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Vários estudos têm apontado a sinalização e os receptores purinérgicos, representados em mamíferos pelos receptores ionotrópicos (P2X1 P2X7) e metabotrópicos (P2Y1,2,4,6, 11,12,14), como um sistema primitivo, envolvido não somente na sinalização neuronal, mas também em muitos outros processos vitais incluindo resposta imune, inflamação, dor, agregação plaquetária e nos processos de diferenciação, proliferação e morte celular, que ocorrem no desenvolvimento e na regeneração tecidual. Condizente com as descrições da literatura, dados do nosso laboratório, baseados na farmacologia dos receptores purinérgicos, sugeriram o envolvimento do subtipo P2Y2 na proliferação e na neurogênese in vitro de células de carcinoma embrionário P19. Tendo em vista a ausência de agonistas e antagonistas específicos para a maioria dos subtipos de receptores purinérgicos, o que vem dificultando a elucidação das funções exatas desses receptores em processos fisiológicos e patológicos, optamos para o screening de uma biblioteca combinatória de oligonucleotídeos para a identificação de ligantes de alta afinidade e especificidade para o receptor P2Y2 (procedimento de SELEX, Evolução Sistemática de Ligantes por Enriquecimento Exponencial). Essa abordagem envolve passos reiterativos de seleção in vitro de moléculas de RNA, estabilizadas por substituição do grupo 2´OH das pirimidinas por um átomo de flúor, que possuem afinidade pelo receptor, até que a mistura de RNAs, originalmente de 1013 diferentes seqüências que adotam uma gama de estruturas secundárias e terciárias, esteja purificada para uma população homogênea de ligantes de alta afinidade pelo receptor P2Y2. O processo envolve a transcrição in vitro da biblioteca de DNA para RNA, a apresentação desta ao alvo, a eluição dos ligantes específicos, denominados aptâmeros, e a regeneração da biblioteca de DNA por RT-PCR, a qual, após uma reação de transcrição in vitro, gera a mistura de RNAs para o próximo ciclo de seleção. Neste trabalho, nós utilizamos como alvo o receptor P2Y2 recombinante humano expresso na linhagem de células de astroglioma humano 1321N1. Ao final de nove ciclos de SELEX, nós isolamos 46 sequências que foram agrupadas em três classes estruturais, de acordo com a presença de regiões consensos. A mistura destas moléculas se ligou ao receptor P2Y2 humano com uma constante de dissociação de 164 nM. Um dos clones isolados, o aptâmero B7, se ligou preferencialmente ao receptor P2Y2 (Kd 184 nM), em relação aos receptores P2Y1 e P2Y4 recombinantes expressos em células 1321N1. A interação deste aptâmero não foi dependente da espécie, uma vez que ele foi capaz de se ligar tanto ao receptor P2Y2 de origem humana como murina. A atividade biológica do aptâmero foi avaliada em células P19 (sabidamente expressando receptores P2Y2 endógenos), na qual a proteção do ATP contra a apoptose, provavelmente interagindo com o receptor P2Y2, foi anulada na presença deste aptâmero em uma concentração mil vezes menor do que a do ATP. Além de confirmar a viabilidade da técnica SELEX para identificar ligantes subtipos-específicos dos receptores purinérgicos, o aptâmero anti-P2Y2 serve como ferramenta fundamental para definir demais funções fisiológicas deste receptor. Passos de otimização das suas propriedades como ligante e biodisponibilidade tornarão este aptâmero um composto de alta relevância farmacêutica. / Many published studies have focused on purinergic signaling and receptors, represented by ionotropic (P2X1 P2X7) and metabotropic (P2Y1,2,4,6,11,12,14) subtypes as a universal system which is not only involved in neuronal signaling, but also in various other vital processes including immune response, inflammation, platelet aggregation as well as differentiation, proliferation and cell death occurring during development and tissue regeneration. In agreement with other published reports, results of our laboratory based on overlapping purinergic receptor pharmacology suggest the participation of the P2Y2 subtype in proliferation and in vitro neurogenesis of P19 embryonal carcinoma cells. In view of the lack of availability of specific agonists and antagonists for most purinergic receptors making the elucidation of exact functions of these receptors in their cellular context almost impossible, we used a combinatorial oligonucleotide library approach, denominated SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) for the development of high-affinity and specificity ligands for the P2Y2 receptor. This approach is based on re-iterative steps of in vitro selection of 2´-fluoro-pyrimidine-modified RNA molecules for receptor-binding affinity from an RNA pool containing 1013 different sequences and secondary and tertiary structures until this pool is purified to a homogeneous population of ligands with high affinity to the P2Y2 receptor. The combinatorial DNA library is in vitro transcribed into RNA followed by target presentation of the RNA library and elution of the target-binders, denominated aptamers, and RT-PCR amplification in order to restore the DNA library used for in vitro transcription for next SELEX cycle. Following nine SELEX cycles using 1321N1 human astroglial cells expressing recombinant human P2Y2 receptors as target, we isolated 46 aptamer sequences which, based on consensus sequence motifs, were grouped in three structural groups. The mixture of the isolated sequences bound themselves to human P2Y2 receptors with a dissociation constant (Kd) of 164 nM. One of the isolated clones, the aptamer denominated B7, bound itself to P2Y2 receptors in preference to P2Y1 and P2Y4 recombinant receptors expressed in 1321N1 cells. The binding activity of the aptamer was not limited to P2Y2 receptors of human origin, as the aptamer also interacted with mouse P2Y2 receptors. The capability of the aptamer of affecting the biological activity of P2Y2 receptors was verified in P19 cells in which ATP-induced protection against apoptosis, mediated by P2Y2 receptors, was abolished in the presence of the aptamer. In addition to providing a proof of principle for the feasibility of developing purinergic subtype-specific ligands by using the SELEX technique, the anti-P2Y aptamer provides a fundamental tool for gaining insights of physiological functions of this receptor in various cellular contexts. Moreover, steps of optimization of receptor binding properties and aptamer half-life in vivo will turn this aptamer into a compound of high pharmaceutical relevance.

Os receptores purinérgicos são divididos em receptores P1 e P2 de acordo com o seu agonista endógeno, os receptores metabotrópicos P1 são ativados por adenosina, enquanto os metabotrópicos P2Y e ionotrópicos P2X são estimulados através do ATP e outros nucleotídeos. Além de sua função bem estabelecida na neurotransmissão, a sinalização purinérgica tem despertado crescente interesse científico devido à sua importância nas funções no metabolismo celular, incluindo os processos de desenvolvimento embrionário e reparação de tecidos. Isso ocorre especialmente no sistema nervoso central, onde eles controlam a proliferação, diferenciação, apoptose e a liberação de fatores neurotróficos. Nesse trabalho nós focamos nas ações sinérgicas entre a sinalização purinérgica e o fator de crescimento de nervos (NGF), tendo em vista três formas conhecidas de interação entre o NGF e os receptores purinérgicos, a potencialização dos efeitos do NGF através de uma ligação cruzada entre as vias, a regulação da expressão dos receptores purinérgicos pelo NGF e regulação da liberação de NGF pela adenosina. Com o objetivo de investigar estes processos sinérgicos na regulação da proliferação, migração e determinação fenotípica, células precursoras neurais foram obtidas do telencéfalo de embriões de rato e cultivadas na forma de neuroesferas, sendo então submetidas a tratamentos com agonistas e antagonistas dos receptores purinérgicos, em associação com o NGF, ao longo da diferenciação. Os efeitos desses tratamentos foram analisados por citometria de fluxo. Nós mostramos que o NGF age sobre as células aumentando a proliferação, migração e população de células indiferenciadas e diminuindo a apoptose. A ativação dos receptores P1 levou à diminuição da gliogênese e ao aumento da proliferação e da migração. A estimulação de receptores P2 resultou em aumento da proliferação e redução da taxa de apoptose. Os receptores purinérgicos potenciaram a proliferação mediada por NGF, resultando assim num aumento da população de células indiferenciadas. Neste último efeito percebemos a participação do receptor P2Y2 na sinergia. Os resultados aqui apresentados revelam novos mecanismos para a interação entre o NGF e a sinalização purinérgica na biologia de células tronco neurais / Purinergic receptors are divided into P1 and P2 receptors according to agonist selectivity, G-protein- coupled P1 receptors are activated by adenosine, while metabotropic P2Y and ionotropic P2X subtypes are stimulated by ATP and other nucleotides. In addition to its well-established function in neurotransmission, purinergic signaling has raised increasing scientific interest due to its importance in essential cellular functions and metabolism including embryonic developmental processes and tissue repair, specially in the central nervous system, where they control proliferation, differentiation, apoptosis and the release of neurotrophic factors. Here we focus on synergistic actions between purinergic P1 and P2 receptor-mediated signaling and the nerve growth factor (NGF), in view of three recognized forms of interaction between NGF and purinergic signaling, the potencialization of NGF-mediated effects through a crosstalk, the regulation of purinergic receptor expression by NGF and the regulation of NGF release by adenosine. With the objective to investigate such synergistic processes in regulating proliferation, neural migration and phenotype determination, neurospheres obtained as proliferating neural stem and progenitor from rat embryonic telencephalon were subjected to treatments with purinergic receptor agonists and antagonists in association with NGF along differentiation. Effects of these treatments were analyzed by flow cytometry. We show that NGF acted on cells by increasing the population of undifferentiated cells, proliferation, migration and reducing apoptosis. P1 receptor activation led to decreased gliogenesis, increased proliferation and migration. Stimulation of P2 receptors resulted in increased proliferation and decreased apoptosis rates. Purinergic receptors potentiated NGF-mediated proliferation, thereby resulting in increased population of undifferentiated cells, in this latter effect, the P2Y2 receptor subtype participated in synergistic processes. The herein presented results reveal novel mechanisms for the interaction of NGF and purinergic signaling in neural stem cell biology

Receptores purinérgicos são expressos em neurônios e glia e, por certo, participam dos processos de sinalização entre estes células. Nos gânglios da raiz dorsal o soma dos neurônios sensoriais é envolto por uma camada de células satélites (CSt), que são células de glia, cuja função é desconhecida. Até o momento a natureza dos receptores purinérgicos presentes nas células satélites foi pouco investigada. No presente trabalho demonstra-se a presença dos receptores P2Y1, P2Y2 e/ou P2Y4 e P2Y6 nas CSt de gânglios da raiz dorsal de ratos recém-nascidos. A prova da existência dos receptores foi a elevação na concentração intracelular do Ca2+, induzida pela aplicação de um agonista dos receptores. Nas culturas de mais de 24 horas, estimuladas por soro bovino fetal, proliferam de forma notável células de glia de aspecto predominantemente fusiforme. Determinou-se que as células fusiformes expressam receptores P2Y1, P2Y2 e/ou P2Y4 e P2Y6. As informações obtidas contribuem para o esclarecimento da sinalização entre neurônios e glia nos gânglios sensoriais da raiz dorsal. / Purinergic receptors are expressed and play role in the sinalization between neurons and glia. In dorsal root ganglia the soma of the sensory neurons is surrounded by a layer of satellite glial cells, whose function is unclear. There are evidences that ATP is released by neurons to act on receptors in satellite cells. So far, the nature of the purinergic receptors of satellite cells was not fully investigated. This study shows the presence of metabotropics purinergic receptors P2Y1, P2Y2 and/or P2Y4, e P2Y6 in satellite cells from dorsal root ganglia of newborn rats. The demonstration was carried on following the transient increases in intracellular calcium concentration induced by a purinergic agonist. As time goes by, in the presence of fetal bovine serum, there is a remarkable proliferation of glial cells, with predominant fusiform shapes. The fusiform cells also express P2Y1, P2Y2 and/or P2Y4, e P2Y6 receptors. These informations add on the understanding of the complex phenomena of neuron-glia interaction.

Wound healing in the corneal epithelium is an essential process to maintain corneal clarity and organism health. The earliest events of cellular injury response include the release of nucleotides and the activation of P2 purinergic receptors. While the purinergic receptor P2X7 has been shown to promote cell migration, its role in corneal epithelial wound healing is still poorly understood. The goal of this work is to better understand the role of P2X7 in the injury response. We analyzed P2X7 expression after epithelial injury in rat corneal organ cultures and found that the receptor localizes to the leading edge of the corneal epithelium. However, overall mRNA and protein expression of P2X7 decreased after injury. Inhibition of P2X7 activation significantly delayed wound closure and prevented the leading edge-localization after injury. We found that P2X7 inhibition altered the wound-induced calcium wave in epithelial cells and altered the number and distribution of focal adhesions in the migrating cells. Live cell imaging of epithelial cells showed that P2X7 inhibition led to altered actin rearrangement, with thick actin bundles in the treated cells. In order to determine the importance of P2X7 in epithelial differentiation and stratified cell migration, we developed a stratified culture model. The cells in the stratified model expressed proliferative and differentiation markers similar to organ cultured corneas, as well as similar P2X7 expression and localization after injury. Together, these results show the importance of P2X7 in the overall purinergic response to injury, and provide tools to study P2X7 in stratified corneal cell migration. To determine if P2X7 may contribute to pathologic delayed wound healing in diseases such as type 2 diabetes, we analyzed P2X7 expression in diabetic human corneas and diabetic model rodent corneas. We showed that P2X7 expression is significantly elevated in unwounded diabetic corneas, and that wound healing is delayed in the rodent model. These data show that elevated P2X7 expression may contribute to the delayed healing in disease and may be a possible therapeutic target.

Vários estudos têm apontado a sinalização e os receptores purinérgicos, representados em mamíferos pelos receptores ionotrópicos (P2X1 P2X7) e metabotrópicos (P2Y1,2,4,6, 11,12,14), como um sistema primitivo, envolvido não somente na sinalização neuronal, mas também em muitos outros processos vitais incluindo resposta imune, inflamação, dor, agregação plaquetária e nos processos de diferenciação, proliferação e morte celular, que ocorrem no desenvolvimento e na regeneração tecidual. Condizente com as descrições da literatura, dados do nosso laboratório, baseados na farmacologia dos receptores purinérgicos, sugeriram o envolvimento do subtipo P2Y2 na proliferação e na neurogênese in vitro de células de carcinoma embrionário P19. Tendo em vista a ausência de agonistas e antagonistas específicos para a maioria dos subtipos de receptores purinérgicos, o que vem dificultando a elucidação das funções exatas desses receptores em processos fisiológicos e patológicos, optamos para o screening de uma biblioteca combinatória de oligonucleotídeos para a identificação de ligantes de alta afinidade e especificidade para o receptor P2Y2 (procedimento de SELEX, Evolução Sistemática de Ligantes por Enriquecimento Exponencial). Essa abordagem envolve passos reiterativos de seleção in vitro de moléculas de RNA, estabilizadas por substituição do grupo 2´OH das pirimidinas por um átomo de flúor, que possuem afinidade pelo receptor, até que a mistura de RNAs, originalmente de 1013 diferentes seqüências que adotam uma gama de estruturas secundárias e terciárias, esteja purificada para uma população homogênea de ligantes de alta afinidade pelo receptor P2Y2. O processo envolve a transcrição in vitro da biblioteca de DNA para RNA, a apresentação desta ao alvo, a eluição dos ligantes específicos, denominados aptâmeros, e a regeneração da biblioteca de DNA por RT-PCR, a qual, após uma reação de transcrição in vitro, gera a mistura de RNAs para o próximo ciclo de seleção. Neste trabalho, nós utilizamos como alvo o receptor P2Y2 recombinante humano expresso na linhagem de células de astroglioma humano 1321N1. Ao final de nove ciclos de SELEX, nós isolamos 46 sequências que foram agrupadas em três classes estruturais, de acordo com a presença de regiões consensos. A mistura destas moléculas se ligou ao receptor P2Y2 humano com uma constante de dissociação de 164 nM. Um dos clones isolados, o aptâmero B7, se ligou preferencialmente ao receptor P2Y2 (Kd 184 nM), em relação aos receptores P2Y1 e P2Y4 recombinantes expressos em células 1321N1. A interação deste aptâmero não foi dependente da espécie, uma vez que ele foi capaz de se ligar tanto ao receptor P2Y2 de origem humana como murina. A atividade biológica do aptâmero foi avaliada em células P19 (sabidamente expressando receptores P2Y2 endógenos), na qual a proteção do ATP contra a apoptose, provavelmente interagindo com o receptor P2Y2, foi anulada na presença deste aptâmero em uma concentração mil vezes menor do que a do ATP. Além de confirmar a viabilidade da técnica SELEX para identificar ligantes subtipos-específicos dos receptores purinérgicos, o aptâmero anti-P2Y2 serve como ferramenta fundamental para definir demais funções fisiológicas deste receptor. Passos de otimização das suas propriedades como ligante e biodisponibilidade tornarão este aptâmero um composto de alta relevância farmacêutica. / Many published studies have focused on purinergic signaling and receptors, represented by ionotropic (P2X1 P2X7) and metabotropic (P2Y1,2,4,6,11,12,14) subtypes as a universal system which is not only involved in neuronal signaling, but also in various other vital processes including immune response, inflammation, platelet aggregation as well as differentiation, proliferation and cell death occurring during development and tissue regeneration. In agreement with other published reports, results of our laboratory based on overlapping purinergic receptor pharmacology suggest the participation of the P2Y2 subtype in proliferation and in vitro neurogenesis of P19 embryonal carcinoma cells. In view of the lack of availability of specific agonists and antagonists for most purinergic receptors making the elucidation of exact functions of these receptors in their cellular context almost impossible, we used a combinatorial oligonucleotide library approach, denominated SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) for the development of high-affinity and specificity ligands for the P2Y2 receptor. This approach is based on re-iterative steps of in vitro selection of 2´-fluoro-pyrimidine-modified RNA molecules for receptor-binding affinity from an RNA pool containing 1013 different sequences and secondary and tertiary structures until this pool is purified to a homogeneous population of ligands with high affinity to the P2Y2 receptor. The combinatorial DNA library is in vitro transcribed into RNA followed by target presentation of the RNA library and elution of the target-binders, denominated aptamers, and RT-PCR amplification in order to restore the DNA library used for in vitro transcription for next SELEX cycle. Following nine SELEX cycles using 1321N1 human astroglial cells expressing recombinant human P2Y2 receptors as target, we isolated 46 aptamer sequences which, based on consensus sequence motifs, were grouped in three structural groups. The mixture of the isolated sequences bound themselves to human P2Y2 receptors with a dissociation constant (Kd) of 164 nM. One of the isolated clones, the aptamer denominated B7, bound itself to P2Y2 receptors in preference to P2Y1 and P2Y4 recombinant receptors expressed in 1321N1 cells. The binding activity of the aptamer was not limited to P2Y2 receptors of human origin, as the aptamer also interacted with mouse P2Y2 receptors. The capability of the aptamer of affecting the biological activity of P2Y2 receptors was verified in P19 cells in which ATP-induced protection against apoptosis, mediated by P2Y2 receptors, was abolished in the presence of the aptamer. In addition to providing a proof of principle for the feasibility of developing purinergic subtype-specific ligands by using the SELEX technique, the anti-P2Y aptamer provides a fundamental tool for gaining insights of physiological functions of this receptor in various cellular contexts. Moreover, steps of optimization of receptor binding properties and aptamer half-life in vivo will turn this aptamer into a compound of high pharmaceutical relevance.

Receptores purinérgicos são expressos em neurônios e glia e, por certo, participam dos processos de sinalização entre estes células. Nos gânglios da raiz dorsal o soma dos neurônios sensoriais é envolto por uma camada de células satélites (CSt), que são células de glia, cuja função é desconhecida. Até o momento a natureza dos receptores purinérgicos presentes nas células satélites foi pouco investigada. No presente trabalho demonstra-se a presença dos receptores P2Y1, P2Y2 e/ou P2Y4 e P2Y6 nas CSt de gânglios da raiz dorsal de ratos recém-nascidos. A prova da existência dos receptores foi a elevação na concentração intracelular do Ca2+, induzida pela aplicação de um agonista dos receptores. Nas culturas de mais de 24 horas, estimuladas por soro bovino fetal, proliferam de forma notável células de glia de aspecto predominantemente fusiforme. Determinou-se que as células fusiformes expressam receptores P2Y1, P2Y2 e/ou P2Y4 e P2Y6. As informações obtidas contribuem para o esclarecimento da sinalização entre neurônios e glia nos gânglios sensoriais da raiz dorsal. / Purinergic receptors are expressed and play role in the sinalization between neurons and glia. In dorsal root ganglia the soma of the sensory neurons is surrounded by a layer of satellite glial cells, whose function is unclear. There are evidences that ATP is released by neurons to act on receptors in satellite cells. So far, the nature of the purinergic receptors of satellite cells was not fully investigated. This study shows the presence of metabotropics purinergic receptors P2Y1, P2Y2 and/or P2Y4, e P2Y6 in satellite cells from dorsal root ganglia of newborn rats. The demonstration was carried on following the transient increases in intracellular calcium concentration induced by a purinergic agonist. As time goes by, in the presence of fetal bovine serum, there is a remarkable proliferation of glial cells, with predominant fusiform shapes. The fusiform cells also express P2Y1, P2Y2 and/or P2Y4, e P2Y6 receptors. These informations add on the understanding of the complex phenomena of neuron-glia interaction.

Os receptores purinérgicos são divididos em receptores P1 e P2 de acordo com o seu agonista endógeno, os receptores metabotrópicos P1 são ativados por adenosina, enquanto os metabotrópicos P2Y e ionotrópicos P2X são estimulados através do ATP e outros nucleotídeos. Além de sua função bem estabelecida na neurotransmissão, a sinalização purinérgica tem despertado crescente interesse científico devido à sua importância nas funções no metabolismo celular, incluindo os processos de desenvolvimento embrionário e reparação de tecidos. Isso ocorre especialmente no sistema nervoso central, onde eles controlam a proliferação, diferenciação, apoptose e a liberação de fatores neurotróficos. Nesse trabalho nós focamos nas ações sinérgicas entre a sinalização purinérgica e o fator de crescimento de nervos (NGF), tendo em vista três formas conhecidas de interação entre o NGF e os receptores purinérgicos, a potencialização dos efeitos do NGF através de uma ligação cruzada entre as vias, a regulação da expressão dos receptores purinérgicos pelo NGF e regulação da liberação de NGF pela adenosina. Com o objetivo de investigar estes processos sinérgicos na regulação da proliferação, migração e determinação fenotípica, células precursoras neurais foram obtidas do telencéfalo de embriões de rato e cultivadas na forma de neuroesferas, sendo então submetidas a tratamentos com agonistas e antagonistas dos receptores purinérgicos, em associação com o NGF, ao longo da diferenciação. Os efeitos desses tratamentos foram analisados por citometria de fluxo. Nós mostramos que o NGF age sobre as células aumentando a proliferação, migração e população de células indiferenciadas e diminuindo a apoptose. A ativação dos receptores P1 levou à diminuição da gliogênese e ao aumento da proliferação e da migração. A estimulação de receptores P2 resultou em aumento da proliferação e redução da taxa de apoptose. Os receptores purinérgicos potenciaram a proliferação mediada por NGF, resultando assim num aumento da população de células indiferenciadas. Neste último efeito percebemos a participação do receptor P2Y2 na sinergia. Os resultados aqui apresentados revelam novos mecanismos para a interação entre o NGF e a sinalização purinérgica na biologia de células tronco neurais / Purinergic receptors are divided into P1 and P2 receptors according to agonist selectivity, G-protein- coupled P1 receptors are activated by adenosine, while metabotropic P2Y and ionotropic P2X subtypes are stimulated by ATP and other nucleotides. In addition to its well-established function in neurotransmission, purinergic signaling has raised increasing scientific interest due to its importance in essential cellular functions and metabolism including embryonic developmental processes and tissue repair, specially in the central nervous system, where they control proliferation, differentiation, apoptosis and the release of neurotrophic factors. Here we focus on synergistic actions between purinergic P1 and P2 receptor-mediated signaling and the nerve growth factor (NGF), in view of three recognized forms of interaction between NGF and purinergic signaling, the potencialization of NGF-mediated effects through a crosstalk, the regulation of purinergic receptor expression by NGF and the regulation of NGF release by adenosine. With the objective to investigate such synergistic processes in regulating proliferation, neural migration and phenotype determination, neurospheres obtained as proliferating neural stem and progenitor from rat embryonic telencephalon were subjected to treatments with purinergic receptor agonists and antagonists in association with NGF along differentiation. Effects of these treatments were analyzed by flow cytometry. We show that NGF acted on cells by increasing the population of undifferentiated cells, proliferation, migration and reducing apoptosis. P1 receptor activation led to decreased gliogenesis, increased proliferation and migration. Stimulation of P2 receptors resulted in increased proliferation and decreased apoptosis rates. Purinergic receptors potentiated NGF-mediated proliferation, thereby resulting in increased population of undifferentiated cells, in this latter effect, the P2Y2 receptor subtype participated in synergistic processes. The herein presented results reveal novel mechanisms for the interaction of NGF and purinergic signaling in neural stem cell biology

Orientador: Cláudia Herrera Tambeli / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T14:36:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Teixeira_JulianaMaia_D.pdf: 23889164 bytes, checksum: c8f281ea2cb5d4c68fb62ac535731385 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A osteoartrite (OA) é uma doença degenerativa e progressiva, caracterizada pela degradação da cartilagem que reveste as extremidades ósseas e inflamação da membrana sinovial, causando incapacidade física, inchaço articular e dor. Embora o alívio da dor severa seja o principal objetivo no tratamento agudo, pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos no desenvolvimento da dor na OA. Estudos demonstram a participação do ATP (adenosina 5¿-trifosfato) em processos de hiperalgesia através da ativação dos receptores purinérgicos P2X3, P2X2/3 e P2X7. Portanto, os objetivos deste estudo foram: (1) investigar a participação dos receptores P2X3, P2X2/3 e P2X7 na hiperalgesia articular em modelo de artrite na articulação do joelho de ratos machos e fêmeas em estro e se há diferenças sexuais no efeito induzido pelos antagonistas de receptores P2X3, P2X2/3 e P2X7. (2) testar a hipótese de que a inflamação articular induzida pela carragenina aumenta a expressão do receptor P2X3 nos condrócitos da cartilagem articular da articulação do joelho de ratos. (3) verificar se o mecanismo pelo qual a ativação dos receptores P2X3, P2X2/3 e P2X7 contribui para a hiperalgesia articular depende da liberação prévia de citocinas pró-inflamatórias e da migração de neutrófilos. (4) investigar se a ativação dos receptores P2X3, P2X2/3 e P2X7 induz hiperalgesia na articulação do joelho de ratos dependente da liberação de mediadores inflamatórios. (5) testar a hipótese de que a ativação dos receptores P2X3, P2X2/3 e P2X7 contribui para a hiperalgesia articular induzida pelos mediadores inflamatórios: bradicinina, citocinas pró-inflamatórias, PGE2 e dopamina. Para os objetivos 1, 4 e 5, a hiperalgesia articular foi quantificada através do teste de Incapacitação Articular. Para o objetivo 2, foi utilizado o ensaio de imunofluorescência. Para os objetivos 3 e 4 foram utilizados os ensaios imuno-enzimáticos ELISA e MPO. Os resultados demonstram que a ativação dos receptores P2X3, P2X2/3 e P2X7 pelo ATP endógeno é essencial para o desenvolvimento da hiperalgesia articular induzida pela carragenina na articulação do joelho de ratos machos e fêmeas em estro, que são mais sensíveis do que os machos aos efeitos anti-hiperalgésicos e anti-inflamatórios induzidos pelo antagonista de receptor P2X7. Durante a inflamação articular induzida pela carragenina ocorre um aumento na expressão dos receptores P2X3 nos condrócitos da cartilagem articular. O papel dos receptores P2X3, P2X2/3 e P2X7 na hiperalgesia articular é mediado pela sensibilização indireta dos nociceptores aferentes primários, dependente da liberação prévia de citocinas pró-inflamatórias e da migração de neutrófilos. Além disso, a ativação dos receptores P2X3, P2X2/3 e P2X7 induz hiperalgesia articular dependente da liberação de bradicinina, aminas simpatomiméticas, prostaglandinas e citocinas pró-inflamatórias. Finalmente, a hiperalgesia articular induzida pelos mediadores inflamatórios bradicinina, PGE2 e dopamina depende da ativação de receptores P2X3 e P2X2/3, enquanto que a ativação de receptor P2X7 contribui para a hiperalgesia articular induzida pela bradicinina e dopamina. Concluindo, os resultados apresentados sugerem que os receptores P2X3, P2X2/3 e P2X7 são alvos farmacológicos interessantes para o tratamento das doenças inflamatórias articulares como a osteoartrite. Particularmente em relação ao receptor P2X7, antagonistas seletivos podem ser usados para reduzir a dor e inflamação no joelho, especialmente em mulheres / Abstract: Osteoarthritis (OA) is a degenerative and progressive disease, characterized by cartilage breakdown which covers the bone ends and by synovial membrane inflammation, causing disability, joint swelling and pain. The relief of severe pain is the main goal of the acute treatment, but little is known about the mechanisms involved in the development of pain in OA. It has been demonstrated the role of ATP (adenosine 5'-triphosphate) in processes of hyperalgesia through activation of purinergic receptors P2X3, P2X2/3 and P2X7. Therefore, the aims of this study were: (1) to investigate the role of P2X3, P2X2/3 and P2X7 receptors in articular hyperalgesia in the knee joint arthritis model in males and estrus females rats and, if so, whether there are sex differences in the effect induced by the selective P2X3, P2X2/3 and P2X7 receptors antagonists. (2) to test the hypothesis that the carrageenan-induced articular inflammation increases the expression of P2X3 receptor in chondrocytes of articular cartilage of the knee joint. (3) to verify whether the mechanism by which the P2X3, P2X2/3 and P2X7 receptors activation contributes to articular hyperalgesia depends on previous pro-inflammatory cytokines release and neutrophil migration. (4) to investigate whether the P2X3, P2X2/3 and P2X7 receptors activation induces articular hyperalgesia in the rat¿s knee joint which depends on release of inflammatory mediators. (5) to verify whether the activation of P2X3, P2X2/3 and P2X7 receptors contributes to the articular hyperalgesia induced by the inflammatory mediators bradykinin, pro-inflammatory cytokines, PGE2 and dopamine. For the aims 1, 4 and 5, the articular hyperalgesia was quantified by the rat knee joint Incapacitation Test. The immuno?uorescence method was used for the aim 2. For aims 3 and 4, the ELISA and MPO immunoenzymatic assays were used. The results demonstrate that P2X3, P2X2/3 and P2X7 receptors activation by endogenous ATP is essential for the development of carrageenan-induced articular hyperalgesia in the knee joint of male and estrus female rats, which are more sensitive than males to anti-hyperalgesic and anti-inflammatory effects induced by the P2X7 receptor antagonist. During carrageenan-induced joint inflammation occurs an increased of P2X3 receptors expression in chondrocytes of the articular cartilage. The essential role played by P2X3, P2X2/3 and P2X7 receptors in the development of articular hyperalgesia is mediated by an indirect sensitization of the primary afferent nociceptors dependent on the previous pro-inflammatory cytokines release and neutrophil migration. Moreover, the P2X3, P2X2/3 and P2X7 receptors activation induces articular hyperalgesia which depends on bradykinin, sympathomimetic amines, prostaglandins and pro-inflammatory cytokines release. Finally, the articular hyperalgesia induced by inflammatory mediators bradykinin, PGE2 and dopamine depends on the P2X3 and P2X2/3 receptors activation, while the P2X7 receptor activation contributes to the bradykinin- and dopamine-induced articular hyperalgesia. In conclusion, our results suggest that P2X3, P2X2/3 and P2X7 receptors are interesting pharmacological targets for the treatment of inflammatory joint diseases such as osteoarthritis. In particular, selective P2X7 receptor antagonists can be used to reduce inflammation and pain in the knee joint, especially in women / Doutorado / Fisiologia / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

Les récepteurs purinergiques P2Y ont un rôle modulateur de la sécrétion d'insuline et constituent une cible potentielle pour la recherche de nouveaux antidiabétiques. Dans le modèle du pancréas isolé perfusé de Rat, dans des conditions fonctionnelles proches de la physiologie, nous avons montré que l'activation de ces récepteurs potentialise l'effet insulino-sécrétoire d'une stimulation glucosée. Cet effet requiert le métabolisme du glucose ; il est probablement lié à une augmentation de la concentration intracellulaire de Ca2+, et est indépendant d'un effet direct sur les canaux potassiques ATP dépendants. Nous avons également étudié les effets pancréatiques de nouveaux agonistes des récepteurs P2Y, synthétisés par l'équipe du Pr B. Fischer : parmi ces dérivés, le 2-méthylthio-ATP-a-S (isomère A) est un insulino-sécrétagogue gluco-dépendant, hautement efficace et puissant (CE50 de 28,1 nmol/l), avec une très bonne sélectivité tissulaire. Par ailleurs, nous avons exploré l'implication des récepteurs P2Y dans la prolifération cellulaire en utilisant un modèle de lignée cellulaire insulino-sécrétrice issue d'insulinome de Rat (lignée INS-1E) : aux doses utilisées, l'ATP-a-S (agoniste du récepteur P2Y) et le GLP-1 entraînent une réponse insulinique comparable, mais une augmentation de l'AMPc intracellulaire d'amplitude différente ; de plus, contrairement au GLP-1, l'ATP-a-S est sans effet sur la prolifération des cellules. Enfin, en collaboration avec l'équipe du Pr C. Gachet, nous avons montré l'implication des récepteurs de sous-type P2Y1 dans la réponse insulinique d'îlots pancréatiques de Souris. Nos travaux ont donc permis d'améliorer les connaissances sur les récepteurs purinergiques P2Y des cellules ß pancréatiques en ce qui concerne leurs mécanismes d'action, leurs effets sur l'insulino-sécrétion et sur la prolifération cellulaire ; nous avons également contribué au développement d'agonistes spécifiques, potentiellement intéressants pour le traitement du diabète de type 2. / P2Y purinergic receptors play a role in the modulation of insulin secretion and represent a potential therapeutic target for new antidiabetic drugs. In the model of isolated perfused rat pancreas, in functional conditions close to physiology, we have shown that the activation of these receptors amplify the glucose-induced insulin secretion. This effect requires the metabolism of glucose; it is probably related to a rise in intracellular Ca2+ concentration, and is independent from a direct effect on ATP-dependent potassium channels. We have also studied the pancreatic effects of new P2Y receptor agonists, synthesized by the group of Prof. B. Fischer: among these compounds, 2-methylthio-ATP-a-S (A isomer) is a glucose-dependent insulin secretagogue, with high efficacy and potency (EC50 at 28.1 nmol/l), and with very good tissue selectivity. On the other hand, we have investigated the implication of P2Y receptors in cell proliferation, using a model of insulin secreting cell line from rat insulinoma (INS-1E cell line): at the doses used, ATP-a-S (a P2Y receptor agonist) and GLP-1 induce a similar insulin response, but an increase in intracellular cAMP of different magnitude; moreover, in contrast to GLP-1, ATP-a-S is ineffective on cell proliferation. Finally, in collaboration with the group of Prof. C. Gachet, we have shown that the P2Y1 receptor subtype was involved in the insulin response of mice pancreatic islets. Thus, our studies contributed to the improvement of knowledge on P2Y purinergic receptors of pancreatic ß-cells, as regards their mechanisms of action, their effects on insulin secretion and on cell proliferation; we also contributed to the development of specific agonists, potentially interesting for the treatment of type 2 diabetes.