Tumor de bexiga é o tipo de tumor mais comum que ocorre no trato urinário, originado a partir do epitélio estratificado da bexiga. A incidência em homens é maior do que em mulheres, está associado com a industrialização e relacionado com a origem ocupacional do paciente. Mais de 90% dos tumores de bexiga são devidos a alterações neste epitélio, sendo o principal tipo, o tumor nas células transicionais. A linhagem T24 de tumor de bexiga humana tem sido usada como modelo de tumor invasivo de bexiga. Nucleotídeos são uma importante classe de moléculas sinalizadoras, conhecidos por regular muitas funções pato-fisiológicas no espaço extracelular. O ATP extracelular é conhecido por mediar uma variedade de respostas biológicas no sistema nervoso central e periférico, principalmente pela ligação aos receptores acoplados à proteína G, P2Y ou pelos receptores ligados aos canais iônicos, P2X. A sinalização mediada pelos nucleotídeos é controlada por uma eficiente cascata enzimática que inclui os membros das ecto-nucleotidases ENTPDases, E-NPPs e ecto-fosfatases alcalinas as quais de formas diferenciadas podem gerar AMP que pode ser hidrolisado pela ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’-NT, CD73) gerando adenosina. Muitos estudos têm indicado que o ATP extracelular exerce um efeito primordial no trato urinário e que suas ações são mediadas por receptores P2. Baseado na ampla distribuição das ecto-nucleotidases em vários tipos de tecidos e considerando a potencial participação destas enzimas na regulação da sinalização purinérgica em tecido de bexiga normal e tumoral, o objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade das ectoenzimas e a presença dos receptores purinérgicos nas células T24 de tumor de bexiga humano. Muitos estudos vêm demonstrando evidências da relação entre o sistema purinérgico e o crescimento tumoral. Nossos resultados mostraram que as células T24 apresentam uma extrema diminuição da capacidade de hidrólise dos nucleotídeos tri- e difosfatados quando comparada com os nucleotídeos monofosfatados, que apresentam uma alta capacidade de hidrólise. Os resultados obtidos pela hidrólise mostram uma baixa expressão das E-NTPDases, contrastando com uma significante atividade da ecto-5’- nucleotidase, e pelo menos um membro da família das E-NPPs. Muitos papéis fisiológicos para a família das E-NPPs têm sido descritos incluindo reciclagem de nucleotídeos e modulação da sinalização purinérgica. No presente estudo nós analisamos a atividade desta enzima na linhagem celular T24 em pH ótimo para as E-NPPs e em pH fisiológico para cultura de células. Curvas de tempo e substrato mostraram atividade das E-NPPs apenas no pH ótimo da enzima. A análise por RT-PCR mostrou a presença apenas da E-NPP1. Quanto à expressão das ecto-enzimas, nosso estudo mostrou que a linhagem T24 expressa apenas a E-NTPDase 5 (CD39L4) e não expressa as demais E-NTPDases. Nós identificamos todos os receptores P2Y nas células, dando suporte a idéia de que alterações no número de células tumorais pode ser devido a modulação da proliferação celular via receptores P2. Em nosso estudo também investigamos o efeito do ATP extracelular nas células T24, em diferentes concentrações e tempos de tratamento, mostrando que o ATP extracelular diminui significativamente o número de células. Estes dados indicam que as vias de sinalização purinérgica podem ter um importante papel na regulação das funções da bexiga urinária. Outros estudos são necessários para confirmar as funções do sistema purinérgico nos tumores de bexiga e as possíveis terapias antitumorais. / Bladder cancer is the most commonly tumor occurring in urinary tract, originating from normal stratified transitional epithelium of the bladder. The incidence in men is bigger than in women and is associated with industrialization and related to occupational origin. More than 90% of histological cell type of bladder cancer is transitional cell carcinoma. The T24 cell is a lineage of human bladder transitional cell carcinoma, and it has been used as model of invasive bladder cancer. Nucleotides, an important class of signaling molecules, are known to regulate many pathophysiological functions in the extracellular space. Extracellular ATP is recognized as an agonist that mediates a wide variety of biological responses in the central and peripheral nervous systems, largely by binding to either G protein-coupled receptors P2Y or ligand- gated P2X receptors. The nucleotide-mediated signaling is controlled by a highly efficient enzymatic cascade which includes the members of E-NTPDase (ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase) family, E-NPP (ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase) family and ecto-alkaline phosphatases. The AMP formed by the action of these enzymes is hydrolyzed to adenosine by the action of an ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’-NT, CD73). Although several lines of evidence have indicated that extracellular ATP plays primordial role in the urinary tract and these actions are mediated by P2 receptors. Based on the wide distribution of ecto-nucleotidases in various tissues and considering the potential participation of these enzymes in the regulation of purinergic signaling in normal and tumoral bladder tissues, the objective of the present study was to examine the activity of ecto-enzymes and the presence of the purinergic receptors in T24 human bladder tumor cell line. Several studies have demonstrated evidence for the relation between the purinergic signaling and tumor growth. Our results show that T24 cell line presents an extremely decreased capacity to hydrolyze all tri- and di-phosphate nucleosides when compared to the nucleoside monophosphates, which have a higher capacity to hydrolyze. The results obtained show a low expression of E- NTPDases, contrasting to a significant activity of ecto-5’-nucleotidase, and at least one of the enzymes family of E-NPPs. Multiple physiological roles for E-NPPs have been related, including nucleotide recycling and modulation of purinergic receptor signaling. In the present study, we describe an enzyme activity in T24 cell line in the optimum pH for ENPP and in physiological pH to the culture cells. Time and substrate curve have shown an E-NPP activity only in the enzyme optimal pH. The RT-PCR analysis showed the presence of only the E-NPP1. Regarding the expression of the ecto-enzymes, our study has showed that the T24 cell line expresses only the E-NTPDase 5 (CD39L4) and does not express the other E-NTPDases. We have identified all P2Y receptors in the cell line studied supporting the idea that the alteration of cancer cell number might be due to modulation of cell proliferation via P2 receptors. In this study we also investigated the effects of extracellular ATP in T24 cell line in different concentrations and times of treatment. As shown, the extracellular ATP decreases significantly the cell number. These data could indicate that the purinergic signaling pathways may play an important role in regulating urinary bladder function. Further studies to provide functions for the purinergic system in bladder tumor will be necessary to improve the possibilities of antitumor therapies.

Os nucleotídeos extracelulares modulam uma variedade de ações biológicas via ativação de receptores purinérgicos. Esses efeitos são controlados pela ação de ectonucleotidases, tais como as E-NTPDases e a ecto-5´-NT/CD73, as quais hidrolisam o ATP até adenosina no meio extracelular. Alterações no sistema purinérgico podem estar envolvidas na progressão dos gliomas. O ATP induz a proliferação celular dos gliomas e, ao contrário dos astrócitos, gliomas apresentam baixa expressão das E-NTPDases, particularmente da NTPDase2. Assim, a restauração da atividade ATPásica nesses tumores poderia ser uma estratégia para prevenir as ações mediadas pelo ATP. De acordo com essa idéia, a coinjeção de apirase/NTPDase1, uma enzima depletora de ATP, e gliomas diminuiu a progressão tumoral in vivo. O objetivo desse estudo foi aprofundar a participação dos receptores purinérgicos e das E-NTPDases na progressão dos gliomas. A análise das culturas de linhagem de glioma C6 e de C6 ex vivo revelou similaridade na expressão de receptores purinérgicos e das E-NTPDases, sugerindo que alterações nessa via estariam presentes em culturas primárias de gliomas. Ao contrário do esperado, o restabelecimento da expressão da NTPDase2 nos gliomas resultou em aumento da malignidade tumoral. A superexpressão da NTPDase2 aumentou a adesão das células C6 em cultura e em experimentos in vivo promoveu dramático aumento do crescimento tumoral e presença de alterações histológicas nos pulmões sugestivas de metástase. Esses eventos foram relacionados ao acúmulo de ADP extracelular, recrutamento de plaquetas para a área tumoral e pulmonar, aumento de angiogênese e da resposta inflamatória, denotado pela presença de infiltrado leucocitário nos gliomas e aumento sérico das citocinas IL-1 , TNF-a e IL-6. Além disso, os receptores purinérgicos modularam a secreção espontânea e estimulada por TLR de IL-8 e MCP-1, bem como a proliferação celular induzida por LPS em linhagem de glioma humano. Finalmente, a análise da expressão das ectonucleotidases em gliomas de ratos e de humanos revelou ausência das NTPDase1 e 2, baixa expressão da NTPDase3 e expressão elevada da ecto-5´-NT/CD73, indicando que a alteração no padrão de expressão das ectonucleotidases também é uma característica de tumores humanos. Os resultados dessa tese reforçam a hipótese do envolvimento do sistema purinérgico na progressão dos gliomas e sugerem esse sistema como um alvo interessante no combate dos tumores cerebrais. / Extracellular nucleotides modulate a variety of biological actions via purinergic receptor activation. These effects are modulated by ectonucleotidases, such as ENTPDases and ecto-5´-NT/CD73, which hydrolyze ATP to adenosine in the extracellular milieu. Disruption on purinergic signaling has been involved in glioma progression. ATP induces glioma cell proliferation and, in opposite to astrocytes, gliomas have low expression of all NTPDases, particularly NTPDase2. Therefore, the restoration of the ATPase activity to gliomas could be a strategy to overcome the ATP mediated effects. Accordingly, the co-injection of apyrase/NTPDase1, an ATP scavenger, with gliomas decreases the glioma progression in vivo. The objective of this study was to better evaluate the purinergic receptor and E-NTPDase participation on glioma progression. The analysis of C6 cell line and C6 ex vivo cultures revealed similarity in the purinergic receptor and E-NTPDase expression, suggesting that disruption in the purinergic pathway is a characteristic exhibited by primary glioma cell cultures. Surprisingly, the NTPDase2 restoration to C6 gliomas resulted in increased tumor malignity. The NTPDase2 overexpression increased the C6 cell adhesion in culture and in in vivo experiments it promoted dramatic glioma growth and induced histological alterations in lung tissue suggestive of metastasis. These events were related to extracellular ADP accumulation, platelets recruitment to glioma and lung tissues, increase of angiogenesis and inflammation. Additionally, it was observed an increase of leukocyte infiltration in the implanted tumors and in IL-1 , TNF-a e IL-6 serum levels. Moreover, the purinergic receptors modulated the basal and TLR stimulated IL-8 and MCP-1 release and the LPS induced cell proliferation in a human glioma cell line. Finally, the analysis of ectonucleotidases expression in rat and human gliomas showed the absence of NTPDase1 and 2, low expression of NTPDase3 and high expression of ecto-5´-NT/CD73, indicating that alterations in the ectonucleotidase expression pattern is a characteristic also exhibited by human tumors. In conclusion, these results reinforce the hypothesis of purinergic signaling involvement in glioma progression and point to this pathway as an interesting target for glioma treatment.

Os nucleotídeos extracelulares modulam uma variedade de ações biológicas via ativação de receptores purinérgicos. Esses efeitos são controlados pela ação de ectonucleotidases, tais como as E-NTPDases e a ecto-5´-NT/CD73, as quais hidrolisam o ATP até adenosina no meio extracelular. Alterações no sistema purinérgico podem estar envolvidas na progressão dos gliomas. O ATP induz a proliferação celular dos gliomas e, ao contrário dos astrócitos, gliomas apresentam baixa expressão das E-NTPDases, particularmente da NTPDase2. Assim, a restauração da atividade ATPásica nesses tumores poderia ser uma estratégia para prevenir as ações mediadas pelo ATP. De acordo com essa idéia, a coinjeção de apirase/NTPDase1, uma enzima depletora de ATP, e gliomas diminuiu a progressão tumoral in vivo. O objetivo desse estudo foi aprofundar a participação dos receptores purinérgicos e das E-NTPDases na progressão dos gliomas. A análise das culturas de linhagem de glioma C6 e de C6 ex vivo revelou similaridade na expressão de receptores purinérgicos e das E-NTPDases, sugerindo que alterações nessa via estariam presentes em culturas primárias de gliomas. Ao contrário do esperado, o restabelecimento da expressão da NTPDase2 nos gliomas resultou em aumento da malignidade tumoral. A superexpressão da NTPDase2 aumentou a adesão das células C6 em cultura e em experimentos in vivo promoveu dramático aumento do crescimento tumoral e presença de alterações histológicas nos pulmões sugestivas de metástase. Esses eventos foram relacionados ao acúmulo de ADP extracelular, recrutamento de plaquetas para a área tumoral e pulmonar, aumento de angiogênese e da resposta inflamatória, denotado pela presença de infiltrado leucocitário nos gliomas e aumento sérico das citocinas IL-1 , TNF-a e IL-6. Além disso, os receptores purinérgicos modularam a secreção espontânea e estimulada por TLR de IL-8 e MCP-1, bem como a proliferação celular induzida por LPS em linhagem de glioma humano. Finalmente, a análise da expressão das ectonucleotidases em gliomas de ratos e de humanos revelou ausência das NTPDase1 e 2, baixa expressão da NTPDase3 e expressão elevada da ecto-5´-NT/CD73, indicando que a alteração no padrão de expressão das ectonucleotidases também é uma característica de tumores humanos. Os resultados dessa tese reforçam a hipótese do envolvimento do sistema purinérgico na progressão dos gliomas e sugerem esse sistema como um alvo interessante no combate dos tumores cerebrais. / Extracellular nucleotides modulate a variety of biological actions via purinergic receptor activation. These effects are modulated by ectonucleotidases, such as ENTPDases and ecto-5´-NT/CD73, which hydrolyze ATP to adenosine in the extracellular milieu. Disruption on purinergic signaling has been involved in glioma progression. ATP induces glioma cell proliferation and, in opposite to astrocytes, gliomas have low expression of all NTPDases, particularly NTPDase2. Therefore, the restoration of the ATPase activity to gliomas could be a strategy to overcome the ATP mediated effects. Accordingly, the co-injection of apyrase/NTPDase1, an ATP scavenger, with gliomas decreases the glioma progression in vivo. The objective of this study was to better evaluate the purinergic receptor and E-NTPDase participation on glioma progression. The analysis of C6 cell line and C6 ex vivo cultures revealed similarity in the purinergic receptor and E-NTPDase expression, suggesting that disruption in the purinergic pathway is a characteristic exhibited by primary glioma cell cultures. Surprisingly, the NTPDase2 restoration to C6 gliomas resulted in increased tumor malignity. The NTPDase2 overexpression increased the C6 cell adhesion in culture and in in vivo experiments it promoted dramatic glioma growth and induced histological alterations in lung tissue suggestive of metastasis. These events were related to extracellular ADP accumulation, platelets recruitment to glioma and lung tissues, increase of angiogenesis and inflammation. Additionally, it was observed an increase of leukocyte infiltration in the implanted tumors and in IL-1 , TNF-a e IL-6 serum levels. Moreover, the purinergic receptors modulated the basal and TLR stimulated IL-8 and MCP-1 release and the LPS induced cell proliferation in a human glioma cell line. Finally, the analysis of ectonucleotidases expression in rat and human gliomas showed the absence of NTPDase1 and 2, low expression of NTPDase3 and high expression of ecto-5´-NT/CD73, indicating that alterations in the ectonucleotidase expression pattern is a characteristic also exhibited by human tumors. In conclusion, these results reinforce the hypothesis of purinergic signaling involvement in glioma progression and point to this pathway as an interesting target for glioma treatment.

Tumor de bexiga é o tipo de tumor mais comum que ocorre no trato urinário, originado a partir do epitélio estratificado da bexiga. A incidência em homens é maior do que em mulheres, está associado com a industrialização e relacionado com a origem ocupacional do paciente. Mais de 90% dos tumores de bexiga são devidos a alterações neste epitélio, sendo o principal tipo, o tumor nas células transicionais. A linhagem T24 de tumor de bexiga humana tem sido usada como modelo de tumor invasivo de bexiga. Nucleotídeos são uma importante classe de moléculas sinalizadoras, conhecidos por regular muitas funções pato-fisiológicas no espaço extracelular. O ATP extracelular é conhecido por mediar uma variedade de respostas biológicas no sistema nervoso central e periférico, principalmente pela ligação aos receptores acoplados à proteína G, P2Y ou pelos receptores ligados aos canais iônicos, P2X. A sinalização mediada pelos nucleotídeos é controlada por uma eficiente cascata enzimática que inclui os membros das ecto-nucleotidases ENTPDases, E-NPPs e ecto-fosfatases alcalinas as quais de formas diferenciadas podem gerar AMP que pode ser hidrolisado pela ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’-NT, CD73) gerando adenosina. Muitos estudos têm indicado que o ATP extracelular exerce um efeito primordial no trato urinário e que suas ações são mediadas por receptores P2. Baseado na ampla distribuição das ecto-nucleotidases em vários tipos de tecidos e considerando a potencial participação destas enzimas na regulação da sinalização purinérgica em tecido de bexiga normal e tumoral, o objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade das ectoenzimas e a presença dos receptores purinérgicos nas células T24 de tumor de bexiga humano. Muitos estudos vêm demonstrando evidências da relação entre o sistema purinérgico e o crescimento tumoral. Nossos resultados mostraram que as células T24 apresentam uma extrema diminuição da capacidade de hidrólise dos nucleotídeos tri- e difosfatados quando comparada com os nucleotídeos monofosfatados, que apresentam uma alta capacidade de hidrólise. Os resultados obtidos pela hidrólise mostram uma baixa expressão das E-NTPDases, contrastando com uma significante atividade da ecto-5’- nucleotidase, e pelo menos um membro da família das E-NPPs. Muitos papéis fisiológicos para a família das E-NPPs têm sido descritos incluindo reciclagem de nucleotídeos e modulação da sinalização purinérgica. No presente estudo nós analisamos a atividade desta enzima na linhagem celular T24 em pH ótimo para as E-NPPs e em pH fisiológico para cultura de células. Curvas de tempo e substrato mostraram atividade das E-NPPs apenas no pH ótimo da enzima. A análise por RT-PCR mostrou a presença apenas da E-NPP1. Quanto à expressão das ecto-enzimas, nosso estudo mostrou que a linhagem T24 expressa apenas a E-NTPDase 5 (CD39L4) e não expressa as demais E-NTPDases. Nós identificamos todos os receptores P2Y nas células, dando suporte a idéia de que alterações no número de células tumorais pode ser devido a modulação da proliferação celular via receptores P2. Em nosso estudo também investigamos o efeito do ATP extracelular nas células T24, em diferentes concentrações e tempos de tratamento, mostrando que o ATP extracelular diminui significativamente o número de células. Estes dados indicam que as vias de sinalização purinérgica podem ter um importante papel na regulação das funções da bexiga urinária. Outros estudos são necessários para confirmar as funções do sistema purinérgico nos tumores de bexiga e as possíveis terapias antitumorais. / Bladder cancer is the most commonly tumor occurring in urinary tract, originating from normal stratified transitional epithelium of the bladder. The incidence in men is bigger than in women and is associated with industrialization and related to occupational origin. More than 90% of histological cell type of bladder cancer is transitional cell carcinoma. The T24 cell is a lineage of human bladder transitional cell carcinoma, and it has been used as model of invasive bladder cancer. Nucleotides, an important class of signaling molecules, are known to regulate many pathophysiological functions in the extracellular space. Extracellular ATP is recognized as an agonist that mediates a wide variety of biological responses in the central and peripheral nervous systems, largely by binding to either G protein-coupled receptors P2Y or ligand- gated P2X receptors. The nucleotide-mediated signaling is controlled by a highly efficient enzymatic cascade which includes the members of E-NTPDase (ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase) family, E-NPP (ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase) family and ecto-alkaline phosphatases. The AMP formed by the action of these enzymes is hydrolyzed to adenosine by the action of an ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’-NT, CD73). Although several lines of evidence have indicated that extracellular ATP plays primordial role in the urinary tract and these actions are mediated by P2 receptors. Based on the wide distribution of ecto-nucleotidases in various tissues and considering the potential participation of these enzymes in the regulation of purinergic signaling in normal and tumoral bladder tissues, the objective of the present study was to examine the activity of ecto-enzymes and the presence of the purinergic receptors in T24 human bladder tumor cell line. Several studies have demonstrated evidence for the relation between the purinergic signaling and tumor growth. Our results show that T24 cell line presents an extremely decreased capacity to hydrolyze all tri- and di-phosphate nucleosides when compared to the nucleoside monophosphates, which have a higher capacity to hydrolyze. The results obtained show a low expression of E- NTPDases, contrasting to a significant activity of ecto-5’-nucleotidase, and at least one of the enzymes family of E-NPPs. Multiple physiological roles for E-NPPs have been related, including nucleotide recycling and modulation of purinergic receptor signaling. In the present study, we describe an enzyme activity in T24 cell line in the optimum pH for ENPP and in physiological pH to the culture cells. Time and substrate curve have shown an E-NPP activity only in the enzyme optimal pH. The RT-PCR analysis showed the presence of only the E-NPP1. Regarding the expression of the ecto-enzymes, our study has showed that the T24 cell line expresses only the E-NTPDase 5 (CD39L4) and does not express the other E-NTPDases. We have identified all P2Y receptors in the cell line studied supporting the idea that the alteration of cancer cell number might be due to modulation of cell proliferation via P2 receptors. In this study we also investigated the effects of extracellular ATP in T24 cell line in different concentrations and times of treatment. As shown, the extracellular ATP decreases significantly the cell number. These data could indicate that the purinergic signaling pathways may play an important role in regulating urinary bladder function. Further studies to provide functions for the purinergic system in bladder tumor will be necessary to improve the possibilities of antitumor therapies.

Os nucleotídeos extracelulares modulam uma variedade de ações biológicas via ativação de receptores purinérgicos. Esses efeitos são controlados pela ação de ectonucleotidases, tais como as E-NTPDases e a ecto-5´-NT/CD73, as quais hidrolisam o ATP até adenosina no meio extracelular. Alterações no sistema purinérgico podem estar envolvidas na progressão dos gliomas. O ATP induz a proliferação celular dos gliomas e, ao contrário dos astrócitos, gliomas apresentam baixa expressão das E-NTPDases, particularmente da NTPDase2. Assim, a restauração da atividade ATPásica nesses tumores poderia ser uma estratégia para prevenir as ações mediadas pelo ATP. De acordo com essa idéia, a coinjeção de apirase/NTPDase1, uma enzima depletora de ATP, e gliomas diminuiu a progressão tumoral in vivo. O objetivo desse estudo foi aprofundar a participação dos receptores purinérgicos e das E-NTPDases na progressão dos gliomas. A análise das culturas de linhagem de glioma C6 e de C6 ex vivo revelou similaridade na expressão de receptores purinérgicos e das E-NTPDases, sugerindo que alterações nessa via estariam presentes em culturas primárias de gliomas. Ao contrário do esperado, o restabelecimento da expressão da NTPDase2 nos gliomas resultou em aumento da malignidade tumoral. A superexpressão da NTPDase2 aumentou a adesão das células C6 em cultura e em experimentos in vivo promoveu dramático aumento do crescimento tumoral e presença de alterações histológicas nos pulmões sugestivas de metástase. Esses eventos foram relacionados ao acúmulo de ADP extracelular, recrutamento de plaquetas para a área tumoral e pulmonar, aumento de angiogênese e da resposta inflamatória, denotado pela presença de infiltrado leucocitário nos gliomas e aumento sérico das citocinas IL-1 , TNF-a e IL-6. Além disso, os receptores purinérgicos modularam a secreção espontânea e estimulada por TLR de IL-8 e MCP-1, bem como a proliferação celular induzida por LPS em linhagem de glioma humano. Finalmente, a análise da expressão das ectonucleotidases em gliomas de ratos e de humanos revelou ausência das NTPDase1 e 2, baixa expressão da NTPDase3 e expressão elevada da ecto-5´-NT/CD73, indicando que a alteração no padrão de expressão das ectonucleotidases também é uma característica de tumores humanos. Os resultados dessa tese reforçam a hipótese do envolvimento do sistema purinérgico na progressão dos gliomas e sugerem esse sistema como um alvo interessante no combate dos tumores cerebrais. / Extracellular nucleotides modulate a variety of biological actions via purinergic receptor activation. These effects are modulated by ectonucleotidases, such as ENTPDases and ecto-5´-NT/CD73, which hydrolyze ATP to adenosine in the extracellular milieu. Disruption on purinergic signaling has been involved in glioma progression. ATP induces glioma cell proliferation and, in opposite to astrocytes, gliomas have low expression of all NTPDases, particularly NTPDase2. Therefore, the restoration of the ATPase activity to gliomas could be a strategy to overcome the ATP mediated effects. Accordingly, the co-injection of apyrase/NTPDase1, an ATP scavenger, with gliomas decreases the glioma progression in vivo. The objective of this study was to better evaluate the purinergic receptor and E-NTPDase participation on glioma progression. The analysis of C6 cell line and C6 ex vivo cultures revealed similarity in the purinergic receptor and E-NTPDase expression, suggesting that disruption in the purinergic pathway is a characteristic exhibited by primary glioma cell cultures. Surprisingly, the NTPDase2 restoration to C6 gliomas resulted in increased tumor malignity. The NTPDase2 overexpression increased the C6 cell adhesion in culture and in in vivo experiments it promoted dramatic glioma growth and induced histological alterations in lung tissue suggestive of metastasis. These events were related to extracellular ADP accumulation, platelets recruitment to glioma and lung tissues, increase of angiogenesis and inflammation. Additionally, it was observed an increase of leukocyte infiltration in the implanted tumors and in IL-1 , TNF-a e IL-6 serum levels. Moreover, the purinergic receptors modulated the basal and TLR stimulated IL-8 and MCP-1 release and the LPS induced cell proliferation in a human glioma cell line. Finally, the analysis of ectonucleotidases expression in rat and human gliomas showed the absence of NTPDase1 and 2, low expression of NTPDase3 and high expression of ecto-5´-NT/CD73, indicating that alterations in the ectonucleotidase expression pattern is a characteristic also exhibited by human tumors. In conclusion, these results reinforce the hypothesis of purinergic signaling involvement in glioma progression and point to this pathway as an interesting target for glioma treatment.

Tumor de bexiga é o tipo de tumor mais comum que ocorre no trato urinário, originado a partir do epitélio estratificado da bexiga. A incidência em homens é maior do que em mulheres, está associado com a industrialização e relacionado com a origem ocupacional do paciente. Mais de 90% dos tumores de bexiga são devidos a alterações neste epitélio, sendo o principal tipo, o tumor nas células transicionais. A linhagem T24 de tumor de bexiga humana tem sido usada como modelo de tumor invasivo de bexiga. Nucleotídeos são uma importante classe de moléculas sinalizadoras, conhecidos por regular muitas funções pato-fisiológicas no espaço extracelular. O ATP extracelular é conhecido por mediar uma variedade de respostas biológicas no sistema nervoso central e periférico, principalmente pela ligação aos receptores acoplados à proteína G, P2Y ou pelos receptores ligados aos canais iônicos, P2X. A sinalização mediada pelos nucleotídeos é controlada por uma eficiente cascata enzimática que inclui os membros das ecto-nucleotidases ENTPDases, E-NPPs e ecto-fosfatases alcalinas as quais de formas diferenciadas podem gerar AMP que pode ser hidrolisado pela ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’-NT, CD73) gerando adenosina. Muitos estudos têm indicado que o ATP extracelular exerce um efeito primordial no trato urinário e que suas ações são mediadas por receptores P2. Baseado na ampla distribuição das ecto-nucleotidases em vários tipos de tecidos e considerando a potencial participação destas enzimas na regulação da sinalização purinérgica em tecido de bexiga normal e tumoral, o objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade das ectoenzimas e a presença dos receptores purinérgicos nas células T24 de tumor de bexiga humano. Muitos estudos vêm demonstrando evidências da relação entre o sistema purinérgico e o crescimento tumoral. Nossos resultados mostraram que as células T24 apresentam uma extrema diminuição da capacidade de hidrólise dos nucleotídeos tri- e difosfatados quando comparada com os nucleotídeos monofosfatados, que apresentam uma alta capacidade de hidrólise. Os resultados obtidos pela hidrólise mostram uma baixa expressão das E-NTPDases, contrastando com uma significante atividade da ecto-5’- nucleotidase, e pelo menos um membro da família das E-NPPs. Muitos papéis fisiológicos para a família das E-NPPs têm sido descritos incluindo reciclagem de nucleotídeos e modulação da sinalização purinérgica. No presente estudo nós analisamos a atividade desta enzima na linhagem celular T24 em pH ótimo para as E-NPPs e em pH fisiológico para cultura de células. Curvas de tempo e substrato mostraram atividade das E-NPPs apenas no pH ótimo da enzima. A análise por RT-PCR mostrou a presença apenas da E-NPP1. Quanto à expressão das ecto-enzimas, nosso estudo mostrou que a linhagem T24 expressa apenas a E-NTPDase 5 (CD39L4) e não expressa as demais E-NTPDases. Nós identificamos todos os receptores P2Y nas células, dando suporte a idéia de que alterações no número de células tumorais pode ser devido a modulação da proliferação celular via receptores P2. Em nosso estudo também investigamos o efeito do ATP extracelular nas células T24, em diferentes concentrações e tempos de tratamento, mostrando que o ATP extracelular diminui significativamente o número de células. Estes dados indicam que as vias de sinalização purinérgica podem ter um importante papel na regulação das funções da bexiga urinária. Outros estudos são necessários para confirmar as funções do sistema purinérgico nos tumores de bexiga e as possíveis terapias antitumorais. / Bladder cancer is the most commonly tumor occurring in urinary tract, originating from normal stratified transitional epithelium of the bladder. The incidence in men is bigger than in women and is associated with industrialization and related to occupational origin. More than 90% of histological cell type of bladder cancer is transitional cell carcinoma. The T24 cell is a lineage of human bladder transitional cell carcinoma, and it has been used as model of invasive bladder cancer. Nucleotides, an important class of signaling molecules, are known to regulate many pathophysiological functions in the extracellular space. Extracellular ATP is recognized as an agonist that mediates a wide variety of biological responses in the central and peripheral nervous systems, largely by binding to either G protein-coupled receptors P2Y or ligand- gated P2X receptors. The nucleotide-mediated signaling is controlled by a highly efficient enzymatic cascade which includes the members of E-NTPDase (ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase) family, E-NPP (ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase) family and ecto-alkaline phosphatases. The AMP formed by the action of these enzymes is hydrolyzed to adenosine by the action of an ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’-NT, CD73). Although several lines of evidence have indicated that extracellular ATP plays primordial role in the urinary tract and these actions are mediated by P2 receptors. Based on the wide distribution of ecto-nucleotidases in various tissues and considering the potential participation of these enzymes in the regulation of purinergic signaling in normal and tumoral bladder tissues, the objective of the present study was to examine the activity of ecto-enzymes and the presence of the purinergic receptors in T24 human bladder tumor cell line. Several studies have demonstrated evidence for the relation between the purinergic signaling and tumor growth. Our results show that T24 cell line presents an extremely decreased capacity to hydrolyze all tri- and di-phosphate nucleosides when compared to the nucleoside monophosphates, which have a higher capacity to hydrolyze. The results obtained show a low expression of E- NTPDases, contrasting to a significant activity of ecto-5’-nucleotidase, and at least one of the enzymes family of E-NPPs. Multiple physiological roles for E-NPPs have been related, including nucleotide recycling and modulation of purinergic receptor signaling. In the present study, we describe an enzyme activity in T24 cell line in the optimum pH for ENPP and in physiological pH to the culture cells. Time and substrate curve have shown an E-NPP activity only in the enzyme optimal pH. The RT-PCR analysis showed the presence of only the E-NPP1. Regarding the expression of the ecto-enzymes, our study has showed that the T24 cell line expresses only the E-NTPDase 5 (CD39L4) and does not express the other E-NTPDases. We have identified all P2Y receptors in the cell line studied supporting the idea that the alteration of cancer cell number might be due to modulation of cell proliferation via P2 receptors. In this study we also investigated the effects of extracellular ATP in T24 cell line in different concentrations and times of treatment. As shown, the extracellular ATP decreases significantly the cell number. These data could indicate that the purinergic signaling pathways may play an important role in regulating urinary bladder function. Further studies to provide functions for the purinergic system in bladder tumor will be necessary to improve the possibilities of antitumor therapies.

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-20T15:33:03Z No. of bitstreams: 1 Anael Viana Pinto Alberto.pdf: 4150812 bytes, checksum: 9ce0a5d780533302dcc603ae65f510fe (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-20T15:33:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Anael Viana Pinto Alberto.pdf: 4150812 bytes, checksum: 9ce0a5d780533302dcc603ae65f510fe (MD5) Previous issue date: 2012-10-31 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / ATP e outros nucleotídeos são liberados para o meio extracelular por vias reguladas ou pela perda da integridade de membrana. Uma vez fora da célula, esses compostos podem ativar receptores P2: P2X (receptores ionotrópicos) e P2Y (receptores acoplados a proteínas G). Além disso, O receptor P2X7 é um importante membro da família P2X, já que sua ativação pode levar a abertura de um poro membranar que permite a passagem de moléculas de até 900 Da. Os eosinófilos são as principais células efetoras em respostas alérgicas e estão associados com diversos processos fisiológicos e patológicos. Nesse trabalho investigamos a expressão de receptores P2 e suas funções em eosinófilos. Nesse contexto, nosso primeiro passo foi investigar a expressão e funcionalidade dos receptores P2X por patch clamping. Nossos resultados sugerem a presença de P2X1, de P2X2 e de P2X7. Em seguida, avaliamos por microfluorimetria a funcionalidade dos receptores P2Y, e verificamos com base na ordem de potência a possível presença de P2Y2, de P2Y4, de P2Y6 e de P2Y11. Além disso, confirmamos nossos dados por imunofluorescência. Realizamos também ensaios de migração in vitro e in vivo, para verificar se os nucleotídeos extracelulares poderiam atrair eosinófilos. O ATP foi capaz de induzir a migração dos eosinófilos, enquanto a suramina, um bloqueador P2, aboliu esse efeito, tanto in vitro, utilizando transwell, como in vivo, utilizando um modelo de pleurisia alérgica em ratos. Em seguida, avaliamos o possível papel da panexina-1 como poro associado ao receptor P2X7. Nesse trabalho utilizamos inibidores de hemicanais em experimentos de patch clamp e em ensaios de permeabilização de corante. Os resultados indicam que os inibidores de hemicanais não bloquearam a geração de corrente ou a captação de corante após a ativação do receptor P2X7 em macrófagos de ratos e camundongos. Demonstramos que eosinófilos de rato expressam receptores P2X e P2Y por imunofluorescência. Além disso, demonstramos que a ativação de receptores P2 pode aumentar a migração de eosinófilos in vitro e in vivo. Além disso, foi demonstrado que inibidores de panexina-1 não bloqueiam a captação do corante ou a corrente gerada pela ativação do receptor P2X7. Os nossos resultados demostraram que panexina-1 não é o poro associado ao receptor P2X7 em macrófagos / ATP and other nucleotides are released from cells through regulated pathways or following the loss of plasma membrane integrity. Once outside the cell, these compounds can activate P2 receptors: P2X ionotropic receptors and G protein-coupled P2Y receptors. . Additionally, P2X7 receptor is an important member of the P2X family of ionotropic receptor as its activation opens a non-selective pore allowing the passage of molecules up to 900 Da. Eosinophils represent major effector cells in the allergic inflammatory response and they are, in fact, associated with several physiological and pathological processes. Here we investigate the expression of P2 receptors and roles of those receptors in murine eosinophils. In this context, our first step were to investigate the expression and functionality of the P2X receptors by patch clamping, our results suggest the presence of P2X1, P2X2 and P2X7. Next we evaluate by microfluorimetry the expression of P2Y receptors, our results based in the ranking order of potency suggests the presence of P2Y2, P2Y4, P2Y6 e P2Y11. Moreover, we confirmed our findings by immunofluorescence assays. We also did in vitro and in vivo migration assays to verify whether nucleotides could attract eosinophil. ATP increased migration of eosinophils, while suramin a P2 blocker abolished this effect in both in vitro, using trasnwell, and in vivo, using a model of rat allergic pleurisy. Next, we evaluated the putative role of pannexin-1 as the pore associated to the P2X7 receptor. We used hemichannels inhibitors in patch clamp and dye uptake experiments. The results indicate that they do not interfere with current generation or dye uptake after activation of P2X7R in rat and mouse macrophages. We have demonstrated that rat eosinophils express P2X and P2Y receptors by immunofluorescence. In addition, the activation of P2 receptors can increase migration of eosinophils in vitro and in vivo. Moreover, we demonstrated that specific inhibitors of pannexin-1 did not interfere with the dye uptake or current generated by the P2X7 activation. Our results showed that pannexin-1 is not the pore associated to the P2X7 receptor in macrophages.

As doenças infecciosas estão entre as principais causas de morte no mundo. Nas infecções bacterianas, os componentes das paredes destes organismos são descritos como os principais antígenos. Os macrófagos estão diretamente envolvidos no reconhecimento e ataque de agentes patogênicos, além de atuarem como moduladores da resposta imunológica. Os macrófagos participam do combate às infecções bacterianas através da fagocitose dos agentes patogênicos e da produção de diversos mediadores inflamatórios como citocinas, metaloproteinases (MMP), espécies reativas de oxigênio (ROS) e óxido nítrico(NO). Estes mediadores são importantes na resposta inflamatória, contribuindo para o controle da infecção. Entretanto, a produção exacerbada destas moléculas contribui na patogênese das complicações associadas à inflamação, como a sepse e a falência múltipla de órgão. A maior parte dos estudos tem focado a resposta das células imunes a infecções por bactérias gram-negativas ou ao seu principal antígeno, o lipopolisacarídeo (LPS). No entanto, as infecções por bactérias gram-positivas são freqüentes e resultam em grande taxa de mortalidade. As doenças infecciosas estão entre as principais causas de morte no mundo. Nas infecções bacterianas, os componentes das paredes destes organismos são descritos como os principais antígenos. Os macrófagos estão diretamente envolvidos no reconhecimento e ataque de agentes patogênicos, além de atuarem como moduladores da resposta imunológica. Os macrófagos participam do combate às infecções bacterianas através da fagocitose dos agentes patogênicos e da produção de diversos mediadores inflamatórios como citocinas, metaloproteinases (MMP), espécies reativas de oxigênio (ROS) e óxido nítrico(NO). Estes mediadores são importantes na resposta inflamatória, contribuindo para o controle da infecção. Entretanto, a produção exacerbada destas moléculas contribui na patogênese das complicações associadas à inflamação, como a sepse e a falência múltipla de órgão. A maior parte dos estudos tem focado a resposta das células imunes a infecções por bactérias gram-negativas ou ao seu principal antígeno, o lipopolisacarídeo (LPS). No entanto, as infecções por bactérias gram-positivas são freqüentes e resultam em grande taxa de mortalidade. Os receptores de adenosina, em macrófagos, possuem função antiinflamatória em modelos de infecções por bactérias gram-negativas, no entanto, pouco se investigou a ação destes receptores em infecções por bactérias gram-positivas. O diabetes é uma doença metabólica comum que apresenta diversas complicações secundárias, muitas delas associadas aos níveis elevados de glicose. Os pacientes diabéticos apresentam uma ocorrência aumentada de infecções bacterianas, além de o diabetes tipo 2 estar associado com uma inflamação crônica, caracterizada por níveis plasmáticos aumentados de citocinas pró-inflamatórias. Adicionalmente, estes pacientes possuem maior risco de desenvolver doenças cardiovasculares e aterosclerose, o que tem sido relacionado à hiperglicemia e à inflamação crônica. A regulação, pela glicose, da resposta inflamatória em macrófagos expostos a bactérias gram-negativas ou ao seu antígeno principal, o LPS, é descrita, entretanto, a ação da glicose em modelos de infecções por bactérias gram-positivas não é conhecida. O tratamento dos macrófagos RAW 264.7 com concentrações elevadas de glicose aumentaram a resposta inflamatória ao LTA, com o aumento da produção de NO, TNF-a e MMP-9. Estes resultados mostram que tanto os receptores de adenosina como concentrações elevadas de glicose modulam a resposta inflamatória a S. aureus. Os receptores de adenosina parecem atuar num mecanismo autócrino de modulação da resposta inflamatória, apontando um possível alvo terapêutico. Já a modulação da resposta inflamatória dos macrófagos por concentrações aumentadas de glicose pode contribuir para complicações associadas ao diabetes, como a aterosclerose e a inflamação crônica. / Infectious diseases are among the majors causes of mortality around the world. In bacterial infections, the bacterial cell wall components are described as the main antigens. The macrophages are key mediators of inflammatory response, acting in the attack to the pathogens and in the regulation of immune response. These cells act in the phagocytosis of pathogenic agents and in the production of inflammatory mediators, like cytokines, matrix-metalloproteinases (MMP), reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide (NO). These mediators participate of inflammatory response, acting in infection control, notwithstanding, exacerbated production of these molecules could contribute to inflammatory complications, like sepsis and multiple organ failure. Several studies has addressed the inflammatory response to gram-negative bacterial infections or lipopolysaccharide (LPS), the main antigen of these microorganisms, however grampositive bacterial infections are prevalent and associated to high mortality. The adenosine receptors are described to possess anti-inflammatory properties in macrophages in gram-negative bacterial infections models but the role of these receptors in gram-positive bacterial infections is unknown. Diabetes is a prevalent metabolic disorder which presents several associated complications; much of them associated to increased glucose levels. Diabetic patients shown increased occurrence of bacterial infections and type 2 diabetes is associated to a chronic inflammatory state, with increased circulatory levels of pro-inflammatory cytokines. Type 2 diabetic patients possess increased risk of cardiovascular diseases and atherogenesis, which has been associated to hyperglycemia and chronic inflammation. The regulation of macrophages inflammatory response to gram-negative bacterial infections or to its antigen LPS by increased levels of glucose is described, however, the role of increased glucose in gram-positive bacterial infections is unknown. For this reasons, we studied the role of adenosine receptors and increased glucose in macrophages activation by Staphylococcus aureus antigens, considering that this bacteria is the major organism in hospital infections. The treatment of RAW 264.7 macrophages with S. aureus antigens lipoteichoic acid (LTA) and peptidoglycan (PEG) resulted in the production of proinflammatory mediators. Diabetes is a prevalent metabolic disorder which presents several associated complications; much of them associated to increased glucose levels. Diabetic patients shown increased occurrence of bacterial infections and type 2 diabetes is associated to a chronic inflammatory state, with increased circulatory levels of pro-inflammatory cytokines. Type 2 diabetic patients possess increased risk of cardiovascular diseases and atherogenesis, which has been associated to hyperglycemia and chronic inflammation. The regulation of macrophages inflammatory response to gram-negative bacterial infections or to its antigen LPS by increased levels of glucose is described, however, the role of increased glucose in gram-positive bacterial infections is unknown. For this reasons, we studied the role of adenosine receptors and increased glucose in macrophages activation by Staphylococcus aureus antigens, considering that this bacteria is the major organism in hospital infections. The treatment of RAW 264.7 macrophages with S. aureus antigens lipoteichoic acid (LTA) and peptidoglycan (PEG) resulted in the production of proinflammatory mediators.

As doenças infecciosas estão entre as principais causas de morte no mundo. Nas infecções bacterianas, os componentes das paredes destes organismos são descritos como os principais antígenos. Os macrófagos estão diretamente envolvidos no reconhecimento e ataque de agentes patogênicos, além de atuarem como moduladores da resposta imunológica. Os macrófagos participam do combate às infecções bacterianas através da fagocitose dos agentes patogênicos e da produção de diversos mediadores inflamatórios como citocinas, metaloproteinases (MMP), espécies reativas de oxigênio (ROS) e óxido nítrico(NO). Estes mediadores são importantes na resposta inflamatória, contribuindo para o controle da infecção. Entretanto, a produção exacerbada destas moléculas contribui na patogênese das complicações associadas à inflamação, como a sepse e a falência múltipla de órgão. A maior parte dos estudos tem focado a resposta das células imunes a infecções por bactérias gram-negativas ou ao seu principal antígeno, o lipopolisacarídeo (LPS). No entanto, as infecções por bactérias gram-positivas são freqüentes e resultam em grande taxa de mortalidade. As doenças infecciosas estão entre as principais causas de morte no mundo. Nas infecções bacterianas, os componentes das paredes destes organismos são descritos como os principais antígenos. Os macrófagos estão diretamente envolvidos no reconhecimento e ataque de agentes patogênicos, além de atuarem como moduladores da resposta imunológica. Os macrófagos participam do combate às infecções bacterianas através da fagocitose dos agentes patogênicos e da produção de diversos mediadores inflamatórios como citocinas, metaloproteinases (MMP), espécies reativas de oxigênio (ROS) e óxido nítrico(NO). Estes mediadores são importantes na resposta inflamatória, contribuindo para o controle da infecção. Entretanto, a produção exacerbada destas moléculas contribui na patogênese das complicações associadas à inflamação, como a sepse e a falência múltipla de órgão. A maior parte dos estudos tem focado a resposta das células imunes a infecções por bactérias gram-negativas ou ao seu principal antígeno, o lipopolisacarídeo (LPS). No entanto, as infecções por bactérias gram-positivas são freqüentes e resultam em grande taxa de mortalidade. Os receptores de adenosina, em macrófagos, possuem função antiinflamatória em modelos de infecções por bactérias gram-negativas, no entanto, pouco se investigou a ação destes receptores em infecções por bactérias gram-positivas. O diabetes é uma doença metabólica comum que apresenta diversas complicações secundárias, muitas delas associadas aos níveis elevados de glicose. Os pacientes diabéticos apresentam uma ocorrência aumentada de infecções bacterianas, além de o diabetes tipo 2 estar associado com uma inflamação crônica, caracterizada por níveis plasmáticos aumentados de citocinas pró-inflamatórias. Adicionalmente, estes pacientes possuem maior risco de desenvolver doenças cardiovasculares e aterosclerose, o que tem sido relacionado à hiperglicemia e à inflamação crônica. A regulação, pela glicose, da resposta inflamatória em macrófagos expostos a bactérias gram-negativas ou ao seu antígeno principal, o LPS, é descrita, entretanto, a ação da glicose em modelos de infecções por bactérias gram-positivas não é conhecida. O tratamento dos macrófagos RAW 264.7 com concentrações elevadas de glicose aumentaram a resposta inflamatória ao LTA, com o aumento da produção de NO, TNF-a e MMP-9. Estes resultados mostram que tanto os receptores de adenosina como concentrações elevadas de glicose modulam a resposta inflamatória a S. aureus. Os receptores de adenosina parecem atuar num mecanismo autócrino de modulação da resposta inflamatória, apontando um possível alvo terapêutico. Já a modulação da resposta inflamatória dos macrófagos por concentrações aumentadas de glicose pode contribuir para complicações associadas ao diabetes, como a aterosclerose e a inflamação crônica. / Infectious diseases are among the majors causes of mortality around the world. In bacterial infections, the bacterial cell wall components are described as the main antigens. The macrophages are key mediators of inflammatory response, acting in the attack to the pathogens and in the regulation of immune response. These cells act in the phagocytosis of pathogenic agents and in the production of inflammatory mediators, like cytokines, matrix-metalloproteinases (MMP), reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide (NO). These mediators participate of inflammatory response, acting in infection control, notwithstanding, exacerbated production of these molecules could contribute to inflammatory complications, like sepsis and multiple organ failure. Several studies has addressed the inflammatory response to gram-negative bacterial infections or lipopolysaccharide (LPS), the main antigen of these microorganisms, however grampositive bacterial infections are prevalent and associated to high mortality. The adenosine receptors are described to possess anti-inflammatory properties in macrophages in gram-negative bacterial infections models but the role of these receptors in gram-positive bacterial infections is unknown. Diabetes is a prevalent metabolic disorder which presents several associated complications; much of them associated to increased glucose levels. Diabetic patients shown increased occurrence of bacterial infections and type 2 diabetes is associated to a chronic inflammatory state, with increased circulatory levels of pro-inflammatory cytokines. Type 2 diabetic patients possess increased risk of cardiovascular diseases and atherogenesis, which has been associated to hyperglycemia and chronic inflammation. The regulation of macrophages inflammatory response to gram-negative bacterial infections or to its antigen LPS by increased levels of glucose is described, however, the role of increased glucose in gram-positive bacterial infections is unknown. For this reasons, we studied the role of adenosine receptors and increased glucose in macrophages activation by Staphylococcus aureus antigens, considering that this bacteria is the major organism in hospital infections. The treatment of RAW 264.7 macrophages with S. aureus antigens lipoteichoic acid (LTA) and peptidoglycan (PEG) resulted in the production of proinflammatory mediators. Diabetes is a prevalent metabolic disorder which presents several associated complications; much of them associated to increased glucose levels. Diabetic patients shown increased occurrence of bacterial infections and type 2 diabetes is associated to a chronic inflammatory state, with increased circulatory levels of pro-inflammatory cytokines. Type 2 diabetic patients possess increased risk of cardiovascular diseases and atherogenesis, which has been associated to hyperglycemia and chronic inflammation. The regulation of macrophages inflammatory response to gram-negative bacterial infections or to its antigen LPS by increased levels of glucose is described, however, the role of increased glucose in gram-positive bacterial infections is unknown. For this reasons, we studied the role of adenosine receptors and increased glucose in macrophages activation by Staphylococcus aureus antigens, considering that this bacteria is the major organism in hospital infections. The treatment of RAW 264.7 macrophages with S. aureus antigens lipoteichoic acid (LTA) and peptidoglycan (PEG) resulted in the production of proinflammatory mediators.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:44:34Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A pilocarpina é um agonista colinérgico que, quando injetada em altas doses (i.p.) a ratos, reproduz as principais características da epilepsia do lobo temporal (ELT) humana. O animal exibe diferentes padrões de comportamentos, incluindo status epilepticus (fase aguda), normalização comportamental (fase latente) e finalmente crises espontâneas e recorrentes (fase crônica). Os objetivos desse estudo foram analisar por microdiálise e HPLC a concentração de ATP e seus metabólitos na formação hipocampal de ratos que se encontram nas fases aguda e crônica do modelo experimental de ELT induzida por pilocarpina, e avaliar através de imunoblot e imuno-histoquímica, os receptores P2X2,4,7 na formação hipocampal desses animais, incluindo o grupo latente. O procedimento de microdiálise foi aplicado para determinação da concentração de purinas liberadas durante o status epilepticus (SE) em amostras coletadas nos seguintes tempos: Basal (3 amostras antes de qualquer tratamento), após a administração de metilescopolamina (usada para minimizar os efeitos periféricos da pilocarpina) e 30 min. 1H, 2H, 3H e 4H após a aplicação da pilocarpina. Os animais crônicos foram estudados nos períodos interictal e ictal. As amostras foram analisadas por HPLC com detecção por fluorescência. Animais de três grupos experimentais (G12H; GLat; GCro) e respectivos controles, foram empregados para o estudo dos receptores P2X2,4,7, através de imunoblot e imuno-histoquímica. O imunoblot foi revelado por quimiluminescência. A imuno-histoquímica foi feita com cortes fixados e flutuantes em tampão, usando anticorpo biotinilado e kit ABC e revelação com diaminobenzidina. O estudo bioquímico revelou um aumento de ADP, AMP e adenosina durante o SE. Na fase crônica, evidenciou-se uma redução de todas as purinas no período interictal, e um aumento das mesmas no período ictal, sendo significante para o ATP e adenosina. Em relação aos receptores estudados por imuno-histoquímica e imunoblot, observou-se uma intensa redução dos P2X4 versus CT no período crônico (35%, p<0.001, ANOVA), um aumento do P2X7 nas fases aguda e crônica (G12H: 20%, p<0,05; GCRO: 18% p<0,05, ANOVA).Com base nos resultados, conclui-se que o metabolismo das purinas está alterado na fisiopatologia da ELT induzida por pilocarpina, por exemplo, na fase aguda o aumento na concentração de ADP, AMP e de adenosina, pode estar refletindo um aumento na taxa metabólica do ATP pelas ectonucleotidases, como um mecanismo compensatório inibitório. No entanto, o ATP antes de ser metabolizado pode estar ativando receptores P2X7, e exercendo um papel importante na citotoxicidade. Já na fase crônica, a redução das purinas, infere principalmente um comprometimento na atividade inibitória mediada pela adenosina, que por sua vez pode facilitar a susceptibilidade às crises epilépticas. / Pilocarpine, a muscarinic cholinergic agonist when inject at high doses (i.p.) in rats, reproduces the main characteristics of Human Temporal Lobe Epilepsy (TLE). The animal exhibits different patterns of behavior, including status epilepticus (acute phase), electrophysiological and behavioral normalization (latent phase) and spontaneous recurrent seizures (chronic phase). The objectives of this study were to analyze by means of microdyalysis and HPLC, the concentration of ATP and its metabolites ADP, AMP and adenosine in the hippocampal formation of rats during the acute and chronic phases of pilocarpine model, and evaluating by western blotting and immunohistochemistry, the receptors P2X2,4,7 in the hippocampal formation of these animals. The microdyalysis procedure used to determine the purines concentration in the acute period, was taken according to the following periods of time: Basal (three samples before treatment onset), after methylscopolamine injection (used in order to minimize the peripheral effects of pilocarpine) and 30 min. 1h, 2h, 3h and 4h after pilocarpine injection. Chronic animals were studied during the interictal and ictal period. The samples were analyzed by a fluorescence detector coupled to HPLC. Animals from three different experimental groups (Group 12h = G 12h, Latent Group = G Lat, Chronic Group = G Cro) and their respective controls were utilized to analyze the purinergic receptors P2X2,4,7, by means of western blotting and immunohistochemistry. The immunohistochemistry was achieved with fixated slices floating on buffer solution, using biotinylated antibody, ABC kit and development with diaminobenzidine. The biochemical study revealed an increase of ADP, AMP and adenosine concentrations during the SE. In contrast, a reduction of all purines was detected in the hippocampal formation during the interictal period of chronic rats. Rats studied during the ictal phase, exhibited high concentrations of ATP and adenosine. The immunohistochemistry and western blotting analysis showed a great reduction of P2X4, versus CT in the chronic period (35%, p<0.001, ANOVA), and an increase of P2X7, in the acute and chronic phases (G12H: 20%, p<0.05; GCRO: 18% p<0.05, ANOVA). According to these findings, we can conclude that the metabolism of purines is altered in the hippocampal formation of rats in pilocarpine-induced epilepsy. In the acute phase, the increase of ATP metabolites may reflect an increase in the metabolism rates of ATP by the ectonucleotidases, possibly as a compensatory inhibitory mechanism. On the other hand, before ATP is hydrolyzed, it may activate P2X7 purinoceptor, and consequently, intensify hyperexcitability and cytotoxicity cascades. A decrease in all purines analyzed in the chronic phase could suggest an energy metabolism dysfunction in the epileptic hippocampus. The decrease in the adenosine concentrations might facilitate the onset of spontaneous and recurrent seizures. / BV UNIFESP: Teses e dissertações