normal fibroblasts RMF-EG through a mechanism that requires JNK1,2 activation, early increase of CTGF and NOX4 expression with a consequent increase of intracellular ROS levels
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Determinación de carbohidratos en jugos de fruta con electrodos enzimáticosRistoff, María Emilia 22 November 2013 (has links)
El objetivo general de la presente tesis fue el diseño y la construcción de un biosensor amperométrico para determinar glucosa en jugos de fruta (utilizando el de manzana como modelo) que sea económico, de fácil construcción y que tenga respuesta rápida. Con tal fin se construyó un electrodo de pasta de carbono que consistió en un cilindro de teflón con un contacto eléctrico de acero inoxidable. Los materiales de la pasta de carbono fueron una mezcla de polvo fino de grafito y parafina, a los cuales se agregó la enzima glucosa oxidasa (GOx) y el ferroceno, como mediador. Se estudiaron diferentes condiciones de operación del biosensor tales como el pH del medio de reacción, el potencial aplicado y la carga de enzima en la pasta de carbono, siendo las condiciones óptimas seleccionadas: medio de reacción (buffer de fosfatos pH 7), potencial de trabajo (0.16 V) y carga enzimática (10%).
Se determinó la actividad enzimática de la enzima tanto libre como luego del proceso de inmovilización, y se estudió la cinética de la enzima en el electrodo, la cual se corresponde con la cinética típica de Michaelis-Menten, siendo los valores de los parámetros cinéticos k’m= 0.0195 M e imax= 35.5 μA.
A continuación se construyó la curva de calibración cuyo intervalo lineal de concentraciones de glucosa fue de 0.1 mM a 4.48 mM, con una sensibilidad de 0.61 μA/mM y un valor del límite de detección de 0.05 mM, valores completamente aceptables para el biosensor en cuestión. También se evaluaron características del sensor como su tiempo de respuesta, que fue menor a 12 segundos en todos los casos y la repetibilidad y la precisión intermedia dando en ambos casos muy buenos resultados.
Posteriormente se evaluó la estabilidad del sensor bajo diferentes condiciones de almacenamiento con y sin inmersión en la solución buffer y tanto bajo refrigeración como a temperatura ambiente. Todos los resultados fueron altamente satisfactorios y concuerdan con los esperados para el biosensor y más aún teniendo en cuenta la simpleza respecto de los materiales empleados y a la construcción del mismo.
Otro estudio fue la evaluación de las interferencias debidas a sustancias electroquímicamente activas en el jugo de fruta, en este caso de manzana, que puedan afectar a la señal de la glucosa. Como posibles interferentes se estudiaron: ácido ascórbico, sacarosa, fructosa, almidón, ácido málico y ácido cítrico. Sólo el ácido ascórbico fue una sustancia interferente, debiendo eliminarse este compuesto del jugo como paso previo a la determinación de glucosa con el biosensor. Se estudiaron dos técnicas de eliminación: eliminación enzimática del ácido ascórbico y eliminación por oxidación directa con oxígeno del aire ambiente. Ambas técnicas dieron excelentes resultados en la eliminación de este compuesto.
Finalmente se procedió a la determinación de glucosa en muestras reales, para lo cual se emplearon dos jugos de manzana: uno comercial y uno concentrado obtenido directamente de fábrica. Para validar los resultados obtenidos con el biosensor se utilizó un glucómetro digital. En todos los casos los errores en las determinaciones respecto a los valores obtenidos con el glucómetro fueron menores al 4%, lo que indica el muy buen desempeño del biosensor. / The main objective of the present Thesis was the design and construction of an amperometric biosensor to determine glucose in fruit juices (using apple juice as a model), considering this type of bio-electrodes are relatively cheap, simple to develop, set up and run and characterized by a fast response. The used carbon paste electrode consisted in a Teflon cylinder with stainless steel electric contact. Carbon paste was a mixture of graphite in fine powder and liquid paraffin, to which the enzyme glucose oxidase (GOx) and ferrocene as mediator was added. Several operation conditions were studied such as reaction medium pH, working potential and enzymatic load in the carbon paste, being the optimal conditions selected phosphate buffer (pH 7) as reaction medium, a working potential of 0.16 V, and 10% enzymatic load.
Enzymatic activity of both free enzyme and enzyme after the immobilization process was determined. Furthermore the kinetic of the enzyme in the electrode was studied, and the result shows that it follows a typical Michaelis-Menten kinetic, with k’m= 0.0195 M and imax= 35.5 μA.
The calibration curve shown that the linear range of glucose concentration was in the range 0.1 mM to 4.48 mM, with a sensitivity of 0.61 μA/mM and a detection limit of 0.05 mM. These values are completely acceptable for this kind of biosensor. Sensor characteristics, including response time (<12 sec. in all cases), intermediate precision and repeatability were evaluated.
Stability of the sensor under different storage conditions was also evaluated. Results were highly satisfactory and consistent, considering used materials and simplicity of construction. Interferences from electrochemically-active substances in apple juice, which may affect glucose signal, were carefully considered. The possible studied interfering substances were: ascorbic acid, sucrose, fructose, starch, malic acid and citric acid. Only the ascorbic acid was observed to be an interfering substance, which must be removed from juice previously to the determination of glucose with the biosensor. Two removal techniques for ascorbic acid were assayed: enzymatic removal and elimination by direct oxidation with air. Both techniques showed to be appropriate for ascorbic acid elimination.
Finally, the determination of glucose in real samples was carried out, using two apple juices samples, a ready to drink commercial one, and a concentrated juice directly obtained from a factory. To validate the results obtained with the biosensor a digital glucometer was used. In all cases the errors in the determinations were lower than 4%, demonstrating the very good performance of the biosensor.
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Efectos de la deficiencia aislada y simultánea de hierro y cobre sobre la actividad de la citocromo C oxidasa del musculo esquelético en ratas.Iannacone Silva, Eleana Pilar January 2014 (has links)
El hierro y el Cobre son dos micronutrientes necesarios para la generación de energía en nuestro organismo y los encontramos como componentes estructurales y funcionales de la citocromo c oxidasa, ubicada en la membrana interna de la mitocondria, sitio de producción de adenosintrifosfato para la actividad del músculo esquelético. Objetivo: Demostrar que la deficiencia simultánea de hierro y cobre disminuye la actividad de la citocromo c oxidasa del músculo esquelético en ratas. Diseño de investigación: Analítico, Experimental, prospectivo de causa - efecto, transversal. Metodología: Se utilizaron ratas de la raza Holtzman, machos de 21 días de edad, destetadas, las cuales fueron distribuidas en forma aleatoria en 4 grupos de 7 animales cada uno según las características de la dieta: grupo control (valores de hierro y cobre, 50mg/kg de dieta y 6 mg/kg de dieta, respectivamente), grupo deficiente de hierro (valor de hierro fue de 6mg/kg de dieta), grupo deficiente de cobre (valor de cobre fue de 1 mg/kg de dieta) y grupo deficiente en hierro y cobre (valores de hierro y cobre, 6 mg/kg de dieta y 1mg/kg de dieta, respectivamente) por 8 semanas, al término de este período los animales, previo ayuno de 14 horas, fueron anestesiadas con cloroformo. La sangre se extrajo por punción cardíaca y se procedió a la extracción del músculo cuadríceps de la extremidad posterior para proceder al homogenizado y así obtener la fracción mitocondrial, y realizar la medición de la actividad de la citocromo c oxidasa, que fue estudiada midiendo la disminución en la densidad óptica a 550nm del citocromo c reducido a medida que es oxidado por la enzima siguiendo el método de Prohaska y Wells. Análisis estadístico: Se aplicó la prueba de Kruskal-Wallis, luego para la comparación de medianas se utilizó la prueba no paramétrica de Mann-Whitney, para el procesamiento de datos se usó el programa SPSS v. 12.0 Resultados: Se encontraron diferencias estadísticamente significativas (p<0.05) en la actividad de la citocromo c oxidasa de músculo esquelético de ratas entre los grupos con dieta control comparado con la dieta deficiente en cobre (p=0,006), los grupos con dieta control comparado con la dieta con deficiencia simultánea de hierro y cobre (p=0,006), los grupos con dieta deficiente en hierro comparado con la dieta deficiente de cobre (p=0,009) y, los grupos con dieta deficiente de hierro comparado con la dieta con deficiencia simultánea de hierro y cobre (p=0,013). Conclusión: La actividad de la citocromo c oxidasa disminuye significativamente en la deficiencia simultánea de hierro y cobre seguida de la deficiencia de cobre.
Palabras clave: hierro, cobre, citocromo c oxidasa, músculo esquelético. / Iron and copper are two micronutrients necessary for the generation of energy in our body and are found as structural and functional components of cytochrome c oxidase, located in the inner membrane of mitochondria, adenosine triphosphate production site to active skeletal muscle. Objective: Demonstrate isolate and simultaneous iron and copper deficiency diets decrease cytochrome c oxidase activity in skeletal muscle of rats. Research Design: Analytical, experimental, transversal and prospective. Methodology: Male Holtzman rats , 21 days of age, were used and randomly assigned in 4 groups of 7 animals to a control diet (containing 50mg of iron/kg of diet and 6mg of copper/kg of diet), an iron-deficient diet (containing 6mg of iron/kg of diet), a copper-deficient diet (1mg of copper/kg of diet), or an iron and copper deficient diet (containing 6mg of iron/kg of diet and 1mg of copper/kg of diet), respectively. The rats were fed for eight weeks, after a 14 hours fast, were anesthetize with chloroform. The blood samples were taken by cardiac puncture, and cuadriceps muscles were dissected out for measurement of cytochrome c oxidase activity. Muscle homogenates were prepared in order to isolate mitochondria by differential centrifugation and then the cytochrome c oxidase activity was assayed by measuring the decrease in optical density at 550 nm of reduced cytochrome c as it is oxidized by the enzyme following the method of Prohaska and Wells. Statistical analysis: The Kruskal-Wallis test was applied, then nonparametric Mann-Whitney test was used to compare medians. Program SPSS v 12.0 was used for data processing. Results: Statistically significant differences (p <0.05)in the cytochrome c oxidase activity of skeletal muscle were found, between the control diet group compared with copper deficient diet group (p = 0.006), control diet group compared with simultaneous iron and copper deficiency diet (p = 0.006), iron deficient diet group compared with copper deficient diet group (p = 0.009),and iron deficient diet group compared with simultaneous iron and copper deficient diet group (p = 0.013). Conclusion: The cytochrome c oxidase activity decreased significantly in skeletal muscle of rats fed with simultaneous iron and copper deficient diet and copper-deficient diet.
Key words: Iron, Copper, Cytochrome c oxidase, skeletal muscle.
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Aproximación enzimática, molecular y proteómica al estudio de la podredumbre apical de tomate (Lycopersicon esculentum M.): implicación de polifenol oxidasa (PPO) y enzimas antioxidantesCasado Vela, Juan 09 July 2004 (has links)
No description available.
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Análisis funcional de las polifenol oxidasas (PPOs) de frutos de níspero (Eriobotrya japonica Lindl): desarrollo y aplicación de herramientas moleculares y proteómicasMorante Carriel, Jaime 27 July 2012 (has links)
No description available.
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Estudi dels mecanismes moleculars implicats en el dany vascular induït per l'activitat catalítica de la SSAO en el context de l'Angiopatia Cerebral Amiloide associada a la demència tipus AlzheimerSolé Piñol, Montserrat 24 July 2009 (has links)
L'amino oxidasa sensible a semicarbazida (SSAO) és un enzim localitzat en el teixit adipós, en el múscul llis i endoteli del sistema vascular, i en el plasma sanguini en forma soluble. Com a enzim metabolitza amines primàries, però desenvolupa també una funció insulinomimètica en teixit adipós i múscul llis, i una funció d'adhesió limfocitària a l'endoteli en situacions inflamatòries, on és coneguda com a Proteïna d'Adhesió Vascular 1 (VAP-1). El metabolisme dels seus substrats genera peròxid d'hidrogen, amoni i diferents aldehids en funció de l'amina metabolitzada. Aquests productes han estat associats a l'aparició de dany vascular en malalties en les que s'han detectat nivells incrementats d'activitat o expressió de la SSAO, com la diabetis, les aturades cardíaques o la malaltia d'Alzheimer (AD), però els mecanismes responsables d'aquest increment es desconeixen encara. En pacients d'AD, a més, s'han detectat increments d'expressió tissular i d'activitat plasmàtica d'aquest enzim. Per tal de poder estudiar aquesta proteïna in vitro, s'han generat i caracteritzat bioquímicament dues línies cel·lulars vasculars d'endoteli i múscul llis, transfectades de forma estable amb el gen de la SSAO/VAP-1 humana, ja que l'expressió d'aquesta proteïna es perd en cèl·lules en cultiu. Amb aquestes línies cel·lulars s'han estudiat els efectes dels productes generats pel metabolisme de la metilamina, un dels principals substrats fisiològics de la SSAO, en el context de l'Angiopatia Cerebral Amiloide associada a l'AD (CAA-AD). Els resultats han mostrat que els productes generats per l'activitat de la SSAO transfectada indueixen la mort apoptòtica de les cèl·lules de múscul llis. Aquesta mort és dependent de l'activitat transcripcional de p53, la qual provoca una desregulació del balanç Bax/Bcl-2 mitocondrial, una inducció de l'expressió de Puma-αi una activació de les caspases 9 i 3. D'altra banda, s'ha utilitzat el tractament amb el pèptid beta amiloide de 40 amino àcids amb la mutació Dutch (Aβ1-40 D) com a model de CAA-AD, patologia que cursa amb dipòsits d'Aβ i degeneració vasculars. En aquest model, l'Aβ provoca un increment de la SSAO endotelial, que es tradueix en l'aparició de citotoxicitat associada al metabolisme de la metilamina. A més, s'ha confirmat que l'activitat SSAO incrementa el dipòsit d'Aβ, i es descriu un nou paper de la SSAO en aquesta patologia, consistent en promoure el dipòsit d'Aβ mitjançant mecanismes independents de la seva activitat catalítica. Finalment, s'han determinat els nivells d'activitat SSAO plasmàtica en una mostra més gran de pacients d'AD que la utilitzada en un estudi anterior, i s'ha fet extensió d'aquest anàlisi a pacients afectats per altres demències amb afectació vascular com la demència vascular o la demència mixta. Els resultats han permès confirmar que l'augment plasmàtic d'SSAO nomes es produeix en condicions de demència severa en AD, de forma independent de l'edat i sexe dels individus. D'altra banda, no s'han observat canvis significatius en l'activitat SSAO de pacients afectats per altres demències; tot i així, aquests resultats no descarten una possible implicació de la SSAO en aquestes patologies, essent necessari l'anàlisi d'un grup de pacients amb demència severa en aquestes condicions així com l'anàlisi del teixit cerebrovascular d'aquests. Existeix, doncs, una implicació directa de l'activitat SSAO tant en la degeneració vascular associada a l'AD com en la deposició de l'Aβ. Aquests efectes poden ser rellevants durant tot el procés patològic, inicialment promovent la deposició d'Aβ, i en etapes més avançades en les que s'ha detectat un increment de la seva activitat en el plasma, contribuint també al dany vascular. Seran necessaris, però, estudis posteriors amb mostres de pacients per poder determinar la seva possible implicació en el dany vascular en altres demències. / Semicarbazide sensitive amine oxidase (SSAO) is an enzyme localized in adipocytes, in the smooth muscle and endothelial cells of vascular system, and in blood plasma as a soluble form. Besides its enzymatic function of primary amines metabolism, SSAO activity has also insulinomimetic effects in adipose and in smooth muscle tissues, and it behaves as vascular adhesion protein 1 (VAP-1) in endothelial cells under inflammatory conditions. The SSAO substrates oxidation generates hydrogen peroxide, ammonia and different aldehydes depending on the metabolized amine. These products have been related to the vascular damage observed in diseases where increased levels of SSAO plasma activity and/or tissue expression have been detected, as diabetes, congestive heart failure or Alzheimer's disease (AD). The mechanisms that induce this increase, however, are not fully understood. Moreover, increased SSAO tissue expression levels and plasma activity have been detected in AD patients. In order to perform in vitro studies with this protein, and due to the loss of SSAO expression in cell cultures, an endothelial and a smooth muscle cell line were transfected in a stable form with the human SSAO/VAP-1 gene. These cell lines were biochemically characterized and used to analyze the effect of methylamine oxidation products, as methylamine is one of the main physiological SSAO substrates, in the context of Cerebral Amyloid Angiopathy related to AD (CAA-AD). Results showed that the products generated by the transfected SSAO activity were able to induce the apoptotic cell death of the smooth muscle cells. This apoptotic cell death was p53 transcriptional activity-dependent, and it involved the mitochondrial apoptotic pathway through the Bax/Bcl-2 ratio deregulation, the Puma-α expression induction and the caspases 9 and 3 activation. On the other hand, treatment with the 40 amino acids length amyloid beta peptide containing the Dutch mutation (Aβ1-40 D) was used as CAA-AD model, which is characterized by vascular Aβ deposits and vascular degeneration as well. Results showed that Aβ treatment induced an increase of SSAO/VAP-1 protein amount in endothelial cells, which induced the appearance of methylamine oxidation-dependent cytotoxicity. Moreover, besides the confirmation that SSAO activity enhances the Aβdeposition, which was recently described, results revealed a new involvement of SSAO in the Aβ deposition process through enzymatic activity-independent mechanisms. Finally, the SSAO plasmatic activity was determined in a larger population of AD patients than the used in a previous study, and the analysis has been extended to patients afflicted by other dementias showing vascular damage such as vascular dementia or mixed dementia. The obtained results confirmed the increase of plasma SSAO activity only at severest dementia conditions, and that it was age and sex¬independent. However, SSAO activity levels did not show significant differences in increasing conditions of vascular dementia or mixed dementia. Even though, these results do not allow ruling out a possible involvement of SSAO in these pathologies, since severe groups of demented patients were not available. In the same way, the analysis of the cerebrovascular tissue of these patients would help giving us a final conclusion. In summary, the obtained results show a direct involvement of SSAO activity in the CAA-AD-related vascular degeneration as well as in Aβ deposition by activity¬dependent and independent mechanisms. Moreover, Aβdeposition increases the SSAO availability, thus reinforcing its toxic effect. These effects can become important during all the disease progression, enhancing the Aβ deposition at early stages, but also contributing to the vascular damage at advanced ones when SSAO activity is increased. Even so, it would be necessary to perform more studies on plasma human samples in order to determine its possible involvement in the vascular damage observed in other dementia conditions.
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Efectes de l'ostracisme i del gen de la monoamino-oxidasa A en una tasca experimental d'agressió en humansGallardo Pujol, David 22 October 2009 (has links)
L'any 2002, Caspi et al. informaren per primer cop d'una interacció entre un factor genètic concret (el gen de la monoamino-oxidasa A o MAOA) i un factor ambiental concret, el maltractament infantil, i de llurs efectes sobre el comportament antisocial en l'edat adulta. Aquest treball seminal originà posteriors recerques que tractaren de replicar aquesta interacció amb diferents mostres i metodologies. Tots aquests treballs, però, tenen en comú la utilització de dissenys correlacionals. És a dir, cap d'ells pot assegurar la causalitat dels efectes de la interacció genotip-ambient en el comportament antisocial. L'objectiu d'aquest treball és, principalment, replicar les troballes de Caspi et al. (2002) de forma experimental, mitjançant la utilització d'anàlegs de laboratori. Per una altra banda, la majoria de treballs no han trobat una relació directa entre el gen de la MAOA i l'agressió, però fins ara no havia estat estudiat el paper dels trets de personalitat com a possibles endofenotips que estiguin mediant en aquesta relació. Les hipòtesis d'aquest treball són dues, 1) que els subjectes portadors de l'al·lel de baixa activitat del gen de la MAOA sota una condició d'adversitat ambiental respondran de forma significativament més elevada en una tasca d'agressió experimental. Per contra, no hi haurà diferències entre aquells subjectes que no hagin estat exposats a adversitat ambiental en funció del seu genotip MAOA. 2) Els trets de personalitat "agressivitat" i "impulsivitat" tindran un paper significatiu en la relació entre genotip i fenotip (MAOA i agressió respectivament), essent els portadors de l'al·lel de baixa activitat del gen de la MAOA més agressius i impulsius i puntuant així més alt en la tasca d'agressió de laboratori. Per tal d'induir l'adversitat ambiental o ostracisme utilitzem la tasca Cyberball, genotipem als subjectes mitjançant procediments estàndard i com a variable dependent utilitzem una tasca d'agressió experimental anomenada Point Subtraction Aggression Paradigm (PSAP). Per tal de posar a prova la primera hipòtesi utilitzem una Anàlisi Multivariant de la Variància, i per tal de posar a prova la segona hipòtesi, un Model d'Equacions Estructurals. Els resultats ens indiquen que el gen de la MAOA no té cap efecte sobre la agressió mesurada segons el PSAP, mentre que l'ostracisme i la interacció entre ambdós sí, explicant un 30% de la variabilitat de l'agressió gràcies a les variables independents. Els resultats avalen la rèplica de les troballes de Caspi et al. en una situació controlada de laboratori. Així doncs, mitjançant un disseny experimental, aquest treball ha reproduït una interacció entre el gen de la MAOA i l'ostracisme i els seus efectes sobre l'agressió. D'altra banda, hem contrastat parcialment la segona hipòtesi del treball, trobant efectes indirectes del gen de la MAOA en l'agressió en el PSAP a través del tret de personalitat "impulsivitat". Com a conclusions generals, podem afirmar que el tipus de disseny que hem utilitzat en aquest treball podria generalitzar-se a d'altres formes d'interacció genotip-ambient que han estat detectades. Sens dubte, creiem que pot ésser una eina molt útil per a d'altres investigadors. També hem observat com és possible d'emprar variables de personalitat com a endofenotips. De fet, no només és possible sinó que creiem que és desitjable, per tal de reduir la distancia entre el genotip i el fenotip. / In 2002, Caspi et al. reported for the first time an interaction between a specific genetic factor (monoamine-oxidase A or MAOA gene) and a specific environmental factor, child abuse, and their effects on antisocial behavior in adulthood. This seminal work originated research that tried to replicate this interaction with different samples and methodologies. All these studies, however, have in common the use of correlational designs. The main aim of this study is mainly to replicate the findings of Caspi et al. (2002) experimentally. The hypotheses of this study are two, 1) that subjects carrying the low-activity allele of the MAOA gene under adverse environmental condition will respond significantly higher in the aggression experimental task. However, there won't be differences between those subjects that have not been exposed to environmental adversity regardless of their MAOA genotype. 2) Personality traits "aggressiveness" and "impulsiveness" will show a significant role in the relationship between genotype and phenotype (MAOA and aggression, respectively), being carriers of the low-activity allele of the MAOA gene more aggressive and impulsive, and thus scoring higher in the aggression task. We induced environmental adversity (ostracism) using the Cyberball task, genotype was obtained following standard procedures. As dependent variable we used the experimental aggression task Point Subtraction Aggression Paradigm (PSAP). Results indicate that MAOA gene has no effect on PSAP aggression, while the interaction between ostracism does have, explaining up to 30% of the variance. Thus, using an experimental design, this study has reproduced an interaction between the MAOA gene and environmental adversity and its effects on aggression. Furthermore, we found partial support for the second hypothesis, finding indirect effects of the MAOA gene on PSAP aggression via "impulsiveness". As a general conclusion, we can state that the type of design that we used in this study could be generalized to other forms of genotype-environment interaction that have been detected. Undoubtedly, we can be a useful tool for other researchers. We have also observed how it is possible to use variables as personality endofenotips. In fact, not only possible but believe it is desirable to reduce the gap between genotype and phenotype.
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Caracterización analítica de defensina-1 y actividad de glucosa oxidasa en miel como indicadores de la infección por Nosema ceranae en abejasCebrero Acuña, Gonzalo Felipe January 2018 (has links)
Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Magíster en Bioquímica área de especialización Bioquímica Ambiental y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Las abejas llevan a cabo el mayor porcentaje de polinizaciones, tanto de plantas silvestres como domésticas, lo que les otorga una función invaluable para el medio ambiente y los productores que se benefician de ellas. En los últimos años se ha visto disminuido notoriamente su número, representado por la cantidad de colonias perdidas después de la temporada de invierno. Las colonias están sufriendo un síndrome denominado Desorden de Colapso de Colmena (DCC) que consiste en el abandono repentino de la colmena por la mayoría de las abejas obreras. Hasta ahora no se ha podido describir ningún agente que por sí solo desencadene el síndrome, sin embargo, se ha atribuido relevancia a distintos factores que podrían tener influencia en este fenómeno. Algunos de estos factores son patógenos, parásitos y pesticidas. Nosema ceranae es un microsporidio que inicialmente se encontraba en la abeja melífera asiática (Apis cerana) y que en los últimos años ha infectado a la abeja melífera occidental (Apis mellifera). Estudios han relacionado la presencia de N. ceranae con colmenas afectadas por DCC, postulándolo como un factor importante en el desarrollo del síndrome. Individualmente, N. ceranae induce estrés metabólico e inmunosupresión en abejas melíferas, lo que finalmente podría afectar a la colmena comprometiendo así su inmunidad social. La inmunidad social corresponde al conjunto de respuestas que los organismos sociales presentan frente a un patógeno o amenaza, que comprende principalmente cambios en el comportamiento y secreciones en el alimento que producen (jalea real y miel). La miel, además de ser el alimento para las abejas de la colmena, posee actividad antimicrobiana debido a la presencia de peróxido de hidrógeno, generado por la enzima glucosa oxidasa (GOX), metilglioxal (en el caso de la miel de Manuka) y defensina-1, lo que contribuye a la inmunidad social de la colmena. Defensina-1 es un péptido con actividad antimicrobiana producido por distintos tejidos en la abeja melífera, incluyendo las glándulas hipofaríngeas y mandibulares, desde donde se secreta hacia la miel y la jalea real. En este estudio se propone que N. ceranae produce una inmunosupresión en abejas melíferas, lo que se traduciría en una menor generación de peróxido de hidrógeno y presencia de defensina-1 en la miel, indicando un compromiso de su inmunidad social. Dado lo anterior, la hipótesis propuesta es “La miel producida por abejas de la especie Apis mellifera infectadas con el microsporidio Nosema ceranae contiene menor cantidad del péptido antimicrobiano defensina-1 y una actividad de glucosa oxidasa disminuida en relación a la producida por abejas no infectadas.” Los objetivos generales de la tesis fueron: A) Relacionar la presencia del péptido antimicrobiano defensina-1 y la actividad de glucosa oxidasa en miel con la infección por Nosema ceranae en abejas y; B) Contar con métodos de análisis simples para establecer la presencia de defensina-1 en miel basados en espectroscopía molecular. Para ello se obtuvo la fracción comprendida entre 3 y 10 kDa de muestras de miel obtenidas desde el valle central de la región de O’Higgins. Esta fracción se caracterizó mediante fluorescencia y resolución multivariada de curva (MCR), lo que permitió evidenciar la presencia de la defensina por detección del triptófano presente en el péptido. Además, en esta fracción se determinó la presencia de enlaces disúlfuro, asociados a la estructura de la defensina, cuya concentración estuvo correlacionada con la concentración relativa de triptófano en la misma. En la miel no fraccionada se determinaron la actividad de GOX y la actividad antibacteriana, las que estuvieron relacionadas con el contenido relativo de defensina-1. Por otra parte, se expresó y purificó defensina-1 recombinante desde E. coli la que fue sometida a la misma caracterización y/o análisis de la miel fraccionada, permitiendo así tener un patrón de comparación. Paralelamente se determinó la presencia de N. ceranae en las abejas de las colmenas muestreadas mediante recuento de esporas en el microscopio y amplificación de su material genético a través de PCR en tiempo real. Al evaluar el conjunto de resultados se observó que la miel producida por abejas infectadas o que habían sufrido una reciente infección con Nosema spp contenía mayor cantidad de defensina-1 y mayor acumulación de peróxido de hidrógeno en relación a la producida por abejas no infectadas, lo que demuestra que la infección habría inducido una mayor producción del péptido y GOX siendo reflejado en la miel. Esto último se contrapone a la hipótesis planteada inicialmente. Sin embargo, las mieles que presentaron esta relación tienen además un origen geográfico y floral común; lo que igualmente podría ser la causa de la relación observada o que la defensina-1 y GOX se expresen constitutivamente en mayor cantidad en estas colonias, presentando así una ventaja genética sobre otras ante posibles infecciones / Honey bees are responsible of the highest percentage of pollination, including wild and domesticated plants, which gives them a priceless function for environment and producers who benefit from them. In recent years their number has been reduced, represented in the loss of colonies after winter season. Colonies are suffering a syndrome called Colony Collapse Disorder (CCD) which consists in the sudden abandonment of the colony by most of the worker bees. Until now there is no agent described that can trigger the syndrome by itself, however, several factors have been attributed to influence in this phenomenon. Some of these factors are pathogens, parasites and pesticides. Nosema ceranae is a microsporidian which was founded at first in the Asiatic honeybee (Apis cerana) and in the last years has infected the European honeybee (Apis mellifera). Studies have related de N. ceranae presence in bee hive affected by CCD, postulating it as an important factor in the development of this syndrome. Individually, N. ceranae induce metabolic stress and immunosuppression in honeybees, compromising the social immunity. Social immunity is the group of responses that social organisms have developed against a pathogen or threat, includes mainly behavior changes and secretions to the food produced (royal jelly and honey). The honey is the food for hive’s bee and has antimicrobial activity due to the presence of hydrogen peroxide, generated by glucose oxidase enzyme (GOX), methylglyoxal (in manuka honey) and defensin-1, which contributes to the social immunity of the hive. Defensin-1 is a peptide with antimicrobial activity produced by several cell types in the honey bee, including hypopharyngeal and mandibular glands, from where it is secreted towards honey and royal jelly. In this study, it is proposed that N. ceranae produces an immunosuppression in honey bees, which would result in a lower generation of hydrogen peroxide and the presence of defensin-1 in honey, indicating a compromise of their social immunity. Given the last, the proposed hypothesis is "The honey produced by bees (Apis mellifera) infected with Nosema ceranae contains less antimicrobial peptide defensin-1 and decreased glucose oxidase activity in relation to that produced by non-infected bees." The general objectives of the project are: A) To relate the presence of the antimicrobial peptide defensin-1 and the activity of glucose oxidase in honey with the infection by Nosema ceranae in bees and; B) Have simple analysis methods to establish the presence of defensin-1 in honey based on molecular spectroscopy. For this, the fraction comprised between 3 and 10 kDa of honey samples from the central valley of the O'Higgins region was obtained. This fraction was characterized by fluorescence and multivariate curve resolution (MCR), which allowed to demonstrate the presence of the defensin by detection of tryptophan present in the peptide. In addition, in this fraction the presence of disulfide bridges, associated with the structure of the defensin, whose concentration was correlated with the relative concentration of tryptophan in it, was determined. In the unfractionated honey, GOX activity and antibacterial activity were determined, which were related to the relative content of defensin-1. On the other hand, recombinant defensin-1 was expressed and purified from E. coli which was subjected to the same characterization and/or analysis of the fractionated honey, thus allowing to have a comparison pattern. In parallel, the presence of N. ceranae in the bees of the sampled hives was determined by counting the spores in the microscope and amplifying their genetic material through real-time PCR. When evaluating the set of results, it was observed that the honey produced by bees infected or that had suffered a recent infection with Nosema spp contained a greater amount of defensin-1 and a greater accumulation of hydrogen peroxide in relation to that produced by non-infected bees. Results show that the infection would have induced a higher production of the peptide and GOX being reflected in the honey. These results are the opposite of the proposed hypothesis. However, the honeys that presented this relationship also have a common geographical and floral origin; what could equally be the cause of the observed relationship or that defensin-1 and GOX are constitutively expressed in greater quantity in these colonies, thus presenting a genetic advantage over others in the face of possible infections / Fondecyt
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