Made available in DSpace on 2016-03-15T14:19:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 romulo_bezerra_ioc_dout_2012.pdf: 7162611 bytes, checksum: 3d02f06c712f13335b047fc33620dd3c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / O P2X7 é um receptor purinérgico que está envolvido em importantes funções fisiológicas e metabólicas, mas também tem participação em diversas patologias, principalmente aquelas de caráter inflamatório. Apesar de sua relevância, ainda não se têm disponíveis antagonistas específicos que possam ser utilizados na clínica para o tratamento de doenças relacionadas à ativação deste receptor. Muitos fármacos comercializados nos dias de hoje apresentam estruturas químicas relacionadas a um produto natural extraído de alguma espécie botânica de uso consagrado na medicina popular. Baseia-se nisso a relevância do estudo de produtos naturais para obtenção de uma atividade específica sobre alvos celulares. Logo, esse trabalho teve como interesse o estudo de extratos vegetais e fúngicos obtidos de espécies dos diferentes biomas, cedidos pelo LQPN do Centro de Pesquisas René Rachou \2013 Fiocruz-MG, visando á identificação de antagonistas para o receptor P2X7. Nosso primeiro passo foi à padronização de uma metodologia que permitiu a triagem de cerca de 60 extratos ao mesmo tempo, através da utilização de um espectrofotômetro de placas. Depois de padronizada, promovemos a aplicação dessa metodologia na triagem de 1800 extratos, dos quais apenas três extratos (8067,8549 e 8568) apresentaram atividade antagonista na faixa de corte pré-estabelecida [100 \03BCg/mL], com perfis de inibição de 65 %, 62 % e 61 % respectivamente, sobre o P2X7R. Destes extratos foram determinados os IC´s50 tanto em células de linhagem murina (2,1 \03BCg/mL; 2.6 \03BCg/mL e 3.8 \03BCg/mL) quanto em células de linhagem humana (0.69, 0.92 e 1.5 \03BCg/mL), sendo possível verificar maior atividade quando testados em células de linhagem humana Posteriormente avaliamos a ação destes sobre funções fisiológicas relacionadas à ativação do P2X7R, nessa etapa, observamos o efeito inibitório destes extratos sobre a liberação de IL-1beta, ROS e NO, onde os três compostos foram capazes de inibir estas funções numa faixa entre 50 % a 60 %. Para obtermos uma caracterização do efeito farmacológico destes extratos sobre o receptor P2X7, realizamos experimentos de eletrofisiologia, caracterizando assim uma ação inibitória dose-dependente destes, sendo que nos respectivos IC´s50 os perfis de inibição da corrente foram de: 76 %, 47 % e 75 %. Também avaliamos a citotoxicidade in vitro utilizando as células de ambas às linhagens e verificamos que não apresentaram significativa toxicidade quando tratadas por 24 h. em doses até quatro vezes maiores que o IC50, visto que os resultados foram semelhantes ao controle não tratado. Depois de avaliarmos a atividade antagonista destes extratos in vitro, partimos para os experimentos in vivo utilizando os modelos de úlcera induzida por etanol e de dor neuropática e inflamatória, pois existem trabalhos previamente descritos na literatura que correlacionam a atividade do P2X7R com a evolução dessas patologias. No ensaio de dor neuropática, apenas dois extratos mostraram atividade analgésica (8067 e 8549) inibindo o estímulo de dor em 68 % e 66 %, porém no contexto da dor inflamatória os três extratos mostraram efeito analgésico, inibindo o estímulo em: 8067 = 48%, 8549 = 50% e 8568 = 44 % Os resultados obtidos do experimento de úlcera induzida por etanol demonstraram o efeito inibitório sobre a formação de úlceras desses extratos em: 88 %, 84 % e 51 %, inclusive foram mais efetivos que o BBG (antagonista reversível deste receptor) e que o medicamento utilizado na clínica (Lansoprazol), os quais inibiram a formação de úlceras em 43 % e 46% respectivamente. Nosso conjunto de resultados apontam extratos com significativa atividade antagonista sobre o P2X7R, com potencial para o desenvolvimento de novos fármacos com grande interesse para a indústria farmacêutica, além de contribuir para o conhecimento acerca de propriedades medicinais presentes na biodiversidade / The purinergic receptor P2X7 is involved in important physiological and metabolic functions, but it also participates in pathology, especially when inflammatory in character. Despite the importance of P2X7, it has no specifi c antagonists yet available for use in clinical treatment of diseases related to the receptor's activation. Today, many drugs on the market have chemical structures related to natural products obtained from botanical species with traditional use in indigen ous medicine, forming the basis for studying natural products to obtain specific activity on cellular targets. This work focused primarily on the study of plant and fungal species extracts obtained from different biomes provided by LQPN of the Research Cen ter René Rachou - Fiocruz - MG, aiming to identify antagonists for the P2X7 receptor. The first step was to standardize a method that allowed the screening of approximately 60 extracts at the same time through the use of a plate spectrophotometer. Once stand ardized, the application of this methodology was promoted in the screening of 1800 extracts. Of these, only three extracts (8067, 8549 and 8568) showed antagonistic activity in the pre - established cut range [100 mg/mL], with inhibition profiles of 65%, 62% , and 61% respectively, on the P2X7R. Th e IC's50 of them were determinate in murine (2.1, 2.6, and 3.8 mg/mL) and human (0.69, 0.92, and 1.5 mg/mL) cell lines. Which an increased activity was possible to verify when they were tested in human cells. Consequ ent evaluation of action on physiological functions related to the activation of P2X7R revealed an inhibitory effect of these extracts on the release of IL - 1beta, NO, and ROS. The three tested compounds were able to inhibit these functions in a range betwe en 50% and 60%. To obtain a pharmacological characterization of these extracts on the P2X7 receptor, electrophysiological experiments were conducted, which characterized the dose - dependent inhibitory effects, exhibiting inhibitory current profiles of 76%, 47%, and 75%, respectively. In vitro cytotoxicity was also evaluated, using both cell strains, showing no significant toxicity after 24 hours of treatment at doses of up to four times that of the IC50; the results were similar to the untreated control. Aft er evaluating the antagonistic activity of these extracts in vitro, experiments using the in vivo models of ethanol - induced ulcers and inflammatory and neuropathic pain were performed. Previous studies correlate the activity of the P2X7R with the evolution of these pathologies. In the neuropathic pain protocol experiment, only two extracts showed analgesic activity (8067 and 8549) by inhibiting the pain stimulation by 68% and 66%, but in the context of inflammatory pain, the three tested extracts showed ana lgesic effects by inhibiting the stimulus by the following percentages: 8067 = 48 %, 8549 = 50%, and 8568 = 44%. The results of the ethanol - induced ulcer demonstrated an inhibitory effect on the ulcer’s development of 88%, 84%, and 51% by these extracts, a nd found that the extracts were more effective than BBG (reversible antagonist of this receptor) and the medicine used clinically (Lansoprazole), which inhibited the formation of ulcers by 43% and 46%, respect ively. The data set links to extracts with significant antagonist activity on the P2X7R, and potential to the development xix of new medicines of great interest to the pharmaceutical industry and important contributions to the knowledge of medicinal properties present in biodiversity

CARMO, Marta Regina Santos do. Efeito neuroprotetor do antagonismo do receptor P2X7 no Parkinsonismo experimental induzido por 6-OHDA. 2015. 110 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-04-17T13:13:51Z No. of bitstreams: 1 2015_tese_mrscarmo.pdf: 2518438 bytes, checksum: 237c71b94e431515b74c222c224d8c8e (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-04-17T13:14:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_tese_mrscarmo.pdf: 2518438 bytes, checksum: 237c71b94e431515b74c222c224d8c8e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-17T13:14:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_tese_mrscarmo.pdf: 2518438 bytes, checksum: 237c71b94e431515b74c222c224d8c8e (MD5) Previous issue date: 2015 / Parkinson’s disease (PD) is characterized by a progressive degeneration of dopaminergic neurons in the substantia nigra (SN) and a concomitant decrease of dopamine (DA) in the striatum, which can be modeled by 6-OHDA administration. Since ATP released from damaged cells can exert noxious effects on neurons, acting through its P2X7 receptors (P2X7R), the aim of the present study was to investigate the effects of a P2X7R antagonist, Brilliant Blue G (BBG) on 6-OHDA-induced neurotoxicity. Male Wistar rats received stereotaxic injections of 6-OHDA (18 µg/3µl) into the right striatum and were treated with BBG (45 mg/kg, i.p. 48/48 h) for two weeks. In an additional experiment, animals were treated with the selective antagonist A-438079 (10 µM i.c.v.) for two weeks. BBG decreased the number of contralateral rotations in the apomorphine test, an effect mimicked by the selective P2X7R antagonist A438079. BBG has also improved the animals’ performance in the passive avoidance test (short-term memory) and in the cued version of the Morris Water maze. The antagonism of P2X7R by BBG has also prevented the reduction of dopamine content in the striatum and SN as well as the loss of dopaminergic neurons, and microgliosis and astrogliosis in the striatum. BBG treatment also decreased the IL-1β levels in striatum, despite the observed effect not being statistically significant. To grasp the mechanism of action of BBG, we used in vitro models exploring synaptotoxicity (striatal synaptosomes) and neurotoxicity (dopamine-differentiated SH-SY5Y cells). Besides showing that P2X7R are present in striatal dopaminergic terminals, we observed that BBG 100 nM prevented the 6-OHDA-induced synaptosomal dysfunction. Furthermore, we have shown the presence of P2X7 receptors in SH-SY5Y cells, their co-localization with tyrosine hydroxilase, and that BBG attenuates the cell damage, evaluated through lactate dehydrogenase release. The present results suggests that P2X7R contribute to PD pathogenesis through a triple impact on synaptotoxicity, gliosis and neurotoxicity, highlighting the therapeutic potential of P2X7R antagonists in the disease. / A doença de Parkinson (DP) é caracterizada por uma degeneração progressiva dos neurônios da substância negra (SN) e uma concomitante diminuição do conteúdo de dopamina no estriado, que pode ser mimetizada pela administração de 6-OHDA. Visto que o ATP liberado das células danificadas exerce efeitos deletérios diretos sobre os neurônios, agindo através de receptores P2X7, o objetivo do presente trabalho foi estudar os efeitos do Brilliant Blue G (BBG), um antagonista dos receptores P2X7, sobre a neurotoxicidade induzida por 6-OHDA. Ratos Wistar machos receberam injeções estereotáxicas de 6-OHDA (18 µg/3µl) no estriado direito e foram tratados com BBG (45 mg/kg, i.p. 48/48hs) durante 14 dias. Em uma série adicional de experimentos, os animais receberam o antagonista seletivo A-438079 (10 µM i.c.v.) por 14 dias. O tratamento com BBG diminuiu o número de rotações contralaterais no teste da apomorfina, efeito que foi mimetizado pelo antagonista seletivo A-438079. O BBG também melhorou o desempenho dos animais no teste da esquiva passiva (memória de curta duração), assim como na versão com plataforma sinalizada do labirinto aquático. O antagonismo dos receptores P2X7 pelo BBG preveniu ainda a redução do conteúdo de dopamina no estriado e SN, assim como a perda de neurônios dopaminérgicos, a microgliose e astrogliose no estriado. O tratamento com BBG também diminuiu os níveis de IL-1β no estriado, apesar das diferenças observadas entre os grupos não serem estatisticamente diferentes. Com o objetivo de entender melhor o mecanismo de ação do BBG, foram utilizados modelos in vitro explorando a sinaptotoxicidade (sinaptossomas estriatais) e neurotoxicidade (células SH-SY5Y dopaminérgicas diferenciadas). Além da demonstração da presença dos receptores P2X7 nos terminais nervosos estriatais, foi observado que o BBG 100 nM preveniu a disfunção sinaptossomal. Também demonstramos a presença dos receptores P2X7 nas células SH-SY5Y, assim como sua co-localização com tirosina hidroxilase, onde o pré-tratamento com BBG 100 nM diminuiu o dano celular, avaliado através da liberação de lactato desidrogenase. Os resultados obtidos no presente estudo sugerem que os receptores P2X7 contribuem para a patogênese da DP através de um triplo mecanismo sobre a sinaptotoxicidade, gliose e neurotoxicidade, ressaltando o potencial terapêutico dos antagonistas desses receptores na doença.

SANTOS, A. A. Q. A. Papel do receptor P2x7 no efeito da toxina a do Clostridium difficile em modelo de alça ileal em camundongos. 2017. 100 f. Tese (Doutorado em Ciências Médicas) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-01-30T16:00:58Z No. of bitstreams: 1 2017_tese_aaqasantos.pdf: 2658637 bytes, checksum: 8c134a5e88286c7d898fc1d1a091d893 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-01-30T16:01:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_tese_aaqasantos.pdf: 2658637 bytes, checksum: 8c134a5e88286c7d898fc1d1a091d893 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-30T16:01:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_tese_aaqasantos.pdf: 2658637 bytes, checksum: 8c134a5e88286c7d898fc1d1a091d893 (MD5) Previous issue date: 2017-01-16 / Clostridium difficile (C. difficile) is the major cause of colitis associated with the use of antibiotics, with significant morbidity and mortality. The enteric nervous system (ENS) is located in the gastrointestinal tract (GIT) and has an important function of regulating the digestive system. The P2X7 receptor participates in the regulation of cellular permeability, cytokine release and apoptosis, processes that are involved in the pathogenesis of C. difficile induced disease.The aim of this study was to analyze the role of the P2X7 receptor in enteritis induced by C. difficile toxin A (TcdA). The mouse ileal loop was injected with saline (Sodium Chloride 0.9% - Control) or TcdA (50 μg / loop) in mice previously treated with the inhibitors: BBG (50 mg/kg) or A438079 (10 μM) i.p.injection 1 h prior to TcdA (TcdA + BBG; TcdA + A438079) or saline injection. The animals were euthanized after 4h latter and the ileal loop collected for the following analyzes: immunofluorescence for ChAT, NOS, P2X7 and calretinin in membrane preparations, immunohistochemistry for GFAP, HuC / D, S-100β, TUNEL and PCR for P2X7. The results demonstrated that TcdA significantly reduced myenteric plexus neurons in 66.42% when compared to the control, while in the membrane preparations a significant reduction of the immunoreactive neurons to ChAT was observed in 23.21% and Calretinin 28.17%. However, there was a 21.23% increase in labeling for the P2X7 receptor over the control. In the ileal tissue there was an increase of 411.95% and 22.40% respectively in the P2X7 positive area and in the gene expression. In relation to the glial markers, an increase of 125.71% and 144.30% was observed for GFAP and S-100β, respectively. In animals treated with inhibitors P2X7; BBG and A438079, as observed an improvement in histological parameters . In addition , a significant reduction in the number of apoptotic cells decrease in GFAP and S-100β-labeled cells, and cytokines ( TNF-α, IL-1β, IL -6 and IL-8) levels, compared to the control. This was associated with a significant increase in the HuC/D positive area . From these results, it is concluded that TcdA promotes changes in the enteric nervous system, increasing neuronal death and activating glial cells, and that the P2X7 receptor plays an important role in the changes induced by C. difficile TcdA. / O Clostridium difficile (C. difficile) é a maior causa de colite associada ao uso de antibióticos, com significante morbidade e mortalidade. O sistema nervoso entérico (SNE) está localizado no trato gastrointestinal (TGI) e possui importante função de regulação do sistema digestório. O receptor P2X7 presente nas células gliais entéricas (CGE) e no SNE participa na regulação da permeabilidade celular, liberação de citocinas e apoptose, processos que estam envolvidos na patogênese do C. difficile. O objetivo deste estudo foi analisar o papel do receptor P2X7 na enterite induzida pela toxina A (TcdA) do C. difficile. A alça ileal dos camundongos foi injetada com salina (Cloreto de Sódio 0,9%- Controle) ou TcdA (50 μg/alça) em camundongos previamente tratados com os inibidores: BBG (50 mg/kg) ou A438079 (10 μM) via intraperitoneal 1h antes da injeção da TcdA ou salina. Os animais foram eutanaziados após 4h da injeção e a alça ileal coletada para as seguintes analises: imunofluorescência para ChAT, NOS, P2X7 e calretinina nos preparados de membrana, imunohistoquímica para GFAP, HuC/D, S-100β, TUNEL e PCR para P2X7. Os resultados demonstraram que a TcdA reduziu significativamente em 66,42% os neurônios do plexo mioentérico quando comparado ao controle, enquanto nos preparados de membrana observou-se uma redução significativa dos neurônios imunorreativos a ChAT em 23,21% e Calretinina 28,17%, contudo, houve um aumento de 21,23% da marcação para o receptor P2X7 em relação ao controle. No tecido ileal verificou-se um aumento de 411,95% e 22,40% respectivamente na área positiva para P2X7 e na expressão gênica. Em relação aos marcadores gliais, observou-se um aumento de 125,71% e 144,30% para GFAP e S-100β, respectivamente. Nos animais tratados com os inibidores de P2X7: BBG e o A438079 observou-se uma melhora dos parâmetros histológicos, uma redução significativa do número de células apoptóticas, das células marcadas para GFAP e S-100β, das citocinas: TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8 com relação ao controle e um aumento significativo na área positiva para HuC/D em relação a TcdA. A partir desses resultados, concluiu-se que a TcdA promoveu alterações no sistema nervoso entérico, aumentando a morte neuronal e ativando as células da glia, e que o receptor P2X7 tem participação importante nas alterações induzidas pela TcdA do C. difficile.

O sistema purinérgico tem sido amplamente implicado em condições médicas, entre elas, o transtorno bipolar (TB). Até onde sabemos, nenhum estudo foi realizado com o objetivo de esclarecer a possível contribuição do receptor P2X7 (P2X7R) na patofisiologia do TB ou mesmo com o objetivo de revisar o que já fora previamente publicado sobre este assunto. Nos presentes trabalhos, nosso objetivo foi em primeiro lugar explorar a relação entre o receptor e esse transtorno e identificar os mecanismos pelos quais o P2X7R desempenha um papel no TB e por fim revisar a literatura, focando na sinalização purinérgica no TB, com ênfase na sinalização por ATP e adenosina, destacando o potencial papel do P2X7R na modulação da inflamação e ativação microglial em pacientes bipolares. Para o primeiro objetivo, analisamos o efeito de moduladores do P2X7R (BzATP, BBG e A438079) sobre o comportamento (atividade locomotora) e sobre marcadores de neuroinflamação (IL-1 , TNF- e IL-6), excitotoxicidade (GFAP, TBARS) e neuroplasticidade (BDNF) em um modelo farmacológico de mania induzido pelo tratamento agudo e crônico com D – anfetamina (AMPH) (2mg/kg). Demonstramos na atividade locomotora uma aparente falta de capacidade de resposta à AMPH por animais com P2X7R bloqueado ou ausente (P2X7R-/-). Da mesma forma, observamos que o P2X7R participa do aumento do ambiente próinflamatório e excitotóxico induzido pela AMPH, demonstrado pelo papel de reversão do bloqueio do P2X7R ou pela perda de resposta dos animais P2X7R-/-. Em conclusão, nossos resultados suportam a hipótese de que o P2X7R possui um papel na patofisiologia do TB, como sugerido pelo nosso modelo animal, principalmente por mediar a neuroinflamação e a excitotoxicidade e finalmente levando a mudanças comportamentais. Assim, acreditamos que o P2X7R possui potencial para se tornar um alvo terapêutico do TB. Baseado neste cenário, estudos mais detalhados do papel do P2X7R no TB são necessários, especialmente devido à sua capacidade de agir sobre a microglia e modular a neuroinflamação e a excitotoxicidade. / The purinergic system has been increasingly implicated in medical conditions, among them bipolar disorder (BD). Up to date, no study has been conducted in order to clarify the possible contribution of the P2X7 receptor (P2X7R) to BD pathophysiology or even to review the previously data about this subject. In the presents works, we aim firstly to explore the association between the receptor and the disorder and identify the mechanisms by which the P2X7R plays a role in BD and lastly to review the literature focused on purinergic signaling in BD, with an emphasis on ATP and adenosine signaling, highlighting the potential role of P2X7R in modulating inflammation and microglia activation in bipolar patients. For the first aim, we analyzed the P2X7R modulatory effect (BzATP, BBG and A438079) on behavior (locomotor activity) and on markers of neuroinflammation (IL-1 , TNF- and IL-6), excitotoxicity (GFAP, TBARS), and neuroplasticity (BDNF) in a pharmacological model of mania induced by acute and chronic D-amphetamine (AMPH) treatment (2 mg/kg). We demonstrate in the locomotor activity an apparent lack of responsiveness to AMPH by animals with blocked or absent P2X7R (P2X7R-/-). Likewise, we observed that the P2X7R participates in the AMPH-induced increase of proinflammatory and excitotoxicity environment, demonstrated by the reversal role of P2X7R blockage or the lack of response by P2X7R-/- mice. In conclusion, our results provide support for the hypothesis that P2X7R plays a role in BD pathophysiology, as suggested by our animal model, mainly by mediating neuroinflammation and excitotoxicity and ultimately leading to behavioral changes. Thus, we believe that P2X7R has the potential to become a therapeutic target of BD. Based on this scenario, a more detailed study of the role of P2X7R in BD is warranted, especially due to its ability to act on microglia and modulate neuroinflammation and excitotoxicity.

O sistema purinérgico tem sido amplamente implicado em condições médicas, entre elas, o transtorno bipolar (TB). Até onde sabemos, nenhum estudo foi realizado com o objetivo de esclarecer a possível contribuição do receptor P2X7 (P2X7R) na patofisiologia do TB ou mesmo com o objetivo de revisar o que já fora previamente publicado sobre este assunto. Nos presentes trabalhos, nosso objetivo foi em primeiro lugar explorar a relação entre o receptor e esse transtorno e identificar os mecanismos pelos quais o P2X7R desempenha um papel no TB e por fim revisar a literatura, focando na sinalização purinérgica no TB, com ênfase na sinalização por ATP e adenosina, destacando o potencial papel do P2X7R na modulação da inflamação e ativação microglial em pacientes bipolares. Para o primeiro objetivo, analisamos o efeito de moduladores do P2X7R (BzATP, BBG e A438079) sobre o comportamento (atividade locomotora) e sobre marcadores de neuroinflamação (IL-1 , TNF- e IL-6), excitotoxicidade (GFAP, TBARS) e neuroplasticidade (BDNF) em um modelo farmacológico de mania induzido pelo tratamento agudo e crônico com D – anfetamina (AMPH) (2mg/kg). Demonstramos na atividade locomotora uma aparente falta de capacidade de resposta à AMPH por animais com P2X7R bloqueado ou ausente (P2X7R-/-). Da mesma forma, observamos que o P2X7R participa do aumento do ambiente próinflamatório e excitotóxico induzido pela AMPH, demonstrado pelo papel de reversão do bloqueio do P2X7R ou pela perda de resposta dos animais P2X7R-/-. Em conclusão, nossos resultados suportam a hipótese de que o P2X7R possui um papel na patofisiologia do TB, como sugerido pelo nosso modelo animal, principalmente por mediar a neuroinflamação e a excitotoxicidade e finalmente levando a mudanças comportamentais. Assim, acreditamos que o P2X7R possui potencial para se tornar um alvo terapêutico do TB. Baseado neste cenário, estudos mais detalhados do papel do P2X7R no TB são necessários, especialmente devido à sua capacidade de agir sobre a microglia e modular a neuroinflamação e a excitotoxicidade. / The purinergic system has been increasingly implicated in medical conditions, among them bipolar disorder (BD). Up to date, no study has been conducted in order to clarify the possible contribution of the P2X7 receptor (P2X7R) to BD pathophysiology or even to review the previously data about this subject. In the presents works, we aim firstly to explore the association between the receptor and the disorder and identify the mechanisms by which the P2X7R plays a role in BD and lastly to review the literature focused on purinergic signaling in BD, with an emphasis on ATP and adenosine signaling, highlighting the potential role of P2X7R in modulating inflammation and microglia activation in bipolar patients. For the first aim, we analyzed the P2X7R modulatory effect (BzATP, BBG and A438079) on behavior (locomotor activity) and on markers of neuroinflammation (IL-1 , TNF- and IL-6), excitotoxicity (GFAP, TBARS), and neuroplasticity (BDNF) in a pharmacological model of mania induced by acute and chronic D-amphetamine (AMPH) treatment (2 mg/kg). We demonstrate in the locomotor activity an apparent lack of responsiveness to AMPH by animals with blocked or absent P2X7R (P2X7R-/-). Likewise, we observed that the P2X7R participates in the AMPH-induced increase of proinflammatory and excitotoxicity environment, demonstrated by the reversal role of P2X7R blockage or the lack of response by P2X7R-/- mice. In conclusion, our results provide support for the hypothesis that P2X7R plays a role in BD pathophysiology, as suggested by our animal model, mainly by mediating neuroinflammation and excitotoxicity and ultimately leading to behavioral changes. Thus, we believe that P2X7R has the potential to become a therapeutic target of BD. Based on this scenario, a more detailed study of the role of P2X7R in BD is warranted, especially due to its ability to act on microglia and modulate neuroinflammation and excitotoxicity.

O sistema purinérgico tem sido amplamente implicado em condições médicas, entre elas, o transtorno bipolar (TB). Até onde sabemos, nenhum estudo foi realizado com o objetivo de esclarecer a possível contribuição do receptor P2X7 (P2X7R) na patofisiologia do TB ou mesmo com o objetivo de revisar o que já fora previamente publicado sobre este assunto. Nos presentes trabalhos, nosso objetivo foi em primeiro lugar explorar a relação entre o receptor e esse transtorno e identificar os mecanismos pelos quais o P2X7R desempenha um papel no TB e por fim revisar a literatura, focando na sinalização purinérgica no TB, com ênfase na sinalização por ATP e adenosina, destacando o potencial papel do P2X7R na modulação da inflamação e ativação microglial em pacientes bipolares. Para o primeiro objetivo, analisamos o efeito de moduladores do P2X7R (BzATP, BBG e A438079) sobre o comportamento (atividade locomotora) e sobre marcadores de neuroinflamação (IL-1 , TNF- e IL-6), excitotoxicidade (GFAP, TBARS) e neuroplasticidade (BDNF) em um modelo farmacológico de mania induzido pelo tratamento agudo e crônico com D – anfetamina (AMPH) (2mg/kg). Demonstramos na atividade locomotora uma aparente falta de capacidade de resposta à AMPH por animais com P2X7R bloqueado ou ausente (P2X7R-/-). Da mesma forma, observamos que o P2X7R participa do aumento do ambiente próinflamatório e excitotóxico induzido pela AMPH, demonstrado pelo papel de reversão do bloqueio do P2X7R ou pela perda de resposta dos animais P2X7R-/-. Em conclusão, nossos resultados suportam a hipótese de que o P2X7R possui um papel na patofisiologia do TB, como sugerido pelo nosso modelo animal, principalmente por mediar a neuroinflamação e a excitotoxicidade e finalmente levando a mudanças comportamentais. Assim, acreditamos que o P2X7R possui potencial para se tornar um alvo terapêutico do TB. Baseado neste cenário, estudos mais detalhados do papel do P2X7R no TB são necessários, especialmente devido à sua capacidade de agir sobre a microglia e modular a neuroinflamação e a excitotoxicidade. / The purinergic system has been increasingly implicated in medical conditions, among them bipolar disorder (BD). Up to date, no study has been conducted in order to clarify the possible contribution of the P2X7 receptor (P2X7R) to BD pathophysiology or even to review the previously data about this subject. In the presents works, we aim firstly to explore the association between the receptor and the disorder and identify the mechanisms by which the P2X7R plays a role in BD and lastly to review the literature focused on purinergic signaling in BD, with an emphasis on ATP and adenosine signaling, highlighting the potential role of P2X7R in modulating inflammation and microglia activation in bipolar patients. For the first aim, we analyzed the P2X7R modulatory effect (BzATP, BBG and A438079) on behavior (locomotor activity) and on markers of neuroinflammation (IL-1 , TNF- and IL-6), excitotoxicity (GFAP, TBARS), and neuroplasticity (BDNF) in a pharmacological model of mania induced by acute and chronic D-amphetamine (AMPH) treatment (2 mg/kg). We demonstrate in the locomotor activity an apparent lack of responsiveness to AMPH by animals with blocked or absent P2X7R (P2X7R-/-). Likewise, we observed that the P2X7R participates in the AMPH-induced increase of proinflammatory and excitotoxicity environment, demonstrated by the reversal role of P2X7R blockage or the lack of response by P2X7R-/- mice. In conclusion, our results provide support for the hypothesis that P2X7R plays a role in BD pathophysiology, as suggested by our animal model, mainly by mediating neuroinflammation and excitotoxicity and ultimately leading to behavioral changes. Thus, we believe that P2X7R has the potential to become a therapeutic target of BD. Based on this scenario, a more detailed study of the role of P2X7R in BD is warranted, especially due to its ability to act on microglia and modulate neuroinflammation and excitotoxicity.

Made available in DSpace on 2016-04-20T12:39:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 rafael_soares_ioc_mest_2015.pdf: 5479188 bytes, checksum: f6ce23593dd41a10564934ddfa4bd278 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O receptor P2X7, contido na família de receptores P2, é um receptor inotrópico purinérgico, cátion seletivo, ativado por nucleotídeos (ATP). Esses receptores são expressos em células do sistema nervoso central, periférico e células da linhagem hematopoiética além de estarem envolvidos em diversos processos biológicos como a transdução de sinais da dor, participação na inflamação granulomatosa, dentre outros. Dos seus sete subtipos (P2X1 \2013 P2X7) o P2X7 possui a característica de formar um poro cuja condutância é aumentada em aproximadamente 26 vezes em relação à condutância padrão de todos os receptores da família P2X (~15 pS). Este aumento na condutância se reflete em possibilitar a passagem de moléculas de até 900 Da. Este estudo propõe através da aplicação das técnicas de modelagem comparativa e dinâmica molecular analisar o comportamento dinâmico de um modelo do receptor P2X7 humano, desde seus movimentos de fechamento e abertura do canal de baixa condutância, até a passagem de íons catiônicos (Potássio) e aniônicos (cloreto) para avaliar a seletividade do canal. Isto é necessário pois ainda não se dispõe de um modelo experimental (Ressonância Magnética Nuclear ou Cristalografia de raio-X) e ainda existem dúvidas sobre o mecanismo de ativação que elucide o processo de transição entre o estado de menor condutância (um canal aberto) para o estado de maior condutância (formação de um poro) Foram construídos dois modelos do receptor P2X7 por meio de modelagem comparativa utilizando como molde o receptor P2X4 do organismo Danio rerio (único molde viável até o momento) em seus estados aberto e fechado. As simulações de dinâmica molecular revelaram o tempo de fechamento de canal (região transmembranar) e o rearranjo do sítio de ligação ao ATP em ~400ps e ~650ps, respectivamente. As dinâmicas de passagem dos íons confirmaram as características cátion seletivas do canal, visto que foi possível observar a passagem de todos os íons de potássio dispostos na região de estreitamento do canal e também foi observada a expulsão de uma das três dispostas na mesma região que os íons catiônicos avaliados. Estes resultados ressaltam que os sistemas simulados para avaliar o comportamento do receptor P2X7 descrevem comportamentos semelhantes aos descritos experimentalmente ressaltando a possibilidade de uso dos modelos construídos neste trabalho para aplicação em estudos piloto futuros (virtual screening, docking molecular) para avaliação de compostos promissores que atuem como agonistas ou antagonistas mais seletivos que os compostos existentes atualmente / The P2X7 is an inotropic, purinergic, cation-selective and activated by nucleotides (ATP) receptor that belongs to the P2 receptor family. These receptors are found in central and peripheral nervous system cells and in hematopoietic lineage cells. In addition, P2X7 receptors are involved in a vast number of biological processes such as pain signal transduction, participation in granulomatous inflammation, among others. From all seven subtypes (P2X1 \2013 P2X7), P2X7 receptor presents the characteristic of forming a pore whose conductance increases approximately 26 times more than the standard conductance from all others P2X receptors (~15 pS). This rise in the conductance allows the entrance of molecules up to 900 Da. The aim of this study is to employ comparative modeling and molecular dynamics methods to analyze the dynamic behavior of the human P2X7 receptor to assess the channel selectivity, regarding the opening and closing movements and the passage of cations (potassium) and anions (chloride) across the low conductance channel). The combination of these methods is necessary since there is no model determined by experimental methods such as Nuclear Magnetic Resonance or X-ray Crystallography, and doubts remain about the activation mechanism that drives the receptor form a state of low conductance (open channel) to a state of high conductance (pore formation) Two P2X7 receptor models were built by means of comparative modeling using as template the 3D structure of P2X4 receptor from Danio rerio organism in its open and close states. Molecular dynamics simulations revealed the channel closing time (transmembrane region) and the rearrangement of the ATP binding site took place, in ~400 ps and ~650 ps, respectively. The ion entry simulations confirmed the cation selectivity characteristics of the channel, since it was possible to observe the entrance of all potassium molecules present in the narrowed region of the channel. Furthermore, it was noted the expelling of the chloride molecules at the same regions. These results highlight that the P2X7model reproduce its experimental behavior. It is possible to describe similar mechanisms described experimentally; emphasizing the prospect of using these models in future studies (virtual screening, molecular docking) to evaluate lead compounds, capable of acting as more selective agonists or antagonist than the current available ones

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-20T15:33:03Z No. of bitstreams: 1 Anael Viana Pinto Alberto.pdf: 4150812 bytes, checksum: 9ce0a5d780533302dcc603ae65f510fe (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-20T15:33:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Anael Viana Pinto Alberto.pdf: 4150812 bytes, checksum: 9ce0a5d780533302dcc603ae65f510fe (MD5) Previous issue date: 2012-10-31 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / ATP e outros nucleotídeos são liberados para o meio extracelular por vias reguladas ou pela perda da integridade de membrana. Uma vez fora da célula, esses compostos podem ativar receptores P2: P2X (receptores ionotrópicos) e P2Y (receptores acoplados a proteínas G). Além disso, O receptor P2X7 é um importante membro da família P2X, já que sua ativação pode levar a abertura de um poro membranar que permite a passagem de moléculas de até 900 Da. Os eosinófilos são as principais células efetoras em respostas alérgicas e estão associados com diversos processos fisiológicos e patológicos. Nesse trabalho investigamos a expressão de receptores P2 e suas funções em eosinófilos. Nesse contexto, nosso primeiro passo foi investigar a expressão e funcionalidade dos receptores P2X por patch clamping. Nossos resultados sugerem a presença de P2X1, de P2X2 e de P2X7. Em seguida, avaliamos por microfluorimetria a funcionalidade dos receptores P2Y, e verificamos com base na ordem de potência a possível presença de P2Y2, de P2Y4, de P2Y6 e de P2Y11. Além disso, confirmamos nossos dados por imunofluorescência. Realizamos também ensaios de migração in vitro e in vivo, para verificar se os nucleotídeos extracelulares poderiam atrair eosinófilos. O ATP foi capaz de induzir a migração dos eosinófilos, enquanto a suramina, um bloqueador P2, aboliu esse efeito, tanto in vitro, utilizando transwell, como in vivo, utilizando um modelo de pleurisia alérgica em ratos. Em seguida, avaliamos o possível papel da panexina-1 como poro associado ao receptor P2X7. Nesse trabalho utilizamos inibidores de hemicanais em experimentos de patch clamp e em ensaios de permeabilização de corante. Os resultados indicam que os inibidores de hemicanais não bloquearam a geração de corrente ou a captação de corante após a ativação do receptor P2X7 em macrófagos de ratos e camundongos. Demonstramos que eosinófilos de rato expressam receptores P2X e P2Y por imunofluorescência. Além disso, demonstramos que a ativação de receptores P2 pode aumentar a migração de eosinófilos in vitro e in vivo. Além disso, foi demonstrado que inibidores de panexina-1 não bloqueiam a captação do corante ou a corrente gerada pela ativação do receptor P2X7. Os nossos resultados demostraram que panexina-1 não é o poro associado ao receptor P2X7 em macrófagos / ATP and other nucleotides are released from cells through regulated pathways or following the loss of plasma membrane integrity. Once outside the cell, these compounds can activate P2 receptors: P2X ionotropic receptors and G protein-coupled P2Y receptors. . Additionally, P2X7 receptor is an important member of the P2X family of ionotropic receptor as its activation opens a non-selective pore allowing the passage of molecules up to 900 Da. Eosinophils represent major effector cells in the allergic inflammatory response and they are, in fact, associated with several physiological and pathological processes. Here we investigate the expression of P2 receptors and roles of those receptors in murine eosinophils. In this context, our first step were to investigate the expression and functionality of the P2X receptors by patch clamping, our results suggest the presence of P2X1, P2X2 and P2X7. Next we evaluate by microfluorimetry the expression of P2Y receptors, our results based in the ranking order of potency suggests the presence of P2Y2, P2Y4, P2Y6 e P2Y11. Moreover, we confirmed our findings by immunofluorescence assays. We also did in vitro and in vivo migration assays to verify whether nucleotides could attract eosinophil. ATP increased migration of eosinophils, while suramin a P2 blocker abolished this effect in both in vitro, using trasnwell, and in vivo, using a model of rat allergic pleurisy. Next, we evaluated the putative role of pannexin-1 as the pore associated to the P2X7 receptor. We used hemichannels inhibitors in patch clamp and dye uptake experiments. The results indicate that they do not interfere with current generation or dye uptake after activation of P2X7R in rat and mouse macrophages. We have demonstrated that rat eosinophils express P2X and P2Y receptors by immunofluorescence. In addition, the activation of P2 receptors can increase migration of eosinophils in vitro and in vivo. Moreover, we demonstrated that specific inhibitors of pannexin-1 did not interfere with the dye uptake or current generated by the P2X7 activation. Our results showed that pannexin-1 is not the pore associated to the P2X7 receptor in macrophages.

Orientador: Antônio Fernando Ribeiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T16:58:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kmit_Arthur_M.pdf: 1478515 bytes, checksum: 34c7bf6fcce0ab6ab1b63b0927edcf98 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O receptor purinérgico P2X7 é um canal iônico permeável a cátions pertencente da família P2X (P2X1-P2X7). Ele é ativado por altas concentrações (100?M - 1000?M) de ATP (Adenosine 5?-triphosphate), apresentando duas distintas respostas: 1) uma rápida ativação do canal, 2) uma segunda ativação, lenta e continua, que gera largos poros na membrana celular, permeáveis a grande moléculas (900 Da). O receptor P2X7 está envolvido em processos como morte celular, formação de células gigantes e secreção de citocinas como IL-1? e está predominantemente presente em células imunes. Neste estudo foi examinado como as altas correntes do P2X7 são geradas e qual o mecanismo necessário para serem ativadas em oócitos de Xenopus laevis. Os oócitos foram cirurgicamente retirados de uma rã adulta de Xenopus laevis e injetamos o cRNA do P2X7 para expressa-los na membrana celular. Medimos a condutância através da técnica de Voltage Clamp (TEVC). A incubação dos Oócitos superexpressos com P2X7 em BABTA-AM demonstrou que o Ca2+ extracelular, e não intracelular, é necessário para gerar altas correntes não seletivas através do P2X7, e a reposição de íons extracelular (Cl- e Na+) demonstrou regula-las. A mutação de truncamento da cauda C-terminal na proteína P2X7 gerou uma corrente menor após a estimulação com 1mM de ATP. E ainda três bloqueadores de canais o Ácido Tânico, o AO1 e o NPPB inibiram significativamente as correntes geradas pelo P2X7. Nós concluímos que (i) Os oócitos de Xenopus que expressam P2X7 produzem altas correntes não seletivas após estimulação com ATP, (ii) A ativação do P2X7 requer tanto o influxo de Ca2+ e a cauda C-terminal, e (iii) as correntes do P2X7 são regulados por cátions e ânions extracelulares / Abstract: The purinergic P2X7 receptor is an ion channel permeable to cations which belong to the P2X family (P2X1-P2X7). It is activated by high concentrations (100?M - 1000?M) of ATP (adenosine 5'-triphosphate), presenting two distinct responses: 1) a rapid activation of the channel, 2) a second activation, slow and continuous, which generates a large pore in the cell membrane permeable to large molecules (900 Dalton). The P2X7 receptor is involved in processes such as cell death, giant cell formation and secretion of cytokines such as IL-1? and is present predominantly on immune cells. In this study we examined how the P2X7 high currents are generated and what is the mechanism required to be activated in Xenopus laevis oocytes. Oocytes were surgically removed from an adult frog Xenopus laevis and injected with cRNA to express the P2X7 in the cell membrane. We measure the conductance through the Voltage Clamp technique (TEVC). Incubation of oocytes overexpressed with P2X7 receptors in BABTA-AM demonstrated that extracellular Ca2+, and do not intracellular, it is necessary to generate nonselective high currents through P2X7, and replacing extracellular ions (Cl- and Na+) showed regulate them. The truncation mutation in C-terminal tail of the P2X7 protein generated a smaller current after stimulation with 1 mM ATP. And three channel blockers Tannic Acid, AO1 and NPPB significantly inhibited the generated currents by P2X7. We conclude that (i) Xenopus oocytes expressing P2X7 produce a nonselective high currents after stimulation with ATP (ii) Activation of the P2X7 requires both the influx of Ca2+ and C-terminal tail, and (iii) the currents of the P2X7 are regulated by extracellular cations and anions / Mestrado / Saude da Criança e do Adolescente / Mestre em Ciências