El objetivo general de la presente tesis fue el diseño y la construcción de un biosensor amperométrico para determinar glucosa en jugos de fruta (utilizando el de manzana como modelo) que sea económico, de fácil construcción y que tenga respuesta rápida. Con tal fin se construyó un electrodo de pasta de carbono que consistió en un cilindro de teflón con un contacto eléctrico de acero inoxidable. Los materiales de la pasta de carbono fueron una mezcla de polvo fino de grafito y parafina, a los cuales se agregó la enzima glucosa oxidasa (GOx) y el ferroceno, como mediador. Se estudiaron diferentes condiciones de operación del biosensor tales como el pH del medio de reacción, el potencial aplicado y la carga de enzima en la pasta de carbono, siendo las condiciones óptimas seleccionadas: medio de reacción (buffer de fosfatos pH 7), potencial de trabajo (0.16 V) y carga enzimática (10%). Se determinó la actividad enzimática de la enzima tanto libre como luego del proceso de inmovilización, y se estudió la cinética de la enzima en el electrodo, la cual se corresponde con la cinética típica de Michaelis-Menten, siendo los valores de los parámetros cinéticos k’m= 0.0195 M e imax= 35.5 μA. A continuación se construyó la curva de calibración cuyo intervalo lineal de concentraciones de glucosa fue de 0.1 mM a 4.48 mM, con una sensibilidad de 0.61 μA/mM y un valor del límite de detección de 0.05 mM, valores completamente aceptables para el biosensor en cuestión. También se evaluaron características del sensor como su tiempo de respuesta, que fue menor a 12 segundos en todos los casos y la repetibilidad y la precisión intermedia dando en ambos casos muy buenos resultados. Posteriormente se evaluó la estabilidad del sensor bajo diferentes condiciones de almacenamiento con y sin inmersión en la solución buffer y tanto bajo refrigeración como a temperatura ambiente. Todos los resultados fueron altamente satisfactorios y concuerdan con los esperados para el biosensor y más aún teniendo en cuenta la simpleza respecto de los materiales empleados y a la construcción del mismo. Otro estudio fue la evaluación de las interferencias debidas a sustancias electroquímicamente activas en el jugo de fruta, en este caso de manzana, que puedan afectar a la señal de la glucosa. Como posibles interferentes se estudiaron: ácido ascórbico, sacarosa, fructosa, almidón, ácido málico y ácido cítrico. Sólo el ácido ascórbico fue una sustancia interferente, debiendo eliminarse este compuesto del jugo como paso previo a la determinación de glucosa con el biosensor. Se estudiaron dos técnicas de eliminación: eliminación enzimática del ácido ascórbico y eliminación por oxidación directa con oxígeno del aire ambiente. Ambas técnicas dieron excelentes resultados en la eliminación de este compuesto. Finalmente se procedió a la determinación de glucosa en muestras reales, para lo cual se emplearon dos jugos de manzana: uno comercial y uno concentrado obtenido directamente de fábrica. Para validar los resultados obtenidos con el biosensor se utilizó un glucómetro digital. En todos los casos los errores en las determinaciones respecto a los valores obtenidos con el glucómetro fueron menores al 4%, lo que indica el muy buen desempeño del biosensor. / The main objective of the present Thesis was the design and construction of an amperometric biosensor to determine glucose in fruit juices (using apple juice as a model), considering this type of bio-electrodes are relatively cheap, simple to develop, set up and run and characterized by a fast response. The used carbon paste electrode consisted in a Teflon cylinder with stainless steel electric contact. Carbon paste was a mixture of graphite in fine powder and liquid paraffin, to which the enzyme glucose oxidase (GOx) and ferrocene as mediator was added. Several operation conditions were studied such as reaction medium pH, working potential and enzymatic load in the carbon paste, being the optimal conditions selected phosphate buffer (pH 7) as reaction medium, a working potential of 0.16 V, and 10% enzymatic load. Enzymatic activity of both free enzyme and enzyme after the immobilization process was determined. Furthermore the kinetic of the enzyme in the electrode was studied, and the result shows that it follows a typical Michaelis-Menten kinetic, with k’m= 0.0195 M and imax= 35.5 μA. The calibration curve shown that the linear range of glucose concentration was in the range 0.1 mM to 4.48 mM, with a sensitivity of 0.61 μA/mM and a detection limit of 0.05 mM. These values are completely acceptable for this kind of biosensor. Sensor characteristics, including response time (<12 sec. in all cases), intermediate precision and repeatability were evaluated. Stability of the sensor under different storage conditions was also evaluated. Results were highly satisfactory and consistent, considering used materials and simplicity of construction. Interferences from electrochemically-active substances in apple juice, which may affect glucose signal, were carefully considered. The possible studied interfering substances were: ascorbic acid, sucrose, fructose, starch, malic acid and citric acid. Only the ascorbic acid was observed to be an interfering substance, which must be removed from juice previously to the determination of glucose with the biosensor. Two removal techniques for ascorbic acid were assayed: enzymatic removal and elimination by direct oxidation with air. Both techniques showed to be appropriate for ascorbic acid elimination. Finally, the determination of glucose in real samples was carried out, using two apple juices samples, a ready to drink commercial one, and a concentrated juice directly obtained from a factory. To validate the results obtained with the biosensor a digital glucometer was used. In all cases the errors in the determinations were lower than 4%, demonstrating the very good performance of the biosensor.

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Magíster en Bioquímica área de especialización Bioquímica Ambiental y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Las abejas llevan a cabo el mayor porcentaje de polinizaciones, tanto de plantas silvestres como domésticas, lo que les otorga una función invaluable para el medio ambiente y los productores que se benefician de ellas. En los últimos años se ha visto disminuido notoriamente su número, representado por la cantidad de colonias perdidas después de la temporada de invierno. Las colonias están sufriendo un síndrome denominado Desorden de Colapso de Colmena (DCC) que consiste en el abandono repentino de la colmena por la mayoría de las abejas obreras. Hasta ahora no se ha podido describir ningún agente que por sí solo desencadene el síndrome, sin embargo, se ha atribuido relevancia a distintos factores que podrían tener influencia en este fenómeno. Algunos de estos factores son patógenos, parásitos y pesticidas. Nosema ceranae es un microsporidio que inicialmente se encontraba en la abeja melífera asiática (Apis cerana) y que en los últimos años ha infectado a la abeja melífera occidental (Apis mellifera). Estudios han relacionado la presencia de N. ceranae con colmenas afectadas por DCC, postulándolo como un factor importante en el desarrollo del síndrome. Individualmente, N. ceranae induce estrés metabólico e inmunosupresión en abejas melíferas, lo que finalmente podría afectar a la colmena comprometiendo así su inmunidad social. La inmunidad social corresponde al conjunto de respuestas que los organismos sociales presentan frente a un patógeno o amenaza, que comprende principalmente cambios en el comportamiento y secreciones en el alimento que producen (jalea real y miel). La miel, además de ser el alimento para las abejas de la colmena, posee actividad antimicrobiana debido a la presencia de peróxido de hidrógeno, generado por la enzima glucosa oxidasa (GOX), metilglioxal (en el caso de la miel de Manuka) y defensina-1, lo que contribuye a la inmunidad social de la colmena. Defensina-1 es un péptido con actividad antimicrobiana producido por distintos tejidos en la abeja melífera, incluyendo las glándulas hipofaríngeas y mandibulares, desde donde se secreta hacia la miel y la jalea real. En este estudio se propone que N. ceranae produce una inmunosupresión en abejas melíferas, lo que se traduciría en una menor generación de peróxido de hidrógeno y presencia de defensina-1 en la miel, indicando un compromiso de su inmunidad social. Dado lo anterior, la hipótesis propuesta es “La miel producida por abejas de la especie Apis mellifera infectadas con el microsporidio Nosema ceranae contiene menor cantidad del péptido antimicrobiano defensina-1 y una actividad de glucosa oxidasa disminuida en relación a la producida por abejas no infectadas.” Los objetivos generales de la tesis fueron: A) Relacionar la presencia del péptido antimicrobiano defensina-1 y la actividad de glucosa oxidasa en miel con la infección por Nosema ceranae en abejas y; B) Contar con métodos de análisis simples para establecer la presencia de defensina-1 en miel basados en espectroscopía molecular. Para ello se obtuvo la fracción comprendida entre 3 y 10 kDa de muestras de miel obtenidas desde el valle central de la región de O’Higgins. Esta fracción se caracterizó mediante fluorescencia y resolución multivariada de curva (MCR), lo que permitió evidenciar la presencia de la defensina por detección del triptófano presente en el péptido. Además, en esta fracción se determinó la presencia de enlaces disúlfuro, asociados a la estructura de la defensina, cuya concentración estuvo correlacionada con la concentración relativa de triptófano en la misma. En la miel no fraccionada se determinaron la actividad de GOX y la actividad antibacteriana, las que estuvieron relacionadas con el contenido relativo de defensina-1. Por otra parte, se expresó y purificó defensina-1 recombinante desde E. coli la que fue sometida a la misma caracterización y/o análisis de la miel fraccionada, permitiendo así tener un patrón de comparación. Paralelamente se determinó la presencia de N. ceranae en las abejas de las colmenas muestreadas mediante recuento de esporas en el microscopio y amplificación de su material genético a través de PCR en tiempo real. Al evaluar el conjunto de resultados se observó que la miel producida por abejas infectadas o que habían sufrido una reciente infección con Nosema spp contenía mayor cantidad de defensina-1 y mayor acumulación de peróxido de hidrógeno en relación a la producida por abejas no infectadas, lo que demuestra que la infección habría inducido una mayor producción del péptido y GOX siendo reflejado en la miel. Esto último se contrapone a la hipótesis planteada inicialmente. Sin embargo, las mieles que presentaron esta relación tienen además un origen geográfico y floral común; lo que igualmente podría ser la causa de la relación observada o que la defensina-1 y GOX se expresen constitutivamente en mayor cantidad en estas colonias, presentando así una ventaja genética sobre otras ante posibles infecciones / Honey bees are responsible of the highest percentage of pollination, including wild and domesticated plants, which gives them a priceless function for environment and producers who benefit from them. In recent years their number has been reduced, represented in the loss of colonies after winter season. Colonies are suffering a syndrome called Colony Collapse Disorder (CCD) which consists in the sudden abandonment of the colony by most of the worker bees. Until now there is no agent described that can trigger the syndrome by itself, however, several factors have been attributed to influence in this phenomenon. Some of these factors are pathogens, parasites and pesticides. Nosema ceranae is a microsporidian which was founded at first in the Asiatic honeybee (Apis cerana) and in the last years has infected the European honeybee (Apis mellifera). Studies have related de N. ceranae presence in bee hive affected by CCD, postulating it as an important factor in the development of this syndrome. Individually, N. ceranae induce metabolic stress and immunosuppression in honeybees, compromising the social immunity. Social immunity is the group of responses that social organisms have developed against a pathogen or threat, includes mainly behavior changes and secretions to the food produced (royal jelly and honey). The honey is the food for hive’s bee and has antimicrobial activity due to the presence of hydrogen peroxide, generated by glucose oxidase enzyme (GOX), methylglyoxal (in manuka honey) and defensin-1, which contributes to the social immunity of the hive. Defensin-1 is a peptide with antimicrobial activity produced by several cell types in the honey bee, including hypopharyngeal and mandibular glands, from where it is secreted towards honey and royal jelly. In this study, it is proposed that N. ceranae produces an immunosuppression in honey bees, which would result in a lower generation of hydrogen peroxide and the presence of defensin-1 in honey, indicating a compromise of their social immunity. Given the last, the proposed hypothesis is "The honey produced by bees (Apis mellifera) infected with Nosema ceranae contains less antimicrobial peptide defensin-1 and decreased glucose oxidase activity in relation to that produced by non-infected bees." The general objectives of the project are: A) To relate the presence of the antimicrobial peptide defensin-1 and the activity of glucose oxidase in honey with the infection by Nosema ceranae in bees and; B) Have simple analysis methods to establish the presence of defensin-1 in honey based on molecular spectroscopy. For this, the fraction comprised between 3 and 10 kDa of honey samples from the central valley of the O'Higgins region was obtained. This fraction was characterized by fluorescence and multivariate curve resolution (MCR), which allowed to demonstrate the presence of the defensin by detection of tryptophan present in the peptide. In addition, in this fraction the presence of disulfide bridges, associated with the structure of the defensin, whose concentration was correlated with the relative concentration of tryptophan in it, was determined. In the unfractionated honey, GOX activity and antibacterial activity were determined, which were related to the relative content of defensin-1. On the other hand, recombinant defensin-1 was expressed and purified from E. coli which was subjected to the same characterization and/or analysis of the fractionated honey, thus allowing to have a comparison pattern. In parallel, the presence of N. ceranae in the bees of the sampled hives was determined by counting the spores in the microscope and amplifying their genetic material through real-time PCR. When evaluating the set of results, it was observed that the honey produced by bees infected or that had suffered a recent infection with Nosema spp contained a greater amount of defensin-1 and a greater accumulation of hydrogen peroxide in relation to that produced by non-infected bees. Results show that the infection would have induced a higher production of the peptide and GOX being reflected in the honey. These results are the opposite of the proposed hypothesis. However, the honeys that presented this relationship also have a common geographical and floral origin; what could equally be the cause of the observed relationship or that defensin-1 and GOX are constitutively expressed in greater quantity in these colonies, thus presenting a genetic advantage over others in the face of possible infections / Fondecyt