Orientador: Carla Fernanda Franco Penteado, Fernando Ferreira Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-18T10:31:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pallis_FlaviaRubia_M.pdf: 1011006 bytes, checksum: e3d5e88e81757d2d836d12cb03176e09 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O estado homozigoto para hemoglobina S é denominado anemia falciforme. A inflamação tem papel importante no processo de vaso-oclusivo nesta doença; leucócitos, citocinas pró-inflamatórias e moléculas de adesão estão aumentados no sangue periférico dos pacientes com anemia falciforme. A leucocitose está associada com a morbidade e mortalidade nestes pacientes. Além disso, os neutrófilos de pacientes com anemia falciforme apresentam aumento nas propriedades adesivas e quimiotáticas. No entanto, há poucas evidências sobre as possíveis alterações funcionais dos eosinófilos e na produção de mediadores derivados destas células. Os eosinófilos participam intensamente de processos inflamatórios das vias aéreas, são numericamente maiores e apresentam propriedades adesivas aumentadas na anemia falciforme. Os pulmões são particularmente vulneráveis aos eventos vaso-oclusivos na anemia falciforme e as complicações pulmonares são as principais causas de morte e a segunda causa mais comum de hospitalização em pacientes com esta doença. Atualmente a hidroxiureia é o único medicamento utilizado no tratamento das manifestações clínicas da anemia falciforme, por aumentar os níveis de Hb fetal, reduzindo a polimerização da hemoglobina S, a neutrofilia e algumas complicações associadas ao fenômeno vaso-oclusivo. Considerando a escassez de estudos que avaliaram a participação dos eosinófilos na fisiopatologia da anemia falciforme, este projeto visou comparar as propriedades adesivas, a capacidade quimiotática, a desgranulação e a produção de mediadores em eosinófilos de pacientes com anemia falciforme. Além disso, foi investigado se o tratamento com hidroxiureia interfere nas funções dos eosinófilos. Amostras de sangue periférico de pacientes com anemia falciforme foram analisadas e demonstraram maior número absoluto de eosinófilos comparados aos pacientes sem o tratamento com hidroxiureia e aos indivíduos controle. A adesão basal dos eosinófilos de pacientes tratados com hidroxiureia confirmamos que estas células são mais aderentes a fibronectina que os eosinófilos de pacientes com anemia falciforme sem o mesmo tratamento e de indivíduos controle. Além disso, não foi observada nenhuma alteração na adesão destas células quando estimulada com quimiocinas (RANTES, Eotaxina, IL-5). A citometria de fluxo foi utilizada para comparar a expressão e ativação das principais moléculas de adesão nestes eosinófilos, e identificou-se um aumento de expressão da subunidade ? da integrina MAC-1 de pacientes com anemia falciforme sem tratamento com hidroxiureia. Os eosinófilos de pacientes com anemia falciforme em tratamento ou não com hidroxiureia apresentaram maior capacidade de migração espontânea e em resposta aos agentes quimiotáticos (RANTES, Eotaxina, IL-5). Além disso, estes pacientes apresentaram níveis séricos e plasmáticos de RANTES e de Eotaxina-1 elevados. Os eosinófilos de pacientes com anemia falciforme apresentaram maior desgranulação, consequentemente liberou maior quantidade de peroxidase eosinofílica e de neurotoxina derivada dos eosinófilos que os pacientes que foram tratados com hidroxiureia e aos indivíduos controle, mas a co-incubação com RANTES, Eotaxina e IL-5 não alterou esta resposta. Por fim foi observado aumento na produção de espécies reativas de oxigênio nestes pacientes. No conjunto, nossos resultados sugerem que os eosinófilos contribuem significativamente para o processo de vaso-oclusão observado na anemia falciforme / Abstract: Sickle cell anemia is the homozygous state for hemoglobin S. Inflammation plays an important role in the vaso-occlusive process of the disease, where leukocytes, proinflammatory cytokines and adhesion molecules are increased in the peripheral blood of patients with sickle cell anemia. Leukocytosis is associated with morbidity and mortality in these patients. Moreover, neutrophils from sickle cell patients show increased chemotactic and adhesive properties. However, there is little evidence about the possible functional changes in eosinophils and production of mediators derived from these cells. The eosinophils are involved in airway inflammatory processes and are numerically larger and have increased adhesive properties in sickle cell anemia. The lungs are particularly vulnerable to vaso-occlusive events in sickle cell anemia and pulmonary complications are the leading causes of death and second most common cause of hospitalization in these patients. Hydroxyurea is currently the only drug used to treat the clinical manifestations of sickle cell anemia by increasing the levels of fetal hemoglobin, reducing the hemoglobin S polymerization, neutrophils and some complications associated with vaso-occlusive phenomenon. Considering the scarcity of studies that have evaluated the role of eosinophils in the pathophysiology of sickle cell anemia, this project aimed to compare the adhesive properties, chemotaxis capacity, degranulation and production of mediators in eosinophils of patients with sickle cell anemia. Furthermore, we investigated whether treatment with hydroxyurea interferes with the function of eosinophils. Blood samples from patients with sickle cell anemia were analyzed and showed higher absolute number of eosinophils compared with patients without treatment with hydroxyurea and control subjects. The basal adhesion of eosinophils from patients treated with hydroxyurea confirmed that these cells are more adhesive to fibronectin than eosinophils of patients with sickle cell disease without the same treatment and control subjects. Moreover, there was no change in the adhesion of these cells when stimulated with chemokines (RANTES, Eotaxin, IL-5). Flow cytometry was used to compare the expression and activation of major adhesion molecules in these eosinophils, and we identified an increased expression of ? subunit of integrin Mac-1 in patients with sickle cell disease without treatment with hydroxyurea. Eosinophils from patients with sickle cell disease, treated or not with hydroxyurea, had a higher capacity for spontaneous migration and chemotaxis in response to chemotactic agents (RANTES, Eotaxin, IL-5). Moreover, these patients had higher serum and plasma RANTES and Eotaxin-1. Eosinophils from patients with sickle cell anemia had increased degranulation and a consequently higher amount of released eosinophil peroxidase and eosinophil-derived neurotoxin than patients who were treated with hydroxyurea and control subjects, but the co-incubation with RANTES, Eotaxin and IL-5 did not alter this response. Finally, there was an increased production of reactive oxygen species in these patients. Overall, our results suggest that eosinophils contribute significantly to the process of vasoocclusion observed in sickle cell anemia / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Edson Antunes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-14T02:51:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Calixto_MarinaCiarallo_M.pdf: 1332509 bytes, checksum: e48c9d3db15446699095516d38f8c983 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O aumento no número de eosinófilos (EO) nos tecidos, sangue e medula óssea (MO) são considerados eventos importantes na asma, e em geral, números elevados destas células estão correlacionados com a gravidade da doença. Dados epidemiológicos indicam que a obesidade aumenta a prevalência e incidência de asma alérgica e reduz seu controle. Acredita-se que a obesidade e a asma apresentam algumas etiologias comuns, principal-mente em suas bases genética. Entretanto, é possível que existam outros mecanismos bioló-gicos através dos quais a obesidade pode ser tanto a responsável pela causa como pelo a-gravamento da asma. O aumento do tecido adiposo parece elevar a produção de citocinas e quimiocinas, tais como IL-6, TNF-? e eotaxina. Camundongos geneticamente obesos apre-sentam hiperreatividade inata das vias aeríferas, porém pouca atenção tem sido dada ao recrutamento pulmonar de EO em animais obesos. Uma vez que o acúmulo seletivo de eo-sinófilos para as vias aeríferas é considerado um evento central na patogênese da asma, este estudo teve como objetivo investigar o influxo de eosinófilos para o pulmão e o papel das citocinas Th1 e Th2 neste processo, em camundongos obesos por indução de dieta. Foram utilizados camundongos C57bl6/J que receberam dieta hiperlipídica por dez semanas. Na oitava semana de tratamento, os animais foram sensibilizados com 2 injeções s.c de oval-bumina (OVA) com intervalo de sete dias entre as mesmas. Na semana seguinte, camun-dongos sensibilizados e não sensibilizados foram desafiados por via intranasal com OVA. Os camundongos foram sacrificados em diferentes tempos (24, 48, 72 e 96 h) após o desa-fio com OVA, e a contagem de EO no sangue, lavado broncoalveolar (LBA) e MO foi ava-liada. Camundongos obesos por indução de dieta hiperlipídica exibiram aumento no ganho de peso ponderal e no peso do tecido adiposo epididimal, bem como aumento nos níveis de colesterol total comparados com camundongos controle. O desafio intranasal com OVA em camundongos sensibilizados aumentou significativamente a contagem de EO no LBA em todos os tempos avaliados após o desafio com OVA. O número de eosinófilos foi pratica-mente nulo em camundongos não sensibilizados. Camundongos sensibilizados obesos apre-sentaram uma migração tardia de EO para O LBA, com pico em 72 h após o desafio. Além disso, a análise morfológica demonstrou que o parênquima pulmonar de camundongos sen-sibilizados obesos apresentam um marcante aumento no infiltrado de EO, tanto em 48 quanto em 72 h após o desafio, quando comparado com camundongos sensibilizados con-troles. Na MO foi encontrado um significativo aumento no número de eosinófilos maduros e imaturos nos animais sensibilizados obesos quando comparados com os sensibilizados controles. Os níveis de IL-4, IL-5, TNF-?, IL-6, IL-10 e eotaxina aumentaram significati-vamente nos camundongos obesos sensibilizados, atingindo o pico 72 h após o desafio com OVA. Nossos dados indicam que foi possível estabelecer um modelo de obesidade em ca-mundongos que claramente aumenta o influxo de EO para o pulmão em resposta ao desafio com OVA. Em camundongos obesos, os EO permaneceram retidos no parênquima pulmonar, exercendo suas funções efetoras favorecendo a patogênese da asma / Abstract; : Increases in eosinophil (EO) numbers in the tissues, blood, and bone marrow (BM) are a hallmark of asthma and, in general, elevated numbers correlate with disease severity. Epi-demiological data indicate that obesity increases the prevalence and incidence of allergic asthma. The basis for this relationship is unknown, but might be the result of common eti-ologies, comorbidities or genetic basis. Increased fat mass, particularly with central obesity, leads to production of cytokines and chemokines, such as IL-6, TNF-? and eotaxin. Studies have shown that genetically obese mice exhibit innate airway hyperresponsiveness, but little attention has been given to the allergic pulmonary EO recruitment in obese animals. Since selective accumulation of eosinophils into the airways has become a central concept of the asthma pathology, this study was designed to investigate the eosinophil influx into lungs and the role of Th2 cytokines in diet-induced obese mice. Four-week-old male C57bl6/J mice received a high fat diet for 10 weeks. On the eighth week, mice were sensi-tized with two s.c. ovalbumin (OVA) injections at 7 day intervals. One week thereafter, sensitized and non-sensitized animals were intranasally challenged with OVA. The mice were killed at different times (24, 48, 72 and 96 h) after OVA challenge, and EO counts in blood, bronchoalveolar lavage fluid (BAL) and BM were evaluated. High-fat diet mice ex-hibited a significant increase in body weight and epididymal fat, as well as increased total serum cholesterol levels compared with non-obese groups. Intranasal challenge with OVA in sensitized mice largely increased the EO counts in BAL at 48 h and 72 h post-OVA chal-lenge. Eosinophils were nearly absent in the non-sensitized mice. The sensitized obese mice showed a delayed EO emigration to BAL, peaking at 72 h post-OVA challenge. In addition, the morphological analysis showed that lung parenchyma of sensitized obese mice pre-sented a markedly higher EO infiltration at both 48 h and 72 h post-OVA challenge when compared with non-obese mice. In BM, a significant increase in counts of both mature and immature EO was also found in sensitized obese compared with sensitized non-obese mice. The levels of IL-4, IL-5, TNF-?, IL-6, IL-10 and eotaxin significantly increased in BAL of sensitized obese mice, peaking at 72 h-post OVA challenge. Our findings indicate that we have established an experimental model in C57bl6/J obese mice that clearly show a potentiation of EO influx in response to OVA challenge. In obese mice, EO are likely to be retained in the lung parenchyma exerting their effector functions in promoting the pathoge-nesis of airways diseases / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientadores: Edson Antunes, Ivani Aparecida de Souza / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-14T02:35:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mariano_NadiaSabrina_M.pdf: 621386 bytes, checksum: b01cd4d186fa15a5e8ea3c7657df604a (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O Staphylococcus aureus é um tipo de bactéria gram-positiva que produz e secreta uma série de enterotoxinas com propriedade imunomoduladoras. Entretanto, pouco é conhecido sobre os mecanismos envolvidos na exacerbação do influxo celular observado em indivíduos asmáticos expostos a enterotoxinas estafilocócicas. O objetivo desse trabalho é investigar os efeitos da exposição das vias aéreas à enterotoxina estafilocócica do tipo A (SEA) sobre o recrutamento de leucócitos para o pulmão de ratos sensibilizados e desafiados com ovalbumina (OVA). Em nossos protocolos experimentais, ratos foram expostos à SEA 4 h antes ou 4 h após o desafio antigênico com OVA. O lavado broncoalveolar (LBA), a medula óssea e o tecido pulmonar foram obtidos 24 h após o desafio com OVA. A pré-exposição à SEA aumentou significativamente o número de eosinófilos no LBA e no tecido pulmonar de ratos desafiados com OVA, enquanto que o número de neutrófilos e células mononucleares não foi significativamente alterado. Na medula óssea, a pré-exposição à SEA isoladamente aumentou significativamente o número de eosinófilos, sendo esse aumento potencializado em ratos desafiados com OVA. Por outro lado, a pós-exposição à SEA não afetou o número de eosinófilos, neutrófilos ou células mononucleares observadas no LBA. A pré-exposição ao LPS em animais desafiados com OVA aumentou somente o número de neutrófilos no LBA. No LBA de ratos pré-expostos à SEA e desafiados com OVA, notamos uma elevação significativa nos níveis de TNF-? e eotaxina, mas não de IL-10. Os níveis de eotaxina presentes em sobrenadante de cultura de macrófagos alveolares tratados com SEA in vitro aumentaram cerca de 3 vezes em relação a macrófagos não estimulados com SEA. Concluímos que a pré-exposição (mas não a pós-exposição) das vias aéreas de ratos à SEA aumenta seletivamente o número de eosinófilos presente no LBA, tecido pulmonar e medula óssea de ratos desafiados com OVA por mecanismos que envolvem o aumento na síntese de TNF-? e eotaxina / Abstract: Gram-positive Staphylococcus aureus releases classical enterotoxins which aggravates allergic airway diseases. However, little is known about the mechanisms underlying the cell influx exacerbation in asthmatic individuals under exposure to Staphylococcal enterotoxins. We therefore aimed to investigate the effects of airways exposure to Staphylococcal enterotoxin A (SEA) to pulmonary leukocyte recruitment in rats sensitized and challenged with ovalbumin (OVA). Rats were exposed to SEA at 4 h prior to OVA challenge or at 4 h post-OVA challenge. Bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, bone marrow and lung tissue were obtained at 24 h after OVA challenge. Preexposure to SEA markedly enhanced the eosinophil counts in both BAL fluid and pulmonary tissue in OVA-challenged rats, whereas neutrophil and mononuclear cell counts remained unchanged. In bone marrow, pre-exposure to SEA alone significantly increased the number of eosinophils, and that was further increased in OVA-challenged rats. Exposure to SEA post-OVA challenge did not affect the number of eosinophils, neutrophils and mononuclear cells in BAL fluid. Pre-exposure to the endotoxin lipopolyssacharide (LPS) in OVA-challenged animals rather enhanced the neutrophil number in BAL fluid. In rats pre-exposed to SEA and OVA-challenged, a marked elevation in the levels of TNF-? and eotaxin (but not of IL-10) in BAL fluid was observed. The eotaxin levels increased by about of 3-fold in alveolar macrophages treated with SEA in vitro. In conclusion, airways pre-exposure to SEA (but not the postexposition) causes a selective increase in eosinophil number in BAL fluid, lung tissue and bone marrow of OVA-challenged rats by mechanisms involving enhancement of TNF-? and eotaxin synthesis / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Farmacologia

Orientador: Edson Antunes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T19:38:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SouzaFilho_LuisGustavode1974-_M.pdf: 2079653 bytes, checksum: 497d01659ac0eed18bd9c81662ca0b59 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Os inibidores das óxido nítrico sintases (NOS) são amplamente utilizados para avaliar a contribuição do NO na alergia pulmonar, mas os dados obtidos pela utilização de tais inibidores são controversos. Neste estudo, ensaios farmacológicos, bioquímicos e farmacocinéticos foram realizados para se avaliar os efeitos dos tratamentos agudo e crônico com o inibidor não seletivo da NOS, L-NAME, assim como do inibidor seletivo para NOS induzível (iNOS), aminoguanidina, sobre a inflamação das vias aéreas em camundongos BALB/c desafiados com ovalbumina (OVA). O tratamento crônico com L-NAME (50 e 150 mg/kg/dia, por três semanas) aumentou significativamente o número de eosinófilos no lavado broncoalveolar (LBA) de animais desafiados com ovalbumina (OVA; 0,19 ± 0,02 e 0,34 ± 0,03 x 106células/LBA, respectivamente; P<0,0001) em relação aos não tratados (0,13 ± 0,02 x 106 células/LBA). No parênquima pulmonar, o tratamento crônico com L-NAME (150 mg/kg/dia) também elevou significativamente o número de eosinófilos nos animais desafiados com OVA em relação aos animais não tratados (27,0 ± 5,1 e 18,2 ± 1,6 eosinófilos/brônquio, respectivamente; P<0,05). Contrariamente, os tratamentos agudo com L-NAME (50 mg/kg; gavagem 30 min antes do primeiro desafio com OVA) e crônico com aminoguanidina (20 mg/kg/dia, por três semanas) reduziram o número de eosinófilos no LBA (0,05 ± 0,01 e 0,04 ± 0,02 x 106 células/LBA, respectivamente; P<0,05) em relação ao controle. Os tratamentos agudo e crônico com L-NAME reduziram a atividade da NOS constitutiva (cNOS) no cérebro em relação aos animais não tratados (tratamento agudo: 5,8 ± 0,4 e 3,6 ± 0,2 pmol/min/mg de proteína; tratamento crônico: 5,7 ± 0,3 e 0,7 ± 0,2 pmol/min/mg de proteína, para controle e tratado, respectivamente; P<0,05). A atividade da NOS induzível (iNOS) pulmonar foi significativamente reduzida pelos tratamentos agudo com L-NAME e crônico com aminoguanidina (0,7 ± 0,05 e 0,04 ± 0,02 pmol/min/mg de proteína, respectivamente; P<0,05) em relação aos animais não tratados (1,2 ± 0,2 pmol/min/mg de proteína). Contudo, o tratamento crônico com L-NAME não afetou a atividade da iNOS pulmonar. Os níveis séricos de IgE mostraram-se elevados nos animais desafiados com OVA, mas não foram afetados por nenhum dos tratamentos. O tratamento crônico com aminoguanidina (mas não o tratamento crônico com L-NAME) reduziu os níveis elevados de eotaxina no LBA (3,4 ± 1,2 e 1,0 ± 0,5 pg/ml, para controle e tratado, respectivamente; P<0,05). As reduções dos níveis de NOx no LBA pelos tratamentos agudo com L-NAME e crônico com aminoguanidina (1,8 ± 0,4 e 0,6 ± 0,3 µM, respectivamente) foram maiores quando comparadas ao tratamento crônico com L-NAME (6,8 ± 0,6 µM) em relação aos animais não tratados (8,8 ± 0,8 µM). Os protocolos farmacocinéticos mostraram que o L-NAME não é biodisponível quando dado via oral. As concentrações séricas do metabólito do L-NAME, N?-nitro-L-arginina, diminuiram progressivamente de 30 min a 24 horas após a administração (72,0 a 32,1 ng/mL). No tratamento crônico com L-NAME, a concentração do N?-nitro-L-arginina (16,2 ng/mL) mostrou-se próxima do limite de detecção do método (10 ng/ml). Em conclusão, o tratamento crônico com L-NAME por três semanas produziu baixas concentrações séricas do N?-nitro-L-arginina, causando inibição preferencial da atividade da cNOS. Portanto, a potenciação do influxo de eosinófilos pelo tratamento crônico com L-NAME supostamente remove o NO protetor derivado da cNOS, com nenhuma interferência sobre o agravamento da inflamação devido ao NO oriundo da iNOS / Abstract: Nitric oxide synthase (NOS) inhibitors are largely used to evaluate the NO contribution to pulmonary allergy, but contrasting data have been obtained. In this study, pharmacological, biochemical and pharmacokinetic studies were performed to evaluate the effects of acute and chronic treatment of BALB/C mice with non-selective (L-NAME) and selective (aminoguanidine) NOS inhibitors in ovalbumin (OVA)-challenged mice. Long-term L-NAME treatment (50 and 150 mg/kg/day, three weeks) significantly increased the eosinophil number in bronchoalveolar lavage (BAL) fluid (0.19 ± 0.02 and 0.34 ± 0.03 x 106 cells / BAL, respectively; P<0.0001) in comparison with non-treated animals (0.13 ± 0.02 x 106 cells / BAL). In the bronchiolar parenchyma, chronic L-NAME treatment (150 mg/kg/day) also increased the eosinophil number (18.2 ± 1.6 and 27.0 ± 5.1 eosinophils/bronchio, for treated and untreated, respectively; P<0.05). On the other hand, acute L-NAME (50 mg/kg, given by gavage 30 min prior to the first OVA challenge) and aminoguanidine (20 mg/kg/day, three weeks) rather reduced the eosinophil number (0.05 ± 0.0 and 0.04 ± 0.02 x 106 cells / BAL, respectively; P<0.05). Chronic and acute L-NAME treatments markedly reduced the constitutive NOS (cNOS) activity in brain (0.7 ± 0.2 and 3.6 ± 0.2 pmol/min/mg of protein, respectively; P<0.05) in comparison with untreated animals (5.7 ± 0.3 and 5.8 ± 0.4 pmol/min/mg of protein, respectively). The inducible pulmonary NOS (iNOS) activity was markedly reduced by acute L-NAME and aminoguanidine (0.7 ± 0.05 and 0.04 ± 0.02 pmol/min/mg of protein, respectively; P<0.05) compared with untreated animals (1.2 ± 0.2 pmol/min/mg of protein). In contrast, chronic L-NAME failed to affect the iNOS activity. The increased serum IgE levels seen in OVA-challenged animals were not affected by any treatment. Aminoguanidine (but not chronic L-NAME) restored the increased eotaxin levels in BAL (3.4 ± 1.2 and 1.0 ± 0.5 pg/ml; P<0.05). The NOx- levels in BAL fluid were reduced by both acute and chronic L-NAME, as well as by aminoguanidine (1.8 ± 0.4, 6.8 ± 0.6 and 0.6 ± 0.3 µM, respectively; P<0.05) compared with untreated animals (8.8 ± 0.8 µM); however, the reductions of NOx- levels by acute L-NAME and aminoguanidine were significantly higher than the chronic L-NAME treatment. The pharmacokinetic protocols showed that L-NAME per se is not bioavailable when given per os. The serum concentrations of its metabolite N?-nitro-L-arginine decreased from 30 min to 24 h (72.0 to 32.1 ng/mL) after acute L-NAME intake. In chronic treatment, N?-nitro-L-arginine concentration (16.2 ng/mL) was close to the detection limit (10 ng/mL). In conclusion, 3-week treatment with L-NAME yields low serum N?-nitro-L-arginine concentrations, causing a preferential inhibition of cNOS activity. Therefore, potentiation of eosinophil influx by chronic L-NAME reflects a removal of protective cNOS-derived NO, with no interference on the ongoing inflammation due to iNOS-derived NO / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Edson Arantes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T19:45:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lintomen_Leticia_D.pdf: 1121941 bytes, checksum: 2c92a8ddfce83c01ed6c71e524096e0b (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Os eosinófilos participam da patogênese de várias doenças inflamatórias, incluindo infecções parasíticas e doenças alérgicas. Dentre as doenças alérgicas, a eosinofilia tem presença marcante na asma. Atualmente, a asma afeta 300 milhões de indivíduos no mundo, sendo considerada um problema de saúde pública mundial. A asma é uma doença inflamatória crônica que envolve interações entre fatores externos e genéticos, e tem como características principais a inflamação pulmonar e a hiperresponsividade brônquica. O recrutamento de eosinófilos para as vias aeríferas contribui para o caráter crônico da asma. A migração de eosinófilos para o tecido inflamado é um processo complexo, que é regulado por numerosos fatores, incluindo citocinas, quimiocinas, óxido nítrico (NO) e interações de moléculas de adesão. Estudos prévios investigaram as interações funcionais entre NO e CC-quimiocinas. Young e colaboradores (1999) mostraram que o número de eosinófilos no lavado broncoalveolar (LBA) de macacos desafiados está marcadamente aumentado 24 horas após o desafio, e que este aumento é acompanhado de altos níveis de NO no ar exalado e de eotaxina no LBA. Em pacientes com rinite, a eotaxina aumentou o número de eosinófilos no fluido do lavado nasal e também os níveis de NO nasal (Hanazawa et al., 1999). Em contraste, em modelos murinos de asma a inibição seletiva da NOS induzível resultou na redução da migração eosinofílica para os pulmões (Feder et al., 1997; Iijima et al., 2001), que estava associada com o aumento da expressão da CC-quimiocina proteína quimiotática para monócito-1 (MCP-1) no tecido pulmonar (Trifilieff et al., 2000). Além disso, NO (ou doadores de NO) também são capazes de inibir a produção de RANTES (Frank et al., 2000). O NO via formação de peroxinitrito (ONOO-) também pode reduzir a migração de eosinófilos induzida por eotaxina (Sato et al., 2000). Entretanto, o papel modulatório do NO nas funções do eosinófilo mediadas por CC-quimiocinas ainda permanece contraditório. Portanto, o presente trabalho investigou o efeito modulatório do NO na adesão aumentada, quimiotaxia e desgranulação do eosinófilo induzidas pelas Ccquimiocinas eotaxina e RANTES in vitro, e a expressão de VLA-4 e Mac-1 na superfície do eosinófilo. Nós realizamos ensaios funcionais (adesão e desgranulação), análise da expressão de moléculas de adesão por citometria de fluxo (VLA-4 e Mac-1) e a investigação de resíduos de tirosina nitrada para avaliar interações do NO com CC-quimiocinas em eosinófilos humanos. Os ensaios de MTT mostraram que as incubações de eosinófilos por 2, 3, ou 4 horas com eotaxina (10, 100 e 1000 ng/ml) ou RANTES (10, 100 e 1000 ng/ml) não afetam a viabilidade celular e, em determinadas condições, até promovem a ativação das células. Os resultados de adesão à fibronectina mostraram que a eotaxina (10, 100 e 1000 ng/ml) ou RANTES (10, 100 e 1000 ng/ml) não aumentam a adesão de eosinófilos em períodos de incubação de 2 e 3 horas. Entretanto, a incubação de eosinófilos por 4 horas com eotaxina ou RANTES aumentou significativamente a adesão à fibronectina. O L-NAME (0.1 mM), individualmente, aumentou significativamente a adesão de eosinófilos à fibronectina; porém a co-incubação de L-NAME com eotaxina (ou RANTES) não afetou a adesão observada com cada agente isoladamente. Além disso, a expressão de VLA-4 e de Mac-1 não foi modificada em nenhuma das condições experimentais testadas. Eotaxina e RANTES também não foram capazes de aumentar os níveis de GMPc nos eosinófilos, em condições onde o SNP (0.1 mM), usado como controle positivo, aumentou significativamente os níveis desse segundo mensageiro. Além disso, eosinófilos tratados com L-NAME, eotaxina e RANTES, individualmente, foram capazes de desgranular estas células, mas a co-incubação de LNAME com eotaxina (ou RANTES), não alterou esta resposta. Os resultados de quimiotaxia mostraram migração significativa de eosinófilos (tratados ou não com LNAME) em resposta à eotaxina ou RANTES. Os resultados obtidos de Western blotting para 3-nitrotirosina mostraram ausência de proteínas nitradas nos eosinófilos de indivíduos sadios ou asmáticos. No conjunto, nossos resultados mostram que, nas condições experimentais estabelecidas, o NO não modula adesão, migração e desgranulação em eosinófilos estimulados com eotaxina ou RANTES / Abstract: Eosinophils participate in the pathogenesis of many inflammatory diseases, including parasitic infections and allergic diseases. Of the allergic diseases, asthma is characterized by eosinophilia. Currently, asthma affects 300 million people in world, and is an important public health problem. Asthma is an inflammatory chronic disease that involves interactions between external and genetic factors, and has lung inflammation and bronchial hyperresponsiveness as major features. The recruitment of eosinophils into airways contributes to the asthma chronic character. The eosinophil migration to inflamed tissue is a complex process regulated by several factors, including cytokines, chemokines, nitric oxide (NO) and adhesion molecule interactions. Previous studies have investigated the functional interactions between NO and CC-chemokines. Young et al. (1999) showed that the number of eosinophils in the bronchoalveolar lavage (BAL) fluid of challenged monkeys is markedly increased at 24 h post-challenge, accompanied by higher levels of both exhaled NO and eotaxin in BAL fluid. In rhinitis patients, eotaxin increased the number of eosinophils in the nasal lavage fluid, and that was also accompanied by elevated nasal NO levels (Hanazawa et al., 1999). In contrast, in murine models of asthma, selective inhibition of inducible NOS resulted in a reduction in pulmonary eosinophil migration (Feder et al., 1997; Iijima et al., 2001), with an increased expression of the CC-chemokine monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) in the lung tissue (Trifilieff et al., 2000). Moreover, NO (or NO donors) have also been shown to inhibit the production of RANTES (Frank et al., 2000). Nitric oxide via peroxynitrite (ONOO-) formation is reported to reduce eotaxin-induced eosinophil migration (Sato et al., 2000). However, the modulatory role of NO in the CC-chemokines-mediated eosinophil functions is still not well understood. Therefore, the present study was designed to investigate the modulatory effect of NO in the enhanced eosinophil adhesion, chemotaxis and degranulation induced by the Ccchemokines eotaxin and RANTES in vitro, and the expression of VLA-4 and Mac-1 on the eosinophil surface. We therefore carried out functional assays (adhesion and degranulation), flow cytometry analysis of adhesion molecules (VLA-4 and Mac-1 expression) and investigation of tyrosine nitration to evaluate the interactions between NO and CC-chemokines in human eosinophils. MTT assays showed that incubation of eosinophils for 2, 3 or 4 hours with eotaxin (10, 100 and 1000 ng/ml) or RANTES (10, 100 and 1000 ng/ml) did not affect cellular viability and, in some conditions, even caused cellular activation. The results of adhesion to fibronectin showed that eotaxin (10, 100 and 1000 ng/ml) or RANTES (10, 100 and 1000 ng/ml) did not increase eosinophil adhesion at 2 or 3 hours of incubation. Nevertheless, the incubation of eosinophils for 4 hours with eotaxin or RANTES significantly increased adhesion to fibronectin. L-NAME (0.1 mM), alone, significantly increased eosinophil adhesion to fibronectin; however the co-incubation of L-NAME with eotaxin (or RANTES) did not affect the adhesion of each agent. Moreover, expression of VLA-4 and Mac-1 were not modified by any of the experimental conditions. Eotaxin and RANTES did not increase eosinophil cGMP levels under the same conditions in which SNP (0.1mM), used as a positive control, significantly increased the levels of this second messenger. Furthermore, eosinophils treated with L-NAME, eotaxin and RANTES, alone, demonstrated degranulation, however the co-incubation of eosinophils with L-NAME and eotaxin (or RANTES) did not alter this response. Chemotaxis assays showed a significant eosinophil (treated or not with L-NAME) migration in response to eotaxin or RANTES. Western blotting for 3-nitrotyrosine-3 showed a lack of nitrated proteins in eosinophils from healthy or asthmatic donors. Taken together, results show that, under the experimental conditions established, NO does not modulate adhesion, migration and degranulation in eotaxin or RANTES-stimulated eosinophils / Doutorado / Doutor em Farmacologia

Introdução: A doença do refluxo gastroesofágico (DRGE) refratária pode estar relacionada à maior sensibilização a alimentos pelo dano ácido-péptico às junções intercelulares e/ou pelo aumento do pH gástrico pelos inibidores de bomba de prótons (IBPs). A falha na resposta ao tratamento da DRGE tem sido atribuída, entre outras causas, à esofagite eosinofílica (EE). Objetivo: O objetivo principal do estudo foi avaliar a sensibilização a alimentos nos pacientes com DRGE refratária. Como objetivos secundários, comparamos as características dos pacientes sensibilizados com os não sensibilizados e verificamos a resposta clínica da DRGE à dieta de restrição aos alimentos aos quais o paciente estava sensibilizado. Métodos: Os pacientes com DRGE refratária realizaram dieta de restrição baseada no resultado de teste cutâneo de leitura imediata (TCLI) e teste cutâneo de contato (TCC) com alimentos. As características dos pacientes sensibilizados foram comparadas com os não sensibilizados com relação à atopia e número de eosinófilos na mucosa esofágica. Resultados: A prevalência de sensibilização a alimentos nos pacientes com DRGE refratária foi de 27,7%, sendo 15,3% pelo TCLI e 12,3% pelo TCC. Os asmáticos apresentaram maior sensibilização a alimentos (p=0,008). Foi identificada a presença de eosinófilos na mucosa esofágica em 15,8% dos pacientes e esta correlacionou-se com maior sensibilização a alimentos (p=0,011). Foi confirmado um caso de EE. A dieta de exclusão aos alimentos identificados promoveu melhora clínica dos sintomas da DRGE (p=0,004). Conclusão: A presença de eosinófilos na mucosa esofágica associada à maior sensibilização a alimentos e a resposta à dieta de exclusão em pacientes com testes positivos sugere que a DRGE refratária pode representar um estágio inicial da EE. / Abstract: Refractory gastroesophageal reflux disease (GERD) can be related to greater sensitization to foods due to peptic acid damage to intercellular junctions and/or due to the increase in gastric pH by proton pump inhibitors (PPIs). The lack of response to treatment of GERD has been attributed to, among other causes, eosinophilic esophagitis (EE). Objective: The principal objective of the study was to evaluate the sensitization to foods in patients with refractory GERD. As secondary objectives, we compared the characteristics of sensitized patients with those non-sensitized and found a clinical response of GERD to a diet restricting foods to which the patient was sensitized. Methods: Patients with refractory GERD were put on a restriction diet based on the results of skin prick test (SPT) and atopy patch test (APT) with foods. The characteristics of the sensitized patients were compared to those non-sensitized in relation to atopia and number of eosinophils in the esophageal mucosa. Results: The prevalence of sensitization to foods in patients with refractory GERD was 27.7%, where 15.3% were determined by SPT and 12.3% by APT. Asthmatics showed higher sensitization to foods (p=0.008). The presence of eosinophils in the esophageal mucosa was determined in 15.8% of patients, and this correlated with greater sensitization to foods (p=0.011). One case of EE was confirmed. A diet excluding identified sensitizing foods led to clinical improvement with regard to GERD symptoms (p=0,004). Conclusion: The presence of eosinophils in esophageal mucosa associated with greater sensitization to foods and the response to restriction diet in patients with positive tests suggest that refractory GERD can represent an initial stage of EE.

O diabetes mellitus (DM) e a asma são doenças de elevada incidência mundial. Embora ambas as doenças sejam comuns, há uma correlação negativa entre elas, uma vez que o aparecimento de DM, em pacientes previamente asmáticos, determina uma melhora do quadro asmático, em contrapartida, a insulina agrava a asma. O presente estudo avaliou o papel da insulina na vigência da inflamação alérgica crônica pulmonar em camundongos diabéticos e sadios. Para tanto, foram utilizados camundongos machos, da linhagem BALB/C, tornados diabéticos (aloxana, 50 mg/kg, i.v., 10 dias). Os animais foram sensibilizados com ovalbumina (OVA - 20 &#181;g, e Al(OH)3 -2 mg) 10 dias após a injeção de aloxana e receberam a mesma dose após 12 dias, após 6 dias da última sensibilização os animais foram expostos a nebulização durante 7 dias, com solução de OVA (5 mg/mL), ou salina (SAL). Os animais diabéticos e asmáticos foram separados em dois diferentes grupos, para receberem dois tratamentos distintos de insulina, um tratamento com uma única dose de insulina e outro tratamento com doses consecutivas de insulina, sempre antes dos desafios. Após 24h do último desafio foram feitas as seguintes análises: a) o número de células no fluído de lavado broncoalveolar (LBA), leucograma e a glicemia (monitor de glicose); b) quantificação das concentrações de citocinas (IL1 &#946;, TNF-&#945;, IL-6, IL-4, IL-10, VEGF, TGF-ß) no sobrenadante do fluído de LBA pela técnica de ELISA; c) análise morfológica do tecido pulmonar através de cortes histológicos e coloração em hematoxilina e eosina (H/E) e d) deposição e quantificação de colágeno e muco no tecido pulmonar através de análise morfométrica em cortes histológicos corados com Tricômico de Massom e ácido periódico de Schiff (PAS), respectivamente. Comparados aos controles, camundongos diabéticos apresentaram redução de infiltrado inflamatório (34%) no fluído de LBA e de IL-1&#946; (87%). Ambos os grupos apresentaram leve marcação de colágeno e ausência de muco. Os animais não diabéticos desafiados com OVA, apresentaram um aumento de infiltrado inflamatório (44%) no fluído de LBA com presença de eosinófilos (25%), presença de eosinófilos (34%) no sangue periférico, aumento das concentrações de IL-4 (70%) , deposição de colágeno (72%), e presença de muco, quando comparado ao animal controle. Os animais diabéticos desafiados com OVA apresentaram parâmetros similares aos animais diabéticos que receberam nebulização com SAL. O tratamento dos animais diabéticos com dose única de insulina corrigiu completamente os níveis de celularidade no fluído de LBA, a presença de eosinófilos no sangue periférico, e os níveis de concentrações de IL-4 e IL-1&#946;, mas não corrigiu a deposição de colágeno ao redor das vias aéreas e secreção de muco. Já o tratamento com doses consecutivas corrigiu completamente os níveis de infiltrado inflamatório do LBA, presença de eosinófilos tanto no fluído de LBA como no sangue periférico, os níveis de concentrações de IL-1&#946;, deposição de colágeno e secreção de muco. A concentração de IL-10 não diferiu entre os grupos e as demais citocinas analisadas não foram detectadas no ensaio de enzima-imunoensaio utilizado. Em conjunto estes dados sugerem que a insulina deva regular o remodelamento das vias aéreas em modelo experimental de inflamação alérgica pulmonar em camundongos diabéticos controlando o infiltrado inflamatório, a produção de IL-1&#946;, e consequentemente, a deposição de colágeno e secreção de muco. / Diabetes mellitus (DM) and asthma are diseases of high incidence worldwide. Although both diseases are common, there is a negative correlation between them, since the appearance of DM in asthmatic patients previously determines an improvement in asthma profile, however, insulin exacerbates asthma. This study evaluated the role of insulin in the presence of chronic pulmonary allergic inflammation in diabetic mice and healthy. To this end, male mice were used in BALB / C strain, made diabetic (alloxan, 50 mg / kg, i.v., 10 days). Animals were sensitized with ovalbumin (OVA - 20 mcg, and Al (OH) 3 -2 mg) 10 days after the injection of alloxan and received the same dose at 12 days after 6 days after the last sensitization animals were exposed to nebulized for 7 days with OVA solution (5 mg / ml) or saline (SAL). Diabetics and asthmatic animals were divided in two different groups to receive two different insulin treatment, a treatment with a single dose of treatment with insulin and other insulin consecutive doses of ever before challenge. 24 hours after the last challenge the following analysis: a) the number of cells in the bronchoalveolar lavage (BAL), white blood cell count and blood sugar (glucose monitor); b) quantifying the concentrations of cytokines (IL-1 &#946;, TNF-&#945;, IL-6, IL-4, IL-10, VEGF, TGF-ß) in the BAL supernatant by ELISA; c) morphological analysis of lung tissue by histological sections and stained with hematoxylin and eosin (H / E) and d) deposition and quantification of collagen and mucus in the lung tissue by morphometric analysis of histological sections stained with trichrome of Massom and periodic acid Schiff (PAS), respectively. Compared to controls, diabetic mice showed a reduction of inflammatory infiltrate (34%) in the BAL, IL-4 concentrations (54%) and IL-1&#946; (87%). Both groups showed slight marking of collagen and no mucus. Non-diabetic mice challenged with OVA had an increased inflammatory inflammatory infiltration (44%) in the presence of BAL eosinophils (25%), eosinophils (34%) in peripheral blood, increase in IL-1&#946; (44%), collagen deposition (72%) and presence of mucus compared to control animals. Diabetic animals challenged with OVA showed similar patterns to those diabetic animals given nebulization with SAL. Treatment of diabetic rats with a single dose of insulin completely corrected the cellularity levels in BAL eosinophils in peripheral blood and the levels of IL-1&#946; concentrations, but did not correct deposition of collagen around airways and mucus secretion. Since treatment with consecutive doses completely corrected levels of the inflammatory infiltrate of the BAL eosinophils in both the peripheral blood and BAL, the levels IL-1&#946; concentrations, deposition of collagen and mucus secretion. The IL-10 concentration did not differ between groups and other cytokines analyzed were not detected in the test enzyme-immunoassay used. Together these data suggest that insulin is to regulate airway remodeling in an experimental model of allergic lung inflammation in diabetic mice controlling the inflammatory infiltration, IL-1&#946;, and therefore, deposition of collagen and secretion mucus.

O parênquima pulmonar periférico tem sido estudado como um componente da resposta inflamatória na asma. Durante uma constrição induzida, a resistência do tecido aumenta em diferentes modelos de asma. Aproximadamente 60% dos pacientes asmáticos possuem respostas imediata e tardia. A resposta tardia é caracterizada por obstrução mais grave de vias aéreas. No presente estudo, foi avaliada a mecânica de fatias de parênquima pulmonar em cobaias sensibilizadas com ovoalbumina (OVA), tentando reproduzir ambas as repostas imediata e tardia. A mecânica oscilatória de fatias pulmonares foi realizada em um grupo controle (C), em um grupo de resposta imediata (IM) e em dois grupos de resposta tardia: 17 (T1) e 72 (T2) horas após o último desafio com ovoalbumina. Medidas de resistência (R) e elastância (E) foram obtidas antes e depois do desafio com OVA nos grupos C e IM e antes e depois do desafio com Acetilcolina (ACh) em todos os grupos. Com o uso de morfometria, foram avaliadas as densidades de eosinófilos e de células musculares lisas, assim como o conteúdo de colágeno e elastina nas fatias pulmonares. Os valores de R e E basais e pós-agonista estão aumentados nos grupos IM, T1 e T2 quando comparados com o grupo C (p = 0.001). A análise morfométrica mostrou um aumento na densidade de eosinófilos nas fatias de tecido periférico dos grupos IM e T2 quando comparados com o grupo C (p < 0.05). Houve uma correlação positiva significante entre a densidade de eosinófilos nas fatias de parênquima dos grupos C, T1 e T2 e os valores de R e E pós-ACh (r = 0,71, p = 0.001 e r = 0,74, p < 0.001, respectivamente). Os resultados mostram que o parênquima pulmonar está envolvido na resposta tardia deste modelo de inflamação alérgica crônica e que a resposta constritora nesta fase está relacionada à inflamação eosinofílica. / The peripheral lung parenchyma has been studied as a component of the asthmatic inflammatory response. During induced constriction, tissue resistance increases in different asthma models. Approximately 60% of the asthmatic patients show early and late responses. The late response is characterized by more severe airway obstruction. In the present study, we evaluated lung parenchymal strips mechanics in ovalbumin-sensitized guinea pigs, trying to reproduce both early and late inflammatory responses. Oscillatory mechanics of lung strips were performed in a control group (C), in an early response group (ER), and in two late response groups: 17 (L1) and 72 (L2) hours after the last ovalbumin challenge. Measurements of resistance and elastance were obtained before and after ovalbumin challenge in C and ER groups and before and after Acetylcholine challenge in all groups. Using morphometry, we assessed the density of eosinophils and smooth muscle cells, as well as collagen and elastin content in lung strips. The baseline and post-agonist values of resistance and elastance were increased in ER, L1 and L2 groups compared with C (p = 0.001). The morphometric analysis showed an increase in alveolar eosinophil density in ER and L2 groups compared with C group (p < 0.05). There was a significant correlation between eosinophil density in parenchymal strips of C, L1 and L2 groups and values of resistance and elastance post-Acetylcholine (r = 0.71, p = 0.001 and r=0.74, p < 0.001, respectively). The results show that the lung parenchyma is involved in the late response of this guinea pig model of chronic allergic inflammation and the constriction response in this phase is related to the eosinophilic inflammation.

I NTRODUÇÃO: A refratariedade aos inibidores da bomba de prótons (IBP) tem sido o grande desafio dos gastroenterologistas. Este trabalho visa caracterizar os pacientes que persistem com sintomas típicos de doença do refluxo gastroesofágico (DRGE), em uso de inibidores de bomba de prótons em doses de, pelo menos 40mg/dia, quanto aos aspectos demográficos, clínicos e laboratoriais, determinando-se a freqüência da persistência de refluxo ácido pela pH-metria esofágica de 24h. Secundariamente procurouse determinar a freqüência da esofagite eosinofílica nessa população. MÉTODO: Foram entrevistados 110 pacientes que apresentavam persistência de sintomas de pirose e/ou regurgitação em uso de pelo menos 40 mg de IBP por pelo menos 6 semanas. Os mesmos foram submetidos à endoscopia digestiva alta (EDA) com biópsia esofágica, manometria, pHmetria esofágica de duplo canal e exames laboratoriais. RESULTADOS: Dos pacientes avaliados, 77,3% eram do sexo feminino, com média de 46 anos e predomínio de baixa escolaridade. Apenas 10,9% eram tabagistas, 55% apresentavam índice de massa corpórea (IMC) acima de 25Kg/m2, sendo o IMC médio de 27Kg/m2. Entre as comorbidades, as mais freqüentes foram: alergias (72,7%); hipertensão arterial (34,5%), asma (18,2%), depressão (29,1%) e fibromialgia (8,2%), sendo estas duas últimas maiores que a encontrada na população geral. Observou-se freqüência elevada de sintomas dispépticos (70% dos pacientes relataram epigastralgia e 70% plenitude pós-prandial), disfagia (60,9%); globus (37,3%), tosse (37,3%) e dor torácia não cardíaca (30,9%). Apenas 16,4% evidenciavam à endoscopia, lesão em corpo esofágico e 23,6% hérnia de hiato. A maioria dos pacientes (61,8%) apresentava alguma alteração à manometria esofágica. Encontrou-se, entre os pacientes estudados, 24,6% com pHmetria positiva (8,1% no canal distal e 16,45% no proximal) e 75,4% com pH-metria normal. Comparando-se os resultados desses dois grupos de pacientes (pH-metria positiva e normal), segundo as variáveis estudadas, apenas a presença de lesão no corpo esofágico à endoscopia e a elevada escolaridade evidenciaram associação com persistência de pH-metria positiva (p: 0,0061 OR: 4,11 IC: 1,43:11,84 e p: 0,0237 OR: 2,74 IC: 1,13: 6,67 respectivamente). Ao se comparar presença de sintomas atípicos com a presença de refluxo ácido (no esôfago proximal versus distal), apenas globus apresentou associação com pH-metria positiva no canal proximal. Foi diagnosticado um único caso de esofagite eosinofílica entre os pacientes com sintomas típicos de DRGE refratários ao IBP. CONCLUSÃO: DRGE refratária predomina em mulheres de meia idade, associada à alta freqüência de história de alergia, depressão, fibromialgia e sintomas dispépticos. Segundo os resultados da pH-metria, a presença de esofagite erosiva em uso do IBP ou elevada escolaridade foram os únicos fatores de risco para a persistência de refluxo ácido nos dois canais, e globus no canal proximal. Não se observou diferença entre os pacientes com pH-metria positiva ou normal quanto às demais variáveis, até mesmo sintomas dispépticos. É baixa a freqüência de esofagite eosinofílica entre pacientes com pirose e/ou regurgitação refratários ao inibidor da bomba de próton / BACKGROUND: Proton pump inhibitor (PPI) refractory patients have been a big challenge to gastroenterologists. The aim of this study was to characterize the patients that had gastroesophageal reflux disease (GERD) persistent typical symptoms, undergoing PPI medication, administered at a dose of at least 40 mg/day, according to demographic, clinical and laboratory aspects. The primary outcome was to determine the frequency of acid reflux persistence based on the 24-hour esophageal pH-metry result. The secondary outcome was to determine, the frequency of eosinophilic esophagitis in the same population. METHODS: We interviewed 110 patients that presented persistence of heartburn and/or regurgitation symptoms and were undergoing treatment with PPI at a minimum dose of 40 mg/day for at least six weeks. They underwent upper gastrointestinal endoscopy with esophageal mucosa biopsy, esophageal manometry and double probe 24- hour esophageal pH-metry, as well as laboratory tests. RESULTS: 77.3% of the evaluated patients were female, with mean age of 46 years old, and most of them with low educational level. Only 10.9% were tobacco smokers and 55% had body mass index (BMI) greater than 25Kg/m2, showing mean BMI of 27Kg/m2. The most frequent comorbidities were allergy (72.7%), arterial systemic hypertension (34.5%), asthma (18.2%), depression (29.1%) and fibromyalgia (8.2%). Comparing the general population and the group of patients, a higher frequency of depression and fibromyalgia was observed. Some symptoms were found in high frequency: dyspeptic symptoms (70% associated with epigastric pain and 70% with postprandial fullness), dysphagia (60.9%), globus and cough (37.3% each) and no-cardiac chest pain (30.9%). By endoscopy, only 16.4% showed esophageal body lesion and 23.6% hiatal hernia. Most patients (61.8%) presented some alteration in esophageal manometry. Among studied patients, 24.6% had abnormal pHmetry (8.1% in distal probe and 16.45% in the upper probe) and 75.4%, a normal result. When comparing normal to abnormal pH-metry patients according to studied variables only the presence of esophageal body lesion, observed by endoscopy, and high educational level were associated to the persistence of abnormal pH-metry (p: 0.0061; OR: 4.11; IC: 1.43:11.84; and p: 0.0237; OR: 2.74; IC: 1.13: 6.67; respectively). When comparing atypical symptoms with the presence of acid reflux (proximal versus distal esophagus) only globus was associated with abnormal upper probe pHmetry. Only one patient was diagnosed with eosinophilic esophagitis among the total sample with typical gastroesophageal reflux symptoms refractory to PPI treatment. CONCLUSION: Refractory GERD was predominant in middleaged females, associated with high frequency of previous allergy, depression, fibromyalgia and dyspeptics symptoms. The risk factors to the persistence of acid reflux in the two pH-metry probes and to the symptom of globus in the upper pH-metry probe were the persistence of erosive esophagitis in patients undergoing treatment with PPI an a higher educational level. No differences between abnormal or normal pH-metry results patients were found regarding the other variables, such as dyspeptic symptoms. The frequency of eosinophilic esophagitis was low in heartburn and/or regurgitation in PPI refractory patients

Orientador : Edson Antunes / Tese (Doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-22T00:23:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SquebolaCola_DalizeMaria_D.pdf: 2153841 bytes, checksum: 6875f2a61e54f0142d388da72f0f97be (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O Staphylococcus aureus é um tipo de bactéria gram-positiva que produz e secreta uma série de enterotoxinas com propriedade imunomoduladoras. Estudos epidemiológicos mostraram que S. aureus exacerba doenças respiratórias alérgicas, aumentando também o risco de manifestação das mesmas. Entretanto, pouco é conhecido sobre os mecanismos envolvidos na exacerbação do influxo celular observado em indivíduos asmáticos expostos a enterotoxinas estafilocócicas. Sendo assim, o objetivo desse trabalho foi aprofundar o conhecimento sobre os mecanismos responsáveis pela exacerbação da resposta inflamatória pulmonar alérgica em camundongos pré-expostos à enterotoxinas estafilocócicas dos tipos A e B (SEA e SEB) respectivamente. Foram também investigados os efeitos da SEA e SEB na função eosinofílica in vitro (adesão e quimiotaxia). Utilizamos animais pré- expostos à SEA (4 a 48 h) ou SEB (4 a 24 h) antes do desafio com OVA. A pré-exposição à SEA (12 h, 24 h e 48 h) aumentou significativamente o número de eosinófilos no tecido pulmonar em animais desafiados com OVA, o qual foi acompanhado por aumento dos níveis de eotaxina no tecido pulmonar. Na medula óssea, observamos aumento do número de eosinófilos em (24 h e 48 h) acompanhado de aumento dos níveis de IL-5 e eotaxina, e uma redução da expressão de CCR3 e VLA-4 e redução da adesão de eosinófilos a ICAM-1 e VCAM-1. No sangue periférico observamos eosinofilia em 4 h, 12 h e 24 h, retornando aos níveis basais em 48 h. Em relação à SEB observamos um aumento de eosinófilos no tecido pulmonar de animais pré-expostos a esta enterotoxina (4 h, 12 h e 24 h) e desafiados com OVA. O infiltrado eosinofílico pulmonar foi acompanhado de aumento dos níveis de eotaxina e IL-8 e diminuição de IL-4 e IL-6. Na medula óssea observamos um aumento do número de eosinófilos, o qual não foi acompanhado dos níveis de IL-5 e eotaxina. Concluímos que exposição das vias aéreas a SEA potencializa o influxo eosinofílico pulmonar em animais desafiados com OVA, por mecanismos dependentes de IL-5 e eotaxina. Na medula óssea, observamos ainda diminuição da expressão de CCR3 e VLA-4 e prejuízo da adesão celular para VCAM-1. A pré-exposição à SEB também aumenta o influxo eosinofílico pulmonar alérgico provavelmente por mecanismos envolvendo a eotaxina. Na medula óssea, se observou elevação do número de eosinófilos por mecanismos independentes de IL-5 e eotaxina. Para se estudar o efeito direto das enterotoxinas estafilocócicas (EEs) em eosinófilos humanos, realizou ensaios funcionais (quimiotaxia e adesão), análise da fosforilação da p38 MAPK e mobilização de cálcio intracelular. A incubação de eosinófilos com SEA (3 ng/ml) diminuiu a quimiotaxia de eosinófilos em resposta à eotaxina (300 ng/ml), PAF (10-5 M) e RANTES (100 ng/ml) em todos os tempos (0,5 h, 2 h e 4 horas), e as concentrações estudadas (0,5; 1 e 3 ng/ml). Em relação à SEB (30 ng/ml), não notamos diferenças na resposta quimiotática, exceto para a concentração de 1 ng/ml, que foi capaz de inibir a quimiotaxia em resposta à eotaxina. A incubação com SEA e SEB diminuiu a adesão de eosinófilos ativados com eotaxina em placas recobertas com ICAM-1 e VCAM-1. A incubação com SEA e SEB diminuiu a fosforilação da p38 MAPK e a mobilização de cálcio em resposta à eotaxina. Sendo assim, nós concluímos que SEA e a SEB modula negativamente a resposta de eosinófilos humanos in vitro / Abstract: Gram-positive Staphylococcus aureus releases classical enterotoxin which aggravates allergic airway diseases. However, little is known about the mechanisms underlying the cell influx exacerbation in asthmatic individuals under exposure to Staphylococcal enterotoxins. Recent study in our group showed that SEA pre-exposure in OVA challenge mice increase the eosinophils influx for lung tissues and broncoalveolar lavage (BAL) and also increase the eosinophils number in bone marrow. These eosinophils increases in BAL were accompanied for increase of the TNF? and eotaxin. Therefore, the objective of the study, was deepen the know about the responsible mechanisms of the SEA and SEB exacerbation in allergy pulmonary inflammation mice. Were investigated also, the effects of SEA and SEB in eosinophils functions (chemotaxis and adhesion). Mice were exposed to SEA at 4 h, 12 h, 24 h, 48 h and SEB 4 h, 12 h and 24 h prior to OVA challenge or prior PBS instillation. The SEA pre-exposed 12 h, 24 h and 48 h increase the eosinophils number in the lung tissues and in 48 h of the BAL. This increased was preceded of the high eotaxin levels. In the bone marrow we observed a increased of eosinophils number in 24 h and 48 h of SEA pre-exposed, accompanied of the IL-5 and eotaxin increase and the CCR3 and VLA-4 dowregulation and decrease of the eosinophils adhesion function. In blood, we observed an increase of eosinophils number in 4 h, 12 h and 24 h of the SEA pre-exposed returned in the basal levels in 48 h. In relation of SEB, we observed of the pre-exposed of SEB in OVA challenge mice increased of eosinophils number in lung tissues in all the study time (4 h, 12, and 24 h). In the BAL, we observed of the SEB pre-exposed increased the eosinophils number only in 4 h in OVA challenge mice. Also in pulmonary ambit, we observed a high eotaxin (4 h, 12 h) and IL-8 (4 h) levels and a decreased of the IL-4 and IL-6 in all the study time. In bone marrow, the SEB pre-exposed of the 4 h and 12 h, increase the eosinophils number in OVA challenge mice, not accompanied of the high IL-5 and eotaxin levels. In the first part, airways exposure to SEA produces a marked eosinophil recruitment to the lung tissue of allergic mice that is clearly detected at prolonged times of this enterotoxin exposure (24 and 48 h before OVA challenge). Eosinophils accumulate in BM at these same time-periods of SEA exposure through IL-5- and CCR3-dependent mechanisms, along with down-regulation of CCR3 / VL4 and impaired cell adhesion to VCAM-1. On the other hand, eosinophils time-dependently disappear from circulating blood after SEA exposure. Already the airways exposure to SEB produces a marked eosinophil recruitment to the lung tissue of allergic mice that is clearly detected at early times of this enterotoxin exposure and increase of eosinophils number in BM at these same time-periods of SEB exposure through IL-5 and eotaxin-independent mechanisms. It is likely that alterations of BM function are an early step for the progression of asthmatic disease and exacerbation by Staphylococcal enterotoxin. Understanding the mechanisms that regulates bone marrow eosinophil mobilization and its trafficking to the peripheral circulation and airways in allergic animals may be important for the development of effective asthma therapies in conditions of Staphylococcal superantigen exposure. To study the direct effects of the SEs in eosinophils performed the functional assays (chemotaxis and adhesion), p38 MAPK phosphorylation and calcium mobilization. The number of migrated eosinophils was significantly decrease in eosinophils incubated with SEA in the times (30 min, 2 h and 4 h) and SEA concentration (0,5, 1 and 3 ng/ml) to chemotaxis agent, eotaxin, and RANTES, compared with control eosinophils. In relation of the SEB (30 ng /ml), not differences in chemotaxis was found. Only in the SEB concentration of the 1 ng/ml observed decrease of chemotaxis in eotaxin response. In the adhesion, we observed a decreased in eosinophils incubated with SEA and SEB in response of ICAM-1 and VCAM-1. The p38 MAPK phosphorylation and calcium mobilization was decrease in eosinophils incubated with SEA and SEB in eotaxin response. Therefore, we conclude that SEA and SEB was capable of the dowregular of the human eosinophils response / Doutorado / Farmacologia / Doutora em Farmacologia