Orientador: Edson Antunes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-23T06:56:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zanardo_RenataCristinaOnishi_M.pdf: 1046055 bytes, checksum: ded086ce156cc17b6aa9966b8a0c660f (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: Nossos resultados demonstram que, utilizando anticorpo monoclonal de camundongo através de imunohistoquímica, eosinófilos peritoneais de rato expressam a NOS II (30.2 +/- 11.6%) e III (24.7 +/- 7.41%). A migração de eosinófilos in vitro foi avaliada usando-se uma microcâmara de quimiotaxia de 48 poços, e os agentes quimiotáxicos empregados foram N-formil-metionil leucil-fenilalanina (fMLP, 5 x '10 POT. -8 M') e leucotrieno 'B IND. 4' ('LTB IND. 4', '10 POT. -8 M'). O L-NAME (mas não o D-NAME) inibiu significativamente a migração de eosinófilos induzida pelo fMLP (54% de redução para a concentração de 1.0 mM; P<0.05) e 'LTB IND. 4' (61 % de redução para a concentração de 1.0 mM; P<0.05). Os inibidores da NOS II, AMT e TRIM, também atenuaram marcadamente (P<0.05) a migração induzida pelo fMLP (52% e 38% de redução para a concentração de 1.0 mM, respectivamente) e 'LTB IND. 4' (52% e 51 % de redução para a concentração de 1.0 mM, respectivamente). O ODQ (inibidor da guanilato ciclase solúvel), nas concentrações de 0.01 e 0.1 mM, também inibiu significativamente a migração de eosinófilos induzida pelo fMLP. A inibição da migração de eosinófilos pelo L-NAME foi revertida pelo nitroprussiato de sódio (0.1 mM) ou pelo dibutiril GMP cíclico (1 mM). Concluímos que os eosinófilos peritoneais de rato expressam NO sintase(s), e que este mediador desenvolve um papel essencial na locomoção destas células, agindo através de um mecanismo de transdução de GMP cíclico / Abstract: Our results demonstrate that rat peritoneal eosinophil strongly expresses both type II (30.2 +/-11.6%) and type III (24.7 +/- 7.41%), as detected by immunohistochemistry using affinity purified mouse monoclonal antibodies. Eosinophil migration in vitro was evaluated using a 48-well microchemotaxis chamber and the chemotactic agents employed were N-formyl-methionyl-leucylphenylalanine (fMLP, 5 x '10 POT. ¿8' M) and leukotriene 'B IND. 4' ('LTB IND. 4', '10 POT. ¿8' M). L-NAME (but not D-NAME) significantly il")hibited the eosinophil migration induced by both fMLP (54% reduction for 1.0 mM; P<0.05) and 'LTB IND. 4' (61 % reduction for 1.0 mM; P<0.05). The type II NOS inhibitors AMT and TRIM also markedly (P<0.05) attenuated fMLP- (52% and 38% reduction for 1.0 mM, respectively) and 'LTB IND. 4' (52% and 51 % reduction for 1.0 mM, respectively). The inhibition of eosinophil migration by L-NAME was mimicked by the soluble guanylate cyclase inhibitor, ODQ (0.01 and 0.1 mM) and reversed by either sodium nitroprusside (0.1 mM) or dibutyryl cyclic GMP (1 mM). In conclusion, the eosinophil does express NO synthase(s) and this mediator plays an essential role for eosinophillocomotion, , by acting through a cyclic-GMP transduction mechanism / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-03-15T04:05:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 337678.pdf: 8258436 bytes, checksum: 67a6ef5115efff20ad348e0c04dc547b (MD5) Previous issue date: 2015 / A chegada dos neutrófilos até o foco da inflamação desenvolve papelessencial na resposta inflamatória. Além de serem uma populaçãocelular fundamental para conter e eliminar o patógeno, seu acúmulo levaao dano tecidual uma vez que essas células não são capazes dediscriminar entre as células do hospedeiro e o agente causador dainflamação Neutrófilos se acumulam no local da inflamação através deuma série de eventos sequenciais, entre eles a quimiotaxia. Aquimiotaxia é responsável por guiar os neutrófilos até o foco exato dainflamação. Estudos experimentais demonstram que a proteína de faseaguda Alfa-1-glicoproteína ácida (AGP) é capaz de interferir nesseprocesso, pois inibe o rolamento, a adesão e a migração dos neutrófilosin vivo, assim como a quimiotaxia in vitro. Altamente glicosilada,aproximadamente 12% dos carboidratos da AGP são de ácido siálico.Dentre os receptores que reconhecem os ácidos siálicos estão as lectinasdo tipo Siglecs (Sialic acid binding Ig-like lectins). Siglecs apresentamem sua estrutura um domínio inibitório capaz de interferir na respostaintracelular ativada por outros receptores. Assim, a hipótese deste estudoé de que os resíduos de ácido siálico presentes na estrutura da AGPseriam responsáveis pela ativação de Siglec-5 e/ou 9, inibindo aquimiotaxia dos neutrófilos. Para investigar essa hipótese, foi geradauma AGP desialilada sem a presença desse carboidrato. Neutrófilostratados com essa proteína foram submetidos a um ensaio dequimiotaxia em câmara de Boyden. Esse ensaio revelou que a retiradado ácido siálico reverteu o perfil inibitório induzido pela proteínasialilada. Ainda mais, os resultados demonstram que o ácido siálico emsua forma livre também foi capaz de inibir a quimiotaxia de maneiraequivalente à AGP. Sabendo que a AGP é capaz de ligar-se à superfíciedos neutrófilos, procurou-se investigar se essa interação ocorre atravésda ligação do ácido siálico à Siglec-5 ou 9. Para isso foi feita umacitometria de fluxo e avaliada a intensidade de fluorescência emitidapela AGP ou por anticorpos fluorescentes anti-hSiglec-5 e 9, quando napresença de anticorpos neutralizantes hSiglec-5 e 9 ou da AGP nãomarcada, respectivamente. No entanto nenhuma diferença na média deintensidade de fluorescência foi observada. Em conjunto nossoresultados sugerem que o reconhecimento do ácido siálico é necessáriona inibição da quimiotaxia induzida pela AGP.<br> / Abstract : Neutrophil recruitment has a central role in host response and inresolution of inflammation, but if uncontrolled can lead to severe tissuedamage. Overwhelming activation of neutrophils result in aninappropriate infiltration of neutrophils known to elicit cell and tissuedamage that can lead to an organ dysfunction. The acute phase proteinAlpha-1-acid glycoprotein (AGP) was shown to inhibit neutrophilmigration, rolling and adhesion in vivo. AGP also inhibits neutrophilchemotaxis in vitro, and evidence suggests that AGP terminal sialic acidresidues interact with an inhibitory receptor known as Siglec (Sialicacid-binding immunoglobulin-like). However, how AGP affectsneutrophil-response is not completely understood. In this study, weexamine mechanisms related to the effect of AGP on neutrophilchemotaxis responses, and we hypothesized that Alpha-1-acidglycoprotein inhibits neutrophil chemotaxis in vitro by Siglec-5 e/or 9activation. AGP 6µM inhibits neutrophil migration in vitro, as does6µM of sialic acid, when compared with control neutrophils.Neuraminidase treatment of AGP reversed the suppressive effect of theprotein. To investigate how AGP interacts with neutrophils, flowcytometry analyses using AGP labeled with Alexa Fluor 488 andhSiglec-5 and 9 neutralizing antibodies, or AGP and hSiglec-5 and 9fluorescent antibodies were used. Although no difference in the MFIwas observed. Taken together these results suggest that sialic acidrecognition is required for its inhibitory function, and that the interactionof AGP with neutrophils depend on this carbohydrate. However, thisstudy was not able to determine if this interaction was due to the ligationof AGP sialic acid to the receptor Siglec-5 and/or -9.

Orientador : Maria Marluce dos Santos Vilela / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-31T15:01:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Amoras_AnaLidiaBraga_M.pdf: 16753114 bytes, checksum: d704d73dbf02424f587fbb18b6726b51 (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: A Imunodeficiência Comum Variável (ICV) é uma sindrome incompletamente definida, caracterizada por defeito na formação de anticorpos. Devido ao fato da ICV apresentar ainda inúmeros pontos não esclarecidos, propusemo-nos analisar evolutivamente a apresentação clinico-laboratorial de 17 pacientes com diagnóstico de ICV, em seguimento no Ambulatório de Imunologia-Alergia e Pneumologia do Hospital de Clinicas da Universidade Estadual de Campinas(Unicamp). Os pacientes foram avaliados quanto à idade de início dos sintomas e à forma de apresentação clinica e imunológica. A função fagocitária de monócitos foi avaliada in vitro através da quimiotaxia, fagocitose mediada via Fc, CRI e CR3 e atividade do sistema NADPH oxidase. A concentração dos níveis séricos de IgM, IgG, IgA e subclasses de IgG foi determinada por nefelometria e as subpopulações linfocitárias e células NK por citometria de fluxo. Todos os pacientes apresentaram as primeiras manifestações clinicas antes dos quatro anos de idade, evoluíram com infecções de repetição e, em 8 pacientes havia associação de manifestações gastrointestinais e em 7 fenômenos autoimunes. Ao diagnóstico, a média da concentração de IgM, IgG e IgA foi 17 mg/dl, 365 rng/dl e 7,85 mg/dl, respectivamente. Observou-se nos pacientes com ICV, redução significativade todas as subclassesde IgG (IgGI, p=0,0001; IgG2, p=0,002; IgG3, p=0,006 e IgG4, p=0,0001), em relação ao grupo controle. A porcentagem de células NK foi significantemente reduzida (P=0,006) quando comparada aos indivíduos normais. A porcentagem de células-T CD3+(p=0,013)e CD8+ (P=0,004)foi significantemente aumentada e a relação CD4/CD8 (P=0,013) foi significantemente reduzida nos pacientes com ICV em relação ao grupo controle. Entretanto, a porcentagem de células-T CD4+ não demonstrou diferença entre os doisgrupos. Redução do número de' células-B circulantes com valores inferiores a 2% foi observado em 47% dos pacientes com ICV. A fagocitose mediada via Fc, CRI, CR3 (p=0,0001)de monócitos e quimiotaxia (p=0,0027)foram significantemente reduzidas nos pacientes com ICV em relação ao controle normal. Entretanto, não houve diferença na produção de ânion superóxido entre os dois grupos. Devido a heterogeneidade de apresentação clínica entre nossos pacientes e dos relatados na literatura sugere-se que a ICV possa ser a expressão fenotípica de várias doenças, e que defeitos na quimiotaxia e fagocitose de monócitos podem ser caracterizados em um grupo de pacientes, determinando uma nova direção na fisiopatologiada ICV / Abstract: Common variable immunodeticiency is an incompletely detined syndrome, characterized by a defect in antibody formation. Since CVI presents numerous, as yet unclarified, defects we proposed to analyze the evolution of the clínical-laboratorial presentations of 17 patients diagnosed with CVI from the Immunology-Allergy and Pneumology Clínic ofthe Hospital de Clínicas at the State University of Campinas, Brazil. The patients were evaluated according to their age at the initiation of symptoms and their clínical and immunological evolutional presentation. Blood monocyte phagocytic functions were evaluated in vitro by chemotaxis, phagocytosis mediated by Fc, CRI and CR3 and NADPH-oxidase activity. Concentrations of the serum levels of IgM, IgG, IgA and subclasses of IgG were determined by nephelometry and the lymphocyte subset and NK cells were evaluated by flow cytometry. All the patients presented initial clínical manifestations before four years of age, developing repeated infections and, in 8 patients, there was an association of gastrointestinal manifestations and 7 patients presented autoimmune phenomenons. At the time of diagnosis, the mean concentrations of IgM, IgG and IgA were 17.0 rng/dL, 365.0 mg/dL and 7.85 rng/dL, respectively. In CVI patients, significant reductions in all the subclasses of IgG (IgGI, p=0.0001;IgG2, p=0.002; IgG3, p=0.006 and IgG4, p=0.0001) were observed in relation to the control group. The elative number of NK cells was significantly reduced (p=0.006) whencompared with normal individuals. The percentage of CD3+ (p=0.013) and CD8+ T cells (p=0.004) were significant1yreduced in patients with CVI in relation to the control group. However a percentage of CD4+ T cells did not demonstrate any differences between the two groups. A reduction in the number of circulating B cells was also observed, with values lower than 2 % in 47 % of the patients with CVI. Phagocytosis measured via Fc, CRI, CR3 (p=0.0001) of monocytes and chemotaxis (p=0.0027) were significant1yreduced in the patients with CVI in relation to the normal controls. However, there was no difference in the superoxide production between the two groups. Due to the heterogeneity of the clinicalpresentations of our patients and those related by the literature, it may be suggested that CVI may be a phenotypic expression of various diseases and that the defects in the chemotaxis and phagocytosis of monocytes may be characterized in a group of patients, determining a new direction in the physiopathology of CVI / Mestrado / Pediatria / Mestre em Saude da Criança e do Adolescente

Orientador: Edson Antunes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T00:30:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moreira_Juliana_M.pdf: 6595425 bytes, checksum: 59be7d31d2a9cdf5b54ea675fec4f3f8 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Os eosinófilos estão envolvidos no processo de defesa do organismo contra infecções parasitárias e na patogênese de doenças alérgicas, imunológicas e neoplásicas. Estudos anteriores demonstraram a existência de uma via funcional NO/GMPc em eosinófilos de rato e humano que modulam a locomoção deste tipo celular. Os nucleotídeos cíclicos são capazes de modular o processo de ativação de leucócitos, mas seu papel na locomoção é ainda controverso. Este estudo foi realizado para investigar os efeitos do 5-ciclopropil-2-[1-(2-fluor-benzil)-1Hpirazolo[ 3,4-b]piridina-3-il]-pirimidina-4-ilamina (BAY 41-2272) sobre a quimiotaxia de eosinófilos humanos induzida por formil-metionil-Ieucil-fenilalanina (fMLP; 10-7 M) e também sobre os níveis de guanosina-3',5'-monofosfato cíclico (GMPc) e adenosina-3',5'-monofosfato cíclico (AMPc). Os eosinófilos foram incubados com BAY 41-2272 (0,1-10,0 J.LM)por um período de tempo curto (10 min) ou prolongado (90 min). A exposição dos eosinófilos ao BAY 41-2272 tanto por 10 ou 90 min inibiu acentuadamente a quimiotaxia destas células. Na concentração de 1 J.LMde BAY 41-2272, a inibição da quimiotaxia foi em torno de 50%, independente se as células foram incubadas por 10 ou 90 min com este composto. A exposição dos eosinófilos por 90 min ao BAY 41-2272 (1 J.LM)resultou em significante aumento dos níveis de GMPc e AMPc (7,1 :!: 0,2 e 94,8 :!: 1,5 nMl1,5 X 106cels, respectivamente) comparado com o protocolo de 10-min (3,0 :!: 0,2 e 47,3 :!: 1,3 nM/1,5 X 106cels, respectivamente). O aumento dos níveis de GMPc produzidos BAY 41-2272 foi abolido pela pré-incubação dos eosinófilos com o inibidor da guanilato ciclase solúvel 1H-[1,2,4]-oxidiazol[4,3-a] quinoxalin-1-one (ODQ). De acordo com o ensaio de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difenil tetrazolio bromida (MTT), não foi observado qualquer efeito citotóxico sobre os eosinófilos em nenhuma das condições experimentais utilizadas. Nossos resultados mostram que o efeito inibitório do BAY 41-2272 sobre a quimiotaxia de eosinófilos humanos induzida por fMLP em tempo curto ou prolongado de incubação, é acompanhado por significante elevação de GMPc e AMPc, mas nós não detectamos uma correlação direta entre a inibição de quimiotaxia e elevação dos níveis de nucleotídeos cíclicos / Abstract: Eosinophils are implicated in human defense mechanism against inflammatory disorders such as allergy, immunological and neoplasic diseases. Previous studies demonstrated a functional NO-cGMP pathway in the rat and human eosinophils that modulate the locomotion of this cell type. Cyclic nucleotides are able to modulate the processes responsible for leucocyte activation, but its role on eosinophillocomotion is still controversial. This study was designed to investigate the effects of the 5-cyclopropyl-2 [1-(2-fluoro-benzyl)-1Hpyrazolo[ 3,4-b]pyridin-3-yl]-pyrimidin-4-ylamine (BAY 41-2272) on formyl- . methionyl-Ieucyl-phenylalanine (fMLP; 10-7 M)-induced human eosinophil chemotaxis, cyclic guanosine-3',5'-monophosphate (cGMP) and cyclic adenosine- 3',5'-monophosphate (cAMP) levels. Human eosinophils were exposed to BAY 41- 2272 (0.1-10.0 J.1M) for either short (10 min) or prolonged (90 min) time periods. Exposition of eosinophils to BAY 41-2272 for either 10 or 90 min markedly inhibited the eosinophil chemotaxis. At 1 J.1Mof BAY 41-2272, inhibition of fMLP-induced eosinophil chemotaxis was about of 50% irrespective if cells were exposed for 10- or 90 min with this compound. Incubation of eosinophils for 90 min with BAY 41- 2272 (1 J.1M)resulted in significantly higher cGMP and cAMP levels (7.1 :!: 0.2 and 94.8 :!: 1.5 nMl1.5 X 106 cells, respectively) compared with the 10-min protocols (3.0 :!: 0.2 and 47.3 :!: 1.3 nM/1.5 X 106 cells, respectively). The BAY 41-2272- induced cGMP increases were abolished by pre-incubation of eosinophils with the soluble guanylate cyclase inhibitor -[1,2,4]-oxidiazolo[4,3-a] quinoxalin-1-one (ODQ). No eosinophil toxicity was observed in any experimental condition, according to 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay. Our findings show that inhibitory effects of fMLP-induced human eosinophil chemotaxis by BAY 41-2272 at short-term or prolonged exposition are accompanied by significant elevations of cGMP and cAMP, but we could not detect a direct correlation between chemotaxis inhibition and elevation of cyclic nucleotide levels / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Farmacologia

Orientadores: Mary Luci de Souza Queiroz, Giselle Zenker Justo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-25T19:39:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Melo_Adrianade_M.pdf: 2789353 bytes, checksum: 87cf638a789bb737a520a262c9ac8b40 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: Neste trabalho, investigamos os efeitos imunomoduladores do composto MAPA nas atividades fagocitária, lítica e quimiotática de neutrófilos frente aos antígenos Candida albicans e Candida kefyr in vitro, bem como sobre o crescimento e diferenciação de células progenitoras hematopoiéticas da medula óssea para a série granulócito-macrófago (CFU-GM) de animais infectados com Listeria monocytogenes. A capacidade fagocitária apresentou-se aumentada com todas as concentrações de MAPA utilizadas (25, 50, 75 e 1000 j.lg/mL) frente à C. albicans. Por outro lado, em presença de C. kefyr houve um aumento com as três maiores concentrções (50, 75 e 1000 f.lg/mL). Quanto à capacidade lítica, houve um aumento nas três menores concentrações frente à C. albicans e com as três maiores concentrações frente à C. kefyr, indicando uma ação do composto na aderência dos fagócitos, bem como no processo de desgranulação de neutrófilos. A capacidade do neutrófilo de reduzir o corante nitroblue tetrazolium apresentou-se aumentada nas duas maiores concentrações testadas (50 e 75 f.lgfmL), sugerindo uma ação do composto MAPA na produção de óxido nítrico. A quimiotaxia foi utilizada para o estudo quantitativo da locomoção de leucócitos polimorfonucleares, quando incubados com as concentrações de 25, 50 e '75 j.lgfmL de MAPA. Esta atividade apresentou-se aumentada apenas quando as células polimorfonucleares foram incubadas com a concentração de 75 j.lgfmL. Para a realização dos experimentos in vivo os animais foram tratados por 7 dias, consecutivos nas doses de 0,5; 2,0; 5,0 e 7,5 mglKg de MAPA. Ao final do tratamento, os animais foram infectados com uma dose subletal de Listeria monocytogenes. Após a infecção ocorreu uma diminuição dos números de CFU-GM na medula óssea dos animais. Os animais previamente tratados com MAPA apresentaram um aumento no número de CFU-GM da medula óssea com as doses de 2,0 e 5,0 mg/Kg às 48 e 72 horas após a infecção, em relação ao controle e ao grupo infectado. Para avaliar a resistência destes animais à infecção pela L. monocytogenes realizamos uma curva de sobrevida, utilizando uma dose letal da bactéria (3 x 108 bactérias/animal). Trinta e quarenta por cento dos animais previamente tratados com as doses de 0,5 e 5,0 mgIKg de MAPA, respectivamente, sobreviveram à dose letal da L. monocytogenes, enquanto 100% dos animais do grupo controle infectado morreram em oito dias. No entanto, com 7,5 mg/Kg de MAPA todos os animais morreram em até oito dias, não havendo proteção contra a infecção. Diante dos resultados obtidos neste trabalho, podemos sugerir que o composto MAPA aumenta a resistência dos camundongos BALB/c infectados com a L. monocytogenes através do aumento dos precursores hematopoiéticos da medula óssea / Abstract: ln this work, we investigated the effeets of MAPA on the immune response. We have stlldied the neutrophils exposed to these eompound of six normal individuaIs. Phagoeytosis and killing of Candida albicans and Candida ke.fyr by neutrophils, neutrophil ehemotaxis and nitroblue tetrazolium reduetion were measured. The results obtained demonstrated - an inerease in the phagoeytie funetion of neutrophils in exposed to MAPA. On the other hand, lysis of C. albicans and C. kefyr by neutrophils was signifieantly inereased. We also observed a signifieant inerease of nitroblue tetrazolium reduetion and neutrophil ehemotaxis in these eells. e also investigated the effeets of magnesium ammonium phospholinoleatepalmitoleate anhidryde (MAPA), a roteie aggregated polymer isoleted from Aspergillus orizae, on the growth and differentiation of granuloeyte-maerophage progenitor eells (CFU-GM) in normal and Listeria monocytogenes infeeted miee. MAPA was administred subeutaneously (0.5-7.5 mg/Kg) for 7 days. ln the MAPA treated/infeeted groups L. monocytogenes was administred at the end of MAP A treatment. A signifieant reduetion in the numbers ofCFU-GM was observed at 48 h after the infection, followed by a slight restoration at 72 h. Treatment of, these animaIs previously to infection stimulated marrow myelopoiesis in a dosedependent manner. The 5.0 mg/Kg MAPA was the optimal biological aetive dose in infected mice and this dose shedule also stimulated myelopoiesis in normal mice. The 0.5 and 5. O mg/Kg doses given prior to in.fection with a lethal dose of 3 x 108 bacterialanimal led to a 30% and 40% survival, respectively. These results demonstrated that MAPA produces a significant increase in the resistanee of the animaIs infeeted with L. monocytogenes, and that this protection is due, at least in part to increased CFU-GM in the bone marrow ofinfeeted animals / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Gilberto De Nucci / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-21T11:21:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cajina_ErnaldoBoscoAvalos_M.pdf: 2132806 bytes, checksum: c22f4b8f1404438a4f942a6e1733c1f7 (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: O propósito deste estudo foi de avaliar a quimiotaxia de leucócitos polimorfonucleares (PMNs) in vitro em crianças graves, internadas em uma Unidade de Terapia Intensiva Pediátrica. Organizamos o estudo em três fases: uma fase inicial, composta por 8 pacientes e 8 controles., na qual implantamos a metodologia a ser seguida; a segunda, referida como protocolo "A", constituída de 18 pacientes e 10 controles, onde comparamos a quimiotaxia por grupos diante do agente indutor de quimiotaxia, E. coli (100ug/mL) e a terceira, o protocolo "B", com 7 pacientes e 6 controles onde se avalia a existência de fatores inibidores no soro de pacientes (SP). A coleta de amostras em todos os protocolos ocorreu no mesmo horário. O isolamento dos PMNs foi baseado na técnica de separação por gradientes com dupla densidade (1119 e 1077). Cinco mililitros de sangue periférico foram acrescentados à coluna de gradientes em tubos limpos e centrifugados a 500 x g durante 30 min a 25°C. Feita a separação de células, estas eram lavadas, ressuspendidas 2 vezes numa solução tampão, e a seguir contadas na câmara de Neubauer para serem suspendidas novamente (4 x 106 células/mL). A solução tarooão com DH 7.2. contendo 0.1 g% albumina, HEPES e o meio mínimo essencial de Eagle foi utilizada para a lavagem das células. Na fase inicial trabalhamos exclusivamente com soros não tratados. A incubação foi realizada em uma microcâmara de 48 poços, composta de dois compartimentos, separadas por um fiitro de nitrocelulose de 5 micra. Em cima, no nível superior foram colocados 50?L de células de pacientes e controles, e no inferior 27uL do tampão e dos soros respectivos. Após 60 minutos de incubação a 37°C, em atmosfera umidificada com 5% CO2 a microcâmara foi retirada, o filtro corado e em seguida fixado em lâmina de microscopia, estando apto para ser realizada a leitura. No protocolo "B" foram isolados somente os PMNs de controles., conforme a técnica referida anteriormente. Essas células foram incubadas em soros puros, sendo utilizado o mesmo agente indutor de quimiotaxia, porém em 3 concentrações diferentes e a solução tampão foi o indicador da migração espontânea. Alíquotas de soro de pacientes e controles foram estocadas para dosagem do cortisol e das frações C3c e C4 do complemento sérico. Níveis elevados de cortisol foram observados entre os pacientes (*p<0.01), não existindo porém, correlação com a quimiotaxia dos PMNs. As frações de C3c e C4 do complemento foram normais entre os pacientes, porém o C4 foi significativamente menor nos pacientes do que nos controles (*p<0.05). Vinte por cento dos pacientes apresentaram níveis de C3c inferiores ao normal. A contagem de leucócitos foi maior nos pacientes que nos controles, sem correlação com a atividade migratória (*p<0.05). O protocolo "A" sugere que a quimiotaxia de crianças graves, tanto de patologias infecciosas quanto de não infecciosas está preservada, não sendo detectadas diferenças significativas entre controles e pacientes. O protocolo "B" sugere que exista algum "fator" no soro de pacientes, capaz de reduzir a locomoção de neutrófilos de indivíduos sadios. Estudos posteriores e maiores casuísticas, certamente serão de extrema utilidade para caracterizar melhor os fenômenos observados in vitro e sua correlação com modelos in vivo em crianças graves. / Abstract: This study examined the in vitro chemotaxis of polymorphonuclear leukocytes (PMNs) obtained from critical care children admitted to a pediatric intensive care unit. The investigation was carried out in three stages. In the first, cells from eight patients and eight healthy volunteers were used to standardize the conditions for the chemotaxis assay. For this experiment, only non-activated sera from both the patients and the controls were used. In the second stage (Protocol A), the migration of PMNs from 17 patients and ten healthy individuals in response to E. coli lipopolysaccharide (100?g/mL) was studied, and in the third and final stage (Protocol B), the presence of chemotaxis inhibitors in the sera of seven patients was determined. For this, PMNs from 6 selected donors were incubated with sera from patients and healthy individuals in the presence of a chemo-attractant (E. coli lipopolisaccharide, 10p.g/mL, 30?g/mL and 100?g/mL). Blood sampling for the determination of white blood cell counts and for the quantification of Cortisol, C3c and C4 complement fraction levels were obtained from most patients and healthy individuals. In all cases, the blood samples were collected at the same time of day. PMNs were isolated using a double discontinuous Ficoll-Histopaque gradient and then washed twice in 5 mL of a balanced salt solution containing Eagles minimum essential medium, HEPES (0.85g%) and albumin (0.1 g%), pH 7.2 (adjusted with NaOH). The cells were centrifuged at 400 g for 10 min at room temperature between washes and then re-suspended to a concentration of 4 x 106/ml_ prior to use. The viability of these cells was >90% as determined by vital staining with Turk's solution. Chemotaxis was studied using a 48-well micro-chemotaxis chamber. The bottom chamber of each well contained 25 ?L of the desired chemo-attractant or serum while the upper chamber contained 50 ?L of the appropriate PMN suspension. PMN migration was allowed to proceed for 1 hr at 37°C in humidified air containing 5% C02. At the end of this period, the chambers were disassembled and the filter removed, stained, and the number of migrating cells counted. There was no significant difference in the migration of neutrophils obtained from patients and normal individuals in Protocol A (14.0±2.1 vs 11.2±1.0, respectively, counted in ten high power fields). Protocol B showed that the sera of most patients contained a factor(s) capable of significantly (p<0.05) inhibiting the migration of PMNs from healthy donors. The effect of this inhibitor sera factor(s) was definitely significant (p<0.05), being observed in all the concentrations of LPS mentioned above. The Cortisol levels in the patients (20.6±17 ?g /dL), including the three stages, were significantly (p<0.05) greater than in healthy donors (13.16±1.7 ?g/dL) but did not correlate with the ability of inhibit migration. Likewise, whole leukocyte counts were also higher in patients (9270±2470) than in donors (4400±253). The C3c and C4 complement levels were generally normal in most of the patients, but 20%(6/31) had C3c levels under normality. No significant differences were observed between patients and donors C3c levels. On the other side, although both groups had C4 normal levels, the patients levels (23.37±1.9mg/dL) were significantly (p<0.05) lower than in donors (32.34±3.5mg/dL). Based on the above results, we conclude that the ability of PMN from critical care children to migrate following stimulation is unimpaired but that sera from these individuals contain a factor(s) capable of inhibiting the migration of PMN from normal donors. Hormonal levels, white blood cell counts and complement fraction levels failed to correlate with PMN migration. / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Ciências Médicas

Diachasmimorpha longicaudata (Ashmead) (Hymenoptera: Braconidae) é um dos parasitoides mais utilizados em programas de controle biológico de tefritídeos no mundo. Contudo pouco se sabe sobre a capacidade de aprendizagem e memória deste braconídeo na busca pelo hospedeiro Anastrepha fraterculus (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae). Neste estudo, avaliou-se o tempo de residência (TR) e o parasitismo de fêmeas de D. longicaudata oriundas de larvas de A. fraterculus criadas em dieta artificial, goiaba ou manga e posteriormente, expostas aos odores destes frutos. Foi observada a aprendizagem de fêmeas de D. longicaudata condicionadas na fase adulta aos voláteis de óleo essencial de baunilha (OEB) e de laranja (OEL) e avaliadas, com os mesmos, em testes de quimiotaxia. Também registrou-se a memória deste parasitoide exposto ao OEB. Os insetos utilizados nos experimentos foram mantidos em câmaras climatizadas (25 ± 2 °C, 70 ± 10% UR) na fotofase de 14 horas (adultos) e na escotofase (imaturos). As respostas quimiotáxicas foram registradas com olfatômetro tipo “Y” e o parasitismo (condicionamento na fase imatura), em larvas mantidas em unidades com polpa de goiaba, manga ou sem polpa (controle). Fêmeas do parasitoide criadas em larvas mantidas em dieta artificial foram expostas a OEL ou OEB por 4 horas e a aprendizagem e memória (OEB) avaliadas em olfatômetro, a cada 24 h e por até 72 h. Fêmeas inexperientes de D. longicaudata foram mais atraídas para os voláteis de manga e goiaba em relação ao controle. No entanto, as experientes apresentaram TR maior para os odores dos frutos nos quais se desenvolveram. Contudo, quando os odores destes frutos foram oferecidos simultaneamente, o TR foi maior para os voláteis de manga. O percentual de parasitismo de vespas inexperientes foi maior na presença das polpas e, das experientes, nas larvas que continham os odores aos quais haviam sido condicionadas. O TR de fêmeas inexperientes foi significativamente maior para a acetona do que para os odores dos óleos. Fêmeas experientes em OEB responderam mais a este odor em relação ao controle, entretanto, não houve diferença para os experientes em OEL. A memória ao odor de OEB foi mantida por até 48 h. Concluímos que fêmeas experientes reconhecem odores aos quais se desenvolvem e aos óleos aos quais receberam experiência, resultando em preferência a estes quanto ao tempo de residência. Entretanto, reconhecer fatores que interferem na comunicação entre hospedeiro-parasitoide pode possibilitar maior adequação e confiabilidade na utilização de D. longicaudata em programas de controle biológico. / Diachasmimorpha longicaudata (Ashmead) (Hymenoptera: Braconidae) is one of the most used parasitoids in biological control programs of tephritids worldwide. Nevertheless, the knowledge about search strategies related to its learning and memory ability for finding its host [Anastrepha fraterculus (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae)] is still limited. We observed residence time (RT) and parasitism of D. longicaudata females from A. fraterculus larvae reared on artificial diet, guava or mango and later exposed to these fruits odors. We registered the learning behavior of female parasitoids conditioned with vanilla essential oil (VEO) and orange essential oil (OEO) and evaluated with the same volatiles in chemotaxis’ bioassays. We also recorded the memory of this parasitoid exposed to VEO. Insects were kept under controlled chambers (25 ± 2 °C, 70 ± 10% RH) with 14-hour photophase (adults) or in the schotophase (immature). The chemotactic responses were recorded with a "Y" olfactometer and the parasitism (immature stage conditioning), in larvae kept in fractions with guava pulp, mango or without pulp (control). Parasitoids females reared on larvae maintained on artificial diet were exposed to VEO or OEO for 4 hours and learning and memory (VEO) evaluated in olfactometer, every 24 until 72 h. Inexperienced females of D. longicaudata were more attracted to volatiles of mango and guava when contrasted with control. Nevertheless, the experienced ones presented higher RT to the odors from fruits that they developed. However, when the odors of these fruits were offered simultaneously, the RT was higher for mango volatiles. The percentage of parasitism of inexperienced wasps was higher on the presence of pulps and, to experienced, in the larvae with odors which it had been conditioned. RT of inexperienced females was significantly higher for acetone than for odors of oils. Female with previous contact with VEO responded more to this odor than to control, however, no differences were found in chemotactic responses of females pre-exposed to OEO. VEO odor memory was maintained at least 48 hours. We conclude that experienced females recognized odors to which they developed and the oils to which they have been given experience, resulting in preference as to residence time, resulting in preference to them as to the residence time. However, recognizing interference factors in host-parasitoid communication may allow greater adequacy and reliability to use D. longicaudata in biological control programs.

Orientador: Cristiano Gallina Moreira / Banca: Ana Marisa Fusco Almeida / Banca: Samar Freschi de Barros / Resumo: Salmonella Typhimurium é um patógeno causador de gastroenterite em humanos e outros mamíferos, e sua habilidade de invadir as células epiteliais e replicar-se dentro de macrófagos a torna um importante modelo de estudo de mecanismos de virulência e interação patógeno-hospedeiro. O estudo desta interação baseia-se na sinalização química via hormônios do hospedeiro e do patógeno, e durante a investigação destes processos foi detectada uma nova proteína denominada VisP, relacionada a funções celulares diversas como manutenção de membrana, metabolismo, virulência bacteriana e resposta ao estresse. A motilidade via flagelos, importante na colonização e exploração de novos nichos, é um dos importantes mecanismos de patogenicidade bacteriana durante o processo de infecção. O objetivo deste trabalho foi investigar a motilidade mediada por flagelos e seu funcionamento em S. Typhimurium, bem como a participação de VisP durante o processo. Para isso, foram feitos ensaios de motilidade, análise da expressão gênica de genes alvos importantes para a patogênese, expressão da flagelina FliC e microscopia em cada um dos mutantes isogênicos comparados à cepa selvagem. Foi evidenciado que a retirada do gene visP afeta a motilidade de S. Typhimurium, bem como promove um desequilíbrio na homeostase da membrana celular, gerando um aumento exacerbado de flagelina através de um mecanismo ainda não elucidado. A compreensão destes processos é essencial para o entendimento da relação patógeno-hospedeir... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Salmonella Typhimurium is a pathogen that promotes gastroenteritis in humans and mammals, and its ability to invade epithelial cells and replicate inside macrophages makes Salmonella an important model for the study of virulence and host-pathogen interactions. This interaction is based on chemical signaling via host and pathogen hormones, and during this investigation a novel protein named VisP was described. This protein is related to diverse cell processes as membrane maintenance, metabolism, virulence and stress response. Flagellar motility, which is important for colonization and exploration of new niches, is one of the bacterial pathogenicity mechanisms that occurs during infection. The aim of the study was to investigate flagellar motility and its operation in S. Typhimurium and verify the participation of VisP protein during this process. Motility assays, gene expression analysis of target genes important for pathogenesis, expression of FliC protein and microscopy were performed with the isogenic mutants comparative to the wild type. The results demonstrated that the visP gene impacts motility in S. Typhimurium, promoting a misbalance in cellular membrane and increasing levels of flagellin via an unknown mechanism. The elucidation of these processes is essential to understanding host-pathogen associations, and contributes to the development of novel technologies and therapies. / Mestre

Diachasmimorpha longicaudata (Ashmead) (Hymenoptera: Braconidae) é um dos parasitoides mais utilizados em programas de controle biológico de tefritídeos no mundo. Contudo pouco se sabe sobre a capacidade de aprendizagem e memória deste braconídeo na busca pelo hospedeiro Anastrepha fraterculus (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae). Neste estudo, avaliou-se o tempo de residência (TR) e o parasitismo de fêmeas de D. longicaudata oriundas de larvas de A. fraterculus criadas em dieta artificial, goiaba ou manga e posteriormente, expostas aos odores destes frutos. Foi observada a aprendizagem de fêmeas de D. longicaudata condicionadas na fase adulta aos voláteis de óleo essencial de baunilha (OEB) e de laranja (OEL) e avaliadas, com os mesmos, em testes de quimiotaxia. Também registrou-se a memória deste parasitoide exposto ao OEB. Os insetos utilizados nos experimentos foram mantidos em câmaras climatizadas (25 ± 2 °C, 70 ± 10% UR) na fotofase de 14 horas (adultos) e na escotofase (imaturos). As respostas quimiotáxicas foram registradas com olfatômetro tipo “Y” e o parasitismo (condicionamento na fase imatura), em larvas mantidas em unidades com polpa de goiaba, manga ou sem polpa (controle). Fêmeas do parasitoide criadas em larvas mantidas em dieta artificial foram expostas a OEL ou OEB por 4 horas e a aprendizagem e memória (OEB) avaliadas em olfatômetro, a cada 24 h e por até 72 h. Fêmeas inexperientes de D. longicaudata foram mais atraídas para os voláteis de manga e goiaba em relação ao controle. No entanto, as experientes apresentaram TR maior para os odores dos frutos nos quais se desenvolveram. Contudo, quando os odores destes frutos foram oferecidos simultaneamente, o TR foi maior para os voláteis de manga. O percentual de parasitismo de vespas inexperientes foi maior na presença das polpas e, das experientes, nas larvas que continham os odores aos quais haviam sido condicionadas. O TR de fêmeas inexperientes foi significativamente maior para a acetona do que para os odores dos óleos. Fêmeas experientes em OEB responderam mais a este odor em relação ao controle, entretanto, não houve diferença para os experientes em OEL. A memória ao odor de OEB foi mantida por até 48 h. Concluímos que fêmeas experientes reconhecem odores aos quais se desenvolvem e aos óleos aos quais receberam experiência, resultando em preferência a estes quanto ao tempo de residência. Entretanto, reconhecer fatores que interferem na comunicação entre hospedeiro-parasitoide pode possibilitar maior adequação e confiabilidade na utilização de D. longicaudata em programas de controle biológico. / Diachasmimorpha longicaudata (Ashmead) (Hymenoptera: Braconidae) is one of the most used parasitoids in biological control programs of tephritids worldwide. Nevertheless, the knowledge about search strategies related to its learning and memory ability for finding its host [Anastrepha fraterculus (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae)] is still limited. We observed residence time (RT) and parasitism of D. longicaudata females from A. fraterculus larvae reared on artificial diet, guava or mango and later exposed to these fruits odors. We registered the learning behavior of female parasitoids conditioned with vanilla essential oil (VEO) and orange essential oil (OEO) and evaluated with the same volatiles in chemotaxis’ bioassays. We also recorded the memory of this parasitoid exposed to VEO. Insects were kept under controlled chambers (25 ± 2 °C, 70 ± 10% RH) with 14-hour photophase (adults) or in the schotophase (immature). The chemotactic responses were recorded with a "Y" olfactometer and the parasitism (immature stage conditioning), in larvae kept in fractions with guava pulp, mango or without pulp (control). Parasitoids females reared on larvae maintained on artificial diet were exposed to VEO or OEO for 4 hours and learning and memory (VEO) evaluated in olfactometer, every 24 until 72 h. Inexperienced females of D. longicaudata were more attracted to volatiles of mango and guava when contrasted with control. Nevertheless, the experienced ones presented higher RT to the odors from fruits that they developed. However, when the odors of these fruits were offered simultaneously, the RT was higher for mango volatiles. The percentage of parasitism of inexperienced wasps was higher on the presence of pulps and, to experienced, in the larvae with odors which it had been conditioned. RT of inexperienced females was significantly higher for acetone than for odors of oils. Female with previous contact with VEO responded more to this odor than to control, however, no differences were found in chemotactic responses of females pre-exposed to OEO. VEO odor memory was maintained at least 48 hours. We conclude that experienced females recognized odors to which they developed and the oils to which they have been given experience, resulting in preference as to residence time, resulting in preference to them as to the residence time. However, recognizing interference factors in host-parasitoid communication may allow greater adequacy and reliability to use D. longicaudata in biological control programs.

Diachasmimorpha longicaudata (Ashmead) (Hymenoptera: Braconidae) é um dos parasitoides mais utilizados em programas de controle biológico de tefritídeos no mundo. Contudo pouco se sabe sobre a capacidade de aprendizagem e memória deste braconídeo na busca pelo hospedeiro Anastrepha fraterculus (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae). Neste estudo, avaliou-se o tempo de residência (TR) e o parasitismo de fêmeas de D. longicaudata oriundas de larvas de A. fraterculus criadas em dieta artificial, goiaba ou manga e posteriormente, expostas aos odores destes frutos. Foi observada a aprendizagem de fêmeas de D. longicaudata condicionadas na fase adulta aos voláteis de óleo essencial de baunilha (OEB) e de laranja (OEL) e avaliadas, com os mesmos, em testes de quimiotaxia. Também registrou-se a memória deste parasitoide exposto ao OEB. Os insetos utilizados nos experimentos foram mantidos em câmaras climatizadas (25 ± 2 °C, 70 ± 10% UR) na fotofase de 14 horas (adultos) e na escotofase (imaturos). As respostas quimiotáxicas foram registradas com olfatômetro tipo “Y” e o parasitismo (condicionamento na fase imatura), em larvas mantidas em unidades com polpa de goiaba, manga ou sem polpa (controle). Fêmeas do parasitoide criadas em larvas mantidas em dieta artificial foram expostas a OEL ou OEB por 4 horas e a aprendizagem e memória (OEB) avaliadas em olfatômetro, a cada 24 h e por até 72 h. Fêmeas inexperientes de D. longicaudata foram mais atraídas para os voláteis de manga e goiaba em relação ao controle. No entanto, as experientes apresentaram TR maior para os odores dos frutos nos quais se desenvolveram. Contudo, quando os odores destes frutos foram oferecidos simultaneamente, o TR foi maior para os voláteis de manga. O percentual de parasitismo de vespas inexperientes foi maior na presença das polpas e, das experientes, nas larvas que continham os odores aos quais haviam sido condicionadas. O TR de fêmeas inexperientes foi significativamente maior para a acetona do que para os odores dos óleos. Fêmeas experientes em OEB responderam mais a este odor em relação ao controle, entretanto, não houve diferença para os experientes em OEL. A memória ao odor de OEB foi mantida por até 48 h. Concluímos que fêmeas experientes reconhecem odores aos quais se desenvolvem e aos óleos aos quais receberam experiência, resultando em preferência a estes quanto ao tempo de residência. Entretanto, reconhecer fatores que interferem na comunicação entre hospedeiro-parasitoide pode possibilitar maior adequação e confiabilidade na utilização de D. longicaudata em programas de controle biológico. / Diachasmimorpha longicaudata (Ashmead) (Hymenoptera: Braconidae) is one of the most used parasitoids in biological control programs of tephritids worldwide. Nevertheless, the knowledge about search strategies related to its learning and memory ability for finding its host [Anastrepha fraterculus (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae)] is still limited. We observed residence time (RT) and parasitism of D. longicaudata females from A. fraterculus larvae reared on artificial diet, guava or mango and later exposed to these fruits odors. We registered the learning behavior of female parasitoids conditioned with vanilla essential oil (VEO) and orange essential oil (OEO) and evaluated with the same volatiles in chemotaxis’ bioassays. We also recorded the memory of this parasitoid exposed to VEO. Insects were kept under controlled chambers (25 ± 2 °C, 70 ± 10% RH) with 14-hour photophase (adults) or in the schotophase (immature). The chemotactic responses were recorded with a "Y" olfactometer and the parasitism (immature stage conditioning), in larvae kept in fractions with guava pulp, mango or without pulp (control). Parasitoids females reared on larvae maintained on artificial diet were exposed to VEO or OEO for 4 hours and learning and memory (VEO) evaluated in olfactometer, every 24 until 72 h. Inexperienced females of D. longicaudata were more attracted to volatiles of mango and guava when contrasted with control. Nevertheless, the experienced ones presented higher RT to the odors from fruits that they developed. However, when the odors of these fruits were offered simultaneously, the RT was higher for mango volatiles. The percentage of parasitism of inexperienced wasps was higher on the presence of pulps and, to experienced, in the larvae with odors which it had been conditioned. RT of inexperienced females was significantly higher for acetone than for odors of oils. Female with previous contact with VEO responded more to this odor than to control, however, no differences were found in chemotactic responses of females pre-exposed to OEO. VEO odor memory was maintained at least 48 hours. We conclude that experienced females recognized odors to which they developed and the oils to which they have been given experience, resulting in preference as to residence time, resulting in preference to them as to the residence time. However, recognizing interference factors in host-parasitoid communication may allow greater adequacy and reliability to use D. longicaudata in biological control programs.