La acetilcolina ejerce un rol preponderante como neuromodulador en el sistema nervioso central, principalmente a nivel de los circuitos neuronales asociados a cognición, memoria, aprendizaje, atención, recompensa y procesamiento de la información sensorial, modificando su respuesta frente a estímulos internos y externos. La señalización colinérgica ocurre tanto por mecanismos de transmisión sináptica como extrasináptica, siendo estos últimos los principales involucrados en la modulación de la excitabilidad neuronal, la liberación presináptica de neurotransmisores, la plasticidad neuronal y la activación coordinada de distintos grupos de neuronas en el encéfalo. El efecto neuromodulador de la acetilcolina depende no sólo de su sitio de liberación y de la población neuronal blanco, sino también de los receptores a través de los cuales actúa. Por lo tanto, los receptores nicotínicos ionotrópicos constituyen una pieza clave en el sistema colinérgico del encéfalo. Estos son canales iónicos pentaméricos activados por ligando que forman parte de la familia de receptores Cys-loop. Son permeables a cationes y pueden estar formados por cinco subunidades idénticas o por combinaciones de subunidades diferentes, dando lugar a receptores homoméricos o heteroméricos respectivamente. Cada subtipo de receptor nicotínico presenta una estequiometría definida, es decir, una composición y un arreglo espacial de subunidades particular, responsable de las propiedades biofísicas, farmacológicas y funcionales del canal, que se encuentran íntimamente asociadas a su rol fisiológico diferencial. Una de las subunidades de receptor nicotínico más abundantes en el sistema nervioso central es α7, tradicionalmente reconocida por su capacidad para formar receptores homoméricos de origen evolutivo más ancestral. Sin embargo, evidencias recientes demostraron que también posee la habilidad de coensamblarse con otras subunidades para generar receptores heteroméricos, tales como el novedoso subtipo α7β2. Numerosos desórdenes neurológicos, psiquiátricos, inflamatorios y neurodegenerativos se presentan acompañados de una deficiente señalización colinérgica, por lo que estos receptores nicotínicos conformados por subunidades α7 constituyen un promisorio blanco terapéutico. En el presente trabajo de tesis se descifraron las bases moleculares de la activación y modulación de los receptores nicotínicos α7 homoméricos y heteroméricos, utilizando principalmente técnicas electrofisiológicas, con el fin de comprender el impacto diferencial de ambos subtipos en la señalización colinérgica del sistema nervioso central. El capítulo I fue dividido en tres partes y se centró en el estudio de la función molecular del receptor α7 homomérico a nivel macroscópico y microscópico. Este receptor exhibe propiedades cinéticas y farmacológicas particulares que lo tornan óptimo en la mediación de procesos de transmisión extrasinápticos, incluyendo su elevada permeabilidad a los iones calcio y su capacidad para transformar respuestas ionotrópicas transitorias en eventos de señalización metabotrópica sostenidos. En la parte I se analizaron los mecanismos moleculares de activación y modulación del receptor α7 homomérico. En presencia de acetilcolina el receptor se activó y desensibilizó con una cinética rápida, evocando mayoritariamente aperturas aisladas breves. Por el contrario, la activación alostérica presentó un mecanismo molecular radicalmente diferente, con un enlentecimiento de la cinética de desensibilización, que permitió la prolongación de las aperturas individuales y su agrupación en episodios de activación sostenidos de muy larga duración. Asimismo, se evaluó la potenciación por compuestos prototipo previamente reportados como moduladores alostéricos positivos (PAMs), clasificados como tipo I o II en base a sus efectos a nivel de corrientes macroscópicas. Si bien ambos incrementaron el pico de la corriente, los PAMs tipo I produjeron mínimos o nulos cambios en la velocidad de desensibilización del receptor, mientras que los PAMs tipo II disminuyeron dicha velocidad notoriamente e incrementaron la reactivación de receptores desde el estado desensibilizado. Para descifrar el origen molecular de dichos efectos se exploró la potenciación a nivel de corrientes unitarias. Se demostró que los PAMs no afectaron la amplitud máxima del canal, incrementaron el tiempo de estado abierto e indujeron la aparición de episodios de activación sostenidos, modificando así la cinética del receptor en los dos casos. Mientras que los PAMs tipo I promovieron episodios de activación con una duración moderada denominados bursts, los PAMs tipo II generaron clusters de muy larga duración, conformados por varios bursts agrupados. La potenciación por ambos tipos de PAMs también fue diferencialmente afectada por la temperatura, siendo los PAMs tipo II los más sensibles, con una actividad potenciadora significativamente menor a temperatura fisiológica en comparación con el accionar a temperatura ambiente. Esta información resulta muy relevante dado que usualmente la caracterización de los PAMs in vitro es llevada a cabo a temperatura ambiente, pero para su potencial uso terapéutico es indispensable el conocimiento de sus efectos a temperaturas fisiológicas. Además, se comprobó que los determinantes estructurales transmembrana influyen en la potenciación por los dos tipos de PAMs, principalmente en los PAMs tipo II, mientras que los PAMs tipo I resultan menos sensibles. Sin embargo, también se identificaron algunos PAMs tipo I notablemente influenciados por los determinantes transmembrana, con un comportamiento intermedio, más semejante al de los PAMs tipo II. En conjunto, estos resultados aportan información esencial para la implementación de agonistas y PAMs de α7 como agentes terapéuticos en desórdenes donde exista una señalización colinérgica deficiente. En la parte II se reveló una conexión entre los efectos benéficos comunes ejercidos por los flavonoides y el receptor α7 homomérico en el sistema nervioso central, ya que estos compuestos naturales presentaron actividad α7-PAM. Se evaluaron prototipos de las tres principales clases de flavonoides: genisteína, quercetina y 5,7-dihidroxi-4-fenilcumarina como neoflavonoide. Se demostró que todos ellos potenciaron las corrientes macroscópicas y microscópicas evocadas por la acetilcolina y no recuperaron receptores desde el estado desensibilizado. Dicha caracterización funcional permitió clasificarlos como PAMs tipo I. Utilizando receptores α7 mutantes y quiméricos se comprobó que los flavonoides comparten determinantes estructurales de potenciación transmembrana con otros PAMs. Estos compuestos polifenólicos no sólo aumentaron la respuesta ionotrópica del receptor α7, sino también la metabotrópica. Se verificó que los mismos potenciaron la disminución de la generación de especies reactivas de oxígeno intracelulares ejercida por la activación de α7, en forma independiente de su efecto antioxidante intrínseco. Tanto es así que la actividad α7-PAM de los flavonoides se propone como un mecanismo adicional por el cual estos compuestos naturales ejercerían su acción antioxidante y su efecto neuroprotector mediado por receptor. En la parte III se sintetizó una novedosa serie de compuestos sintéticos derivados de 1,2,3-triazol 1,4-disustituidos con grupos arilo y fosfonato, que presentaron actividad α7-PAM. El compuesto de mayor eficacia fue el derivado funcionalizado con el grupo fosfonato de metilo, el cual se comportó como PAM tipo I, potenciando las corrientes macroscópicas y microscópicas evocadas por la acetilcolina de forma compatible con su clasificación. La potenciación por este compuesto fue influenciada por los determinantes estructurales transmembrana, compartidos también por los PAMs tipo II. Además, se aplicaron diversas estrategias de relación estructura-actividad para obtener derivados más eficaces, como modificaciones en la longitud de las cadenas carbonadas, variación del grupo aromático e inversión de la geometría del triazol. Esta última fue la única que permitió conservar el accionar α7-PAM del derivado con fosfonato de metilo. Por lo tanto, estos hallazgos permiten proponer a este compuesto como un novedoso farmacóforo de interés, que no sólo exhibe actividad potenciadora por sí mismo, sino que también resulta útil como plataforma para el desarrollo de nuevos agentes potencialmente terapéuticos. El capítulo II se centró en el estudio de la función molecular del receptor α7 heteromérico, particularmente del receptor α7β2, cuya presencia ha sido confirmada en cerebro anterior basal, corteza e hipocampo. Para descifrar el impacto de la incorporación de subunidades β2 en el pentámero de subunidades α7, se generaron receptores con estequiometrías definidas y controladas mediante dos estrategias: la tecnología de concatámeros y la técnica de electrical fingerprinting, que utilizan subunidades covalentemente unidas y no enlazadas respectivamente. Se determinó que las estequiometrías conteniendo una, dos y tres subunidades β2 dieron lugar a receptores α7β2 funcionales. En relación a la activación ortostérica, a medida que el número de subunidades β2 aumentó en el arreglo pentamérico, la amplitud y la conductancia unitaria permanecieron constantes, mientras que la duración de las aperturas y de los episodios de activación sostenidos se prolongaron significativamente, debido a una disminución en la velocidad de desensibilización. La activación en episodios sostenidos o bursts constituyó la marca o huella cinética distintiva del receptor heteromérico α7β2 con respecto al receptor α7 homomérico. Además, la subunidad β2 no aportó su cara complementaria al sitio ortostérico de unión, sino que la activación eficaz por acetilcolina ocurrió únicamente a través de interfaces α7/α7. En relación a los PAMs, originalmente desarrollados como selectivos para el receptor α7 homomérico, se observó que también ejercieron modulación alostérica positiva sobre el receptor α7β2 heteromérico, pero de forma diferencial. Los PAMs tipo I fueron más selectivos para el receptor homomérico, ya que su actividad potenciadora disminuyó con la presencia de subunidades β2 en el pentámero hasta ser prácticamente nula. En cambio, los PAMs tipo II no resultaron selectivos, dado que potenciaron por igual a los receptores α7 homoméricos y heteroméricos, enmascarando sus diferencias cinéticas intrínsecas. Lo mismo ocurrió con la activación alostérica por agonistas alostéricos, que además poseen la capacidad de actuar como PAMs tipo II. Por lo tanto, este estudio constituye la primera caracterización a nivel de canal único de receptores α7 heteroméricos, demostrando las posibles estequiometrías que dan origen a receptores funcionales y la huella cinética de cada uno. Estos resultados contribuyen al entendimiento del rol distintivo de este nuevo receptor y a su identificación funcional en sistemas nativos, ya que por el momento no existen ligandos selectivos. Además, dado que los PAMs de α7 también potenciaron a α7β2, se propone a la selectividad diferencial como un parámetro importante a considerar para el diseño y desarrollo de moduladores más específicos. También se generaron receptores heteroméricos α7β4 con estequiometrías definidas, para comparar el impacto diferencial de la presencia de distintas subunidades β en el arreglo pentamérico. Las estequiometrías conteniendo una y dos subunidades β4 dieron lugar a receptores α7β4 funcionales. En la activación ortostérica de los mismos por acetilcolina, se observó que a mayor número de subunidades β4 en el pentámero la amplitud de las corrientes unitarias aumenta, a diferencia de lo ocurrido con β2; mientras que las duraciones de las aperturas y de los episodios de activación se incrementan de forma similar a lo ocurrido con β2, pero más notoriamente, con una alta frecuencia. De este modo, la funcionalidad de los receptores α7β4 en el sistema de expresión heterólogo empleado, junto con otras evidencias experimentales, sustentan la potencial existencia de otros receptores α7 heteroméricos in vivo, además del subtipo α7β2 ya identificado en el sistema nervioso central.En conjunto, el presente trabajo de tesis permitió descifrar los mecanismos moleculares de activación y modulación alostérica de los receptores homoméricos α7 y heteroméricos α7β2, los cuales exhibieron propiedades y perfiles funcionales particulares. Esto sugiere que ambos subtipos de receptores α7 podrían actuar in vivo a distinta escala temporal, pero con un patrón espacial compartido en algunas áreas del sistema de neuromodulación colinérgico, ejerciendo un impacto diferencial en los circuitos neuronales asociados a cognición y memoria. La información aportada contribuye entonces no sólo a la dilucidación del rol fisiológico distintivo de los receptores α7 homoméricos y heteroméricos con sus respectivas implicancias fisiopatológicas, sino también al diseño, desarrollo y optimización de nuevos agentes terapéuticos más selectivos. / Acetylcholine plays a major role as neuromodulator in the central nervous system, mainly at the level of neural circuits associated to cognition, memory, learning, attention, reward and sensory gating, by modifying the response to internal and external inputs. Cholinergic signaling occurs by synaptic and extrasynaptic transmission, the latter being the main mechanism involved in the modulation of neuronal excitability, presynaptic neurotransmitter release, neuronal plasticity and coordinated firing of groups of neurons in the brain. The effect of acetylcholine as a neuromodulator depends not only on the site of release and the target neuron, but also on the receptors through which acetylcholine acts. In this regard, the ionotropic nicotinic receptors are a key piece in the brain cholinergic system. They are pentameric ligand-gated ion channels, members of the Cys-loop receptor family. Nicotinic receptors are permeable to cations and can be formed by five identical subunits or different subunit combinations, giving place to homomeric or heteromeric receptors, respectively. Each nicotinic receptor subtype has a defined stoichiometry, which means a particular composition and spatial arrangement of subunits, that is responsible for the biophysical, pharmacological and functional properties of the channel and it is intimately related to the differential physiological role. One of the most abundant nicotinic subunits in the central nervous system is α7, traditionally known by its ability to form homomeric receptors due to its ancestral evolutionary origin. However, recent evidence demonstrated that α7 has also the ability to co-assemble with other subunits to generate heteromeric receptors, for instance the novel α7β2 subtype. Several neurological, mental, inflammatory and neurodegenerative disorders are accompanied by a defective cholinergic signaling, therefore, α7 nicotinic receptors are promising therapeutic targets. In this thesis, by using electrophysiological techniques, we deciphered the molecular basis of the activation and modulation of α7 homomeric and heteromeric nicotinic receptors, with the final aim of elucidating the differential impact of both subtypes in the cholinergic signaling in the central nervous system. Chapter I was divided into three parts and was focused on the study of the molecular function of α7 homomeric receptor at the macroscopic and microscopic level. This receptor exhibits particular kinetic and pharmacological properties that make it ideal for mediating extrasynaptic transmission processes, including high permeability to calcium ions and the ability to transform transient ionotropic responses into sustained metabotropic signaling events. In Part I, the molecular mechanisms of activation and modulation of α7 homomeric receptor were analysed. In the presence of acetylcholine, the receptor activated and desensitized with rapid kinetics, mostly evoking brief isolated openings. On the contrary, allosteric activation showed a radically different molecular mechanism, with a slowdown in the desensitization kinetics that allows the prolongation of individual openings and their grouping into very long-lasting sustained activation episodes. We also evaluated the potentiation by prototype compounds, previously reported as positive allosteric modulators (PAMs) and classified as type I or II depending on their effect at the macroscopic current level. Although both types of PAMs increased the peak current, type I PAMs produced minimal or no changes in the receptor desensitization rate, whereas type II PAMs decreased notoriously that rate and increased reactivation of receptors from desensitized states. To decipher the molecular origin of these effects, potentiation was explored at the single-channel current level, and revealed that both type of PAMs did not affect the maximal channel amplitude, increased open-channel lifetime and induced sustained activation episodes, thus modifying receptor kinetics in both cases. While type I PAMs provoked activation episodes with moderate duration named bursts, type II PAMs generated very long duration clusters, consisting of several grouped bursts. We showed that potentiation by both types of PAMs was differentially affected by temperature, being type II PAMs more sensitive and less active at a more physiological temperature than at room temperature. This information is useful given that PAMs have been usually characterized in vitro at room temperature, but for their therapeutic use it is necessary to know their effects at more physiological temperatures. In addition, it was demonstrated that transmembrane structural determinants influence potentiation by both types of PAMs, mainly by type II PAMs, while type I PAMs are less sensitive. Nevertheless, some type I PAMs significantly influenced by transmembrane determinants were also identified, with an intermediate behaviour, more similar to that of type II PAMs. Overall, these results provide important information required for the implementation of α7 agonists and PAMs as therapeutic tools for disorders with a defective cholinergic signaling. In Part II, a link between the common beneficial effects exerted by flavonoids and α7 homomeric receptor in the central nervous system was revealed, since these natural compounds showed α7-PAM activity. We evaluated prototypes from the three main flavonoids classes: genistein, quercetin and 5,7-dihydroxy-4-phenylcoumarin as a neoflavonoid. All flavonoids enhanced macroscopic and microscopic currents elicited by acetylcholine and did not recover receptors from the desensitized state, thus allowing us to classify them as type I PAMs. By using mutant and chimeric α7 receptors, we demonstrated that flavonoids share transmembrane structural determinants with other PAMs. These polyphenolic compounds not only increased the receptor ionotropic response, but also the metabotropic one, further reducing the generation of intracellular reactive oxygen species elicited by α7 activation, independently of their direct antioxidant activity. Thus, we propose α7-PAM activity of flavonoids as an additional mechanism by which these natural compounds might exert their receptor-mediated antioxidant action and neuroprotective effect. In Part III, a novel series of synthetic compounds derived from 1,2,3-triazoles 1,4-disubstituted with aryl and phosphonate groups that exhibited α7-PAM activity was synthetized. The most effective compound was the methyl phosphonate-functionalized derivative, which behaves as type I PAM, enhancing the macroscopic and microscopic currents elicited by acetylcholine, in a manner compatible with its classification. Potentiation was influenced by transmembrane structural determinants, also shared by type II PAMs. In addition, several structure-activity relationship strategies were applied to obtain more effective derivatives, for instance modifications of the carbon chains lengths, variation of the aromatic group and inversion of the triazole geometry. The last one allowed the compound to preserve the α7-PAM activity of the methyl phosphonate derivative. Therefore, these results propose this compound not only as a novel pharmacophore with intrinsic PAM activity, but also as a scaffold for the development of new potential therapeutic agents. Chapter II was focused on the study of the molecular function of α7 heteromeric receptors, particularly α7β2 receptor, whose presence has been confirmed in basal forebrain, cortex and hippocampus. To decipher the impact of β2 subunits incorporation into the pentamer of α7 subunits, receptors with fixed and controlled stoichiometries were generated by two approaches: concatemeric technology and electrical fingerprinting technique, which use concatenated and unlinked subunits respectively. It was determined that stoichiometries containing one, two and three β2 subunits gave place to functional α7β2 receptors. Regarding orthosteric activation, as the number of β2 subunits increased in the pentameric arrangement, the amplitude and the single-channel conductance remained constant, while durations of openings and sustained activation episodes were significantly prolonged, due to a decrease in the desensitization rate. Activation in sustained episodes or bursts conforms the kinetic signature of α7β2 heteromeric receptors with respect to α7 homomeric receptor. Moreover, β2 subunit did not provide the complementary face of the orthosteric binding site, so the efficacious activation by acetylcholine occurred only through α7/α7 interfaces. Originally developed as selective for α7 homomeric receptors, we showed that PAMs also exerted positive allosteric modulation on α7β2 heteromeric receptors, but in a differential manner. On the one hand, type I PAMs were more selective for the homomeric receptor, since their potentiating activity decreased with the presence of β2 subunits in the pentamer up to be practically null. On the other hand, type II PAMs were not selective, because they enhanced equally all α7 homomeric and heteromeric receptors, masking their intrinsic kinetic differences. The same occurred with the allosteric activation by allosteric agonists, which also have the capacity to act as type II PAMs. This study constitutes the first single-channel characterization of α7 heteromeric receptors, revealing the stoichiometries that may result in functional receptors and the kinetic signature of each one. These results contribute to the understanding of the distinctive role of this novel receptor and will help to its functional identification in native systems because no selective ligands are available to date. Since α7 PAMs also potentiated α7β2 receptors, we propose the differential selectivity as an important parameter to consider for the design and development of more specific modulators. Furthermore, α7β4 heteromeric receptors with fixed stoichiometry were generated in order to compare the differential impact of distinct β subunits presence into the pentameric arrangement. Stoichiometries containing one and two β4 subunits gave place to functional α7β4 receptors. Regarding orthosteric activation by acetylcholine, it was observed that as the number of β4 subunits in the pentamer increases, the single-channel amplitude rises unlike what occurred with β2, whereas durations of openings and sustained activation episodes increase similarly to what occurred with β2 subunits, but more significantly, with a higher frequency. The functionality of α7β4 receptors in the heterologous expression system used, together with other experimental evidences, support the potential existence of other α7 heteromeric receptors in vivo, besides the α7β2 subtype already identified in central nervous system. On the whole, this thesis work allowed to decipher the molecular mechanisms of activation and allosteric modulation of α7 homomeric and α7β2 heteromeric receptors, which exhibited particular functional profiles and properties. It suggests that both α7 receptors subtypes could act in vivo at distinct temporal scale, but with a shared spatial pattern in some areas of the neuromodulation cholinergic system, exerting a differential impact at the neural circuits associated to cognition and memory. The provided information not only contributes to elucidating the physiological role of α7 homomeric and heteromeric receptors with their respective pathophysiological implications, but also to the design, development and optimization of novel more selective therapeutic agents.

Ingeniero Civil Eléctrico / El presente trabajo de título tiene por objetivo caracterizar la respuesta en la actividad neuronal de sujetos que han sido expuestos a estímulos visuales con contenido emocional mediante el análisis de series de tiempo de los registros electroencefalográficos (EEG). En particular, se comparan tres estados emocionales en base a sus diferencias en los valores de valencia y excitación emocional. La hipótesis de este trabajo es que la respuesta emocional ante estímulos visuales puede ser caracterizada en registros EEG en las dimensiones de tiempo, frecuencia y topografía en el cuero cabelludo. Para esto se introduce un enfoque metodológico en el que se analizan canales individuales de EEG descompuestos en bandas de frecuencia. La base de datos utilizada consiste en nueve sujetos, cuyos registros fueron pre-procesados para eliminar el ruido y artefactos oculares. La metodología propuesta consiste en extracción de características, y la construcción de modelos predictivos de emociones basados en Máquinas de Soporte Vectorial y Bosques Aleatorios. De los nueve sujetos, seis fueron utilizados como conjunto de entrenamiento para construir los modelos predictivos y los tres sujetos restantes fueron usados como conjunto de prueba. Los resultados obtenidos fueron una completa discriminación entre emociones positivas y negativas. Para la distinción entre las tres emociones a la vez se obtuvo una precisión de 2/3. Las 20 características utilizadas para la clasificación incluyen canales de distintos lóbulos del cerebro y frecuencias que van desde la banda delta hasta la gamma. Se observó además una alta influencia de la actividad de la banda alfa en los estados emocionales. Los resultados sugieren que el registro de la actividad neuronal a través de EEG permite obtener signos del estado emocional en respuesta a estímulos visuales, pero para obtener una mayor precisión se deben combinar características de múltiples canales y frecuencias.

El objetivo general de este trabajo de Tesis Doctoral es contribuir al conocimiento y desarrollo de un área básica de importante impacto sobre la salud humana como lo es la fisiología vascular. Nos interesa aportar al conocimiento de los vasos humanos, por lo cual planteamos utilizar en este estudio la arteria umbilical humana (AUH), un vaso sanguíneo accesible, que se descarta luego del parto junto con la placenta, y que tiene un importante rol fisiológico en la regulación del flujo sanguíneo feto-placentario. Analizar las propiedades del músculo liso que integra la pared de esta arteria nos permite profundizar en el conocimiento de los factores endógenos que pueden regular el flujo de este lecho vascular. Los objetivos específicos son: 1) en primer lugar, estudiar la respuesta que genera el ATP extracelular en las células de músculo liso de la AUH, caracterizando los cambios bioeléctricos que puede generar este agonista actuando a través de sus receptores ionotrópicos. 2) en segundo lugar, indagar si este agonista produce variaciones en la concentración del calcio intracelular y cuáles son las estructuras celulares que intervienen en la respuesta. 3) por último, analizar si existe un acople funcional entre receptores purinérgicos ionotrópicos y el canal de K+ de alta conductancia sensible al voltaje y al Ca2+ intracelular, BKCa. Este canal es objeto de estudio de nuestro grupo de investigación y hemos caracterizado, en trabajos previos, sus propiedades electrofisiológicas e identificado su rol protagónico en la modulación del potencial de membrana de estas células.

La temperatura modula las propiedades electrofisiológicas del tejido cardíaco. El enfriamiento o calentamiento del miocardio en modelos animales se ha utilizado con distintos fines relacionados con la investigación de las arritmias cardíacas. Hasta el momento, las limitaciones en la metodología empleada no han posibilitado que las modificaciones térmicas de carácter regional en el epicardio fueran acompañadas de una cartografía eléctrica simultánea. Esta tesis pretende avanzar en este campo trabajando con modelos de corazón aislado y perfundido de conejo. Se ha desarrollado un dispositivo con el que posteriormente se ha realizado la investigación: un electrodo multipolar de alta resolución con capacidad de modificar la temperatura epicárdica en la zona de registro. Se han determinado sus características técnicas y funcionales más relevantes. Se ha aplicado un protocolo experimental encaminado al estudio del efecto modulador de la temperatura sobre determinados parámetros electrofisiológicos. Se ha estudiado: el intervalo QT en ritmo sinusal, la aparición de respuestas repetitivas (despolarizaciones espontáneas) y la inducción de FV en condiciones de estimulación programada, y una vez instaurada la FV: la velocidad de conducción, la longitud de onda, la refractariedad ventricular, la complejidad de los mapas de activación epicárdica ventricular y la reversión de la arritmia mediante enfriamiento selectivo y gradual epicárdico. Los resultados muestran la viabilidad del dispositivo para este tipo de investigaciones. Ello ha posibilitado la inducción de heterogeneidades en la activación eléctrica del tejido: en ritmo sinusal el intervalo QT se prolongó con la hipotermia local y se redujo con la hipertermia; en condiciones de FV, la velocidad de conducción se enlenteció con el frío y se aceleró con el calor, los cambios de temperatura modularon la longitud de onda, el intervalo fibrilatorio y la refractariedad -estimada a partir del percentil 5 del intervalo fibrilatorio / Guill Ibáñez, A. (2012). Estudio de los efectos electrofisiológicos de la modificación local de la temperatura en un modelo experimental de corazón aislado mediante un electrodo específico de alta densidad con modulación térmica [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/16885 / Palancia

El hipocampo es una de las regiones del cerebro más ampliamente estudiadas, y es de interés para gran parte de los neurocientíficos, desde aquellos que estudian su estructura y funcionalidad hasta los que estudian su mal funcionamiento en diversas enfermedades y condiciones patológicas. El hipocampo tiene un papel fundamental, entre otras cosas, en la adquisición y consolidación de la memoria episódica, así como en la orientación espacial. De todas las propiedades de las sinapsis en el hipocampo, quizás la más atractiva, y seguramente la estudiada con mayor entusiasmo, es su habilidad de responder a patrones de activación específicos con aumentos o disminuciones de larga duración en la eficiencia sináptica. Esta propiedad plástica de las sinapsis en general, y de las del hipocampo en particular, es considerada por muchos neurocientíficos como la base celular del aprendizaje de ciertos tipos de recuerdos y memorias. El objetivo principal de esta Tesis Doctoral, fruto de una estrecha colaboración entre el Centro de Biomateriales e Ingeniería Tisular de la Universitat Politècnica de València y el Laboratorio de Plasticidad de las Redes Neuronales del Instituto de Neurociencias (Consejo Superior de Investigaciones Científicas ¿ Universidad Miguel Hernández) de San Juan (Alicante), es aportar nuevos conocimientos sobre los mecanismos que regulan el flujo de información entre las distintas áreas del hipocampo y por tanto, contribuir a un mejor entendimiento de los mecanismos neurofisiológicos que subyacen al aprendizaje y la memoria mediante el análisis de señales adquiridas mediante registros electrofisiológicos de alta densidad, correspondientes a distintas partes del hipocampo y la corteza parietal asociativa, adquiridas en distintos instantes de tiempo antes y después de la potenciación sináptica a largo plazo. Para ello, se ha desarrollado una metodología que nos ha permitido estudiar la actividad espontánea del sistema, y con la que hemos observado la dependencia espacial y temporal de la desviación típica tanto en los cálculos de correlación como en los de coherencia. Además, se ha trabajado tanto con los potenciales de campo locales (LFP por sus siglas en inglés), como con sus componentes independientes, haciendo una comparativa entre los resultados obtenidos para cada caso, en cuanto a correlación y coherencia se refiere, utilizando fragmentos pertenecientes a diferentes etapas durante la potenciación sináptica a largo plazo (LTP por sus siglas en inglés), para conocer los cambios que se dan en esta estructura tras dicha potenciación sináptica. En el caso de la coherencia, hemos podido observar los cambios que se producen debido a la potenciación sináptica en las diferentes bandas de frecuencia. Todos estos cálculos se han realizado de forma ipsilateral, comparando señales pertenecientes a un mismo hemisferio cerebral, y de forma bilateral, comparando señales pertenecientes a hemisferios cerebrales diferentes. Por último, a partir de la experiencia en el manejo de estos registros electrofisiológicos y de sus componentes independientes, se han identificado patrones de correlación interregional, que se suceden en el tiempo como entidades singulares y a los que hemos denominado ¿ministates¿ por su duración menor de un segundo. Dichos patrones, que aparecen de forma repetida en los registros, podrían estar asociados a eventos electrofisiológicos identificables en la señal y estar modulados por procesos de plasticidad sináptica. Así, se ha desarrollado una metodología adecuada para el análisis de señales adquiridas mediante registros electrofisiológicos de alta densidad, mediante el cálculo de la correlación y la coherencia de estas señales electrofisiológicas y de sus componentes independientes, y se ha programado en entorno MATLAB. Gracias a las herramientas desarrolladas y aplicadas hemos comprobado la dependencia temporal y espacial de la dispersión de los valores de correlación y coherencia y hemos analizado la estructura funcional en reposo de los circuitos de la formación hipocampal, obteniendo evidencias a favor de la existencia de dos vías de procesamiento paralelo e independiente en el sistema. Además, hemos hallado patrones de comunicación, a los que hemos denominado ¿ministates¿, que se suceden en el tiempo en secuencias controladas por procesos de plasticidad sináptica, apareciendo repetidamente en las distintas fases estudiadas de nuestro modelo experimental de aprendizaje. Aún nos encontramos lejos de poder describir cómo el aprendizaje modifica el `estado interno¿ del cerebro. Entre las dificultades encontradas cabe destacar la enorme variabilidad en las señales electrofisiológicas registradas en los distintos estados por los que, de forma espontánea, transcurre la actividad cerebral. De esta forma la huella del aprendizaje o la memoria se encuentra enmascarada por grandes fluctuaciones de actividad. Sin embargo, gracias a las herramientas desarrolladas hemos podido aportar datos nuevos sobre cómo tiene lugar la comunicación en la formación hipocampal y constatar que la plasticidad sináptica modula dicha comunicación. / Gabaldón López, MV. (2013). Estudio de la estructura dinámica de las interacciones funcionales en el hipocampo mediante procesado de registros electrofisiológicos cerebrales en rata [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/30777 / TESIS

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Magíster en Bioquímica área de Especialización Bioquímica Ambiental y Memoria para optar al Título de Bioquímico / 1.- RESUMEN Durante la generación de electricidad en sistemas de Celda de Combustible Microbiológicas (MFC, por su sigla en inglés), se han manipulado distintas vías metabólicas para generar un aumento en la bioelectricidad, debido a que los electrones necesarios para este proceso provienen del poder reductor generado dentro de la célula. Esto no solo se ha estudiado en cepas electrogénicas como lo son Geobacter o Shewanella, sino que también se han realizado estudios en Escherichia coli, la cual puede transferir electrones a un electrodo a través de un mediador. Estos últimos años, la investigación se ha centrado específicamente en la manipulación cofactores, principalmente el NADH. En estos casos, alteran tanto vías de consumo como de generación de este cofactor, pero evalúan principalmente la eficiencia de esta modificación en el voltaje, la corriente o en la potencia producida. Sin embargo, pocas veces consideran observar los factores intrínsecos de la bacteria que están produciendo estas mejoras. Debido a esto, en este trabajo se utilizó una MFC con distintas cepas de E. coli con el mediador rojo neutro para observar no solo los cambios en la generación de corriente, sino que también, el consumo de la fuente de carbono (glucosa en este caso), rendimiento, y flujo de electrones en estos cultivos electrogénicos. Esto ayudó a comprender en parte lo que puede estar pasando en el metabolismo bacteriano durante el proceso de generación de corriente. Las cepas utilizadas fueron la cepa de E.coli K-12 MG1655, la cepa NAD-G6PDH la cual presenta un cambio en la especificidad de cofactor de la enzima G6PDH (en la cepa silvestre utiliza NADP+ , en este caso utiliza NAD+), la cepa Δpgi (con la deleción del gen que codifica la enzima fosfogluco isomerasa) y la cepa Δpgi-NAD-G6PDH que posee las dos mutaciones mencionadas. Finalmente, el trabajo demostró que las cepas MG1655 y NAD-G6PDH, que presentan más NADH, generan mayor electricidad en el tiempo que las cepas que tienen la mutación Δpgi. No obstante, el flujo de los electrones de todas las cepas fue similar, ya que no se observaron diferencias significativas. Además, se observó que la cepa Δpgi podría poseer un mejor rendimiento de mmoles de electrones por mmoles de glucosa consumida que las otras cepas, ya que produce una corriente relativamente alta para la poca biomasa y el bajo consumo de glucosa. / During the electricity generation in Microbiological Fuel Cell (MFC) systems, different metabolic pathways have been manipulated to generate an increase in the bioelectricity since the electrons needed for this process come from the reducing power generated inside the cell. This has not only been studied in electrogenic strains such as Geobacter or Shewanella, but also studies have been carried out in Escherichia coli, which can transfer electrons to an electrode through a mediator. Over the last few years, the research has focused specifically on the manipulation of cofactors, mainly in NADH. In these cases, they alter both consumption and generation pathways of this cofactor, but they mainly evaluate the efficiency of this modification in the voltage, the current or the power produced. However, they rarely consider observing the intrinsic factors of the bacteria that are producing these improvements. Due to this, in this work we used an MFC with different strains of E. coli with the Neutral Red mediator to observe not only the changes in the current generation, but also the consumption of carbon source (glucose in this case), yields, and electron flux in these electrogenic cultures. This helped to partially understand what may be happening in the bacterial metabolism during the current generation process. The strains used in this work were E. coli strain K-12 MG1655, strain NAD-G6PDH, which shows a change in the specificity cofactor of the G6PDH enzyme (in the wild type strain uses NADP+, in this case uses NAD+), strain Δpgi (with a deletion of the gene encoding the phosphoglucose isomerase enzyme) and strain Δpgi-NAD-G6PDH that possesses the two mentioned mutations. Finally, the work demonstrated that the strains MG1655 and NAD-G6PDH that present more NADH generate higher current per time than the strains that have the Δpgi mutation. Nevertheless, the electrons flux of all the strains was similar, since no significant differences were observed. In addition, it was observed that the strain Δpgi could have a better yield of mmol of electrons per mmol of consumed glucose than the other strains, since it produces a relatively high current for the low biomass and the low glucose consumption / PAIFAC 2016. Fac Cs. (RC) y Proyecto ENL012/16.

Determina la frecuencia de neuropatía sensitivo-motora distal, en pacientes asintomáticos con diagnóstico de diabetes mellitus tipo 2 que acudan a consulta externa en el Hospital Nacional Daniel Alcides Carrión del Callao, en el periodo enero 2011 - mayo 2012. Identifica y selecciona a los pacientes asintomáticos y a los pacientes con signos clínicos de neuropatía sensitivo-motora distal que presenten diabetes mellitus tipo 2. Realiza el diagnóstico de neuropatía sensitivo-motora distal, a través del estudio electrofisiológico, en dos fases: estudio de conducción nerviosa y electromiografía, en los pacientes seleccionados, para determinar el patrón electrofisiológico y correlacionar los resultados del examen clínico con los resultados del estudio electrofisiológico, así como correlacionar el tiempo de diagnóstico de diabetes mellitus 2 con los resultados del estudio electrofisiológico. / Trabajo académico

La electrofisiología cardíaca permite el estudio de la actividad eléctrica de regiones específicas del corazón y, por tanto, el análisis de las modificaciones de sus características en regiones sometidas a cambios tales como el estiramiento miocárdico agudo. El estiramiento miocárdico modifica las propiedades electrofisiológicas de los cardiomiocitos, originando arritmias cardíacas en diferentes situaciones patológicas. Los efectos mecánicos del estiramiento inducen cambios relacionados con el calcio, y son varios los mecanismos que han sido implicados, incluyendo un incremento de la entrada de Na+ y la activación secuencial de los intercambiadores Na+/H+ y Na+/Ca2+ (modo inverso), ligados a eventos autocrino/paracrinos. Esta Tesis Doctoral tiene como principal objetivo el estudio de la posible participación de estos mecanismos en las respuestas electrofisiológicas al estiramiento mediante el análisis de las modificaciones farmacológicas de dichas respuestas. Se han estudiado las modificaciones de las características de la activación miocárdica durante la fibrilación ventricular (FV) y de las propiedades electrofisiológicas miocárdicas inducidas por el estiramiento miocárdico agudo en 44 corazones de conejo aislados y perfundidos en un sistema Langendorff, utilizando electrodos múltiples epicárdicos y técnicas de cartografía eléctrica, bajo condiciones control (n=9) y durante la perfusión del antagonista de los receptores tipo 1 de angiotensina II losartán 1µM (n=8), del antagonista de los receptores tipo A de endotelina BQ-123 0,1µM (n=9), del inhibidor del intercambiador Na+/H+ 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-amiloride (EIPA) 1µM (n=9) y del inhibidor de la corriente tardía de Na+ ranolazina 5µM (n=9) / Canto Serrano, ID. (2015). Estudio de las modificaciones farmacológicas de los efectos electrofisiológicos producidos por el estiramiento local miocárdico a partir de técnicas dinámicas de cartografía eléctrica, en un modelo experimental de corazón aislado de conejo [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/48544 / TESIS

Programa de Doctorado: Biotecnología en ciencias de la salud (Biotecnología y Bíomedicina)

Los receptores cys-loop pertenecen a la familia de canales iónicos pentaméricos activados por ligandos (pLGICs). Se expresan ampliamente en el sistema nervioso, donde ejercen un rol vital en la comunicación neuronal. Están involucrados en los procesos de aprendizaje, memoria, movimiento, entre otros. Se han asociado alteraciones en la funcionalidad de estos receptores con una gran variedad de desórdenes neurológicos, tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, epilepsia, síndromes miasténicos, esquizofrenia y depresión. Por ello, los receptores cys-loop son importantes blancos farmacológicos. En consecuencia, consideramos que el conocimiento de los mecanismos moleculares que conducen a su activación y disfunción es de suma relevancia. Los receptores Cys-loop están formados por un dominio extracelular, que contiene los sitios de unión de agonista, y un dominio transmembrana, que forma el poro iónico. La interfase entre ambos dominios, llamada región de acoplamiento, desempeña un rol clave en la propagación de los cambios conformacionales que se inician con la unión del agonista en la región extracelular y culminan con la apertura del poro iónico a nivel transmembranal. En este trabajo de Tesis Doctoral estudiamos dos regiones claves en el proceso de activación de los receptores Cys-loop: el sitio de unión de agonista, donde comienza la respuesta, y la interfase entre los dominios extracelular y transmembrana o región de acoplamiento. Utilizamos receptores homopentaméricos que por estar compuestos por cinco subunidades iguales, poseen cinco sitios de unión de agonista y cinco regiones de acoplamiento idénticas. Los receptores homoméricos surgieron más tempranamente en la escala evolutiva por lo que presentan características estructurales y funcionales comunes a todos los miembros Cys-loop, y son, por lo tanto, modelos útiles para el estudio de los receptores de esta familia. En el Capítulo I de esta Tesis determinamos el número de regiones de acoplamiento necesario para la activación de los receptores Cys-loop y su relación con los sitios de unión de agonista. Para ello, utilizamos como modelo de receptor homopentamérico al receptor quimérico a7-5HT3A, compuesto por secuencias del receptor a7 en su dominio extracelular y secuencias del receptor 5-HT3A en su dominio transmembrana, el que ha sido ampliamente utilizado como modelo de a7. Para conocer la contribución de cada una de las cinco regiones de acoplamiento a la estabilidad de canal abierto del receptor a7-5HT3A, empleamos nuestra estrategia experimental denominada electrical fingerprinting. Según esta estrategia, co-transfectamos células con una subunidad conteniendo la región de acoplamiento activa y otra subunidad conteniendo la región de acoplamiento inactiva, una de ellas conteniendo además mutaciones reporteras de conductancia. De esta forma, logramos expresar en membrana receptores con distinto número de regiones de acoplamiento funcionales que son identificados mediante registros de patch-clamp de canal único. Gracias a la presencia de las mutaciones reporteras de conductancia, la medición de la amplitud de cada apertura nos permitió conocer la estequiometria del receptor, es decir, el número de subunidades con región de acoplamiento funcional que tiene el receptor pentamérico que dio origen a esa apertura. Determinamos la duración de los eventos de apertura provenientes de receptores con distinto número de regiones de acoplamiento funcionales, que constituye una medida de la estabilidad de canal abierto. Encontramos que cada región de acoplamiento contribuye en forma independiente y simétrica a la estabilidad del canal abierto y que son necesarias las cinco regiones de acoplamiento funcionales para lograr la óptima activación del receptor. Demostramos además que la presencia de una sola región de acoplamiento funcional en el pentámero es suficiente para lograr la activación pero no permite mantener el canal abierto en su tiempo óptimo. Además generamos receptores a7-5HT3A mutantes, que contenían distinto número de sitios de unión de agonista y regiones de acoplamiento funcionales. Esta estrategia nos permitió establecer los requisitos estructurales mínimos que logran la activación del receptor, así como también los requerimientos estructurales que conducen a la máxima estabilidad del estado abierto. Encontramos que el receptor es capaz de responder al agonista mediante la ocupación de un único sitio si este se encuentra formado por dos subunidades con regiones de acoplamiento funcionales. Sin embargo, para lograr la óptima activación y duración máxima del canal abierto, el receptor modelo utilizado requiere de tres sitios de unión de agonista funcionales y sus cinco regiones de acoplamiento intactas. En el Capítulo II, estudiamos la activación del receptor neuronal a7 en condiciones de sub-ocupación de sus cinco sitios de unión de agonista. Este receptor se localiza principalmente en sitios distantes a los sitios de síntesis y liberación de acetilcolina (ACh), por lo que la ACh, o su producto colina, deben difundir y unirse a receptores a7 distantes. Este mecanismo colinérgico no sináptico predice que el grado de ocupación de los receptores a7 sería bajo en condiciones fisiológicas. Para estudiar la activación del receptor a7 en condiciones de sub-ocupación de sus sitios de agonista, realizamos ensayos electrofisiológicos y medimos la duración del canal abierto de receptores individuales que presentan un único sitio de unión de agonista funcional, y la comparamos con la de receptores que tienen sus cinco sitios funcionales. Para conocer el número de sitios de unión de agonista funcionales empleamos nuevamente la estrategia electrical fingerprinting. Esta estrategia requiere la medición exacta de la amplitud. Teniendo en cuenta que los receptores a7 presentan aperturas de duración breve que no permiten la resolución de su máxima amplitud, los estudios electrofisiológicos se realizaron sobre receptores a7 mutados o en presencia de potenciadores que aumentan la duración del canal abierto. En este trabajo, demostramos que la estabilidad del canal abierto de receptores a7 que presentan un único sitio de unión de agonista funcional es la misma que la de los receptores que presentan sus cinco sitios disponibles. Por otro lado, cuando reemplazamos el dominio transmembrana del receptor a7 por el del receptor 5-HT3A, encontramos que la duración del canal abierto se incrementa al aumentar el número de sitios ocupados por agonista. Este resultado demuestra por primera vez que el dominio extracelular no es el único determinante de la relación entre ocupación y estabilidad del canal abierto. Por lo tanto, en este trabajo demostramos la capacidad del receptor a7 de activarse y producir respuestas máximas con la ocupación de un solo sitio de unión de agonista, propiedad que es única y exclusiva de este receptor dentro de todos los miembros de la familia de receptores Cys-loop. Este resultado posee además relevancia fisiológica dado que esta propiedad le permitiría al receptor adaptarse al mecanismo de transmisión no sináptico. En su conjunto, los resultados que surgen de esta Tesis revelan una novedosa relación funcional entre dos dominios estructurales de estos receptores, el sitio de unión de agonista y la región de acoplamiento, y, además, contribuyen al conocimiento general del mecanismo de activación de los receptores de la familia Cys-loop. / Cys-loop receptors belong to the family of pentameric ligand-gated ion channels (pLGICs). They are widely expressed in the nervous system, where they exert a vital role in neuronal communication. They are involved in learning, memory, movement processes, among others. Functional disorders of these receptors have been associated with several neurological disorders, such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, epilepsy, myasthenic syndromes, schizophrenia and depression. Because Cys-loop receptors are important pharmacological targets for the development of therapies, the knowledge of the molecular mechanisms leading to activation and dysfunction of these receptors is of great importance. Cys-loop receptors contain an extracellular domain that carries the agonist binding sites and a transmembrane region that forms the ion pore. The interface between both domains, named as the coupling region, plays a key role in the propagation of the conformational changes from the binding site at the extracellular domain to the pore, located at the transmembrane region. In this Thesis, we studied two key regions that are essential for the activation process of Cys-loop receptors: the agonist binding site, where the response begins, and the interface between the extracellular and transmembrane domains or coupling region. We used homopentameric receptors that contain five identical subunits, and therefore five identical agonist binding sites and coupling regions. Because homomeric receptors appeared earlier on the evolutionary scale, they present structural and functional features that are common to all Cys-loop members, and are therefore useful models for the study of this receptor family. In Chapter I of this Thesis we studied the number of coupling regions necessary for Cys-loop receptor activation and evaluated the functional relationship of this domain with the agonist binding sites. To this end, we used a model of homopentameric receptor, the a7-5HT3A chimeric receptor, which contains a7 sequences in the extracellular domain and 5-HT3A sequences in the transmembrane domain. To determine the contribution of each of the five coupling regions to the stability of the open channel, we used our experimental strategy which is called electrical fingerprinting. For this strategy, cells were co-transfected with a subunit with an active coupling region and another subunit with an inactive coupling region, one of which carrying reporter conductance mutations, to generate receptors with different number of functional coupling regions. Next, we performed single-channel recordings to identify functional receptors using the patch-clamp technique. Due to the introduction of reporter conductance mutations, the measurement of the amplitude of each opening event allowed us to know receptor stoichiometry, i.e., the number of subunits with functional coupling region present in the pentameric receptor which originated the event. We measured open channel duration of receptors with different numbers of functional coupling regions, which indicates the open channel stability. We found that each coupling region contributes independently and symmetrically to open channel stability. We showed that five coupling regions are necessary to achieve optimal receptor activation and that the presence of only one functional coupling region is sufficient for receptor activation, but with reduced open channel duration. Furthermore, we constructed a7-5HT3A mutant receptors, containing different number of agonist binding sites and functional coupling regions. This strategy allowed us to establish the minimum structural requirements for receptor activation as well as the structural requirements for maximal open channel stability. We found that a7-5HT3A receptors are capable of responding to agonist by occupying a single agonist binding site, only if this site is formed by two subunits carrying functional coupling regions. However, to achieve optimal activation and maximal open channel duration, the model receptor requires three functional agonist binding sites and five functional coupling regions. In Chapter II, we studied a7 neuronal receptor activation under sub-occupancy conditions of its five agonist binding sites. In the brain, this receptor is mainly located at distant sites from the sites of synthesis and release of acetylcholine (ACh), so ACh, or its product choline, diffuse to bind distant a7 receptors. This non-synaptic cholinergic mechanism predicts that the degree of a7 receptor occupancy is low under physiological conditions. To study a7 activation under sub-occupancy conditions we performed single-channel recordings and measured open channel duration of receptors with only one functional agonist binding site, and compared it with that of receptors containing their five intact agonist binding sites. To know the number of agonist binding sites, we employed again the electrical fingerprinting strategy. This strategy requires accurate measurement of open channel amplitude. Because the brief duration of a7 opening events do not allow full amplitude resolution, single-channel recordings were performed in either a7 mutant receptors or in the presence of potentiators that increase open channel duration. In this work, we demonstrated that open channel stability of receptors with a single agonist binding site is the same as that of receptors containing five functional sites. Moreover, when we replaced the transmembrane domain of a7 receptors by that of 5-HT3A receptor, we found that open channel lifetime increases as the number of sites occupied by agonist increases. This result shows for the first time that the extracellular domain is not the only determinant of the relationship between occupancy and open channel stability. Therefore, in this work we demonstrated the ability of a7 receptor for activation and eliciting maximal responses with occupancy of only one agonist binding site, a property that is unique for a7 among all members of the Cys-loop family. This result has a physiological relevance since this property would allow a7 receptors to adapt to their non-synaptic mechanism. Taken together, the results that emerge from this Thesis reveal a novel functional relationship between two structural domains, the agonist binding site and the coupling region, and contribute to the general knowledge of the activation mechanism of Cys-loop receptors.