O sistema purinérgico tem sido amplamente implicado em condições médicas, entre elas, o transtorno bipolar (TB). Até onde sabemos, nenhum estudo foi realizado com o objetivo de esclarecer a possível contribuição do receptor P2X7 (P2X7R) na patofisiologia do TB ou mesmo com o objetivo de revisar o que já fora previamente publicado sobre este assunto. Nos presentes trabalhos, nosso objetivo foi em primeiro lugar explorar a relação entre o receptor e esse transtorno e identificar os mecanismos pelos quais o P2X7R desempenha um papel no TB e por fim revisar a literatura, focando na sinalização purinérgica no TB, com ênfase na sinalização por ATP e adenosina, destacando o potencial papel do P2X7R na modulação da inflamação e ativação microglial em pacientes bipolares. Para o primeiro objetivo, analisamos o efeito de moduladores do P2X7R (BzATP, BBG e A438079) sobre o comportamento (atividade locomotora) e sobre marcadores de neuroinflamação (IL-1 , TNF- e IL-6), excitotoxicidade (GFAP, TBARS) e neuroplasticidade (BDNF) em um modelo farmacológico de mania induzido pelo tratamento agudo e crônico com D – anfetamina (AMPH) (2mg/kg). Demonstramos na atividade locomotora uma aparente falta de capacidade de resposta à AMPH por animais com P2X7R bloqueado ou ausente (P2X7R-/-). Da mesma forma, observamos que o P2X7R participa do aumento do ambiente próinflamatório e excitotóxico induzido pela AMPH, demonstrado pelo papel de reversão do bloqueio do P2X7R ou pela perda de resposta dos animais P2X7R-/-. Em conclusão, nossos resultados suportam a hipótese de que o P2X7R possui um papel na patofisiologia do TB, como sugerido pelo nosso modelo animal, principalmente por mediar a neuroinflamação e a excitotoxicidade e finalmente levando a mudanças comportamentais. Assim, acreditamos que o P2X7R possui potencial para se tornar um alvo terapêutico do TB. Baseado neste cenário, estudos mais detalhados do papel do P2X7R no TB são necessários, especialmente devido à sua capacidade de agir sobre a microglia e modular a neuroinflamação e a excitotoxicidade. / The purinergic system has been increasingly implicated in medical conditions, among them bipolar disorder (BD). Up to date, no study has been conducted in order to clarify the possible contribution of the P2X7 receptor (P2X7R) to BD pathophysiology or even to review the previously data about this subject. In the presents works, we aim firstly to explore the association between the receptor and the disorder and identify the mechanisms by which the P2X7R plays a role in BD and lastly to review the literature focused on purinergic signaling in BD, with an emphasis on ATP and adenosine signaling, highlighting the potential role of P2X7R in modulating inflammation and microglia activation in bipolar patients. For the first aim, we analyzed the P2X7R modulatory effect (BzATP, BBG and A438079) on behavior (locomotor activity) and on markers of neuroinflammation (IL-1 , TNF- and IL-6), excitotoxicity (GFAP, TBARS), and neuroplasticity (BDNF) in a pharmacological model of mania induced by acute and chronic D-amphetamine (AMPH) treatment (2 mg/kg). We demonstrate in the locomotor activity an apparent lack of responsiveness to AMPH by animals with blocked or absent P2X7R (P2X7R-/-). Likewise, we observed that the P2X7R participates in the AMPH-induced increase of proinflammatory and excitotoxicity environment, demonstrated by the reversal role of P2X7R blockage or the lack of response by P2X7R-/- mice. In conclusion, our results provide support for the hypothesis that P2X7R plays a role in BD pathophysiology, as suggested by our animal model, mainly by mediating neuroinflammation and excitotoxicity and ultimately leading to behavioral changes. Thus, we believe that P2X7R has the potential to become a therapeutic target of BD. Based on this scenario, a more detailed study of the role of P2X7R in BD is warranted, especially due to its ability to act on microglia and modulate neuroinflammation and excitotoxicity.

Os nucleotídeos extracelulares modulam uma variedade de ações biológicas via ativação de receptores purinérgicos. Esses efeitos são controlados pela ação de ectonucleotidases, tais como as E-NTPDases e a ecto-5´-NT/CD73, as quais hidrolisam o ATP até adenosina no meio extracelular. Nas células imunes, o ATP pode atuar como uma molécula sinalizadora de perigo enquanto a adenosina, um produto da degradação do ATP, serve como um mecanismo que controla/limita a inflamação. Já, no sistema vascular, o ADP é um agonista fisiológico envolvido na hemostasia normal e na trombose. Considerando que os macrófagos são elementos chave para processos inflamatórios e quando estímulados exibibem um fenótipo pró-inflamatório/defesa (clássico/M1) ou antiinflamatório/reparatório (alterantivo/M2). O objetivo foi investigar a atividade e expressão das ectonuclotidases em diferentes fenótipos de macrófago e avaliar o efeito da homocisteína sobre essas enzimas em macrófagos e plaquetas.. As análises da diferenciação de macrófagos em fenótipo próinflamatório/ M1 e antiinflamatório/M2 revelaram presença igual de receptores purinérgicos. Entretanto, mudança no perfil das ectonucleotidases como E-NTPDase1, E-NTPDase3 e ecto-5’- nucleotidase foram encontradas, sugerindo que os macrófagos devem alterar a casacata purinérgica durante a ativação fenotípica. No fenótipo pró-inflamatório/M1 houve uma diminuição na hidrólise de ATP, sugerindo um acúmulo do mesmo, enquanto no fenótipo antiinflamatório/M2 as enzimas conduzem para uma progressiva diminuição nas concentrações de nucleotídeos (ATP) e aumento na disponibilidade de adenosina. Já os macrófagos expostos a homocisteína apresentaram uma polarização para o fenótipo pro-inflamatório (M1) e nossos achados sugerem o envolvimento da ENTPDase3 e da ecto-5’-nucleotidase em macrófagos nas complicações inflamatórias associadas a homocisteína. Nas plaquetas, as quais são elementos fundamentais no processo de trombogênese, a homocisteína causou uma diminuição na hifrólise de ADP. Essa elevação no nível de ADP ao redor das plaquetas devido a inativação das ectonucleotidases, causada pela homocisteína, deve estar contribuindo para o aumento do risco trombótico descrito em pacientes com hiperhomocisteinemia. Além disso, os animais que receberam homocisteína tiveram um aumento na agregação plaquetária induzida por ADP. Em conclusão, os resultados do presente estudo reforçam o envolvimento do sistema purinérgico em processos inflamatórios/trombóticos e apontam parar o desenvolvimeto de tratamentos para doenças inflamatórias/trobóticas. / Extracellular nucleotides modulate a variety of biological actions via purinergic receptor activation. These effects are modulated by ectonucleotidases, such as ENTPDases and ecto-5´- NT/CD73, which hydrolyze ATP to adenosine in the extracellular milieu. In the cells of the immune system, the ATP can act as danger signaling whereas adenosine, the ATP breakdown product, serves as a negative feedback mechanism to limit inflammation. Already, in the vasculare system, the ADP is a physiological agonist involved in normal hemostasis and thrombosis. Since, macrophages are key to inflammatory process, that depending on the microenvironmental stimulation exhibit proinflammatory/ defense (classical/M1) and antiinflammatory/reparatory (alternative/M2) phenotype. The objective of this study was investigate the activity and expression of the ectonuclotidases in differential macrophage phenotype and evaluate the homocysteine (Hcy) effects on theses enzymes in macrophages and platelets. . The analysis of differential macrophages in phenotype proinflamatory/ M1 and antiinflamatory/M2 showed the same expression to P1 and P2 purinoreceptors. However, change profile of the ectonucleotidases as E-NTPDase1, E-NTPDase3 and ecto-5’- nucleotidase enzymes in macrophages during phenotypic differentiation were found, suggesting that macrophages must alter the purinergic cascade during macrophages differentiation phenotypic. In the pro-inflamatory/M1 phenotype the ATP hydrolysis decreased, suggesting ATP accumulation. On the other hand, the antiinflamatory/M2 phenotype the enzymes lead to a progressive decrease in nucleotides (ATP) concentrations and an increase the adenosine availability. Already, the macrophages exposed to Hcy present a polarized pro-inflammatory profile (M1) and our findings suggest the involvement of the E-NTPDase3 and ecto-5’-nucleotidase in the inflammatory complications associates to homocysteine. In the Platelets, which are fundamental elements to the thrombogenesis process, the homocysteine decreased ADP hydrolysis. This elevation of ADP around of the platelets due inactivating of ectonucleotidase, probably by the indirect action of Hcy, may be contributing to increase thrombotic risk described in individuals with hyperhomocysteinemia. In addition, the animals that received Hcy treatment potentiate platelet aggregation induced by ADP. In conclusion, in the present study the results reinforce purinergic signaling involvement in inflammatory/thrombosis process and point to development of treatments to inflammatory/thrombotic diseases.

O sistema purinérgico tem sido amplamente implicado em condições médicas, entre elas, o transtorno bipolar (TB). Até onde sabemos, nenhum estudo foi realizado com o objetivo de esclarecer a possível contribuição do receptor P2X7 (P2X7R) na patofisiologia do TB ou mesmo com o objetivo de revisar o que já fora previamente publicado sobre este assunto. Nos presentes trabalhos, nosso objetivo foi em primeiro lugar explorar a relação entre o receptor e esse transtorno e identificar os mecanismos pelos quais o P2X7R desempenha um papel no TB e por fim revisar a literatura, focando na sinalização purinérgica no TB, com ênfase na sinalização por ATP e adenosina, destacando o potencial papel do P2X7R na modulação da inflamação e ativação microglial em pacientes bipolares. Para o primeiro objetivo, analisamos o efeito de moduladores do P2X7R (BzATP, BBG e A438079) sobre o comportamento (atividade locomotora) e sobre marcadores de neuroinflamação (IL-1 , TNF- e IL-6), excitotoxicidade (GFAP, TBARS) e neuroplasticidade (BDNF) em um modelo farmacológico de mania induzido pelo tratamento agudo e crônico com D – anfetamina (AMPH) (2mg/kg). Demonstramos na atividade locomotora uma aparente falta de capacidade de resposta à AMPH por animais com P2X7R bloqueado ou ausente (P2X7R-/-). Da mesma forma, observamos que o P2X7R participa do aumento do ambiente próinflamatório e excitotóxico induzido pela AMPH, demonstrado pelo papel de reversão do bloqueio do P2X7R ou pela perda de resposta dos animais P2X7R-/-. Em conclusão, nossos resultados suportam a hipótese de que o P2X7R possui um papel na patofisiologia do TB, como sugerido pelo nosso modelo animal, principalmente por mediar a neuroinflamação e a excitotoxicidade e finalmente levando a mudanças comportamentais. Assim, acreditamos que o P2X7R possui potencial para se tornar um alvo terapêutico do TB. Baseado neste cenário, estudos mais detalhados do papel do P2X7R no TB são necessários, especialmente devido à sua capacidade de agir sobre a microglia e modular a neuroinflamação e a excitotoxicidade. / The purinergic system has been increasingly implicated in medical conditions, among them bipolar disorder (BD). Up to date, no study has been conducted in order to clarify the possible contribution of the P2X7 receptor (P2X7R) to BD pathophysiology or even to review the previously data about this subject. In the presents works, we aim firstly to explore the association between the receptor and the disorder and identify the mechanisms by which the P2X7R plays a role in BD and lastly to review the literature focused on purinergic signaling in BD, with an emphasis on ATP and adenosine signaling, highlighting the potential role of P2X7R in modulating inflammation and microglia activation in bipolar patients. For the first aim, we analyzed the P2X7R modulatory effect (BzATP, BBG and A438079) on behavior (locomotor activity) and on markers of neuroinflammation (IL-1 , TNF- and IL-6), excitotoxicity (GFAP, TBARS), and neuroplasticity (BDNF) in a pharmacological model of mania induced by acute and chronic D-amphetamine (AMPH) treatment (2 mg/kg). We demonstrate in the locomotor activity an apparent lack of responsiveness to AMPH by animals with blocked or absent P2X7R (P2X7R-/-). Likewise, we observed that the P2X7R participates in the AMPH-induced increase of proinflammatory and excitotoxicity environment, demonstrated by the reversal role of P2X7R blockage or the lack of response by P2X7R-/- mice. In conclusion, our results provide support for the hypothesis that P2X7R plays a role in BD pathophysiology, as suggested by our animal model, mainly by mediating neuroinflammation and excitotoxicity and ultimately leading to behavioral changes. Thus, we believe that P2X7R has the potential to become a therapeutic target of BD. Based on this scenario, a more detailed study of the role of P2X7R in BD is warranted, especially due to its ability to act on microglia and modulate neuroinflammation and excitotoxicity.

Glioblastoma multiforme (GBM) é o mais comum e mais maligno tumor cerebral. O péssimo prognóstico é parcialmente devido à baixa biodisponibilidade dos quimioterápicos no tecido tumoral, recorrência originada por células precursoras resistentes ao tratamento e um sistema imune comprometido. De fato, linfócitos regulatórios modulam o sistema imune para uma resposta pró-tumoral, tornando ainda mais difícil o tratamento. Nesse contexto, nanocápsulas lipídicas (LNCs) têm sido amplamente estudadas a fim de aumentar especificidade dos fármacos ao tecido tumoral. Metotrexato (MTX) e trans-resveratrol (RSV) possuem ação antitumoral já descrita, mas necessitam doses relativamente altas para ação anti-glioblastoma in vivo. O MTX também possui ação imunossupressora através do aumento de adenosina no meio extracelular. A Adenosina, por sua vez, pode modular tanto células efetoras quanto células regulatórias no microambiente tumoral. Dessa forma, a hipótese apresentada nessa tese é que o RSV e o MTX possam ser mais eficazes quando carreados por nanocápsulas em modelos de GBM. Além disso, buscamos avaliar se o MTX poderia interferir com enzimas do sistema purinérgico. Por fim, pesquisamos como a adenosina poderia modular linfócitos B e T através das enzimas CD39 e ecto-5’-NT/CD73. O RSV em nanocápsulas e o MTX em nanocápsulas (RSV-LNCs e MTX-LNCs) aumentaram a atividade anti-tumoral em relação aos compostos em solução, induzindo parada no ciclo celular e apoptose em células de GBM. O MTX diminuiu a expressão da proteína antiapoptótica BCL-2 e aumentou a caspase-3 ativa, levando as células de GBM à apoptose. Além disso, o MTX aumentou a expressão da enzima ecto-5’-NT/CD73 tanto em células de glioma quanto em linfócitos T presentes no microambiente dos gliomas. Esse aumento da expressão foi acompanhado da diminuição em linfócitos T efetores e T regulatórios. Também, demonstramos que linfócitos B que possuem alta expressão da enzima CD39, tem capacidade supressiva sobre linfócitos efetores. Em conjunto, os resultados apresentados nessa Tese apresentaram possíveis novas alternativas de tratamento e contribuíram para melhor compreender esse maligno câncer cerebral. / Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and most malignant brain tumor. The awful prognosis is in part due to the low bioavailability of chemotherapy agents in the tumoral tissue, recurrence originated from treatment-resistant progenitor cells and an impaired immune system. Indeed, regulatory lymphocytes modulate the immune system toward a pro-tumoral response, turning the treatment even more difficult. In this sense, lipid-core nanocapsules (LNCs) have been widely studied to raise the drug specificity to the tumor. Methotrexate (MTX) and trans-resveratrol (RSV) have antitumoral activity, but need relatively high doses to the anti-glioblastoma outcome in vivo. MTX has immunosuppressive capability mediated by the increase of adenosine in the extracellular milieu. Adenosine in turn may modulate both effector and regulatory immune cells in the tumoral microenvironment. Thereby, the hypothesis presented is that RSV and MTX may have an antitumor improvement when loaded into LNCs in GBM models. Moreover, we sought to evaluate whether MTX could interfere with purinergic enzymes. Lastly, we evaluated how adenosine could modulate B- and T-lymphocytes through CD39 and ecto-5’NT enzymes. RSV- and MTX-loaded lipid-core nanocapsules (RSV-LNCs or MTX-LNCs) increased their antitumoral outcome in relation to the solution compounds, inducing both cell cycle arrest and apoptosis in GBM cells. MTX decreased the expression of the antiapoptotic protein BCL-2 and increased the active caspase-3, triggering glioblastoma cells to apoptosis. Furthermore, MTX increased the expression of ecto-5’-NT/CD73 in glioma cells and T lymphocytes of the glioma microenvironment. This up-regulation was followed by decreasing in T effector and T regulatory lymphocytes. Also, we further demonstrated that B lymphocytes with high expression of CD39 enzyme can suppress T efector lymphocytes. Also, we further demonstrated that B lymphocytes with high expression of CD39 enzyme can suppress T efector lymphocytes. Taken together, the results presented herein indicate newfound treatment approaches and new knowledge regarding to this deadliest brain tumor.

Glioblastoma multiforme (GBM) é o mais comum e mais maligno tumor cerebral. O péssimo prognóstico é parcialmente devido à baixa biodisponibilidade dos quimioterápicos no tecido tumoral, recorrência originada por células precursoras resistentes ao tratamento e um sistema imune comprometido. De fato, linfócitos regulatórios modulam o sistema imune para uma resposta pró-tumoral, tornando ainda mais difícil o tratamento. Nesse contexto, nanocápsulas lipídicas (LNCs) têm sido amplamente estudadas a fim de aumentar especificidade dos fármacos ao tecido tumoral. Metotrexato (MTX) e trans-resveratrol (RSV) possuem ação antitumoral já descrita, mas necessitam doses relativamente altas para ação anti-glioblastoma in vivo. O MTX também possui ação imunossupressora através do aumento de adenosina no meio extracelular. A Adenosina, por sua vez, pode modular tanto células efetoras quanto células regulatórias no microambiente tumoral. Dessa forma, a hipótese apresentada nessa tese é que o RSV e o MTX possam ser mais eficazes quando carreados por nanocápsulas em modelos de GBM. Além disso, buscamos avaliar se o MTX poderia interferir com enzimas do sistema purinérgico. Por fim, pesquisamos como a adenosina poderia modular linfócitos B e T através das enzimas CD39 e ecto-5’-NT/CD73. O RSV em nanocápsulas e o MTX em nanocápsulas (RSV-LNCs e MTX-LNCs) aumentaram a atividade anti-tumoral em relação aos compostos em solução, induzindo parada no ciclo celular e apoptose em células de GBM. O MTX diminuiu a expressão da proteína antiapoptótica BCL-2 e aumentou a caspase-3 ativa, levando as células de GBM à apoptose. Além disso, o MTX aumentou a expressão da enzima ecto-5’-NT/CD73 tanto em células de glioma quanto em linfócitos T presentes no microambiente dos gliomas. Esse aumento da expressão foi acompanhado da diminuição em linfócitos T efetores e T regulatórios. Também, demonstramos que linfócitos B que possuem alta expressão da enzima CD39, tem capacidade supressiva sobre linfócitos efetores. Em conjunto, os resultados apresentados nessa Tese apresentaram possíveis novas alternativas de tratamento e contribuíram para melhor compreender esse maligno câncer cerebral. / Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and most malignant brain tumor. The awful prognosis is in part due to the low bioavailability of chemotherapy agents in the tumoral tissue, recurrence originated from treatment-resistant progenitor cells and an impaired immune system. Indeed, regulatory lymphocytes modulate the immune system toward a pro-tumoral response, turning the treatment even more difficult. In this sense, lipid-core nanocapsules (LNCs) have been widely studied to raise the drug specificity to the tumor. Methotrexate (MTX) and trans-resveratrol (RSV) have antitumoral activity, but need relatively high doses to the anti-glioblastoma outcome in vivo. MTX has immunosuppressive capability mediated by the increase of adenosine in the extracellular milieu. Adenosine in turn may modulate both effector and regulatory immune cells in the tumoral microenvironment. Thereby, the hypothesis presented is that RSV and MTX may have an antitumor improvement when loaded into LNCs in GBM models. Moreover, we sought to evaluate whether MTX could interfere with purinergic enzymes. Lastly, we evaluated how adenosine could modulate B- and T-lymphocytes through CD39 and ecto-5’NT enzymes. RSV- and MTX-loaded lipid-core nanocapsules (RSV-LNCs or MTX-LNCs) increased their antitumoral outcome in relation to the solution compounds, inducing both cell cycle arrest and apoptosis in GBM cells. MTX decreased the expression of the antiapoptotic protein BCL-2 and increased the active caspase-3, triggering glioblastoma cells to apoptosis. Furthermore, MTX increased the expression of ecto-5’-NT/CD73 in glioma cells and T lymphocytes of the glioma microenvironment. This up-regulation was followed by decreasing in T effector and T regulatory lymphocytes. Also, we further demonstrated that B lymphocytes with high expression of CD39 enzyme can suppress T efector lymphocytes. Also, we further demonstrated that B lymphocytes with high expression of CD39 enzyme can suppress T efector lymphocytes. Taken together, the results presented herein indicate newfound treatment approaches and new knowledge regarding to this deadliest brain tumor.

Os nucleotídeos extracelulares modulam uma variedade de ações biológicas via ativação de receptores purinérgicos. Esses efeitos são controlados pela ação de ectonucleotidases, tais como as E-NTPDases e a ecto-5´-NT/CD73, as quais hidrolisam o ATP até adenosina no meio extracelular. Nas células imunes, o ATP pode atuar como uma molécula sinalizadora de perigo enquanto a adenosina, um produto da degradação do ATP, serve como um mecanismo que controla/limita a inflamação. Já, no sistema vascular, o ADP é um agonista fisiológico envolvido na hemostasia normal e na trombose. Considerando que os macrófagos são elementos chave para processos inflamatórios e quando estímulados exibibem um fenótipo pró-inflamatório/defesa (clássico/M1) ou antiinflamatório/reparatório (alterantivo/M2). O objetivo foi investigar a atividade e expressão das ectonuclotidases em diferentes fenótipos de macrófago e avaliar o efeito da homocisteína sobre essas enzimas em macrófagos e plaquetas.. As análises da diferenciação de macrófagos em fenótipo próinflamatório/ M1 e antiinflamatório/M2 revelaram presença igual de receptores purinérgicos. Entretanto, mudança no perfil das ectonucleotidases como E-NTPDase1, E-NTPDase3 e ecto-5’- nucleotidase foram encontradas, sugerindo que os macrófagos devem alterar a casacata purinérgica durante a ativação fenotípica. No fenótipo pró-inflamatório/M1 houve uma diminuição na hidrólise de ATP, sugerindo um acúmulo do mesmo, enquanto no fenótipo antiinflamatório/M2 as enzimas conduzem para uma progressiva diminuição nas concentrações de nucleotídeos (ATP) e aumento na disponibilidade de adenosina. Já os macrófagos expostos a homocisteína apresentaram uma polarização para o fenótipo pro-inflamatório (M1) e nossos achados sugerem o envolvimento da ENTPDase3 e da ecto-5’-nucleotidase em macrófagos nas complicações inflamatórias associadas a homocisteína. Nas plaquetas, as quais são elementos fundamentais no processo de trombogênese, a homocisteína causou uma diminuição na hifrólise de ADP. Essa elevação no nível de ADP ao redor das plaquetas devido a inativação das ectonucleotidases, causada pela homocisteína, deve estar contribuindo para o aumento do risco trombótico descrito em pacientes com hiperhomocisteinemia. Além disso, os animais que receberam homocisteína tiveram um aumento na agregação plaquetária induzida por ADP. Em conclusão, os resultados do presente estudo reforçam o envolvimento do sistema purinérgico em processos inflamatórios/trombóticos e apontam parar o desenvolvimeto de tratamentos para doenças inflamatórias/trobóticas. / Extracellular nucleotides modulate a variety of biological actions via purinergic receptor activation. These effects are modulated by ectonucleotidases, such as ENTPDases and ecto-5´- NT/CD73, which hydrolyze ATP to adenosine in the extracellular milieu. In the cells of the immune system, the ATP can act as danger signaling whereas adenosine, the ATP breakdown product, serves as a negative feedback mechanism to limit inflammation. Already, in the vasculare system, the ADP is a physiological agonist involved in normal hemostasis and thrombosis. Since, macrophages are key to inflammatory process, that depending on the microenvironmental stimulation exhibit proinflammatory/ defense (classical/M1) and antiinflammatory/reparatory (alternative/M2) phenotype. The objective of this study was investigate the activity and expression of the ectonuclotidases in differential macrophage phenotype and evaluate the homocysteine (Hcy) effects on theses enzymes in macrophages and platelets. . The analysis of differential macrophages in phenotype proinflamatory/ M1 and antiinflamatory/M2 showed the same expression to P1 and P2 purinoreceptors. However, change profile of the ectonucleotidases as E-NTPDase1, E-NTPDase3 and ecto-5’- nucleotidase enzymes in macrophages during phenotypic differentiation were found, suggesting that macrophages must alter the purinergic cascade during macrophages differentiation phenotypic. In the pro-inflamatory/M1 phenotype the ATP hydrolysis decreased, suggesting ATP accumulation. On the other hand, the antiinflamatory/M2 phenotype the enzymes lead to a progressive decrease in nucleotides (ATP) concentrations and an increase the adenosine availability. Already, the macrophages exposed to Hcy present a polarized pro-inflammatory profile (M1) and our findings suggest the involvement of the E-NTPDase3 and ecto-5’-nucleotidase in the inflammatory complications associates to homocysteine. In the Platelets, which are fundamental elements to the thrombogenesis process, the homocysteine decreased ADP hydrolysis. This elevation of ADP around of the platelets due inactivating of ectonucleotidase, probably by the indirect action of Hcy, may be contributing to increase thrombotic risk described in individuals with hyperhomocysteinemia. In addition, the animals that received Hcy treatment potentiate platelet aggregation induced by ADP. In conclusion, in the present study the results reinforce purinergic signaling involvement in inflammatory/thrombosis process and point to development of treatments to inflammatory/thrombotic diseases.

O sistema purinérgico tem sido amplamente implicado em condições médicas, entre elas, o transtorno bipolar (TB). Até onde sabemos, nenhum estudo foi realizado com o objetivo de esclarecer a possível contribuição do receptor P2X7 (P2X7R) na patofisiologia do TB ou mesmo com o objetivo de revisar o que já fora previamente publicado sobre este assunto. Nos presentes trabalhos, nosso objetivo foi em primeiro lugar explorar a relação entre o receptor e esse transtorno e identificar os mecanismos pelos quais o P2X7R desempenha um papel no TB e por fim revisar a literatura, focando na sinalização purinérgica no TB, com ênfase na sinalização por ATP e adenosina, destacando o potencial papel do P2X7R na modulação da inflamação e ativação microglial em pacientes bipolares. Para o primeiro objetivo, analisamos o efeito de moduladores do P2X7R (BzATP, BBG e A438079) sobre o comportamento (atividade locomotora) e sobre marcadores de neuroinflamação (IL-1 , TNF- e IL-6), excitotoxicidade (GFAP, TBARS) e neuroplasticidade (BDNF) em um modelo farmacológico de mania induzido pelo tratamento agudo e crônico com D – anfetamina (AMPH) (2mg/kg). Demonstramos na atividade locomotora uma aparente falta de capacidade de resposta à AMPH por animais com P2X7R bloqueado ou ausente (P2X7R-/-). Da mesma forma, observamos que o P2X7R participa do aumento do ambiente próinflamatório e excitotóxico induzido pela AMPH, demonstrado pelo papel de reversão do bloqueio do P2X7R ou pela perda de resposta dos animais P2X7R-/-. Em conclusão, nossos resultados suportam a hipótese de que o P2X7R possui um papel na patofisiologia do TB, como sugerido pelo nosso modelo animal, principalmente por mediar a neuroinflamação e a excitotoxicidade e finalmente levando a mudanças comportamentais. Assim, acreditamos que o P2X7R possui potencial para se tornar um alvo terapêutico do TB. Baseado neste cenário, estudos mais detalhados do papel do P2X7R no TB são necessários, especialmente devido à sua capacidade de agir sobre a microglia e modular a neuroinflamação e a excitotoxicidade. / The purinergic system has been increasingly implicated in medical conditions, among them bipolar disorder (BD). Up to date, no study has been conducted in order to clarify the possible contribution of the P2X7 receptor (P2X7R) to BD pathophysiology or even to review the previously data about this subject. In the presents works, we aim firstly to explore the association between the receptor and the disorder and identify the mechanisms by which the P2X7R plays a role in BD and lastly to review the literature focused on purinergic signaling in BD, with an emphasis on ATP and adenosine signaling, highlighting the potential role of P2X7R in modulating inflammation and microglia activation in bipolar patients. For the first aim, we analyzed the P2X7R modulatory effect (BzATP, BBG and A438079) on behavior (locomotor activity) and on markers of neuroinflammation (IL-1 , TNF- and IL-6), excitotoxicity (GFAP, TBARS), and neuroplasticity (BDNF) in a pharmacological model of mania induced by acute and chronic D-amphetamine (AMPH) treatment (2 mg/kg). We demonstrate in the locomotor activity an apparent lack of responsiveness to AMPH by animals with blocked or absent P2X7R (P2X7R-/-). Likewise, we observed that the P2X7R participates in the AMPH-induced increase of proinflammatory and excitotoxicity environment, demonstrated by the reversal role of P2X7R blockage or the lack of response by P2X7R-/- mice. In conclusion, our results provide support for the hypothesis that P2X7R plays a role in BD pathophysiology, as suggested by our animal model, mainly by mediating neuroinflammation and excitotoxicity and ultimately leading to behavioral changes. Thus, we believe that P2X7R has the potential to become a therapeutic target of BD. Based on this scenario, a more detailed study of the role of P2X7R in BD is warranted, especially due to its ability to act on microglia and modulate neuroinflammation and excitotoxicity.

Vários estudos têm apontado a sinalização e os receptores purinérgicos, representados em mamíferos pelos receptores ionotrópicos (P2X1 P2X7) e metabotrópicos (P2Y1,2,4,6, 11,12,14), como um sistema primitivo, envolvido não somente na sinalização neuronal, mas também em muitos outros processos vitais incluindo resposta imune, inflamação, dor, agregação plaquetária e nos processos de diferenciação, proliferação e morte celular, que ocorrem no desenvolvimento e na regeneração tecidual. Condizente com as descrições da literatura, dados do nosso laboratório, baseados na farmacologia dos receptores purinérgicos, sugeriram o envolvimento do subtipo P2Y2 na proliferação e na neurogênese in vitro de células de carcinoma embrionário P19. Tendo em vista a ausência de agonistas e antagonistas específicos para a maioria dos subtipos de receptores purinérgicos, o que vem dificultando a elucidação das funções exatas desses receptores em processos fisiológicos e patológicos, optamos para o screening de uma biblioteca combinatória de oligonucleotídeos para a identificação de ligantes de alta afinidade e especificidade para o receptor P2Y2 (procedimento de SELEX, Evolução Sistemática de Ligantes por Enriquecimento Exponencial). Essa abordagem envolve passos reiterativos de seleção in vitro de moléculas de RNA, estabilizadas por substituição do grupo 2´OH das pirimidinas por um átomo de flúor, que possuem afinidade pelo receptor, até que a mistura de RNAs, originalmente de 1013 diferentes seqüências que adotam uma gama de estruturas secundárias e terciárias, esteja purificada para uma população homogênea de ligantes de alta afinidade pelo receptor P2Y2. O processo envolve a transcrição in vitro da biblioteca de DNA para RNA, a apresentação desta ao alvo, a eluição dos ligantes específicos, denominados aptâmeros, e a regeneração da biblioteca de DNA por RT-PCR, a qual, após uma reação de transcrição in vitro, gera a mistura de RNAs para o próximo ciclo de seleção. Neste trabalho, nós utilizamos como alvo o receptor P2Y2 recombinante humano expresso na linhagem de células de astroglioma humano 1321N1. Ao final de nove ciclos de SELEX, nós isolamos 46 sequências que foram agrupadas em três classes estruturais, de acordo com a presença de regiões consensos. A mistura destas moléculas se ligou ao receptor P2Y2 humano com uma constante de dissociação de 164 nM. Um dos clones isolados, o aptâmero B7, se ligou preferencialmente ao receptor P2Y2 (Kd 184 nM), em relação aos receptores P2Y1 e P2Y4 recombinantes expressos em células 1321N1. A interação deste aptâmero não foi dependente da espécie, uma vez que ele foi capaz de se ligar tanto ao receptor P2Y2 de origem humana como murina. A atividade biológica do aptâmero foi avaliada em células P19 (sabidamente expressando receptores P2Y2 endógenos), na qual a proteção do ATP contra a apoptose, provavelmente interagindo com o receptor P2Y2, foi anulada na presença deste aptâmero em uma concentração mil vezes menor do que a do ATP. Além de confirmar a viabilidade da técnica SELEX para identificar ligantes subtipos-específicos dos receptores purinérgicos, o aptâmero anti-P2Y2 serve como ferramenta fundamental para definir demais funções fisiológicas deste receptor. Passos de otimização das suas propriedades como ligante e biodisponibilidade tornarão este aptâmero um composto de alta relevância farmacêutica. / Many published studies have focused on purinergic signaling and receptors, represented by ionotropic (P2X1 P2X7) and metabotropic (P2Y1,2,4,6,11,12,14) subtypes as a universal system which is not only involved in neuronal signaling, but also in various other vital processes including immune response, inflammation, platelet aggregation as well as differentiation, proliferation and cell death occurring during development and tissue regeneration. In agreement with other published reports, results of our laboratory based on overlapping purinergic receptor pharmacology suggest the participation of the P2Y2 subtype in proliferation and in vitro neurogenesis of P19 embryonal carcinoma cells. In view of the lack of availability of specific agonists and antagonists for most purinergic receptors making the elucidation of exact functions of these receptors in their cellular context almost impossible, we used a combinatorial oligonucleotide library approach, denominated SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) for the development of high-affinity and specificity ligands for the P2Y2 receptor. This approach is based on re-iterative steps of in vitro selection of 2´-fluoro-pyrimidine-modified RNA molecules for receptor-binding affinity from an RNA pool containing 1013 different sequences and secondary and tertiary structures until this pool is purified to a homogeneous population of ligands with high affinity to the P2Y2 receptor. The combinatorial DNA library is in vitro transcribed into RNA followed by target presentation of the RNA library and elution of the target-binders, denominated aptamers, and RT-PCR amplification in order to restore the DNA library used for in vitro transcription for next SELEX cycle. Following nine SELEX cycles using 1321N1 human astroglial cells expressing recombinant human P2Y2 receptors as target, we isolated 46 aptamer sequences which, based on consensus sequence motifs, were grouped in three structural groups. The mixture of the isolated sequences bound themselves to human P2Y2 receptors with a dissociation constant (Kd) of 164 nM. One of the isolated clones, the aptamer denominated B7, bound itself to P2Y2 receptors in preference to P2Y1 and P2Y4 recombinant receptors expressed in 1321N1 cells. The binding activity of the aptamer was not limited to P2Y2 receptors of human origin, as the aptamer also interacted with mouse P2Y2 receptors. The capability of the aptamer of affecting the biological activity of P2Y2 receptors was verified in P19 cells in which ATP-induced protection against apoptosis, mediated by P2Y2 receptors, was abolished in the presence of the aptamer. In addition to providing a proof of principle for the feasibility of developing purinergic subtype-specific ligands by using the SELEX technique, the anti-P2Y aptamer provides a fundamental tool for gaining insights of physiological functions of this receptor in various cellular contexts. Moreover, steps of optimization of receptor binding properties and aptamer half-life in vivo will turn this aptamer into a compound of high pharmaceutical relevance.

Os receptores purinérgicos são divididos em receptores P1 e P2 de acordo com o seu agonista endógeno, os receptores metabotrópicos P1 são ativados por adenosina, enquanto os metabotrópicos P2Y e ionotrópicos P2X são estimulados através do ATP e outros nucleotídeos. Além de sua função bem estabelecida na neurotransmissão, a sinalização purinérgica tem despertado crescente interesse científico devido à sua importância nas funções no metabolismo celular, incluindo os processos de desenvolvimento embrionário e reparação de tecidos. Isso ocorre especialmente no sistema nervoso central, onde eles controlam a proliferação, diferenciação, apoptose e a liberação de fatores neurotróficos. Nesse trabalho nós focamos nas ações sinérgicas entre a sinalização purinérgica e o fator de crescimento de nervos (NGF), tendo em vista três formas conhecidas de interação entre o NGF e os receptores purinérgicos, a potencialização dos efeitos do NGF através de uma ligação cruzada entre as vias, a regulação da expressão dos receptores purinérgicos pelo NGF e regulação da liberação de NGF pela adenosina. Com o objetivo de investigar estes processos sinérgicos na regulação da proliferação, migração e determinação fenotípica, células precursoras neurais foram obtidas do telencéfalo de embriões de rato e cultivadas na forma de neuroesferas, sendo então submetidas a tratamentos com agonistas e antagonistas dos receptores purinérgicos, em associação com o NGF, ao longo da diferenciação. Os efeitos desses tratamentos foram analisados por citometria de fluxo. Nós mostramos que o NGF age sobre as células aumentando a proliferação, migração e população de células indiferenciadas e diminuindo a apoptose. A ativação dos receptores P1 levou à diminuição da gliogênese e ao aumento da proliferação e da migração. A estimulação de receptores P2 resultou em aumento da proliferação e redução da taxa de apoptose. Os receptores purinérgicos potenciaram a proliferação mediada por NGF, resultando assim num aumento da população de células indiferenciadas. Neste último efeito percebemos a participação do receptor P2Y2 na sinergia. Os resultados aqui apresentados revelam novos mecanismos para a interação entre o NGF e a sinalização purinérgica na biologia de células tronco neurais / Purinergic receptors are divided into P1 and P2 receptors according to agonist selectivity, G-protein- coupled P1 receptors are activated by adenosine, while metabotropic P2Y and ionotropic P2X subtypes are stimulated by ATP and other nucleotides. In addition to its well-established function in neurotransmission, purinergic signaling has raised increasing scientific interest due to its importance in essential cellular functions and metabolism including embryonic developmental processes and tissue repair, specially in the central nervous system, where they control proliferation, differentiation, apoptosis and the release of neurotrophic factors. Here we focus on synergistic actions between purinergic P1 and P2 receptor-mediated signaling and the nerve growth factor (NGF), in view of three recognized forms of interaction between NGF and purinergic signaling, the potencialization of NGF-mediated effects through a crosstalk, the regulation of purinergic receptor expression by NGF and the regulation of NGF release by adenosine. With the objective to investigate such synergistic processes in regulating proliferation, neural migration and phenotype determination, neurospheres obtained as proliferating neural stem and progenitor from rat embryonic telencephalon were subjected to treatments with purinergic receptor agonists and antagonists in association with NGF along differentiation. Effects of these treatments were analyzed by flow cytometry. We show that NGF acted on cells by increasing the population of undifferentiated cells, proliferation, migration and reducing apoptosis. P1 receptor activation led to decreased gliogenesis, increased proliferation and migration. Stimulation of P2 receptors resulted in increased proliferation and decreased apoptosis rates. Purinergic receptors potentiated NGF-mediated proliferation, thereby resulting in increased population of undifferentiated cells, in this latter effect, the P2Y2 receptor subtype participated in synergistic processes. The herein presented results reveal novel mechanisms for the interaction of NGF and purinergic signaling in neural stem cell biology

Glioblastoma multiforme é o tumor maligno mais comum do sistema nervoso central em adultos e a sobrevida média é de apenas 12 a 15 meses após o diagnóstico. Por isso, é extremamente importante desenvolver tratamentos mais eficazes e específicos contra essa neoplasia. A presença do sistema imune, incluindo macrófagos associados ao tumor, promove a proliferação tumoral e está associada com um pior prognóstico em pacientes com essa doença maligna. A sinalização purinérgica e o receptor purinérgico P2X7, um canal iônico, têm sido implicados na progressão de diferentes tipos de tumores tanto in vitro como in vivo. A ciclooxigenase 2 (COX-2) desempenha um papel importante na regulação da proliferação celular, diferenciação e na tumorigênese. O ácido ursólico é um triterpeno pentacíclico encontrado em uma variedade de plantas e exibe diversas atividades biológicas e farmacológicas. O objetivo dessa tese é verificar a participação do sistema purinérgico, sistema imune e COX-2 no desenvolvimento e progressão do glioblastoma multiforme, e também investigar os efeitos citotóxicos do ácido ursólico. Primeiramente, verificamos que macrófagos expostos ao meio condicionado de glioma (GL-CM) foram modulados para um fenótipo do tipo M2 e houve um aumento da liberação de IL-10, IL-6 e MCP-1. Esses efeitos foram diminuídos na presença de antagonistas dos receptores P2X7 e A2A. Portanto, os resultados apresentados contribuem para o melhor entendimento da interação entre inflamação e câncer e demonstram que os receptores purinérgicos são importantes para a progressão do glioma. Após, analisamos o papel do receptor P2X7 na proliferação de células de glioma. Surpreendentemente, in vitro, não se observou nenhuma diferença no crescimento das células quando houve a transfecção com o P2X7. Entretanto, in vivo, essas células geraram tumores maiores quando comparado com o controle. Os nossos resultados demonstram que, como em outros tipos de cânceres, o P2X7 tem um papel importante no desenvolvimento e progressão tumoral. Uma vez verificado o importante papel do receptor P2X7 nos macrófagos associados ao tumor e nas células de glioma, investigamos se esse receptor poderia interagir com a enzima COX-2 em células de glioma. Porém, não houve diferença na expressão do P2X7 ou da COX-2 tanto in vitro como in vivo. E também não houve nenhum efeito adicional entre o antagonista de P2X7 e o inibidor seletivo de COX-2. Esse trabalho fornece evidências de que não há relação entre o P2X7 e COX-2 em células de glioma. Em conclusão, todos esses resultados reforçam a hipótese do envolvimento da sinalização purinérgica na progressão do glioblastoma multiforme e tornam o P2X7 como um interessante alvo terapêutico. Finalmente, também investigamos a possível atividade anticâncer do ácido ursólico contra as células de glioma. Essa molécula foi capaz de diminuir o número de células e induziu parada no ciclo celular. In vivo, o ácido ursólico reduziu ligeiramente o tamanho do tumor, mas não alterou as características malignas. Em conclusão, o ácido ursólico pode ser um potencial candidato como adjuvante para o tratamento do glioblastoma multiforme. Em conjunto, todos os resultados apresentados nessa tese indicam possíveis novas abordagens terapêuticas no tratamento e novos conhecimentos em relação a esse maligno câncer cerebral. / Glioblastoma multiforme is the most common malignant tumor of central nervous system in adults and the median survival is only 12 to 15 months after diagnosis. Therefore, it is extremely important to develop more effective and specific treatments. The presence of an inflammatory environment, including tumor-associated macrophages, promotes tumor proliferation and is associated with a poor prognosis in patients with this malignancy. Disruption of purinergic signaling has also been implicated in cancer progression. P2X7R is an ion channel receptor, whose participation in tumor progression has been demonstrated in in vitro and in vivo studies. Cyclooxygenase 2 (COX-2) plays an important role in regulating cell proliferation, differentiation, and tumorigenesis. Ursolic acid is a pentacyclic triterpenoid found in a variety of plants that exhibits several biological and pharmacological activities. The aim of this study is to verify the participation of the purinergic system, immune system and COX-2 in the glioblastoma multiforme development and progression, and also to investigate the anti-proliferative effects of ursolic acid. We first verified that macrophages exposed to glioma conditioned medium (GL-CM) were modulated to an M2-like phenotype and there was an increased IL-10, IL-6 and MCP-1 secretion and these effects were diminished by P2X7 and A2A receptors antagonists. Therefore, the results presented contribute to advancing in the field of cancer-related inflammation and point specific purinergic receptors as targets for glioma progression. After that, we analyzed the role of P2X7 receptor in glioma cell proliferation. Surprisingly, in vitro, no difference in cell growth was observed when the cells were transfected with P2X7R but in vivo these cells generated larger tumors when compared to the control. Our data demonstrate that, as in other type of cancers, P2X7R has an important role in sustaining the development of glioma. Once verified the important role of P2X7 receptor in tumorassociated macrophages and glioma cells, we verified whether this receptor could interact with the COX-2 enzyme in glioma cells. No differences in mRNA expression of P2X7R or COX-2 were verified both in vitro and in vivo experiments. And any additional effect with selective P2X7R antagonist and COX-2 inhibitor were observed in in vitro and in vivo experiments. This work provides evidence that there is no relationship between the P2X7R and COX-2 in glioma. In conclusion, all these results reinforce the hypothesis of purinergic signaling involvement in glioma progression and point to P2X7R as an interesting target for glioma treatment. Finally, we also investigated the potential anticancer activity of ursolic acid against to glioma cells. Ursolic acid decreased the cell number and induced an arrest in the cell cycle in glioma cells. In vivo, ursolic acid slightly reduced the glioma tumor size but did not alter the malignant features. In conclusion, the ursolic acid may be a potential candidate as adjuvant for glioblastoma therapy. Taken together, the results presented herein indicate new adjuvant treatment approaches and new knowledge regarding to this deadliest brain tumor.