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Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica área de especialización en Bioquímica Ambiental y Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / Chile en particular es uno de los países del mundo que alberga una mayor variedad de ecosistemas considerados extremos, por tener condiciones hostiles para la vida. Estas condiciones suponen un obstáculo al cual los organismos que los habitan deben sobreponerse adoptando distintas estrategias de supervivencia. Uno de estos ambientes extremos son los sistemas hidrotermales que se encuentran repartidos a lo largo de toda nuestra geografía. En muchos de los sistemas termales de todo el mundo con la característica de poseer un pH neutro o alcalino, se ha descrito a las cianobacterias de la subsección V (Stigonematales) como uno de los principales organismos que impactan los ciclos biogeoquímicos sobre todo del carbono y nitrógeno. La adaptación a las altas temperaturas de este grupo tan relevante de microorganismos en estos sistemas no ha sido todavía muy estudiada. Una de las posibles causas que hasta la fecha no ha sido explorada, y que podría explicar esta adaptación, es el efecto positivo de su asociación con cianofagos, virus de DNA de doble hebra que las infectan. En otros ecosistemas acuáticos como el marino, se ha sugerido que la interacción cianofago-cianobacteria implica una marcada co-evolución por parte de ambos, lo que tiene un impacto ecológico preponderante. En ambientes marinos los cianofagos han sido estudiados tanto morfológica como filogenéticamente utilizando diversos marcadores moleculares y métodos de observación, mientras que estas metodologías no se han aplicado en relación a la caracterización de cianofagos en sistemas hidrotermales. Debido a este vacío en la literatura en relación a los cianofagos de sistemas termales, es que en el presente proyecto se plantea caracterizar la diversidad tanto morfológica como filogenética de cianofagos presentes tanto en muestras naturales como en aislados en cultivo de cianobacterias del sistema hidrotermal de Porcelana, localizado (42º 27’ 29.1’’S - 72º 27’ 39.3’’O) en la Patagonia norte de Chile (X Región de los Lagos). En este sistema termal prístino, se ha identificado la presencia (Mackenzie et al. 2013) y aislado en cultivo (Alcamán et al. 2017) de cianobacterias de la subsección V. Los miembros de este grupo son dominantes en los tapetes microbianos a temperaturas entre 40°C y 60ºC en este sistema. Se llevarán a cabo análisis morfológicos y estructurales mediante microscopía electrónica (TEM), así como análisis basados en marcadores genéticos como el gen g20 (correspondiente a una proteína de ensamblaje de la cápside viral), psbA (gen de proteína de fotosistema), g23 (codifica para MCP, proteína mayor de la cápside), dnapol (DNA polimerasa), entre otros; análisis de secuencias encontradas en los metagenomas, metatranscriptoma y metaviroma, y en el genoma de los aislados para la detección de profagos. Los resultados que se obtengan en este estudio particular en la terma Porcelana se espera proporcionen la primera información que ayude a identificar los principales cianofagos asociados a cianobacterias termófilas de la subsección V, ayudando así a dilucidar su rol ecológico en este sistema y quizás en muchos otros sistemas termales similares a este repartidos por todo el mundo / Chile in particular is one of the countries in the world that shelters a greater variety of ecosystems considered extreme, because of their hostile conditions to life. These conditions constitute an obstacle to which the organisms that inhabit them must overcome by adopting different strategies of survival. One of these extreme environments are hydrothermal systems that are distributed throughout our geography. In many of the thermal systems of the world with the characteristic of having a neutral or alkaline pH, subsection V cyanobacteria (Stigonematales) have been described as one of the main organisms impacting the biogeochemical cycles, especially carbon and nitrogen. The adaptation to the high temperatures of this group of relevant microorganisms in these systems has not yet been studied. One of the possible causes that until now has not been explored, and which could explain this adaptation is the positive effect of its association with cyanophages, double-stranded DNA viruses that infect them. In other aquatic ecosystems such as the marine, it has been suggested that the cyanophage-cyanobacteria interaction implies a marked co-evolution, which has a preponderant ecological impact. In marine environments, cyanophages have been studied both morphologically and phylogenetically using different molecular markers and observation methods, whereas these methodologies have not been applied in relation to the characterization of cyanophages in hydrothermal systems. The lack of information in the literature regarding on cyanophages of thermal systems, the present project aims to characterize the morphological and genetic diversity of cyanophages present in both natural and cyanobacterial culture isolates of the Porcelana hydrothermal system, located (42º 27 '29.1''S - 72º 27 '39.3''O) in the northern Patagonia of Chile (X Region de los Lagos). In this pristine thermal system, the presence (Mackenzie et al. 2013) and isolated in culture (Alcamán et al. 2017) of subsection V was identified. The members of this group are dominant in the microbial mats at temperatures between 40°C And 60°C in this system. Morphological and structural analyzes will be performed using electron microscopy (TEM), as well as analyzes based on genetic markers such as the g20 gene (corresponding to a viral capsid assembly protein), psbA (photosystem protein gene), g23 (Major capsid protein), dnapol (DNA polymerase), among others; analysis of sequences found in metagenomes, metatranscriptome and metavirome, and in the genome of the isolates for the detection of prophages. The results obtained in this particular study in the Porcelana termal system are expected to provide the first information that will help to identify the main cyanophages associated to thermophilic cyanobacteria of subsection V, helping to elucidate their ecological role in this system and perhaps in many other thermal systems similar to this one, spread all over the world

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Magíster en Bioquímica área de Especialización Bioquímica Ambiental y Memoria para optar al Título de Bioquímico / 1.- RESUMEN Durante la generación de electricidad en sistemas de Celda de Combustible Microbiológicas (MFC, por su sigla en inglés), se han manipulado distintas vías metabólicas para generar un aumento en la bioelectricidad, debido a que los electrones necesarios para este proceso provienen del poder reductor generado dentro de la célula. Esto no solo se ha estudiado en cepas electrogénicas como lo son Geobacter o Shewanella, sino que también se han realizado estudios en Escherichia coli, la cual puede transferir electrones a un electrodo a través de un mediador. Estos últimos años, la investigación se ha centrado específicamente en la manipulación cofactores, principalmente el NADH. En estos casos, alteran tanto vías de consumo como de generación de este cofactor, pero evalúan principalmente la eficiencia de esta modificación en el voltaje, la corriente o en la potencia producida. Sin embargo, pocas veces consideran observar los factores intrínsecos de la bacteria que están produciendo estas mejoras. Debido a esto, en este trabajo se utilizó una MFC con distintas cepas de E. coli con el mediador rojo neutro para observar no solo los cambios en la generación de corriente, sino que también, el consumo de la fuente de carbono (glucosa en este caso), rendimiento, y flujo de electrones en estos cultivos electrogénicos. Esto ayudó a comprender en parte lo que puede estar pasando en el metabolismo bacteriano durante el proceso de generación de corriente. Las cepas utilizadas fueron la cepa de E.coli K-12 MG1655, la cepa NAD-G6PDH la cual presenta un cambio en la especificidad de cofactor de la enzima G6PDH (en la cepa silvestre utiliza NADP+ , en este caso utiliza NAD+), la cepa Δpgi (con la deleción del gen que codifica la enzima fosfogluco isomerasa) y la cepa Δpgi-NAD-G6PDH que posee las dos mutaciones mencionadas. Finalmente, el trabajo demostró que las cepas MG1655 y NAD-G6PDH, que presentan más NADH, generan mayor electricidad en el tiempo que las cepas que tienen la mutación Δpgi. No obstante, el flujo de los electrones de todas las cepas fue similar, ya que no se observaron diferencias significativas. Además, se observó que la cepa Δpgi podría poseer un mejor rendimiento de mmoles de electrones por mmoles de glucosa consumida que las otras cepas, ya que produce una corriente relativamente alta para la poca biomasa y el bajo consumo de glucosa. / During the electricity generation in Microbiological Fuel Cell (MFC) systems, different metabolic pathways have been manipulated to generate an increase in the bioelectricity since the electrons needed for this process come from the reducing power generated inside the cell. This has not only been studied in electrogenic strains such as Geobacter or Shewanella, but also studies have been carried out in Escherichia coli, which can transfer electrons to an electrode through a mediator. Over the last few years, the research has focused specifically on the manipulation of cofactors, mainly in NADH. In these cases, they alter both consumption and generation pathways of this cofactor, but they mainly evaluate the efficiency of this modification in the voltage, the current or the power produced. However, they rarely consider observing the intrinsic factors of the bacteria that are producing these improvements. Due to this, in this work we used an MFC with different strains of E. coli with the Neutral Red mediator to observe not only the changes in the current generation, but also the consumption of carbon source (glucose in this case), yields, and electron flux in these electrogenic cultures. This helped to partially understand what may be happening in the bacterial metabolism during the current generation process. The strains used in this work were E. coli strain K-12 MG1655, strain NAD-G6PDH, which shows a change in the specificity cofactor of the G6PDH enzyme (in the wild type strain uses NADP+, in this case uses NAD+), strain Δpgi (with a deletion of the gene encoding the phosphoglucose isomerase enzyme) and strain Δpgi-NAD-G6PDH that possesses the two mentioned mutations. Finally, the work demonstrated that the strains MG1655 and NAD-G6PDH that present more NADH generate higher current per time than the strains that have the Δpgi mutation. Nevertheless, the electrons flux of all the strains was similar, since no significant differences were observed. In addition, it was observed that the strain Δpgi could have a better yield of mmol of electrons per mmol of consumed glucose than the other strains, since it produces a relatively high current for the low biomass and the low glucose consumption / PAIFAC 2016. Fac Cs. (RC) y Proyecto ENL012/16.

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Magíster en Bioquímica área de especialización Bioquímica Ambiental y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Las abejas llevan a cabo el mayor porcentaje de polinizaciones, tanto de plantas silvestres como domésticas, lo que les otorga una función invaluable para el medio ambiente y los productores que se benefician de ellas. En los últimos años se ha visto disminuido notoriamente su número, representado por la cantidad de colonias perdidas después de la temporada de invierno. Las colonias están sufriendo un síndrome denominado Desorden de Colapso de Colmena (DCC) que consiste en el abandono repentino de la colmena por la mayoría de las abejas obreras. Hasta ahora no se ha podido describir ningún agente que por sí solo desencadene el síndrome, sin embargo, se ha atribuido relevancia a distintos factores que podrían tener influencia en este fenómeno. Algunos de estos factores son patógenos, parásitos y pesticidas. Nosema ceranae es un microsporidio que inicialmente se encontraba en la abeja melífera asiática (Apis cerana) y que en los últimos años ha infectado a la abeja melífera occidental (Apis mellifera). Estudios han relacionado la presencia de N. ceranae con colmenas afectadas por DCC, postulándolo como un factor importante en el desarrollo del síndrome. Individualmente, N. ceranae induce estrés metabólico e inmunosupresión en abejas melíferas, lo que finalmente podría afectar a la colmena comprometiendo así su inmunidad social. La inmunidad social corresponde al conjunto de respuestas que los organismos sociales presentan frente a un patógeno o amenaza, que comprende principalmente cambios en el comportamiento y secreciones en el alimento que producen (jalea real y miel). La miel, además de ser el alimento para las abejas de la colmena, posee actividad antimicrobiana debido a la presencia de peróxido de hidrógeno, generado por la enzima glucosa oxidasa (GOX), metilglioxal (en el caso de la miel de Manuka) y defensina-1, lo que contribuye a la inmunidad social de la colmena. Defensina-1 es un péptido con actividad antimicrobiana producido por distintos tejidos en la abeja melífera, incluyendo las glándulas hipofaríngeas y mandibulares, desde donde se secreta hacia la miel y la jalea real. En este estudio se propone que N. ceranae produce una inmunosupresión en abejas melíferas, lo que se traduciría en una menor generación de peróxido de hidrógeno y presencia de defensina-1 en la miel, indicando un compromiso de su inmunidad social. Dado lo anterior, la hipótesis propuesta es “La miel producida por abejas de la especie Apis mellifera infectadas con el microsporidio Nosema ceranae contiene menor cantidad del péptido antimicrobiano defensina-1 y una actividad de glucosa oxidasa disminuida en relación a la producida por abejas no infectadas.” Los objetivos generales de la tesis fueron: A) Relacionar la presencia del péptido antimicrobiano defensina-1 y la actividad de glucosa oxidasa en miel con la infección por Nosema ceranae en abejas y; B) Contar con métodos de análisis simples para establecer la presencia de defensina-1 en miel basados en espectroscopía molecular. Para ello se obtuvo la fracción comprendida entre 3 y 10 kDa de muestras de miel obtenidas desde el valle central de la región de O’Higgins. Esta fracción se caracterizó mediante fluorescencia y resolución multivariada de curva (MCR), lo que permitió evidenciar la presencia de la defensina por detección del triptófano presente en el péptido. Además, en esta fracción se determinó la presencia de enlaces disúlfuro, asociados a la estructura de la defensina, cuya concentración estuvo correlacionada con la concentración relativa de triptófano en la misma. En la miel no fraccionada se determinaron la actividad de GOX y la actividad antibacteriana, las que estuvieron relacionadas con el contenido relativo de defensina-1. Por otra parte, se expresó y purificó defensina-1 recombinante desde E. coli la que fue sometida a la misma caracterización y/o análisis de la miel fraccionada, permitiendo así tener un patrón de comparación. Paralelamente se determinó la presencia de N. ceranae en las abejas de las colmenas muestreadas mediante recuento de esporas en el microscopio y amplificación de su material genético a través de PCR en tiempo real. Al evaluar el conjunto de resultados se observó que la miel producida por abejas infectadas o que habían sufrido una reciente infección con Nosema spp contenía mayor cantidad de defensina-1 y mayor acumulación de peróxido de hidrógeno en relación a la producida por abejas no infectadas, lo que demuestra que la infección habría inducido una mayor producción del péptido y GOX siendo reflejado en la miel. Esto último se contrapone a la hipótesis planteada inicialmente. Sin embargo, las mieles que presentaron esta relación tienen además un origen geográfico y floral común; lo que igualmente podría ser la causa de la relación observada o que la defensina-1 y GOX se expresen constitutivamente en mayor cantidad en estas colonias, presentando así una ventaja genética sobre otras ante posibles infecciones / Honey bees are responsible of the highest percentage of pollination, including wild and domesticated plants, which gives them a priceless function for environment and producers who benefit from them. In recent years their number has been reduced, represented in the loss of colonies after winter season. Colonies are suffering a syndrome called Colony Collapse Disorder (CCD) which consists in the sudden abandonment of the colony by most of the worker bees. Until now there is no agent described that can trigger the syndrome by itself, however, several factors have been attributed to influence in this phenomenon. Some of these factors are pathogens, parasites and pesticides. Nosema ceranae is a microsporidian which was founded at first in the Asiatic honeybee (Apis cerana) and in the last years has infected the European honeybee (Apis mellifera). Studies have related de N. ceranae presence in bee hive affected by CCD, postulating it as an important factor in the development of this syndrome. Individually, N. ceranae induce metabolic stress and immunosuppression in honeybees, compromising the social immunity. Social immunity is the group of responses that social organisms have developed against a pathogen or threat, includes mainly behavior changes and secretions to the food produced (royal jelly and honey). The honey is the food for hive’s bee and has antimicrobial activity due to the presence of hydrogen peroxide, generated by glucose oxidase enzyme (GOX), methylglyoxal (in manuka honey) and defensin-1, which contributes to the social immunity of the hive. Defensin-1 is a peptide with antimicrobial activity produced by several cell types in the honey bee, including hypopharyngeal and mandibular glands, from where it is secreted towards honey and royal jelly. In this study, it is proposed that N. ceranae produces an immunosuppression in honey bees, which would result in a lower generation of hydrogen peroxide and the presence of defensin-1 in honey, indicating a compromise of their social immunity. Given the last, the proposed hypothesis is "The honey produced by bees (Apis mellifera) infected with Nosema ceranae contains less antimicrobial peptide defensin-1 and decreased glucose oxidase activity in relation to that produced by non-infected bees." The general objectives of the project are: A) To relate the presence of the antimicrobial peptide defensin-1 and the activity of glucose oxidase in honey with the infection by Nosema ceranae in bees and; B) Have simple analysis methods to establish the presence of defensin-1 in honey based on molecular spectroscopy. For this, the fraction comprised between 3 and 10 kDa of honey samples from the central valley of the O'Higgins region was obtained. This fraction was characterized by fluorescence and multivariate curve resolution (MCR), which allowed to demonstrate the presence of the defensin by detection of tryptophan present in the peptide. In addition, in this fraction the presence of disulfide bridges, associated with the structure of the defensin, whose concentration was correlated with the relative concentration of tryptophan in it, was determined. In the unfractionated honey, GOX activity and antibacterial activity were determined, which were related to the relative content of defensin-1. On the other hand, recombinant defensin-1 was expressed and purified from E. coli which was subjected to the same characterization and/or analysis of the fractionated honey, thus allowing to have a comparison pattern. In parallel, the presence of N. ceranae in the bees of the sampled hives was determined by counting the spores in the microscope and amplifying their genetic material through real-time PCR. When evaluating the set of results, it was observed that the honey produced by bees infected or that had suffered a recent infection with Nosema spp contained a greater amount of defensin-1 and a greater accumulation of hydrogen peroxide in relation to that produced by non-infected bees. Results show that the infection would have induced a higher production of the peptide and GOX being reflected in the honey. These results are the opposite of the proposed hypothesis. However, the honeys that presented this relationship also have a common geographical and floral origin; what could equally be the cause of the observed relationship or that defensin-1 and GOX are constitutively expressed in greater quantity in these colonies, thus presenting a genetic advantage over others in the face of possible infections / Fondecyt

Tesis de Magíster en Bioquímica área de Especialización en Bioquímica Ambiental y Memoria para optar al Título de Bioquímico / El uso masivo de pesticidas de amplio espectro en el tiempo ha generado efectos adversos sobre organismos no blanco. Las abejas domésticas (Apis mellifera) han sido uno de los principales organismos afectados causando gran preocupación por su importancia ecológica y económica. Las pérdidas de colonias de abejas melíferas y de otros polinizadores silvestres principalemente en Europa y América del norte han causado gran preocupación. Las causas de estas pérdidas aún no se conocen con certeza, pero se piensa que podría deberse a un problema multifactorial que incluye agentes biológicos, mala nutrición y el uso de agentes protectores de cultivos o pesticidas, entre otras causas. La intensa actividad de recolección de las abejas melíferas las expone a pesticidas de la agricultura y xenobióticos en general. En Chile las regiones de Valparaíso (V) y O’Higgins (VI) presentan una alta actividad agrícola, alto uso de pesticidas e importante desarrollo apícola por lo que fueron consideradas como regiones de riesgo para la salud de las abejas. En el presente proyecto se desarrolló una metodología para la determinación de algunos de los pesticidas más usados en estas regiones considerando los neonicotinoides; acetamiprid y tiametoxam, el fenilpirazol; fipronil, los halogenados; acrinatrina y clorotalonil, y los organofosforados; metidation, diazinon, dimetoato, metamidofos, clorpirifos, profenofos, azinfos metil y cumafos. La metodología desarrollada fue posteriormente utilizada en la determinación de muestras de campo. A través de la técnica de dispersión de matriz en fase sólida (MSPD) para la extracción y limpieza de los analitos en conjunto con cromatografía de gases acoplada a detectores específicos de micro captura de electrones (μECD) y fotometría de llamas (FPD) se logró establecer recuperaciones sobre un 60% de cada unos de los pesticidas mencionados al límite de cuantificación (LOQ; 0,005 – 0,050 μg/g) con una desviación estándar (RSD) ≤16%. Con esta metodología se pudo detectar 9 de los 13 pesticidas seleccionados presentes en el 65% de las muestras. Clorpirifos y acrinatrina fueron los pesticidas más frecuentemente encontrados en concentraciones que varían entre <0,015 (LOQ) – 0,067 μg/g y <0,020 (LOQ) – 0,026 μg/g respectivamente. Seguidos de diazinon encontrado exclusivamente bajo el LOQ (<0,015 μg/g). Las altas ventas de estos plaguicidas en las regiones afectadas y sus características de lipofilicidad podrían estar aumentando la exposición de las abejas de estos sectores debido a una acumulación de los plaguicidas en el ambiente (como por ejemplo en la cera de las colmenas) / A method based on matrix solid-phase dispersion (MSPD) associated to gas chromatography-flame photometric detection (GC-FPD), GC-electron capture detection (GC-ECD) and GC-mass spectrometry (GC-MS) for confirmation purposes, was developed for the determination of a representative group of thirteen pesticides in honeybee with particular concern in the apicultural field (fipronil, thiamethoxam, acetamiprid, acrinathrin, metamidophos, dimetoathe, diazinon, chlorpyrifos, methidathion, profenophos, azinphos methyl, chlorothalonil and coumaphos). Factors influencing the extraction efficiency of MSPD were investigated and optimized through response surface method. The use of octadecylsilyl (C18) sorbent combined with a florisil clean-up and acetonitrile-methanol (99:1) elution was the optimal condition for the extraction of the selected pesticides. Under this condition the recovery of pesticides at the limit of quantification (LOQ; 0.005 to 0.050 μg g -1) ranged from 60 to 101% with RSDs ≤ 16%. The proposed method was applied to the analysis of honeybees collected in 68 field hives from areas of great apicultural and agricultural development in central Chile. In 65% of these samples nine different pesticides were detected. Pesticides most frequently found were chlorpyrifos (35% of the samples, <0.015-0.067 μg g-1), acrinathrin (34% of the samples, <0.020-0.026 μg g-1) and diazinon (11% of the samples at values <0.015 μg g-1). The incidence of these pesticides in bees can be related to their sales volume, use to combat the varroosis in hives and hydrophobicity / Fondecyt