Memoria presentada para optar al título de Químico / Hoy en día existe una creciente preocupación mundial por la disminución sostenida de las abejas melíferas (Apis Mellifera). La desaparición inexplicable de estas en un corto plazo de tiempo se ha denominado “Síndrome de Colapso de Colmena”, entre cuyas causas estaría el parásito microsporideo Nosema ceranae al producir un estado de inmunidad deprimida a nivel individual y social (colmena). La inmunidad social se asocia a sustancias que las abejas generan en sus glándulas hipofaríngeas y que depositan en los productos destinados a la alimentación de la colmena como la jalea real y la miel. Entre estos compuestos están el péptido antimicrobiano defensina-1 y la enzima glucosa oxidasa (GOX) y cuya producción se ve alterada por la infección con Nosema spp. Por tanto, la miel es una solución saturada de azúcar que contiene además una mezcla compleja de proteínas, aminoácidos, compuestos fenólicos, etc.; provenientes tanto del néctar de flores ubicadas en el entorno geográfico de las colmenas, como del metabolismo de las abejas, siendo así un reflejo de este. Consecuentemente, esta memoria plantea que el análisis multifactorial de algunos parámetros físico-químicos relevantes de la miel permitirá establecer relaciones con la presencia de N. ceranae en las abejas que la produjeron, con su actividad antimicrobiana y/o con su origen geográfico. El objetivo central del trabajo fue caracterizar mieles de diferentes regiones del país mediante sus contenidos de prolina, actividad de GOX, defensina-1 y compuestos fluorescentes y establecer las citadas relaciones. Se implementaron y aplicaron de manera satisfactoria métodos para la determinación de prolina, acumulación de H2O2 (evidencia de la actividad de GOX) y presencia de defensina-1 en mieles de la VI y X regiones del país; basados en espectroscopía UV-visible y calibración de orden cero y primer orden. Para estos últimos se obtuvieron límites de cuantificación diez veces menores que para los de orden cero. Los contenidos de prolina en las mieles (224 a 694 mg/kg) fueron mayores al mínimo indicado por las normas para considerarla como genuina, auténtica y madura (180 mg/kg). La acumulación de H2O2 fluctuó desde no detectada y 381 μg por cada 100 g de miel por hora. La determinación del contenido de péptidos antimicrobianos se realizó sólo en las muestras de la X Región, ya que en estas se determinó además su actividad antimicrobiana; obteniendo valores entre 16,6 y 25,9 mg/kg. Por otra parte, los perfiles de fluorescencia total de las mieles analizados mediante resolución multivariada de curvas (MCR), presentaron cuatro componentes asignados a aminoácidos aromáticos (principalmente triptófano), riboflavina, compuestos fenólicos y productos de las reacciones de Maillard. El análisis de componentes principales (PCA) de los parámetros obtenidos para mieles de la VI Región (prolina, áreas relativas de los cuatro componentes fluorescentes, acumulación de H2O2 y presencia de N. ceranae en las abejas) mostró una relación directa entre la presencia de la infección y la acumulación de H2O2, lo cual indica que la infección incrementaría la producción y/o actividad de GOX. La variabilidad observada para los demás parámetros se debe principalmente al tipo de alimentación y al entorno en el que se desenvuelve la abeja, por lo que permitieron una clasificación inicial de las mieles por su origen geográfico. Por su parte, el PCA de los parámetros obtenidos para las mieles de la X Región (los antes indicados más concentración de defensina-1 y actividad antimicrobiana) mostró una relación directa entre la actividad antimicrobiana, la cantidad de defensina-1 y la acumulación de H2O2 en la miel; lo que indica que ambos factores contribuyen de manera significativa y complementaria a su actividad antimicrobiana, donde el primero tiene acción sobre bacterias Gram positiva con efectividad variable, mientras que el H2O2 es de “amplio espectro” sobre otras bacterias / Today there is a growing global concern about the steady decline of honeybees (Apis Mellifera). The unexplained disappearance of these in a short period of time has been called “Colony Collapse Disorder”, among whose causes would be the microsporidea parasite N. ceranae to produce a state of immunity depressed at individual and social level (hive). Social immunity is associated with substances that bees produce in their hypopharyngeal glands and placed in products intended for feeding of the hive as royal jelly and honey. Between these compounds are the antimicrobial peptide defensin-1 and the enzyme glucose oxidase (GOX) and whose output is altered by infection with Nosema spp. Therefore, honey is a saturated sugar solution also contains a complex mixture of proteins, amino acids, phenolic compounds, etc.; both from the nectar of flowers located in the geographical environment of the hive, like bees metabolism, thus being a reflection of this. Consequently, this report proposes that the multifactorial analysis of some relevant physico-chemical parameters of honey will establish relations with the presence of N. ceranae on bee that produced it, with its antimicrobial activity and/or geographical origin. The main objective of the study was to characterize honeys from different regions of the country through its contents proline, GOX activity, defensin-1 and fluorescent compounds and establish these relationships. They were implemented and applied satisfactorily methods for determining proline, accumulation of H2O2 (evidence of GOX activity) and presence of defensin-1 in honeys of VI and X regions; based UV-visible spectroscopy and calibration of zero order and first order. For the latter limits of quantification obtained were ten times lower than for zero order. / Fondecyt

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Magíster en Bioquímica área de especialización Bioquímica Ambiental y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Las abejas llevan a cabo el mayor porcentaje de polinizaciones, tanto de plantas silvestres como domésticas, lo que les otorga una función invaluable para el medio ambiente y los productores que se benefician de ellas. En los últimos años se ha visto disminuido notoriamente su número, representado por la cantidad de colonias perdidas después de la temporada de invierno. Las colonias están sufriendo un síndrome denominado Desorden de Colapso de Colmena (DCC) que consiste en el abandono repentino de la colmena por la mayoría de las abejas obreras. Hasta ahora no se ha podido describir ningún agente que por sí solo desencadene el síndrome, sin embargo, se ha atribuido relevancia a distintos factores que podrían tener influencia en este fenómeno. Algunos de estos factores son patógenos, parásitos y pesticidas. Nosema ceranae es un microsporidio que inicialmente se encontraba en la abeja melífera asiática (Apis cerana) y que en los últimos años ha infectado a la abeja melífera occidental (Apis mellifera). Estudios han relacionado la presencia de N. ceranae con colmenas afectadas por DCC, postulándolo como un factor importante en el desarrollo del síndrome. Individualmente, N. ceranae induce estrés metabólico e inmunosupresión en abejas melíferas, lo que finalmente podría afectar a la colmena comprometiendo así su inmunidad social. La inmunidad social corresponde al conjunto de respuestas que los organismos sociales presentan frente a un patógeno o amenaza, que comprende principalmente cambios en el comportamiento y secreciones en el alimento que producen (jalea real y miel). La miel, además de ser el alimento para las abejas de la colmena, posee actividad antimicrobiana debido a la presencia de peróxido de hidrógeno, generado por la enzima glucosa oxidasa (GOX), metilglioxal (en el caso de la miel de Manuka) y defensina-1, lo que contribuye a la inmunidad social de la colmena. Defensina-1 es un péptido con actividad antimicrobiana producido por distintos tejidos en la abeja melífera, incluyendo las glándulas hipofaríngeas y mandibulares, desde donde se secreta hacia la miel y la jalea real. En este estudio se propone que N. ceranae produce una inmunosupresión en abejas melíferas, lo que se traduciría en una menor generación de peróxido de hidrógeno y presencia de defensina-1 en la miel, indicando un compromiso de su inmunidad social. Dado lo anterior, la hipótesis propuesta es “La miel producida por abejas de la especie Apis mellifera infectadas con el microsporidio Nosema ceranae contiene menor cantidad del péptido antimicrobiano defensina-1 y una actividad de glucosa oxidasa disminuida en relación a la producida por abejas no infectadas.” Los objetivos generales de la tesis fueron: A) Relacionar la presencia del péptido antimicrobiano defensina-1 y la actividad de glucosa oxidasa en miel con la infección por Nosema ceranae en abejas y; B) Contar con métodos de análisis simples para establecer la presencia de defensina-1 en miel basados en espectroscopía molecular. Para ello se obtuvo la fracción comprendida entre 3 y 10 kDa de muestras de miel obtenidas desde el valle central de la región de O’Higgins. Esta fracción se caracterizó mediante fluorescencia y resolución multivariada de curva (MCR), lo que permitió evidenciar la presencia de la defensina por detección del triptófano presente en el péptido. Además, en esta fracción se determinó la presencia de enlaces disúlfuro, asociados a la estructura de la defensina, cuya concentración estuvo correlacionada con la concentración relativa de triptófano en la misma. En la miel no fraccionada se determinaron la actividad de GOX y la actividad antibacteriana, las que estuvieron relacionadas con el contenido relativo de defensina-1. Por otra parte, se expresó y purificó defensina-1 recombinante desde E. coli la que fue sometida a la misma caracterización y/o análisis de la miel fraccionada, permitiendo así tener un patrón de comparación. Paralelamente se determinó la presencia de N. ceranae en las abejas de las colmenas muestreadas mediante recuento de esporas en el microscopio y amplificación de su material genético a través de PCR en tiempo real. Al evaluar el conjunto de resultados se observó que la miel producida por abejas infectadas o que habían sufrido una reciente infección con Nosema spp contenía mayor cantidad de defensina-1 y mayor acumulación de peróxido de hidrógeno en relación a la producida por abejas no infectadas, lo que demuestra que la infección habría inducido una mayor producción del péptido y GOX siendo reflejado en la miel. Esto último se contrapone a la hipótesis planteada inicialmente. Sin embargo, las mieles que presentaron esta relación tienen además un origen geográfico y floral común; lo que igualmente podría ser la causa de la relación observada o que la defensina-1 y GOX se expresen constitutivamente en mayor cantidad en estas colonias, presentando así una ventaja genética sobre otras ante posibles infecciones / Honey bees are responsible of the highest percentage of pollination, including wild and domesticated plants, which gives them a priceless function for environment and producers who benefit from them. In recent years their number has been reduced, represented in the loss of colonies after winter season. Colonies are suffering a syndrome called Colony Collapse Disorder (CCD) which consists in the sudden abandonment of the colony by most of the worker bees. Until now there is no agent described that can trigger the syndrome by itself, however, several factors have been attributed to influence in this phenomenon. Some of these factors are pathogens, parasites and pesticides. Nosema ceranae is a microsporidian which was founded at first in the Asiatic honeybee (Apis cerana) and in the last years has infected the European honeybee (Apis mellifera). Studies have related de N. ceranae presence in bee hive affected by CCD, postulating it as an important factor in the development of this syndrome. Individually, N. ceranae induce metabolic stress and immunosuppression in honeybees, compromising the social immunity. Social immunity is the group of responses that social organisms have developed against a pathogen or threat, includes mainly behavior changes and secretions to the food produced (royal jelly and honey). The honey is the food for hive’s bee and has antimicrobial activity due to the presence of hydrogen peroxide, generated by glucose oxidase enzyme (GOX), methylglyoxal (in manuka honey) and defensin-1, which contributes to the social immunity of the hive. Defensin-1 is a peptide with antimicrobial activity produced by several cell types in the honey bee, including hypopharyngeal and mandibular glands, from where it is secreted towards honey and royal jelly. In this study, it is proposed that N. ceranae produces an immunosuppression in honey bees, which would result in a lower generation of hydrogen peroxide and the presence of defensin-1 in honey, indicating a compromise of their social immunity. Given the last, the proposed hypothesis is "The honey produced by bees (Apis mellifera) infected with Nosema ceranae contains less antimicrobial peptide defensin-1 and decreased glucose oxidase activity in relation to that produced by non-infected bees." The general objectives of the project are: A) To relate the presence of the antimicrobial peptide defensin-1 and the activity of glucose oxidase in honey with the infection by Nosema ceranae in bees and; B) Have simple analysis methods to establish the presence of defensin-1 in honey based on molecular spectroscopy. For this, the fraction comprised between 3 and 10 kDa of honey samples from the central valley of the O'Higgins region was obtained. This fraction was characterized by fluorescence and multivariate curve resolution (MCR), which allowed to demonstrate the presence of the defensin by detection of tryptophan present in the peptide. In addition, in this fraction the presence of disulfide bridges, associated with the structure of the defensin, whose concentration was correlated with the relative concentration of tryptophan in it, was determined. In the unfractionated honey, GOX activity and antibacterial activity were determined, which were related to the relative content of defensin-1. On the other hand, recombinant defensin-1 was expressed and purified from E. coli which was subjected to the same characterization and/or analysis of the fractionated honey, thus allowing to have a comparison pattern. In parallel, the presence of N. ceranae in the bees of the sampled hives was determined by counting the spores in the microscope and amplifying their genetic material through real-time PCR. When evaluating the set of results, it was observed that the honey produced by bees infected or that had suffered a recent infection with Nosema spp contained a greater amount of defensin-1 and a greater accumulation of hydrogen peroxide in relation to that produced by non-infected bees. Results show that the infection would have induced a higher production of the peptide and GOX being reflected in the honey. These results are the opposite of the proposed hypothesis. However, the honeys that presented this relationship also have a common geographical and floral origin; what could equally be the cause of the observed relationship or that defensin-1 and GOX are constitutively expressed in greater quantity in these colonies, thus presenting a genetic advantage over others in the face of possible infections / Fondecyt