Orientador: Antonio Condino-Neto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T00:36:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LopezQuintero_JuanAlvaro_D.pdf: 7436572 bytes, checksum: eb2963a0c566df32123d4f6057f04520 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: objetivo geral deste projeto foi investigar o desenvolvimento a reguJação do sistema NADPH oxidase na linhagem eosinofilica humana Nos concentramos nos genes CYBB que codifica a gp91-phox, componente principal do heterodímero citocromo b e no gene NCF-I que codifica a p47-phox. A expressão destes, e de outros genes estreitamente relacionados, é reguJada segundo a 1àsede diferenciação celular, sendo específica de células mielóides. Nosso estudo baseou-se em dois modelos experimentais. O primen-o desenvolvido a partir de leucócitos derivados de sangue de cordão umbilical, cuhivados com citocinas que promovem o crescimento e a diferenciação de eosinófilos, especificamente interleucina-3 (IL-3) e interleucina-5 (IL-5) e o segundo, desenvolvido a partir do clone 15 de células da linhagem HL-60, cultivado previamente em condições alcaJina.c;e posteriormente estimulado com ácido butírico. Em paralelo, lItili7amos os mesmos sistemas de diferenciação de eosinófilos, com citocinas que influenciam a função fagocítica, especificamente interferon-gama (IFN-y) e :fàtorde necrose tumoral-alfa (TNF-a). Também estud~mos o efeito dos glicocorticóides, em particuJar a dexametasona sobre a atividade oxidase de células HL-60 clone 15 diferenciadas com citocinas. Examinamos a atividade do sistema NADPH oxidase (por meio da redução do citocromo c especificamente inibida pela superóxido dismutase) e a expressão dos genes que codificam os componentes do sistema NADPH oxidase gp91-phox e p47-phox. Nossos resultados mostraram que as células HL-60 clone 15 se diferenciam numa linhagem eosinofilica quando tratadas com ácido butirico 0,5 mM, expressando um fenótipo eosinófilico maduro, com capacidade para liberar superóxido em quantidades relevantes. Também demonstramos que a cuJtura dessas células com IFN-y e TNF-a é suficiente para induzir sua diferenciação eosinofilica, além de expressar transcritos para os componentes gp91-phox e p47-phox do sistema NADPH oxidase. Verificamos que o ácido butírico, IFN-y e TNF-a. juntos tem a capacidade de aumentar a indução do sistema NADPH oxidase, sugerindo que podem utilizar vias comuns ou distintas para estimuJar o sistema NAPDH oxidase, o qual está relacionado ao estágio de desenvolvimento da diferenciação eosinofilica. Por outro lado, observamos que a dexametasona inibe tanto a atividade NADPHoxidasecomo a expressão do enegp91-phoxquandoadministradaantes,masnão apósa diferenciaçãodas céluJaslllr6O clone 15 com IFN-y e TNF-a. Em relação aos leucócitos derivados do sangue de cordão umbilical cuhivados com IL-3 e IL-5, demonstramos que se diferenciam e demonstram características morfológicas similares a eosinófilos maduros, além de apresentar um incremento significativo na liberação de superóxido e expressão gêniea de gp91-phox no dia 28 de cultura. Os estudos pretendem contribuir para o avanço do conhecimento sobre os mecanismos que reguJam o sistema NADPH oxidase fagocítico humano, em específico na linhagem eosinofilica humana / Abstract: The aim of t1ús study was to investigate the development and regulation of the NADPH oxidase system in the human eosmophilic lineage. We concentrated our studies in the CYBB gene, which encodes the gp91-phox, the main component of the heterodimer cytocbrome b and NCF-I gene, which encodes the p47-phox protein. The expression of these genes js regulated according to the phase of celluJar differentiation, SPeCificof myeloid cells. Our study was basedon two experimentalmodels. The first one, was developed with leukocytes ftom umbilical cord blood, cultured with cytokines tbat promote the eosinophilic growing and differentiation, specifically interleukin-3 (ll.-3) and interleukin-5 (IL-5) and the second one, was established with HL-60 clone 15 ceUs,previously cultured in aIkaline conditions and later stimuJated with butyric acid. In parallel, we used the same systems of eosinophil differentiation, with cytokines tbat influence the phagocytic function, specifically interferon-gamma (IFN-y) and tumor necrosis Jàctor alpba (TNF- a). The effects of the glucocorticoids, particuIary dexamethasone on the oxidase activity of HL-6O clone 15 cells differentiated with cytokines were also studied. We examined the NADPH oxidase system activity (by means of the reduction of cytochrome c specüically inhibited by superoxide dismutase) and the gene expression of gp91-phox and p47-phox, components ofNADPH oxidase system. Our results showed tbat, the HL-60 clone 15 cells were differennated in 3Deosinophilic lineage when were treated with butyric acid 0,5 mM, expressing a mature eosinophils phenotype, able to release superoxide in excellent amounts. We aIso demonstrated, tbat the cuhure of these cells with IFN-y e TNF-a are su:fficient to induce the eosmophilic differentiation, besides expressing 1ranscripts of gp91-phox and p47-phox. We observed tbat butyric acid, IFN-y e TNF-a together are able to increase the NADPH oxidase system induction, which suggests tbat they can use common or distinct pathways to stimuJate the NAPDH oxidase system, which :isrelated with the phase of eosinophilic djfferentiation development. On the other hand, we observed tbat dexamethasone mbibits the NADPH activity oxidase, aswellasgp91-phoxgene expressionwhenadministeredbefure,but not afterHL-6Oclone 15 cells differentiation with IFN-y e TNF-a. Regarding the umbilical cord blood leucocytes cultured with IL-3 and IL-S, similar morphologic characteristics to that of matme eosinoplilis were obsetved, besides presenting a significant Ü1creasein superoxide release and expression of gp9l-phox gene in day 28 of culture. The studies intend to oontribute to the advance of the knowledge on the mecbanisms that reguJate the human phagocytic NADPH oxidase system, specifically in the human eosinophilic Jineage / Doutorado / Doutor em Farmacologia

Orientador: Edson Antunes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-23T06:56:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zanardo_RenataCristinaOnishi_M.pdf: 1046055 bytes, checksum: ded086ce156cc17b6aa9966b8a0c660f (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: Nossos resultados demonstram que, utilizando anticorpo monoclonal de camundongo através de imunohistoquímica, eosinófilos peritoneais de rato expressam a NOS II (30.2 +/- 11.6%) e III (24.7 +/- 7.41%). A migração de eosinófilos in vitro foi avaliada usando-se uma microcâmara de quimiotaxia de 48 poços, e os agentes quimiotáxicos empregados foram N-formil-metionil leucil-fenilalanina (fMLP, 5 x '10 POT. -8 M') e leucotrieno 'B IND. 4' ('LTB IND. 4', '10 POT. -8 M'). O L-NAME (mas não o D-NAME) inibiu significativamente a migração de eosinófilos induzida pelo fMLP (54% de redução para a concentração de 1.0 mM; P<0.05) e 'LTB IND. 4' (61 % de redução para a concentração de 1.0 mM; P<0.05). Os inibidores da NOS II, AMT e TRIM, também atenuaram marcadamente (P<0.05) a migração induzida pelo fMLP (52% e 38% de redução para a concentração de 1.0 mM, respectivamente) e 'LTB IND. 4' (52% e 51 % de redução para a concentração de 1.0 mM, respectivamente). O ODQ (inibidor da guanilato ciclase solúvel), nas concentrações de 0.01 e 0.1 mM, também inibiu significativamente a migração de eosinófilos induzida pelo fMLP. A inibição da migração de eosinófilos pelo L-NAME foi revertida pelo nitroprussiato de sódio (0.1 mM) ou pelo dibutiril GMP cíclico (1 mM). Concluímos que os eosinófilos peritoneais de rato expressam NO sintase(s), e que este mediador desenvolve um papel essencial na locomoção destas células, agindo através de um mecanismo de transdução de GMP cíclico / Abstract: Our results demonstrate that rat peritoneal eosinophil strongly expresses both type II (30.2 +/-11.6%) and type III (24.7 +/- 7.41%), as detected by immunohistochemistry using affinity purified mouse monoclonal antibodies. Eosinophil migration in vitro was evaluated using a 48-well microchemotaxis chamber and the chemotactic agents employed were N-formyl-methionyl-leucylphenylalanine (fMLP, 5 x '10 POT. ¿8' M) and leukotriene 'B IND. 4' ('LTB IND. 4', '10 POT. ¿8' M). L-NAME (but not D-NAME) significantly il")hibited the eosinophil migration induced by both fMLP (54% reduction for 1.0 mM; P<0.05) and 'LTB IND. 4' (61 % reduction for 1.0 mM; P<0.05). The type II NOS inhibitors AMT and TRIM also markedly (P<0.05) attenuated fMLP- (52% and 38% reduction for 1.0 mM, respectively) and 'LTB IND. 4' (52% and 51 % reduction for 1.0 mM, respectively). The inhibition of eosinophil migration by L-NAME was mimicked by the soluble guanylate cyclase inhibitor, ODQ (0.01 and 0.1 mM) and reversed by either sodium nitroprusside (0.1 mM) or dibutyryl cyclic GMP (1 mM). In conclusion, the eosinophil does express NO synthase(s) and this mediator plays an essential role for eosinophillocomotion, , by acting through a cyclic-GMP transduction mechanism / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2015. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-05-16T14:03:09Z No. of bitstreams: 1 2015_ValeriaBotanGoncalves.pdf: 3081656 bytes, checksum: e7c80f76335485c2aa490d674794927b (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2016-06-01T11:42:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_ValeriaBotanGoncalves.pdf: 3081656 bytes, checksum: e7c80f76335485c2aa490d674794927b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-01T11:42:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_ValeriaBotanGoncalves.pdf: 3081656 bytes, checksum: e7c80f76335485c2aa490d674794927b (MD5) / A esofagite eosinofílica (EoE) é uma doença emergente mundialmente, com patogênese ainda pouco compreendida. Trata-se de uma doença imuno-antígeno mediada, crônica, caracterizada, clinicamente, por sintomas relacionados à disfunção esofágica e, histologicamente, por uma predominante inflamação mediada por eosinófilos. Existe consenso mundial que a presença de 15 ou mais eosinófilos por campo de grande aumento na biópsia esofágica caracteriza histologicamente a doença. Assim, para confirmação diagnóstica é estritamente necessária a realização de endoscopia digestiva alta com biópsia esofágica. O acompanhamento da evolução da EoE tem se mantido com múltiplas endoscopias digestivas altas seguido por biópsias. Os eosinófilos desempenham papel central neste processo inflamatório, sendo atualmente, o alvo de várias pesquisas no desenvolvimento de novos métodos diagnósticos, principalmente não invasivos, para controle da EoE. Portanto, o objetivo deste trabalho foi verificar se os parâmetros quantitativos de ativação dos eosinófilos podem auxiliar como método de triagem diagnótica em pacientes portadores de esofagite eosinofílica. Tratou-se de um estudo transversal, onde foram selecionados 31 pacientes portadores de EoE e 10 pacientes controles, dos quais foram retirados 10 ml de sangue periférico, após consentimento informado. O estado de ativação dos eosinófilos do sangue periférico foi avaliado por parâmetros morfológicos após aderência destas células à lâmina. Os seguintes parâmetros morfológicos foram quantificados: eosinófilos normais, espraiamento, arredondamento, presença de pseudópodes localizados e generalizados, emissão de grânulos de pequena, moderada e grande quantidade, presença de vacúolos, presença de grânulos isolados, degeneração celular e comunicação celular. Observamos que o número de eosinófilos no sangue periférico com características normais foi significantemente menor nos indivíduos portadores de esofagite eosinofílica do que nos indivíduos controle. Este parâmetro foi capaz de discriminar todos os indivíduos portadores de EoE estudados dos indivíduos do grupo controle não portadores da doença, com sensibilidade de 100% para detecção da EoE nos indivíduos estudados. Todos os parâmentros morfológicos, exceto contato celular, presença de grânulos em pequena quantidade e emissão de pseudópodes generalizados, foram maiores nos pacientes portadores de EoE, conseguindo discriminar a doença. Entretanto, não observamos correlação de gravidade clínica, endoscópica ou histológica pela utilização dos parâmetros periféricos de ativação dos eosinófilos. Mostramos, de forma inédita, que o teste de ativação dos eosinófilos do sangue periférico caracaterizados por parâmetros morfológicos é capaz de triar pacientes sintomáticos portadores de EoE para a realização de endoscopia digestiva alta e que este método é acurado, de fácil realização e poderá ser um teste útil para auxiliar na definição do diagnóstico nos pacientes portadores de EoE. / Eosinophilic esophagitis (EoE) is a worldwide emerging disease with poorly understood pathogenesis. It is a chronic immune/antigen mediated disease, clinically characterized by symptoms related to esophageal dysfunction and histologically by a predominant eosinophilic inflammation in the esophagus. There is a global consensus that the presence of ≥ 15 eosinophils per high power field, histologically characterize the disease. Diagnosis and treatment response monitoring in EoE requires endoscopical and histological examination of the esophagus. Eosinophils play a central role in the inflammatory process, currently being the target of several research to develop new diagnostic methods, especially non-invasive, for control of EoE. Therefore, this work aimed to assess whether morphological changes associated with activation of eosinophils in peripheral blood could be a useful noninvasive test to screen for EoE. This was a cross sectional study where 31 EoE patients and 10 controls were evaluated. Peripheral blood was drawn to evaluate the activation state of peripheral blood eosinophils, after informed consent. Eosionophils were evaluated by morphological criteria after adhesion to the slide. The following morphological parameters were evaluated: normal eosinophils, spreading, rounding, presence of localized and generalized pseudopods, release of small, moderate and large quantity of granules, cytoplasmatic vacuoles, cluster of free eosinophils granules, cell degeneration and cell communication. The number of eosinophils in the peripheral blood with normal characteristics was significantly lower in individuals with eosinophilic esophagitis than in control subjects. This parameter was able to discriminate all individuals with EoE studied compared with the control group, with 100% sensitivity for detection of EoE in the subjects studied. All morphological parameter settings except cell comunication, release of granules in small amount and presence of generalized pseudopods were higher in patients with EoE, being able to discriminate the disease. However, no correlation was found among the activation state of peripheral blood eosinophils and clinical severity, endoscopic or histological parameters. We show, in an unprecedent study, that eosinophil morphological activation evalution might be a useful test to screen for eosinophilic esophagitis and it may help to adequately make the decision to indicate endoscopic examination to symptomatic patients, avoiding unnecessary endoscopy.

Made available in DSpace on 2016-02-26T13:34:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 kennedy_ferreira_ioc_mest_2015.pdf: 44305121 bytes, checksum: da312c4a5b872f68587755d33c58e5f0 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Em resposta à uma variedade de estímulos, os eosinófilos são recrutados da circulação para focos inflamatórios, onde modulam a resposta imune, através da liberação de proteínas derivadas dos grânulos secretores. Eosinófilos secretam suas proteínas através de diferentes maneiras de secreção: i) clássica exocitose dos grânulos; ii) desgranulação por piecemal (PMD), um processo de secreção mediada por vesículas de transporte; e iii) a citólise. Estes mecanismos estão bem caracterizadas em humanos, mas ainda são poucos conhecidas em camundongos. Aqui, foram investigados os mecanismos subjacentes a desgranulação de eosinófilos murinos durante as respostas inflamatórias in vivo (modelo de asma) e in vitro (após estímulos pró-inflamatória). Camundongos Balb/c foram imunizados com uma suspensão de ovalbumina (OVA) (50 mg) e Al (OH) 3 (5 mg) em 200 ml de NaCl a 0,9% nos dias 0 (subcutâneamente) e 14 (por via intraperitoneal). Catorze dias depois, os desafios de OVA (50 mg) foram instilados intranasalmente 3 vezes por semana durante 4 semanas. O grupo controle recebeu solução de NaCl 0,9%. Após o tratamento, os fragmentos de pulmão foram fixados e processados para a microscopia de transmissão de eletrônica (MET). Além disso, a interleucina-13 (IL-13), IL-4, a eotaxina-1 (CCL11) e fator de crescimento transformante beta (TGF-\03B2) foram medidos em tecido pulmonar. Nos experimentos in vitro, os eosinófilos foram isolados a partir do baço de camundongos transgênicos para interleucina-5, estimulados com fator estimulante de colônia granulócito-macrófago[GM-CSF (10 ng / mL)], Lipopolissacarídeo [LPS (100 ng / ml)] ou apenas meio, durante 1 h, imediatamente fixada e processada para MET e avaliação da atividade enzimática de ribonucleases. MET revelou uma intensa infiltrado de eosinófilos no pulmão de animais tratados com OVA, mas estas células foram raramente visualizadas em pulmões dos controles Análise ultraestrutural de 975 grânulos de secreção de eosinófilos do infiltrado inflamatório pulmonar mostrou que 47% destes grânulos tinham sinais desgranulação associados à PMD, caracterizadas principalmente pela redução da densidade de elétrons, perdas na matriz ou núcleos, matriz grossa e / ou ampliação de grânulos. As vesículas foram visualizadas na proximidade de grânulos em esvaziamento. Os níveis de eotaxina-1, IL-4, IL-13 e EPO no tecido pulmonar dos camundongos estimulados com OVA foram significativamente aumentados em comparação com os controles, enquanto os níveis de TGF-\03B2 não se alterou. Eosinófilos do baço estimuladas in vitro com GM-CSF e LPS apresentaram alterações morfológicas e cerca de 20% de grânulos apresentaram sinais de PMD. Não foram encontrados fusões de grânulo-grânulo ou grânulo-membrana plasmática. Curiosamente, foram identificadas por MET uma distinta bainha eletrodensa em áreas específicas da membrana limitante grânulo, uma característica morfológica que pode estar associados com a secreção de eosinófilos murinos. Nossos dados demonstram que os eosinófilos murinos são capazes de desgranular através PMD durante as respostas inflamatórias in vivo e in vitro. Embora as características morfológicas reconhecidos como indicativo de PMD são menos pronunciada camundongos em comparação com aquelas documentadas em seres humanos, estes sinais podem ser detectados em eosinófilos murinos sob investigação cuidadosa por TEM. Além disso, nosso estudo demonstram que outros sinais morfológicos, não descritas para eosinófilos humanos, pode ser útil para compreender os processos de secreção em eosinófilos de modelos experimentais / Mechanisms governing secretion of proteins underlie the functions of human eosinophils, leukocytes involved in allergic, inflammatory and immunoregulatory responses. In response to varied stimuli, eosinophils are recruited from the circulation into inflammatory foci, where they modulate immune responses through the release of granule-derived protein. Eosinophils secrete proteins from their specific cytoplasmic granules through different secretion pathways: i) classical granule exocytosis; ii) piecemeal degranulation (PMD), a secretory process mediated by transport vesicles; and iii) cytolysis. These mechanisms are well characterized in humans, but are still poorly understood in mice. Here we investigated the mechanisms underlying eosinophil degranulation of murine models during inflammatory responses in vivo (asthma model) and in vitro (after stimulation with pro-inflammatory stimuli). Balb/c mice were immunized with a mixed suspension of ovalbumin (OVA) (50 μg) and Al(OH)3 (5 mg) in 200 μL of 0.9% NaCl on days 0 (subcutaneously) and 14 (intraperitonealy). Fourteen days later, repetitive OVA challenges (50 μg) were intranasaly instilled 3 times a week during 4 weeks. The control group received 0.9% NaCl solution. After treatment, lung fragments were fixed and processed for light and transmission electron microscopy (TEM). Moreover, interleukin-13 (IL-13), IL-4, eotaxin-1 (CCL11) and transforming growth factor beta (TGF- β) were measured in the lung tissue. For the in vitro experiments, eosinophils were isolated from the spleen of interleukin-5 transgenic mice, stimulated with GM-CSF (10 ng/mL), LPS (100 ng/mL) or medium alone for 1h, immediately fixed and processed to TEM. Both light and TEM revealed an intense eosinophil infiltration in perivascular and peribronchial spaces of OVA-treated animals, but these cells were rarely observed in control lungs. Ultrastructural analysis of 975 secretory granules from infiltrating eosinophils showed that 47% of these granules had degranulation signs associated with PMD, characterized mainly by reduced electron density, losses in the matrix or cores, coarse matrix and/or granule enlargement. Vesicles were visualized nearby emptying granules. Eotaxin-1, IL-4, IL-13 and EPO levels in the lung tissue from OVA-stimulated mice were significantly increased compared to controls while the levels of TGF- β did not change. Spleen eosinophils stimulated in vitro with GM-CSF and LPS exhibited shape changes and around 20% of emptying granules. Granule-granule or plasma membrane-granule fusions were not observed in any situation. Interestingly, we identified by TEM a distinct electron-dense brim at specific areas of the limiting granule membrane, a novel morphological feature which may be associated with secretion in mice eosinophils. Collectively, our data demonstrate that mouse eosinophils are able to degranulate through PMD during inflammatory responses occurring both in vivo and in vitro. Although the morphological features recognized as indicative of PMD are less pronounced in mice compared to those documented in humans, these signs can be detected in mice eosinophils under careful investigation by TEM. Moreover, our study demonstrate that other morphological signs, not described for human eosinophils, may be helpful to understand the secretory processes in eosinophils from mice models.

Orientador: Edson Antunes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T00:30:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moreira_Juliana_M.pdf: 6595425 bytes, checksum: 59be7d31d2a9cdf5b54ea675fec4f3f8 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Os eosinófilos estão envolvidos no processo de defesa do organismo contra infecções parasitárias e na patogênese de doenças alérgicas, imunológicas e neoplásicas. Estudos anteriores demonstraram a existência de uma via funcional NO/GMPc em eosinófilos de rato e humano que modulam a locomoção deste tipo celular. Os nucleotídeos cíclicos são capazes de modular o processo de ativação de leucócitos, mas seu papel na locomoção é ainda controverso. Este estudo foi realizado para investigar os efeitos do 5-ciclopropil-2-[1-(2-fluor-benzil)-1Hpirazolo[ 3,4-b]piridina-3-il]-pirimidina-4-ilamina (BAY 41-2272) sobre a quimiotaxia de eosinófilos humanos induzida por formil-metionil-Ieucil-fenilalanina (fMLP; 10-7 M) e também sobre os níveis de guanosina-3',5'-monofosfato cíclico (GMPc) e adenosina-3',5'-monofosfato cíclico (AMPc). Os eosinófilos foram incubados com BAY 41-2272 (0,1-10,0 J.LM)por um período de tempo curto (10 min) ou prolongado (90 min). A exposição dos eosinófilos ao BAY 41-2272 tanto por 10 ou 90 min inibiu acentuadamente a quimiotaxia destas células. Na concentração de 1 J.LMde BAY 41-2272, a inibição da quimiotaxia foi em torno de 50%, independente se as células foram incubadas por 10 ou 90 min com este composto. A exposição dos eosinófilos por 90 min ao BAY 41-2272 (1 J.LM)resultou em significante aumento dos níveis de GMPc e AMPc (7,1 :!: 0,2 e 94,8 :!: 1,5 nMl1,5 X 106cels, respectivamente) comparado com o protocolo de 10-min (3,0 :!: 0,2 e 47,3 :!: 1,3 nM/1,5 X 106cels, respectivamente). O aumento dos níveis de GMPc produzidos BAY 41-2272 foi abolido pela pré-incubação dos eosinófilos com o inibidor da guanilato ciclase solúvel 1H-[1,2,4]-oxidiazol[4,3-a] quinoxalin-1-one (ODQ). De acordo com o ensaio de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difenil tetrazolio bromida (MTT), não foi observado qualquer efeito citotóxico sobre os eosinófilos em nenhuma das condições experimentais utilizadas. Nossos resultados mostram que o efeito inibitório do BAY 41-2272 sobre a quimiotaxia de eosinófilos humanos induzida por fMLP em tempo curto ou prolongado de incubação, é acompanhado por significante elevação de GMPc e AMPc, mas nós não detectamos uma correlação direta entre a inibição de quimiotaxia e elevação dos níveis de nucleotídeos cíclicos / Abstract: Eosinophils are implicated in human defense mechanism against inflammatory disorders such as allergy, immunological and neoplasic diseases. Previous studies demonstrated a functional NO-cGMP pathway in the rat and human eosinophils that modulate the locomotion of this cell type. Cyclic nucleotides are able to modulate the processes responsible for leucocyte activation, but its role on eosinophillocomotion is still controversial. This study was designed to investigate the effects of the 5-cyclopropyl-2 [1-(2-fluoro-benzyl)-1Hpyrazolo[ 3,4-b]pyridin-3-yl]-pyrimidin-4-ylamine (BAY 41-2272) on formyl- . methionyl-Ieucyl-phenylalanine (fMLP; 10-7 M)-induced human eosinophil chemotaxis, cyclic guanosine-3',5'-monophosphate (cGMP) and cyclic adenosine- 3',5'-monophosphate (cAMP) levels. Human eosinophils were exposed to BAY 41- 2272 (0.1-10.0 J.1M) for either short (10 min) or prolonged (90 min) time periods. Exposition of eosinophils to BAY 41-2272 for either 10 or 90 min markedly inhibited the eosinophil chemotaxis. At 1 J.1Mof BAY 41-2272, inhibition of fMLP-induced eosinophil chemotaxis was about of 50% irrespective if cells were exposed for 10- or 90 min with this compound. Incubation of eosinophils for 90 min with BAY 41- 2272 (1 J.1M)resulted in significantly higher cGMP and cAMP levels (7.1 :!: 0.2 and 94.8 :!: 1.5 nMl1.5 X 106 cells, respectively) compared with the 10-min protocols (3.0 :!: 0.2 and 47.3 :!: 1.3 nM/1.5 X 106 cells, respectively). The BAY 41-2272- induced cGMP increases were abolished by pre-incubation of eosinophils with the soluble guanylate cyclase inhibitor -[1,2,4]-oxidiazolo[4,3-a] quinoxalin-1-one (ODQ). No eosinophil toxicity was observed in any experimental condition, according to 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay. Our findings show that inhibitory effects of fMLP-induced human eosinophil chemotaxis by BAY 41-2272 at short-term or prolonged exposition are accompanied by significant elevations of cGMP and cAMP, but we could not detect a direct correlation between chemotaxis inhibition and elevation of cyclic nucleotide levels / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Farmacologia

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-graduação em Medicina Tropical, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-06-21T16:20:41Z No. of bitstreams: 1 2015_HelaneCatarineDantasdoNascimentoRibeiro.pdf: 5640990 bytes, checksum: f577306d6c7e1c7f705450e010cf2e22 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2016-07-26T10:55:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_HelaneCatarineDantasdoNascimentoRibeiro.pdf: 5640990 bytes, checksum: f577306d6c7e1c7f705450e010cf2e22 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-26T10:55:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_HelaneCatarineDantasdoNascimentoRibeiro.pdf: 5640990 bytes, checksum: f577306d6c7e1c7f705450e010cf2e22 (MD5) / As parasitoses intestinais apresentam uma alta prevalência no mundo. Estudos revelam o aumento das doenças alérgicas e da asma e concomitantemente redução das doenças infectoparasitárias em crianças. A existência de uma correlação é estudada demonstrando a ação imunossupressora dos parasitos intestinais sobre a resposta imunitária sistêmica. Os objetivos do presente trabalho foram avaliar o estado de ativação dos eosinófilos e as funções dos fagócitos comparativamente em crianças com asma, com parasitoses intestinais e na associação de ambas. Foi realizado estudo transversal com 68 crianças residentes no Riacho Fundo II e na Cidade Estrutural, em Brasília/Distrito Federal. Os pacientes foram separados nos grupos: A) crianças com parasitoses intestinais; B) crianças asmáticas sem parasitoses intestinais; C) crianças com parasitoses intestinais e asma e D) grupo controle. Após técnica de aderência em lâmina, foram avaliados: o estado de ativação dos eosinófilos do sangue periférico por parâmetros morfológicos; a fagocitose pelos monócitos (MON) e neutrófilos (NEU) por receptores para padrões moleculares de patógenos (rPMP) e para opsoninas (rOps), como também a produção de ânions superóxido (O-) pelo teste do nitroblue tetrazolium (NBT). As análises estatísticas foram realizadas pelos testes de ANOVA ou Kruskal-Wallis. Observamos, além da baixa renda familiar e reduzidas condições de escolaridade, a prática de evacuações no peridomicílio pelas crianças e a ausência de tratamento domiciliar da água de beber. Os parasitos intestinais mais prevalentes foram Ascaris lumbricoides e Giardia lamblia, seguida por Hymenolepis nana e houve associação de parasitos intestinais em 38% dos pacientes parasitados. A ativação dos eosinófilos foi menor nas crianças com enteroparasitoses, quando analisados o percentual de eosinófilos normais, espraiamento, liberação de pequenas quantidades de grânulos e emissão de pseudópode único, comparativamente às crianças asmáticas. A capacidade fagocitária pelos rPMP dos NEU das crianças parasitadas exclusivamente por protozoários foi menor do que a das crianças asmáticas. Quando a fagocitose foi avaliada pelos rOps, a capacidade fagocitária dos MON das crianças asmáticas e também parasitadas foi maior do que a das crianças controle, pela maior ingestão de leveduras pelos MON. A produção de O- pelos fagócitos foi menor nas crianças parasitadas por protozoários do que nas crianças asmáticas e parasitadas por protozoários. Contudo, a produção dos O- foi maior nas crianças parasitadas por helmintos do que nas crianças asmáticas. Em conclusão, a infecção parasitária e o quadro de asma tiveram efeitos opostos sobre as diversas funções da imunidade inata estudada. O tipo de resposta dependeu do tipo de parasito e helmintos e protozoários determinaram repostas opostas: enquanto os protozoários, particularmente a Giardia intestinalis, diminuíram a capacidade fagocitária dos NEU pelos rPMP, os helmintos estimularam a fagocitose pelos MON pelos rOps. Em adição, enquanto no quadro de asma observamos certo grau de ativação dos eosinófilos, nas crianças parasitadas, essa ativação dos eosinófilos no sangue periférico não ocorreu, possivelmente por fatores supressores produzidos pelos parasitos. Tais achados podem contribuir para o esclarecimento sobre a resposta imune inata aos parasitos e suas repercussões no indivíduo, auxiliando na abordagem das parasitoses e no desenvolvimento de novas terapêuticas para a asma e atopias. / Intestinal parasites have a high prevalence worldwide, mainly in developing countries in places showing poor sanitary and socio-economic conditions. Several studies point to an increase in allergic diseases and asthma over the years, and show a concomitant reduction in infectious and parasitic diseases in children. The existence of such a correlation or causal factor has been investigated in experimental models with animal and human beings, leading to findings that demonstrate the immunosuppressive action of the parasites on the systemic immune response. Factors depending on the host, such as genotype, immune competence and nutritional status; and factors depending on the parasite, as the parasite load and the pathogenicity and virulence of helminths or protozoans, will determine the type of immune response triggered in infected individuals. In this context, this work aimed to evaluate eosinophil activation status and phagocytes' functions comparatively in children with asthma, intestinal parasites and in combination of both. A cross-sectional study was done in 68 children living in Riacho Fundo II and Chácara Santa Luzia in Cidade Estrutural, in Brasilia/Federal District, Brazil. The socio-economic-cultural evaluation of the families, and clinical, laboratory and stool testing of each child were made. Four groups were studied: A) Helminths or/and protozooan parasitized children; B) asthmatic children; C) asthmatic and parasitized children; and D) control group. The blood eosinophil activation status was assessed by morphologic parameters after adherence to glass. The phagocytic capacity of monocytes and neutrophils was evaluated by pathogen-associated molecular pattern receptors (PAMPr) and the opsonin receptors, as well as superoxide anions production by nitroblue tetrazolium test (NBT). Statistic analyses were performed by ANOVA or Kruskal-Wallis test. Eosinophils were lower activated in children with intestinal parasites than in asmathic children, by percentage of normal eosinophils, spreading, releasing of small quantities of granules and emission of a single pseudopod. The phagocytic capacity of neutrophils of children exclusively parasitized by protozoan was lower than that of asthmatic children, by pathogen-associated molecular pattern receptors. When the phagocytosis was evaluated by opsonin receptors, phagocytic capacity of monocytes in asthmatic children concomitantly parasitized was higher than that of controls. Superoxide anions production was lower in children parasitized by protozoan than in children with asthma plus protozoan. However, superoxide anions production was higher in children who were parasitized by helminths than in asthmatic children. In conclusion, our data showed that parasitic infection and asthma had opposite effects on several immune innate functions. Furthermore, immune response depended on the type of parasite, and helminths and protozoa determined opposite responses: whereas protozoan, mainly Giardia intestinalis, decreased phagocytic capacity by neutrophils by PAMPr, helminths stimulated phagocytosis by monocytes by opsonin receptors. In addition, whereas in asthmatic children there were some eosinophil activation, in parasitized children there was no blood eosinophil activation possibly determined by suppressive factors produced by parasites. These findings may contribute to make clear the innate immune response to parasites and their impact on individual, assisting to understand parasites and in development of new therapies for treatment of asthma and atopies.

Objetivos: 1) Determinar la prevalencia de incremento de eosinófilos en mucosa colónica en pacientes con colitis linfocítica (CL). 2) Determinar la coexistencia de colitis eosinofílica (CE) en pacientes con CL. Materiales y métodos: Las biopsias colónicas de pacientes adultos con diarrea crónica diagnosticados como CL en el hospital Daniel A. Carrión durante octubre 2009 a marzo 2012 fueron revisadas de forma independiente por 2 patólogos. Microscópicamente, se investigó y cuantificó la presencia de eosinófilos en mucosa colónica. Resultados: Se incluyeron 68 casos de CL, de los cuales 76,5% tuvieron eosinófilos elevados en la mucosa colónica y en 51,4% se pudo hacer el diagnóstico de CE según los criterios establecidos. Conclusión: Tres de cuatro pacientes con CL presentan eosinófilos elevados y 1 de cada 2 pacientes con CL cumple criterios para CE. / Objectives: 1) To determine the prevalence of increased number of eosinophils in colonic mucosa of patients with lymphocytic colitis (LC). 2) To determine the coexistence of eosinophilic colitis (EC) in patients with lymphocytic colitis. Materials and methods: slides of adult patients with cronic diarrhea with diagnosis of LC were reviewed between October 2009 and March 2012. The number of eosinophils was quantified. Results: Sixty eight patients with LC were included. Elevated eosinophils were found in 76.5 and in 51.4% a diagnosis of EC was established. Conclusion: 3 out of 4 patients with LC had elevated eosinophils and 1 of 2 patients with LC had criteria for EC.

Made available in DSpace on 2014-12-05T18:40:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) tulio_pinto_ioc_mest_2007.pdf: 1186917 bytes, checksum: e706fc53fa372ea502331c68d3529a78 (MD5) Previous issue date: 2014-11-18 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os cisteinil-leucotrienos (CisLT) são importantes mediadores da asma, que induzem broncoconstrição, secreção de muco e efeitos regulatórios no infiltrado de populações leucocitárias, especialmente de eosinófilos. A asma sensível à aspirina, ou induzida por aspirina (AIA), tem sido vista como resultante de um aumento da produção de CisLT conseqüente ao desvio do ácido araquidônico para a via da 5-lipoxigenase (5-LO), na ausência de ciclo-oxigenase (COX) ativa. Como os inibidores de COX, aspirina e indometacina, aumentam a eosinopoiese dependente de IL-5 em cultura de medula óssea murina, nós avaliamos a participação dos CisLT no mecanismo de ação destes moduladores em cultura líquida de medula óssea. As culturas foram estabelecidas com medula óssea de camundongos BALB/c, C57BL/6 e deficientes do receptor de CisLT do tipo 1 (CysLT1R - em background BALB/c e C57BL/6) na presença de IL-5, por 7 dias. CisLTs (LTC4, LTD4 and LTE4) aumentaram a produção de eosinófilos com eficiência comparável (efeito máximo entre 10-7 e 10-8M). Estes efeitos foram comparáveis, tanto nos números como na morfologia dos eosinófilos, aos obtidos com aspirina (10-8M) e indometacina (10-7M). O inibidor da proteína ativadora de 5-lipoxigenase (FLAP), MK-886, bloqueou o efeito de ambas, aspirina e indometacina, mas não dos CisLT. Por outro lado, os antagonistas competitivos de CysLT1R, MK-571 e Montelukast, bloquearam os efeitos do LTD4, da indometacina e da aspirina Todos os três agentes foram capazes de proteger eosinófilos em desenvolvimento da apoptose induzida por Prostaglandina E2 (PGE2). A medula óssea de camundongos CysLT1R (-/-) não respondeu ao LTD4, à indometacina e à aspirina. A capacidade dos inibidores de COX de proteger eosinófilos em desenvolvimento dos efeitos do produto pré-formado da COX, PGE2, indicam que estas drogas atuam pela promoção da produção de CisLT, mais do que pelo bloqueio à sintese de PGE2. Além disso, o efeito citoprotetor é abolido se a medula óssea é incubada com inibidores de COX associados com o MK-886 e Montelukast. Em conjunto, estes resultados sugerem que, na presença dos inibidores de COX, CisLT são formados e promovem eosinopoiese atuando em CisLT1R. CisLT igualmente medeiam os efeitos citoprotetores dos inibidores de COX. O mecanismo de ação dos inibidores de COX na eosinopoiese murina é, portanto, basicamente semelhante ao mecanismo de desvio proposto para AIA / Cysteinyl-Leukotrienes (CysLT) are impor tant mediators of asthma, which induce bronchoconstriction, mucus secretion and a variety of regulatory effects on the infiltrating leukocyte populations, especially eosinophils. Increased CysLT production resulting from the shunting of arachidonic acid towards the 5-lipoxygenase (5-LO) pathway in the absence of acti ve cyclooxygenase (COX) is a one mechanism proposed to explain the fisiopatology of Aspiri n-sensitive, or aspirin-induced, asthma (AIA). Because the COX inhibitors, aspi rin and indomethacin, increase Interleucin-5- dependent eosinophilopoiesis in murine bone-ma rrow culture, we evaluated the participation of CysLT in the mechanism of action of both agents in this model. Liquid bone-marrow cultures were establis hed from BALB/c, C57BL/6 and CysLT 1 R deficient mice (in both the BALB/c and C57B L/6 genetic background) in the presence of interleucin-5, for 7 days. CysLTs (LTC 4 , LTD 4 and LTE 4 ) increased eosinophil production (maximum effect at 10 -7 -10 -8 M). Their effects were comparable, in number as well as morphology of the eosi nophils, to those of aspirin (10 -8 M) and indomethacin (10 -7 M). The 5-lipoxygenase activating pr otein (FLAP) inhibitor, MK- 886, blocked the effects of both aspiri n and indomethacin, but not those of the CysLT. On the other hand, t he competitive antagonists of t he CysLT receptor type 1 (CysLT 1 R), MK-571 and Montelukast, bl ocked the effects of LTD 4 , indomethacin and aspirin. All three agents were capable of protecting developing eosinophils from the apoptosis-inducing actions of prostaglandin E 2 (PGE 2 ). Bone-marrow from CysLT 1 R deficient mice did not respond to LTD 4 , indomethacin or aspirin. The ability of COX inhibitors to protect developing eosinophils from the effects of a preformed COX derivative (PGE 2 ) further indicates that these drugs act by promoting CysLT production rather than preventing synthesis of PGE 2 . Furthermore, this cytoprotective effect is abolished if bone-marrow is incubated with COX inhibitors in association with FLAP or CysLT 1 R inhibitors, or with LTD 4 in association with CysLT 1 R inhibitors. Taken together, these findings suggest that, in the presence of COX inhibitors, CysLT are formed which promote eosinophil opoiesis by acting on high affinity CysLT 1 R. CysLT equally mediate the cytoprotecti ve effects of COX inhibitors. The mechanism of action of COX inhibitors on murine eosinophilopoiesis is, therefore, similar in its essential features to the shunting mechanism, one of mechanisms involved with fisiopatology of AIA.

Orientador: Oslei Paes de Almeida / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-17T05:06:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bertao_JoseMaria_M.pdf: 1158624 bytes, checksum: 12900ae1b7c22b887b2541ec3c6ed6c9 (MD5) Previous issue date: 1985 / Resumo: Eosinófilos estavam presentes na inflamação gengival provocada experimentalmente em ratos, colocando-se ligadura com fio de algodão na região cervical dos primeiros molares inferiores. O número de eosinófilos aumentou progressivamente ate 30 dias após a colocação do irritante gengival, não havendo posterior modificações quantitativas. Inicialmente, os eosinófilos estavam localizados nas áreas inflamadas subjacentes ao epitelio e, depois de 30 dias, situavam-se no córiom mais profundo, entre as" fibras de colágeno. Mastócitos raramente foram observados no tecido periodontal próximo às áreas inflamadas, indicando que estas células não atuaram diretamente na migração dos eosinófilos. Além da participação dos eosinófilos, em mecanismos imunológicos sugere-se que possam" estar envolvidos na síntese e degradação de fibras colágenas. Com bases nos resultados deste trabalho, concluimos que: a) Eosinófilos estavam presentes na doença periodontal provocada experimentalmente em ratos. b)O número de eosinófilos aumentou após a colocaçãodo irritante gengival ate aos 45 dias. c)Não foi constatada a presença de mastócitos na - irea da doença periodontal inflamatória experimentalmente provocada / Abstract: Gingival inflammation provoked experimentally 1n rats presented eosinophils in the cellular infiltrate. Eosino phil number inereased progressively to a peak at 30 days and bsequently there was no quantitative alteration. lnitially eosinophils were found in inflammed areasunderneath the gingival epithelium and in latter periods were more numerous in deep corion among the collagen fibers. The extraeytoplasmie granules were among the collagen fibrils and close - to fibroblast which phagoeytosed collagen. Mast cells rarely were found in the vieinity of inflammed areas indieating that these cells did not participate in eosinophil migration. lt is suggested that eosinophil collagenase and other cytoplasmic enzymes act on the metabolism of rat / Mestrado / Biologia e Patologia Buco-Dental / Mestre em Ciências

INTRODUÇÃO: O significado clínico das vasculites, lesões isquêmicas, efeito Quilty e da presença de eosinófilos em biópsias endomiocardicas de receptores de transplante cardíaco com rejeições leves não foi ainda estabelecido. OBJETIVOS: Verificar se estes achados histológicos encontrados nas biópsias endomiocardicas (eosinófilos, vasculites, efeito Quilty e lesões isquêmicas) são capazes de predizer rejeição aguda do enxerto acompanhada ou não de grave comprometimento hemodinâmico e morte por rejeição aguda. MÉTODOS: Foram reavaliadas 939 biópsias endomiocardicas consecutivas classificadas como OR ou 1R pela de 2005 da Nomenclatura da Sociedade Internacional de Transplante de Coração e Pulmão e dividimos estas em dois grupos (1) Biópsias preditoras: aquelas que precederam rejeição aguda, rejeição aguda associada à grave comprometimento hemodinâmico ou morte e (2) Biópsias não preditoras aquelas que não precederam eventos clínicos. Comparamos a ocorrência dos seguintes achados histológicos: vasculites, lesões isquêmicas, efeito Quilty e eosinófilos por análise uni e multivariada entre os grupos. RESULTADOS: Após análise estatística verificou-se que a presença de vasculite intensa e de eosinófilos como maiores preditores tanto para rejeição aguda futura, apresentando respectivamente as seguintes razões de chance: 10,60 (IC95%: 3,62 31,06. p<0,001) e 6,26 (IC95%:3,16 12,43. p< 0,001) , quanto para rejeição aguda associada á grave comprometimento hemodinâmico, que para este desfecho clínico apresentaram respectivamente as seguintes razões de chance 7,52 (IC95%: 1,45-38,93. p=0,016) e 6,61 (IC95%: 2,38 18,31. p< 0,001), e também para morte em decorrência a rejeição aguda com as respectivas razões de chance: 11,20 (IC95%: 3,53 36,17. p < 0, 001) e 14,50 (IC95%: 2,19 36,17. p = 0,006). CONCLUSÕES: Vasculites intensas e eosinófilos em biópsias do miocárdio são os principais fatores preditores de rejeição aguda, rejeição aguda associada à grave comprometimento hemodinâmico e morte pós - transplante cardíaco / INTRODUCTION: The clinical meaning of vasculitis, ischemic lesions, Quilty effect and the presence of eosinophils in endomyocardial biopsies of transplant recipients with mild rejections have not been established yet. OBJECTIVES: Verify if these histological findings (eosinophils, vasculitis, Quilty effect and ischemic lesions), whose clinical meaning remains unknown so far, are able to predict acute rejection of the transplanted organ, accompanied or not by severe hemodynamic compromise and death due to acute rejection. METHODS: We reevaluated 939 consecutive endomyocardial biopsies classified as 0R or 1R, according to the nomenclature that the International Society for Heart and Lung Transplantation established in 2005. We divided these biopsies in 2 groups, as they follow: (1) Predictor biopsies, which are preceded by acute rejection, acute rejection associated to severe hemodynamic compromise or death and (2) Non-predictor biopsies that did not precede any clinical events. We compared the occurrence of the histological findings studied (eosinophils, vasculitis, Quilty effect and ischemic lesions) through univariate and multivariate analysis among the groups. RESULTS: After an appropriate statistical analysis, the result obtained was the presence of intense vasculitis and eosinophils as the greatest predictors of future acute rejection, presenting the respective odds ratio: 10,60 (IC95%: 3,62 31,06. p<0,001) and 6,26 (IC95%:3,16 12,43. p< 0,001), as well as acute rejection associated to severe hemodynamic compromise, which presented the respective odds ratio for this clinical outcome: 7,52 (IC95%: 1,45-38,93. p=0,016) and 6,61 (IC95%: 2,38 18,31. p< 0,001) and death due to acute rejection, presenting the respective odds ratio: 11,20 (IC95%: 3,53 36,17. p < 0, 001) and 14,50 (IC95%: 2,19 36,17. p = 0,006). CONCLUSIONS: Intense vasculitis and eosinophils in myocardial biopsies post-cardiac transplantation are the chief factors that can predict acute rejection, acute rejection associated to severe hemodynamic compromise or death